Кинетика и механизм биолюминесцентного окисления люциферина светляков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. И.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет Кафедра химической энзимологии

На правах рукописи УДК 577.158.54

ГАНДЕЛЬМАП ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМ БИОЛЮШЯЕСЦЕНТНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛЩИФЕРША СВЕТЛЯКОВ

02.00.15 - химическая кинетика к катализ

Автореферат диссертация на соискание учснсА степени кандидата хшкческях наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена на кафедре химической. энзимояогу.и хткческого факультета Московского государственного университета им. И.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Й.Н.Угароза

Научный консультант: кандидат химических наук, старший научный сотрудник Л.П.Бровко

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Г.И.Лихтенштейн

Ведущее научно-исследовательское учреждение - Институт Физиологически-активных. веществ АН СССР

заседании Сиецизлизкровэнпого ученогсг совета Д 053.05.76 г.о химическим наукам при химическом факультете МГУ в Московском Государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские горы, Химический факультет МГУ, кафедра химической энзимологии, зуд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ. у /'

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник А.П.Савицклй

Защита состоится

часов на

Автореферат разослан

Ученый секретарь совета, кандидат химических наук

ОБ'ДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди множества биолюминесцентных сис-' тем, существующих в природе-, наиболее загадочной и интересной представляется биолюминесцентнзя система светляков. Она привлекает к себе внимание исследователей как с теоретической, так и с практической точки зрения. Отличительной особенностью процесса биолюминесцентного окисления люциферина является высокий квантовый выход (100 %}. Важную роль в создании благоприятных условий для образования высокоэнергетичного излучателя играет белковая матрица, на которой протекает реакция. Понимание механизма образования и поведения столь высоко эффективного излучателя в процессе реакции, а также роль глобулы люциферазы в испускании видимого света важно, так как рассматриваемая реакция представляет собой, уникальный пример биоконверсии химической энергии в световую. Кинетика биэлюми-несцентного окисления люциферина светляков имеет вид, не типичный для ферментативных процессов. Имеется большое количество разрозненных экспериментальных данных о зависимости фор® кинетической, кривой от концентраций реагирующих веществ и 'условий проведения реакции. Химическая схема и описывапцая ее математическая модель, достоверно огрзжащая весь набор имеющихся литературных.и экспериментальных данных, до настоящего момента не разработаны. Наличие такой схемы и модели позволят целенаправленно влиять на отдельные стадии процесса и разрабатывать новые методики биоаналитического применения люциферззы.

Научная новизна работа. В работе проведено детальное исследование "быстрой" и интегральной кинетики биолшинесцентного окисления люциферина светляков в люциферазной системе светляков Ьис.1о1а 1п1п§ге11са, проанализированы различные химические схемы и описывающие их математические модели, изучены флуоресцентные свойства водных растворов продукта реакции - окси-люциферина - и его структурных аналогов в свободной и связанной с ферментом форме, предложен и обоснован диссоциативный механизм поведения излучателя в нативной биолюминесцентной

системе светляков.

На кинетической кривой интенсивности биолюминесценции имеется индукционный период, ыонозкспонекциальное возрастание до точки максимума и после дующий длительный спзд .до куля. Показано, что количественные параметры сложной зависимости интенсивности биолюминесценции (т.е. скорости реакции) от времени (величина индукционного периода, время достижения максимума и сил да интенсивности) зависят от концентраций субстратов, 'Фермента и условий проведения реакции. Англиз, множества химических схем показал, что оптимальной является схема, включающая собственно Ферментативный цикл превращений люциферазы я инактивацию ее самой и ее комплексов с субстратами и продуктом, численными методами получены оценки величин констант отдельных стадий, с немощью которых удовлетворительно описываются как быстрые вачальные стадии ферментативного процесса, так и интегральные юшетические кривые.

На основании изученных флуоресцентных свойств оксилюцк-фериза в средах с различными значениями рН и диэлектрической проницаемости установлена структура трех типов излучателей: сиккй г феьольнэя форма, желто-зеленый - фенолят енольвей формы и дианжж, красный - фенолят кетонной формы оксилщифе-рина.

