Структуры хромофоров жёлтого (zFP538) и пурпурного (asFP595) гомологов зелёного флуоресцентного белка (GFP) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Введение.

Обзор литературы

1. Ковалентные структуры хромофоров цветных гомологов зелёного флуоресцентного белка (GFP) как ключ к происхождению и механизмам эволюции семейства GFPподобных белков

1.1 .Введение.

1.2.Структуры и свойства GFP и его гомологов. Структуры хромофоров GFP-подобных белков.

1.3.Спектральные свойства GFP-подобных белков, выделяемых из них хромопептидов и синтетических модельных хромофоров.

1.4. Некоторые свойства iV-ацилиминов.

1.5.Фрагментация полипептидных цепей жёлтого и красных гомологов GFP.

1.6. Роль отдельных аминокислотных остатков в последовательностях гомологов GFP в формировании их хромофоров и в их спектральных свойствах, выявляемая методами направленного и статистического мутагенеза.

1.7.Структуры хромофоров жёлтого (zFP538) и пурпурного (asFP595) гомологов GFP и возможные механизмы их образования.

1.8.Природные имидазо[1,2-а]пиразины, их синтетические аналоги и вопросы биосинтеза.

1.9.Гипотезы о происхождении и эволюции семейства GFP-подобных белков: проблемы и перспективы.

Исследования структур, образующихся в белках в результате посттрансляционных модификаций, остаются одним из важных направлений современной химии белка. Особенный интерес представляют (вероятно, очень древние эволюционно) самопроизвольные/автокаталитические процессы, приводящие к изменению не только и не столько боковых групп аминокислотных остатков, но и топологии основной полипептидной цепи с разрывом химических связей и образованием новых. Наиболее интригующее свойство подобных посттрансляционных модификаций - их спонтанное прохождение без участия ферментов и/или низкомолекулярных соединений. Одним из таких процессов является формирование хромофоров в семействе зелёного флуоресцентного белка (GFP) [Tsien, 1998]. Относительно недавно открытые многочисленные цветные гомологи GFP [Ando et al., 2002; Lukyanov et al., 2000; Matz et al., 1999] демонстрируют богатое разнообразие ковалентных модификаций вблизи общего ядра хромофора GFP-типа и обилие вариаций сходного на начальных этапах механизма образования этой сложной структуры. Исследователю открывается картина непосредственных эволюционных изменений весьма древнего биохимического механизма, по-видимому, уходящего своими корнями к истокам возникновения жизни на нашей планете. Многие процессы и конкретные биохимические реакции в этой группе хромофоров были обнаружены впервые в химии белка и остаются уникальными для этих объектов. Помимо своего общенаучного значения, GFP-подобные белки представляют и большой практический интерес. Применение гомологов GFP в качестве инструментов (например, как репортеров экспрессии генов) в биотехнологических и фундаментальных работах очень широко и общеизвестно [Verkhusha & Lukyanov, 2004; Lukyanov et al., 2005]. Но детальные исследования их хромофоров, несомненно, откроют новые перспективы и для биотехнологии низкомолекулярных метаболитов. Уже почти очевидно, что хромофоры GFP-подобных белков служили в далёком прошлом (вероятно, служат и поныне) предшественниками эндогенных имидазо[1,2-я]пиразинов, пока малоизученного класса соединений, которые, по-видимому, важны для многих биохимических процессов в живых тканях и являются весьма многообещающими фармацевтическими прототипами лекарственных веществ. Одна из наиболее хорошо изученных функций природных имидазо[1,2-а]пиразинов - роль субстратов люциферазных реакций, лежащих в основе биолюминесценции (самосвечения) многих неблизкородственных представителей животного царства. Помимо сугубо фундаментального интереса, биолюминесценция имеет и широчайшее практическое применение при визуализации многих биохимических процессов (как in vitro, так и in vivo), а субстрат люциферазной реакции нужен в качестве химического реактива, удешевление производства которого (биотехнологического взамен сложного химического синтеза) станет возможным вскоре после выяснения деталей его биосинтеза. Исследования структур и механизмов формирования хромофоров GFP-подобных белков совершенно необходимы для скорейшего решения этой важной прикладной задачи.