Получены, выделены и охарактеризованы спектрально комплексы фермент-продукт к фермент-еннтетачееккй оксилюцнферга. Проведенное сравнение спектров флуоресценции этих комплексов и свободного оксилюциферина в воде со спектрами, биолюминесценции нативной лшдферик-лщиферззной систем при различных рН показало, что" электронно-возбужденный анион-бирадикал ок-силюцкферюга в момент образования покидает гидрофобную . поверхность белка, излучательно дезактивируется в водном микро-окруясенш, частично структурированном аминокислотными остатками белка, и вновь связывается в комплекс фермент-продукт, который частично диссоциирует, регенерируя активный фермент, а частично инэктивируется. Подобное поведение излучателя в момент испускания до настоящего времени наблюдалось только з модельных системах.

Практическое значение работы. Предложенная химическая схема оиолюминесцентного окисления люцмферина и ее математическая ' модель позволяют целенаправленно изменять условия. протекания реакции путем введения в реакционную смесь различных добавок и селективного воздействия на отдельные стадии-процесса. Таким образом, может быть повышена стабильность лвциферазных реагентов, повышена их активность и эффективность использования в анализе АТР и АТР-зависижх ферментов. Показанный в данной работе впервые диссоциативный механизм поведения излучателя в ферментативной, системе может наблюдаться и з других биологических системах.

.Цель работы. Целью данной работы являлось детальное исследование кинетики Оиолшинесцентного окисления люциферина светляков, рзэработка схем и: математической модели:, описывающей полную кинетическую кривую, а также выяснение механизма образования и новедешя излучателя в нативной дюциферин-люциферазной системе светляков Lucióla mingrelica. Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на II Всесоюзном совещании по хемилюминесценцик (Уфз, 1986), на Международном Сишозиуме. "Chemical physics oí Bisyres Catalysis" (Таллин, 198Т), на У Международной Симпозиуме . "Bioluminescence and Cberailminescence" (Флоренция, 1988),на I Международной школе "Bloliginal Luminescence" (Вроцлав,. 1989),на Ш Всесоюзном совещании по хеышгоминесценции (Рига, 1990), на УП Всесоюзном симпозиуме "Инженерная знзимология" (Москва, 1991). По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Содержание и объем работы. Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, результаты и обсуждение, выводы к список цитируемой литература (98 названий). Работа изложена на 140 страницах печатного текста и включает 12 таблиц и 39 рисунков.

Методическая.часть. В работе использовали васокоочищеннув лвциферэзу светляков L.mingrellca, выделенную в лабораторных условиях; оксилюциферкн к его аналоги, синтезированные в лаборатории органического синтеза кафедры химической знзимология; АТР фирмы "Reanal", Венгрия-, Тритон Х-100 фирмы "Merck",

ФРГ; носитель для гель-фильтрации - TOTOPEARI ШУ-40 (Fine), Япония. "Быструю" кинетику регистрировала на спектрофотометре R-401 ("Union Gikeri", Франция) работающем по "принципу "остановленной струя" во фяуоркметрической модификации с вшшочен-ккм. источником света. Интегральную кинетику измеряли на явми-лометре 1251 ("ИЗ", Швеция). Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре В-2-25 ("Вееклнп", СЩД) спектры флуоресценции - на флуорнметре MPF-4 ("Hitachi", Япония). Кинетику затухания флуоресценции к анизотропии флуоресценции измеряли на оригинальном автоматизированном лазерном спектрометре с шткосекундным вреыешшм разрешением в лаборатории гопсосекундной спектроскопии Международного лазерного центра '.¡ГУ. Количественную обработку экспериментальных данных проводили в программе WATTRO PRO ("Borland", СМ.), численный анализ кинетических схем проводили по оригинальной програше решения пряькк кинетических задач "Транслятор схем химической кинетики" (TCXKL), разработанной на Химическом факультете и запатентованной фирмой "Borland", США.. Относительная погрешность экспериментальных.и расчзтннх величин' составляла не более 1С %.

Принятые обозначения. Е - лгоцифераза, IBg - люциферин, L0 - оксилюцифериЕ, k'lS - эдснозян-5'-тркфосфорнзя кислота, AMP - оденозин-5'-монофссфсрная кислота, РР^ - неорганический цярофосфат, MsOLiL, - 6' -ыетоксшшцйфзрин, ВТ - 2-циан-б-гядроксибенэтиазол, S - субстрат, Р - продукт, ЕР - комплекс фермент-продукт, ЕЮ - комплекс фэрмент-синтетическкй оксклю-цкферин, V - наблюдаемая скорость реакции, I - интенсивность люминесценции,'Ну - константа-Мкхзэлиса, KD - константа диссоциации, Kj - константа ингибировзняя, к - константа скорости, kln - константа скорости инактивации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .1. Кинетика биотамикзецантнаго окисления люциферина "ч"- Окисление люциферша протекает под действием .кислорода воздуха в присутствии-¿TP и ионов В результате реакции

выделяется:углекислый газ, образуются РРр AMP и продукт реакции - оксилюциферин. Реакция протекает в присутствии фер-

мептэ - люциферази. Известно, что процесс окисления лгагефери-па включает несколько стадий: образование тройного фармент-субстрзтного комплекса, промежуточного продукта - лгациферил-аденилатз; окисление этого промежуточного продукта кислородом воздуха с образованием синглетлого электронно-возбужденного продукта - оксгслюциферина; его дезактивация, сопровождаемая выделением кванта зидГмого света (схема 1). В результате реакции образуется лрочянй комплекс фермент-продукт, который может быть выделен хромзтографичеии. Вопрос о регенерации активного фермента в результате диссоциации этого комплекса до сих пор оставался открытым.

■ 0?

Е + LH2 + ATP -—^ E-LH2'ATP -г—т E'LH2-№> - £■■>

ppi COg.AMP -> [Е-Р*1 -у» Е'Р > Е*+ Р схема 1

Кинетическую схему окисления люциферина в условиях насыщения по всем субстратам за исключением одного можно представить следующим образом (схема 2):

%1 • "" -< Взкеой особенностью данной реакции является выделение видизяо-

го света, интенсивность которого служит мерой скорости реакции и монет быть легко зарегистрирована с помощью люминесцентного оборудования. Так как квантовый выход реакции равен 1, то

т___ у _ (ПЕР] V гтр 1

I - -д^— - 7 - д^— - к3 (ЕР, ]

То есть зависимость интенсивности биолюминесценции от времени, регистрируемая экспериментальео, представляет собой кинетическую кривую концентрации промежуточного продукта ЕР, с точностью до коэффициента. Нестабильность водных растворов оксилюциферинз, мзлый процент превращения субстратов в ходе реакции и низкий выход продукта затрудняют экспериментальное получение традиционных кинетических кривых накопления продукта в ходе реакции. Анализ кинетики бколшинесцеятной реакции представляется целесообразным разделить на две части: милли-секундннй диапазон, исследуемый методом "быстрой" кинетики, к

минутный, исследуемый методой интегрзльной кинетики. -"ШС-ТРАЯ" ЮШЕТИКА БИ0ЛШИНЕСЦЕН1Н0Г0 ОКИСЛЕНИЯ ЛВДИФЕРШ;

Методом "остановленной струи" получеяы кинетические кривые интенсивности биолюминесценции в диапазоне времея 160-32000 мс в зависимости от концентраций А.ТР к Тйэ (0,1-Ю Ку) (рис. 1). Рассчитает . • константа скорости нарастания <"Нараст ) на участке 2 до точки ыэксимумз и спада (кспа„а) на участке 3

(рис. 1) после него в однозксшженцкаяьноы приближении (таб-

лица 1).

Рис. I. Зависимость ингенсив-ности ииолонииесценции ог времени, полученная ивтодзн 'быстрой' кинетики

.г, ° ^««а- ^мвкс ¿о РО • ' '

Таблица 1. Параметры кинетических кривых интенсивности биолюминесценции, определенные методами "быстрой" кинетики и рассчитанные по схемам 2-4

LM'FJ мМ ILtloJ мнЬГ Чгакс' с ^нарарт' с" кспа|а'

эксп расч эксц расч

10 50 8 10 0,16 0,15 • 26 ± 1 ■ 0,12-3,1

10 25 12 14 0,19 0,18 26 ± 3 0,17-1,85

10 "5 16 1Ь 0,20 0,23 18 ± 4 0,05-1,54

10 2,5 18 16 0,20 0,24 22 ± 2 —

10 0,5 20 16 0,22 0,25 - —

5 100 16 10 0,13 0,13 33 ± 1 6,3-1,1

1 100 2С 16 0,16 0,22 22 ± 3 —

0,5 100 20 16 0,20 0,2? 22 ± г 0,17-1,5

0,1 100 30 10 0,25 0,33 19 ± 0,5 — . .