Представленная работа имела целью установление структур хромофоров и химических основ механизмов их формирования в двух гомологах GFP, жёлтом флуоресцентном белке (zFP538) и пурпурном нефлуоресцентном хромобелке (asFP595) из морских кишечнополостных. В ходе исследования решались следующие задачи:

1) разработка методов препаративной наработки, денатурации и протеолитической деградации исследуемых белков с целью минимального повреждения их нативных хромофоров;

2) разработка методов выделения содержащих хромофоры протеолитических пептидов;

3) препаративная наработка хромопептидов, их всестороннее изучение с привлечением ряда современных физико-химических методов: масс-спектрометрии, спектроскопии ЯМР ('Н и 13С), электронной спектроскопии и аминокислотного анализа;

4) установление, на основании полученных данных, структур хромопептидов из zFP538 и asFP595 и, в качестве контроля, из красного флуоресцентного белка DsRed;

5) установление, с учётом полученной информации о хромопептидах, а также на основании экспериментов с полноразмерными GFP-подобными белками (N-концевое секвенирование, масс-спектрометрические, хроматографические и электрофоретические исследования), точных сайтов самопроизвольной фрагментации полипептидных цепей zFP538 и asFP595 вблизи их хромофоров;

6) направленный мутагенез изучаемых GFP-подобных белков с целью изменения их хромофоров и способности к самопроизвольной фрагментации;

7) выдвижение обоснованных предположений о структурах хромофоров в нативных zFP538 и asFP595 и о возможных механизмах их формирования.

Обзор литературы

Выводы

1. Из протеолитических гидролизатов трёх цветных гомологов зелёного флуоресцентного белка (GFP), а именно: жёлтого zFP538, пурпурного asFP595 и красного DsRed -выделено в общей сложности 8 (восемь) разных хромофорсодержащих пептидов (хромопептидов).

2. Выделенные хромопептиды охарактеризованы с помощью ряда физико-химических методов: электронной спектроскопии, аминокислотного анализа, масс-спектрометрии, спектроскопии ЯМР ('Н и 13С).

3. В своей совокупности полученные данные позволили установить структуры всех выделенных хромопептидов, некоторые хромофоры структурно охарактеризованы впервые.

4. Получен ряд точечных мутантов zFP538 и его зелёного гомолога zFP506, изучены их фенотипы.

5. Изучена самопроизвольная фрагментация полипептидных цепей zFP538 и asFP595, картированы точные сайты этих фрагментаций.

6. Впервые установлена структура фрагментированного хромофора красного флуоресцентного белка DsRed и опровергнут альтернативный механизм образования хромофора в пурпурном белке asFP595.

7. Выдвинуты обоснованные предположения о структурах хромофоров нативных zFP538 и asFP595 и возможных механизмах их образования.

1. Басюк В.А. Имидазо1,2-а.пиразины. // Успехи химии 1997. Т. 66. С. 207-224 (Basiuk V.A. Imidazo[l ,2-a]pyrasines. // Russ. Chem. Revs. 1997. V. 66. P. 187-204).

2. Верхуша B.B., Аковбян H.A., Ефременко E.H., Варфоломеев С.Д., Вржещ П.В. Кинетический анализ созревания и денатурации красного флуоресцентного белка DsRed. // Биохимия 2001. Т. 66. С. 1656-1667.

3. Зубова Н.Н., Булавина А.Ю., Савицкий А.П. Спектральные и физикохимические свойства зеленого (GFP) и KpacHoro(drFP583) флуоресцирующих белков. // Успехи биол. химии 2003. Т. 43. С. 163-224.

4. Пахомов А.А.,' Мартынова Н.Ю., Гурская Н.Г., Балашова Т.А., Мартынов В.И. Фотопревращение хромофора флуоресцентного белка из Dendronephthya sp. // Биохимия 2004. Т. 69. С. 1108-1117.

5. Роберте Дж., Касерио М. Основы органической химии (пер. с англ.). М.: Мир, 1978. Т. 1.С. 488-491.

6. Терней А. Современная органическая химия (пер. с англ.). М.: Мир, 1981. Т. 2. С. 15-18.

7. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии (пер. с англ.). М.: Мир, 1981. Т. 3. С. 1672-1673.

8. Янушевич Ю.Г., Булина М.Е., Гурская Н.Г., Савицкий А.П., Лукьянов К.А. Выявление ключевых аминокислотных остатков, определяющих цвет зеленого и желтого флуоресцентных белков из кораллового полипа Zoanthus. // Биоорган, химия 2002. Т. 28. С. 303-307.

9. Ananikov V.P. Evaluation of 13С NMR spectra of cyclopropenyl and cyclopropyl acetylenes by theoretical calculations. // Central European Journal of Chemistry (CEJC) 2004. V. 2. P. 196213.

10. Andersen L.H., Lapierre A., Nielsen S.B., Nielsen I.B., Pedersen S.U., Pedersen U.V., Tomita S. Chromophores of the green fluorescent protein studied in the gas phase. // Eur. Phys. J. D 2002. V. 20. P. 597-600.

11. Ando R., Наша H., Yamamoto-Hino M., Mizuno H., Miyawaki A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. V. 99. P. 12651-12656.

12. Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. V. 97. P. 11984— 11989.