0,05 100 32 18 0,36 0,42 - —

Видно, что увеличение . концентрации субстрата приводит к. уменьшению индукционного периода и времени достижения макси- ' мума. Ранее в литературе отмечалось, что величина индукционного периода и времени достижения максимума не зависят от концентрации субстрата в широком диапазоне. Константа скорсс-; ти нарастания интенсивности равна 23 ± 5,сек-1, ез зависит от

концентраций реагирующих веществ. Это свидетельствует о подчинения стадии, обуславливающей нарастание интенсивности биолюминесценции, первому порядку. Вероятно, это образование промежуточного продукта ЕР1 с константой ^ (сх. 2). Спад интенсивности биолюминесценции плохо аппроксимируется моноэкспоненциальной зависимостью и, по-видимому, обусловлен совокупностью нескольких стадий с близкими константами скоростей.

Поскольку математические модели начального участка кинетической кривой биолюминесценции ранее не разрабатывались, то наш проведен анализ различных схем, описывающих этот участок. Были рассмотрены приведенная выше схема 2, включающая регенерацию активного фермента, более сложная схема 3, учитывающая обратимость всех стадий, а также схема 4, согласно которой окисление люциферина протекает как один нёкзталити-ческкй цикл.

К К к, ^

Е + 8 ЕБ =з==2й= ЕР, ЕР Е + Р схема 3

к к Ч

Е + 3 ЕБ —>-ЕР1 > ЕР схема 4

Из литературных данных известно, что к /к1 = Кв Е = 10 М для 1Л2 и 3*10"* и для Д.ТР, = Ко Ер » 3*10 М для ЬО.

Значения констант к2 и Зс3 взяты близкими к кнараст и кспада, определенным экспериментально методом "быстрой" кинетики. Проведенный с учетом этих соотношений численный анализ схем 2-4 показал, что для кинетических кривых Ки характерно наличие индукционного периода, максимума и спада (таблица 1). Количественные значения т^ и Ъмакс зависят от набора констант и начальных концентраций АТР и Зависимости I(1:) для всех схем не отличаются друг от друга ври одинаковом наборе констант. Значение ¡^ может варьироваться в диапазоне 104-10б М-1 с~1 (в противном случае исчезает индукциннный период). Значения констант к^, кд и к4 достаточно близки между собой и находятся в дязпззоне 1-100 с"1, поэтому невозможно выделить скорость лимитирующую стадию. Все попытки значительного изменения этих констант приводили к существенному откло-

нению расчетных криви биолюминесценции от экспериментальных. Проведенный анализ объясняет имеющиеся в литературе данные о влиянии добавок различных веществ на общий вид кинетической кривой. Введение в реакционную среду ПАВ, липосом, коонзима А и др., по-видимому, вызывает различные изменения хонстаа-с скоростей отдельных стадий, а следовательно, и общего вида кинетической кривой. Однако дальнейшая оптимизация модели па основании только давзчх до "быстрой" кинетике не представляется возможной, требуется кссдедозагае длительного спада биолюминесценции методами интегральной кинетики. ШТЬТРШНАЛ КИНЕТИКА БИОШВЯЕСЦЕНТНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЖЩЕРША. Получены серж кшетичёсккх кргаых интенсивности биолюминесценции 1(1:) при различных начальных концентрациях фермента (10~13 - «Г9 М) и люцвферина С10_б—10—3 М) для больших времен (1-5 часов) -в условиях насыщения по А'ГР (КЫСу), и 02. Рассчитаны площади, ограниченные кривыми интенсивности и осью абсцисс на отрвзке времени от 0 до бесконечности

а

(1 1(1 )й1:). Под. бесконечностью подразумевается время, при о

котором остаточное свечение составляет 1% от максимального. В таблице 2 приведены параметры экспериментальных кинетических кривых интенсивности биолюминесценции для различных начальных концентраций лвциферазы к люцяферина- Экспериментально нолу-.чекнне зависимости интегралов от начальных концентраций фермента и лгсцкферива представлены на рис. 2 и 3. Зависимость интеграла интенсивности биолюминесценции от начальной концентрации фермзнтз в логарифмических координатах млеет вид прямой с тангенсом угла наклона, 'близким к 1, от начальной кон-центрецкл. лщиферинз - кривой с насыщением.' Прямолинейная зависимость от Е0 свидетельствует об отсутствии оборота' фермента, что может быть следствием ингибирования фермента избытком субстрата или промежуточными и конечными продуктами.. Ранее было показано, что ингибирование люциферазы продуктом (несмотря на высокую констзету связывания) не мокет объяснить наблюдаемую зависимость интенсивности от времени. Ингибирование избытками субстратов в литературе не описано и наш также

а

Таблица 2. Параметры кинетических кривых интенсивности биолюминесценции, полученные экспериментально и рассчитанные по схеме 7

1Е], М [ЬН21, м г , мин го

зкел расч экса раич

5*10-]? 5*101 А 5*10 1и ■ ' 40 444 5800 44 446 ■4387 120 60 50 100 03 60

5*10~]2 5*1 о: ° 5*10 Н 5*10 2»10"? 5*10 2 1*10 3 1150 2100 57С0 9000 920 " 1880 4600 8600 200 180 120 90 100 90 80 65

ре зафиксировано. По литературным данным, зависимость, аналогичная приведенной на рис. 3, может наблюдаться в случае инактивации фермента в процессе реакции на стадии, непосред-стзенно связанной с введением субстрата.

Рис. 2. Згексимос

ть ингегралз Рис. 3. Зависимость интеграла

кнтенскснэсти биглетгоквецекции интенсквиост» еиол&чикесцекци*

ог концентрации лецкреразы от концентрации лоцифериха

X - экспер,, — - рассчкг. X - экстер., — - рассчаг.

Нами рассмотрены схемы 5-7, которые в отличие от схем '2 л 4 включзазт янактквзцию как самого Фермента, так и его когш-лексов с субстратом и продуктом. Схема 3 была исключена из рассмотрения, так как трудно предположить обратимость кзлуча-телькой стадии 3. Стадия 2, как ш показали, также практически необратима.

Е*5

Е +

i

5

Ш Е +

С 5

"Ш

б Е5 ^

РЧ 5

1п

к к з ЕБ

1п

к

ЕБ — ♦ к.

ЕР,

-> ЕР,

-> ЕР

-> ЕР

Е + Р

Е?

ЕР

+ Р

схема 5

схема 5

схема 7

"-4

ЕР!п нестабильный

зрмент

Известно, что люцифераза

при 25°С), субстраты Ее стабилизируют фермент

"ЧгГ

0,02 а в результате реакции образуется прочный комплекс фермент-продукт.

Численный анализ схем 5-7 с использованием оценок значений констант отдельных стадий, полученных при исследовании начального участка, показал, что зависимости 1(1) для схем 5 и б, хорошо опксываявде даЕше "быстрой" кинотики, не совпадают с экспериментальными кривыми при большой глубине протекания реакций. Соглосео схеме 5, реакция идет до полного истощения фермента и заканчивается в течение нескольких минут.

Численный анэлго схемы б показал следующее: при кз г

К5 кру-

тизна спада интенсивности уменьшается с увеличением 30, однако экспериментальная зависимость носит обратный характер; при К3 » К5 скорость биолюминесценции на?лного выше скорости каактивацкн фермента и, следовательно, крутизна спада мала, а время завершения реакции велико, что также не соответствует .эксперименту. Крутизна спада возрастет, если наблюдается инактивация ещз какой-нибудь формы фермента.

Согласно схеме 7, параллельно ферментативному процессу происходит инактивация фермента, в также его комплексов с субстратом и с конечным продуктом. Неактивный- комплекс фермент-продукт, по-видимому, и есть тот самый комплекс, который может быть выделен из реакционной смеси после завершения реакции. Кинетическая кривая, задаваемая этой схемой, наиболее, адекватно описывает наблюдаемую экспериментально зависимость интенсивности биолюминесценции от времени во всем временном диапазоне. Наилучшее соответствие рассчетвых и экспериментальных данных было достигнуто при следующем наборе констант:

>

к( = 104 г'с"1, - 0,1 с"1, кг - 20 с"1, кз = 10 с"1, к4 = 1 о"1, к . = 10Г ТЛ"1 с*1, к,. = 0,ТО1 с"1, к. = 0,001 с'1 в

5 II 5 о

диапазоне концентраций фермента 10" - 10 М, лвдциферина 10"8-10"3 М (таблица 2).

Согласно предложенной модели, действительно максимальная интенсивность пропорциональна концентрации фермента (табл. 2). Его разбавление уменьшает крутизну спада интенсивности. Рост Б0 увеличивает крутизну спада. Зависимость 1макс от 50 имеет ввд кривой с насыщением,,, т.е. опкснвзется уравнением

о

зывают хорошее соответствие рассчитанных и экспериментальных величин (рис. 2 и 3). 3 начальный период реакции схема 7 вырождается в схему 2, так как нз малых временах инактивации фермента можно не учитывать. Полноз количественное совпадение расчетных ;; экспериментальных -данных не достигнуто (это может быть сделано только ври решзшш обратной кинетической задачи). Отчасти это объясняется и тем, что не существует методов точного определения концентрации•активного фермента.