13. Banfield J.E., Brown G.M., Davey F.H., Davies W., Ramsay Т.Н. N-acyl derivatives of aromatic ketimines. //Aust. J. Sci. Res. 1948. Ser. A. V.l. P. 330-342.

14. Barondeau D. P., Kassmann C. J., Tainer J. A. and Getzoff E. D. "Understanding GFP Chromophore Biosynthesis: Controlling Backbone Cyclization and Modifying Post-translational Chemistry" //Biochemistry. 2005. V. 44. P. 1960-1966

15. Bax A., Griffey R.H., Hawkins B.L. Correlation of proton and nitrogen-15 chemical shifts by multiple quantum NMR. // J. Magn. Reson. 1983. V.55. P. 301-315.

16. Bax A., Davis D.G. MLEV-17-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy. // J. Magn. Reson. 1985. V. 5. P. 355-366.

17. Bax A., Davis D.G. Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy. // J. Magn. Reson. 1985. V.63. P. 207-213.

18. Bax A., Subramanian S. Sensitivity-enhanced two-dimensional heteronuclear shift correlation NMR spectroscopy. // J. Magn. Reson. 1986. V. 67. P. 565-569.1 j -l

19. Bax A., Summers M.F. H and С assignments from sensitivity-enhanced detection of heteronuclear multiple-bond connectivity by 2D multiple quantum NMR. // J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108. P. 2093-2094.

20. Becke A.D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. // J. Phys. Chem. 1993. V. 98. P. 5648-5652.

21. Bell A.F., He X., Wachter R.M., and Tonge PJ. Probing the ground state structure of the green fluorescent protein chromophore using Raman spectroscopy // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 4423-4431.

22. Bevis B.J., Glick B.S. Rapidly maturing variants о f the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. P. 83-87 .

23. Binkley J.S., Pople J.A. Muller-Plesset theory for atomic ground state energies. // Int. J. Quantum Chem. 1975. V. 9. P. 229.

24. Bokman S.H., Ward W.W. Renaturation of Aequorea green-fluorescent protein. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. V. 101. P. 1372-1380.

25. Brejc K., Sixma Т.К., Kitts P.A., Kain, S.R., Tsien R.Y., Ormo M., Remington S.J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. // Proc.Natl Acad.Sci.USA 1997. V. 94. P. 2306-2311.

26. Breuer S.W., Bernath Т., Ben-Ishai D. N-benzoyl-benzaldimines and N-R-alkoxybenzyl-benzamides. //Tetrahedron 1967. V. 23. P. 2869-2877.

27. Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. A monomeric red fluorescent protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. V. 99. P. 7877-7882.

28. Carugo O. When X-rays modify the protein structure: radiation damage at work. // Trends in Biochemical Sciences. 2005. V. 30. P. 213-219.

29. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., and Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. 1994. V. 263. P. 802-805.

30. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., Boxer S.G. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: Multiple states and proton transfer. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. V. 93. P. 8362-8367.

31. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G., and Ward W.W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 1212-1218.

32. Corbett J.F. Benzoquinone Imines. Part II. Hydrolysis of p-Benzoquinone Monoimine and p-Benzoquinone Di-imine. // J. Chem. Soc.1969 (B). P. 213-216.

33. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. // Trends Biochem. Sci. 1995. V. 20. P. 448-455.

34. Cubitt A.B., Woollenweber L.A., Heim R. Understanding structure-function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. // Methods Cell Biol. 1999. V. 58. P. 19-30.

35. Darwin Ch. On the origin of species by means of natural selection. London: John Murray, Albemarle Street, 1859. P. 193 (Дарвин Ч. Происхождение видов путём естественного отбора. (пер. с англ.). СПб.: Наука, 1991. С. 160).

36. Deng W.P. Site-directed mutagenesis of virtually any plasmid by eliminating a unique site. // Anal. Biochem. 1992. V. 200. P. 81-88.

37. Ditchfield R. Self-consistent perturbation theory of diamagnetism. I. A gauge-invariant LCAO method for NMR chemical sifts. //Mol. Phys. 1974. V. 27. P. 789-807.

38. Elsliger M.A., Wachter R.M., Hanson G.T., Kallio K., and Remington S.J. Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH. // Biochemistry, 1999 V 38, P5296-5301.

39. Fradkov A.F., Chen Y., Ding L., Barsova E.V., Matz M.V., Lukyanov S.A. Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants green fluorescent protein homolog. // FEBS Lett. 2000. V. 479. P. 127-130.

40. Frisch M.J., Trucks G.W., Schlegel H.B., Scuseria G.E., Robb M.A., Cheeseman, J. et al. (79 co-authors). Gaussian 03, Revision B.04. Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA, 2003.