Таким образом, использование комплексного подхода к изучению шшетики Оиолишнссцентного окисления (методов "быстрой" к интегральной кинетики в сочетании с математическим моделированием) позволило предложить достаточно простую схему, наиболее полно и достоверно отражающую весь набор, имеющихся ва сегодняшний день литературных и полученных наш экспериментальных данных по кинетике биолюминесценции в системе люцяферазы сестляков lucióla raingrelica. П. Спектральные свойства люциферина, оксилюциферина и их аналогов

Получены спектры поглощения LH^, МеОШ2, ВТ и L0 при 300-600 ем в диапазоне рН 1-10 в водном и этанольном растворах. Спектры водных растворов оксилюциферина получены впервые. Показано, что для соединений с незамещенной б'-ОН-груштой (LH2, 10, ВТ), способных образовывать фенолят-ион, характерен сдвиг максимума спектра поглощения в длинноволновую область при переходе из нейтральной среда в целоч-

Михззлнса-Ментен. Графики зависимостей /Idt от и 5,. пока-

кую. Из рН-ззвкскшсти спектров поглощения LHg рассчитаны рК основного и возбужденного состояний б'-ОН-группы, рзвные 8,7 и -0,5, соответственно. Методами субнанссекундной и стационарной флуороскотги показано, что время переноса протона от б'-Ой-группы LFig з воде в возбужденном состоянии много меньше времени жизни самой возбужденной фенольной формы. Несмотря на наличие в водных растворах в основном состоянии как фенольной, так и фенолятной форм, в возбужденном состоянии во всей исследованном диапазоне рИ существует только, фенолят. Для этзнольнкх раствороз характерно наличие протовированных форм L0 при любых рН.

Таблица 3. Максимума флуоресценции аналогов оксилюциферина в различных условиях и структура излучателя

Соед-j Условия нив (

кош;

Макс.фл-цик (нм) и структура излучателя сишш ржлго-зеденьЙ! красный

ВТ

ЬНо

R.

е > он, рН 1-1С К20 рН>9

.»о -437

s со

а -соои

ЕЮК.рН 1-)6 НО, рН>9

рН <8

E19I,рК

рН <3 1 -

420

HO-ltj

420

450

НО-Е -К -

1 г

450 450

500 -к.-ск 5Ô0

540

"o-R -В -СОО" 1 Z

540

540

2-соои 620

- бензтиазол, - таазол Получены спектры возбуждения и испускания флуоресценции ЬН^, МэОН1>, ВТ и ЬО в водном и зтанольном растворах в интервале рН 1-10. Спектры возбуждения ^годность» совпадают со спектрами поглощения. Для спектров испускания характерны три типа максимумов: синий (420-450 ем), зеленый (500 нм) -или. желто-зеленый (540-560 нм) и красный (620 нм) (таблица 3)..

Оксклвцкферин шкет существовать в растворе в виде шести различных равновесных форм. Фенольяые формы (1-И), существующие в сильно—кислых растворах и неаолярных средах, являются

Н О рН<8

1

источником синей Флуоресценции. Фенолятные формы (1У-У1) -желто-зелепые и краевые излучатели. Так как известно, что аналог оксилщиферина (5,5-диметилоксилюциферин), ке способный енолизоваться, испускает только красную флуоресценцию, то логично предположить, что имечко кето-форма 1У - красный излучатель, а фенолят енолэ У и дизнпок У1 - желто-зеленые из-

. лучзтелисхема 8). • и н и й 450 тм

схема в

И. Флуоресцентные свойства комплексов люциферазы с люцифери-ном, сссипяциферинсм и их аналогами

Методом флуориметрнческого титрования по тушешш флуо-ресценщш триптофана определены константы диссоциации комплексов Ш^, НйеОШ^ и ЕВТ, равные 11,3+0,3, 1,5±0,5, 13±1 мкМ, соответственно, совпадающие с величинами К^ и К^, определенными кинетически. Нэ основании данных по стационарной я времяразрешенной спектроскопии сделай вывод о диссоциативном механизме испускания низкомолекулярных флуорофоров в составе комплексов ЕШ-> и ЕМеОЫТ^ при фотовозбуждении.

Из полной реакционной смеси методом гель-фильтрации выделен каталитически неактивный комплекс ЕР II изучена рН-завискмссть его спектров флуоресценции. Показано, что продуктом реакции является окенлюциферин, э комплекс имеет некова-лентную природу. Полечен и выделен комплекс люциферазы с синтезированным оксилюцкферкном (ЕЬО) и изучена рН-зависимость его спектров флуоресценции. Сравнение флуоресцентных свойств комплексов ЕР и ЕЬО показывает, что участки связывания окси-люциферина с ферментом весьма различаются по своим физико-химическим свойствам для люциферазы в момент ее функциониро-

вання, когда образуется ЕР, к для люцпфе.разы в "покоящемся" состоянии при образовании комплекса ЕЮ. Это, по-видимому, обусловлено заметными конформационнымл изменениями люцифораэы-в процессе реакции.

ПОБЕДЕН!® ИЗЛУЧАТЕЛЯ В НАТИВГОЙ ЛСЦИФЕРИ1!-ЛЮЩ5ФЕРАЗ|ЮЙ СИСТЕМЕ СВЕТЛЯКОВ. Ранае было показано, что максимум спектра 'биолюминесценции смещается из желто-зеленой в красную область при понижении рН (синяя люминесценция не наблюдается). Анализ флуоресцентных свойств оксилюциферина в водных и водно-зтазольных растворах, а также в виде комплексов ЕР и ЕЬО показал, что форма спектров флуоресценции сильно зависит от микроокруягения испускающей частицы. Соотношение интексквнос-тей красной и желто-зеленой флуоресценции в' их максимумах (620 и 570 нм соответственно), характеризующее соотношение кетонной и енольной форм оксилщиферяна, является весьма информативной характеристикой микроокружения оксилвцнферинз. Проведено сравнение рй-завискмости соотношения Ь^О'^ЗТО для оксилюциферина в водном растворе, в комплексах ЕР и ЕЬО к для спектров биолюминесценции натквной люциферин-лвцифсрззноа системы (рис. 4). Видно, что спектральные параметры биолюминесценции наиболее близки к люминесценции свободного оксилюциферина в воде (кривые 1,2). Такой результат представляется весьма странным нз первый взгляд, так как излучателем в биолюминесцентной системе должна бы являться сшглетная элек-

Рис. 4. рН-Зависимость отношения красной (620 нм) и желто-зеленой (570 нм) интенсизностей лзоминес- ' ; ценцки оксилюциферина .(*е(>э5=380 .нмХ 1) биолюминесценция в натквной и системе светляков; 2) II) в воде; 3) ЕЮ; 4) ЕР

Гид

157»

г *' * * Рк -

тронно-возбукденвая молекула оксилюциферина, связанная с гид-

рофобпой глобулой белка. Следовало бы ожидать наличие спектральных свойств, более характерных для спиртовой среды.

Для объяснения этого факта предложена следующая гипотеза (рис. 5). При. образовании в процессе реакции злектронко-возбузкдсшюго зяион-бирадикалэ _ ^комплекс Фермент-кзлучзтель

мгновенно распадается (стадия ) и возбужденный оксилюцифе-рин излучательно дезактивируется в водном микроокрукешге, частично структурированном аминокислотными остатками фермея-тз. После излучательной дезактивации продукт вновь связывает-•ся с фермвнтом в прочный комплекс БР, который частично распадается, регенирируя активный фермент, а частично инактивиру-"ется. Подтверждением предложенной гипотезы служат следующие факты: 1) совпадение флуоресцентных свойств ко?.шлексов фермент-продукт, выделении яз реакционных смесей с различны?« максимумами биолюминесценции (желто- зеленым - при рН 7,8 и красным - при рН 5,6); 2) близость констант скоростей затухэ-■ ния флуоресценции оксилюциферияа и составе комплексов ЕР к ЕЬО и,в водной среде и их существенное отличие ст аналогичных характеристик в спирте; 3) отсутствие изменения кинетики анизотропии флуоресценции у аналога окгашоциферина - ИеОЫ^ при его связывании о лздиферазой; 4) наличке диссоциативного механизма поведения низкомолекулярных_флуррофо.рдв_в_модельных

мицэллярвых системах.'

Рис. 5. Модель образования и поведения излучателя в биолюминесцентной системе светляков Lucióla mingrelica

выводы

1. На основании математического анализа экспериментальных данных по "быстрой" кинетике и различных схем протекания реакции предложена кинетическая модель начальных стадий биолкь минесценткого окисления люцкферкнз, включающая три последовательные неравновесные стадии, начиная с образования фермент-субстратного комплекса. Численными методами сделаны оценки величин констант скоростей отдельных стадий.

2. Анализ интегральных кинетических кривых зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации люциферазы к люци-ферина показал, что в ходе ферментативного окисления_наблюдается существенная инактивация фермента. С иомощью методов математического моделирования предложена кинетическая схема наиболее полно описывающая экспериментальные данные. Схема включает собственно ферментативный цикл превращений (образование фермент-субстратного комплекса,"промежуточного продукта

- люциферкладенклата, его окисление с образованием глектрон-но-возбуждевного продукта - оксштцкферша, его последующей излучательной дезактивацией и' регенерацию фермента в результате диссоциации комплекса фермеат-продукт) и инактивацию трех форм фермента: свободного, а также комплексов Фермент-субстрат и фермент-продукт. Получены численные оценки величин констант скоростей отдельных стадий.

3. Предложена кинетическая модель биолшинесцентного окисления лвдиферяна светляков, адекватно описывающая полную временную зависимость интенсивности биолюминесценции в широком интервале концентраций субстратов и фермента.

4. Из основании детального исследования спектров поглощения и флуорссцонции оксилюциферкна и его структурных аналогов, в водной и водго-зтанольной средах в широком диапазоне рН (1-Ю) идентифицированы структуры трех типов излучателей: синий

- фенояьные формы, желто-зеленый - фенолят екольной форда и', дканион, красный - фенолят кетонной формы оксилюциферкна.' \

5. В результате подробного исследования флуоресцентных "свойств комплексов ELiig, ЕКеОЬН^.и ЕЬО (в стационарном и вре-

мярззрешенном.режимах) показано, что для них характерен дис-

г

социатизкый механизм испускания флуоресценции при фотовсзбузк-деяки.

б. На основании анализа спектров СиолшиЕесцекцшш и параметров флуоресценции модельных систем впервче предложен диссоциативный механизм поведения излучателя в биолгаикесцентпой системе : электронно-возбуаденкый аниоа-бирадикал оксилюцифе-рина в момент его образования покидает гидрофобную поверхность белкз, излучательно дезактивируется в водно« микроокру-жеяии, частично структурированном аминокислотными остатками белка, и звовь связывается в4комплекс фермент-продукт, кото-'рьй частично диссоциирует, регенерируя активный фермент, я частично кнактивируется.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Бровко Л.Ю., Дементьева Е.И., Угарова H.H., Дружинина E.H., Гандсльман O.A.. pH-Зависимость спектров биолюминесценции и гсгнетичаских констант для лкциферазы светляков/УЕиохи-тп. 1985. Т. 51. Ml. С. 130-139.

2. Brovko L.Yu., Gandelnan O.A., Ugaxova н.Н. Fireîly BIolu-raincacenca. Fluorescence Studies of luciîerase Interactions with oxyluciferin and Its .amlcgs/Zln Biological Luminescence. Singapore-New Jersey-bondcn-Hong Kong. 1989. P. 292308.

3. Гзнделъмая O.A.., Бровко 1.Ю., Угарова H.H., Щеголев A.A. Еиэлшннесцентная система светляков. Исследование взаимодействия продукта реакции - оксилвцкферина к его аналогов с лю-циферазой методами флуоресцентной спектроскогми/'/Бнохимия. 1990. Т. 55. Вт. 6. С. 1052-1053.

4. Бровко Л.Ю., Дементьева 13.Й., Гавдельман O.A. Спектры био-хемклюминесценшш лвциферазЕой систем светляков и их связь со структурой белка//Тезисн докл. П Всесоюзного Совещания по хемилюшшесценци. Уфа. 1986. С. 48. '

5. Brovto L.Yu., Ganflslman O.A. Biolumineccent Oxidation oî îlrefly Luciîerin// Abs tracta. Chemical 'Physics oî Епяуие Catalysis. Tallin. 198T. P. 140.

6. Гавдельман O.A., Бровко Л.Ю., Угарова H.H. Физико-химические аспекты биолюминесценции в лкцпферазной системе

светлякоз/УТезисы докл. И Всесоюзного Совещания до хемилши-несценции. Рига. 19S0. С. 105.

7. Гандельман O.A.., Бровко Л.Ю., Угарова H.H., Поленова Т.Е. Кинетика и механизм биолюминесцентного окисления люциферина светлякоз//Тезисы докл. УП Всесоюзного Симпозиума "Инженерная энзинология". Москва. 1991. С. 23.