41. Garcia Parajo M.F., Koopman M., van Dijk E.M., Subrumaniam V., van Hulst N.F. The nature of fluorescence emission in the red fluorescent protein DsRed, revealed by single-molecule detection. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. V. 98. P. 14392-14397.

42. Gauss J. Effects of electron correlation on the calculation of nuclear magnetic resonance chemical shifts. // J. Phys. Chem. 1993. V. 99. P. 3629-3643.

43. Gong Z., Wan H., Tay T.L., Wang H., Chen M., Yan T. Development of transgenic fish for ornamental and bioreactor by strong expression of fluorescent proteins in the skeletal muscle.// Biochem. Biophys. Res. Comm. 2003. V. 308. P. 58-63.

44. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., Tsien R.Y. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from с oral. //P roc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. V. 97. P. 11990-11995.

45. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., Lukyanov K.A. Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. // BMC Biochem. 2001. 2:6.

46. Gurskaya N.G., Fradkov A.F., Terskikh A., Matz M.V., Labas Y.A., Martynov V.I., Yanushevich Y.G., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. // FEBS Lett. 2001. V.507. P. 16-20.

47. Haddock S.H.D., Rivers T.J., Robison B.H. Can coelenterates make coelenterazine? Dietary requirement for luciferin in cnidarian bioluminescence. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. V. 98. P. 11148-11151.

48. Hariharan P.C., Pople J.A. The effect of d-functions on molecular orbital energies for hydrocarbons. // Chem. Phys. Lett. 1972. V. 16. P. 217-219.

49. He X., Bell A.F., Tonge P.J. Synthesis and spectroscopic studies of model red fluorescent protein chromophores. // Org. Lett. 2002. V. 4. P. 1523-1526.

50. He, X., Bell, A. F., and Tonge, P. J. Ground-state isomerization of a model green fluorescent protein chromophore. // FEBS Lett. 2003. V. 549. P. 35-38

51. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. V. 91. P. 12501-12504.

52. Heng Suen Y., Kagan H.B. Iminomagnesiens. III. Proprietes d'acylimines et acylenamines. // Bull. Soc. Chim. Fr. 1965. V. 5. P. 1460-1463.

53. Hopf M., Gohring W., Ries A., Timpl R., Hohenester E. Crystal structure and mutational analysis of a perlecan-binding fragment of nidogen-1. // Nat. Struct. Biol. 2001. V. 8. P. 634-640.

54. Kiernan J.A. Histological and histochemical methods: Theory and practice. // 1999. Butterworth Heinemann, Oxford, London, UK. Ed.3.

55. Kishi Y., Goto Т., Hirata Y. Cypridina bioluminescence. I. Structure of Cypridina luciferin. // Tetrahedron Lett. 1966. P. 3427-3436

56. Krishnan R., Frisch M.J., Pople J.A. Contribution of triple substitutions to the electron correlation energy in fourth order perturbation theory. // J. Chem. Phys. 1980. V. 72. P. 4244.

57. Mackie G. O. Defensive strategies in planktonic coelenterates. // Mar. Fresh Behav. Physiol. 1995. V. 26 P. 119-129.

58. Malassa V.I., Matthies D. Lineare N-Acylimine eine eigenstandige Verbindungklasse? I. N-Acyl-aldimine. //Chem.-Z. 1987. V. 111. P. 181-185.

59. Malassa V.I., Matthies D.- Lineare N-Acylimine eine eigenstandige Verbindungklasse? II. N-Acyl-ketimine. // Chem.-Z. 1987. V. 111. P. 253-261.

60. Martynov V.I., Maksimov B.I., Martynova N.Y., Pakhomov A.A., Gurskaya N.G., Lukyanov S.A. A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 46288-46292.

61. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. // Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. P. 969-973.

62. McCapra F., Roth M. Cyclisation of a dehydropeptide derivative: a model for Cypridina luciferin biosynthesis. // J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1972. P. 894-895.

63. McCapra F., Manning M.J. Bioluminescence of coelenterates: Chemiluminescent model compounds. // J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1973. P. 467-468.

64. Mizuno H., Sawano A., Eli P., Hama H., and Miyawaki A. Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 2502-2510.

65. Mizuno H., Mai Т.К., Tong K.I., Ando R., Furuta Т., Ikura M., Miyawaki A. Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. // Mol. Cell. 2003. V. 12. P. 1051-1058.

66. Nienhaus К., Nienhaus G.U., Wiedenmann J., Nar H. Structural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005. V. 102. P. 9156-9159.

67. Niwa M., Inouye S., Hirano Т., Matsuno Т., Kojima S., KubotaM., Ohashi M., Tsuji F,1. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. V. 93. P. 13617-13622.

68. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. // Science 1996. V. 273. P. 1392-1395.

69. Petersen J., Wilmann P.G., Beddoe Т., Oakley A.J., Devenish R.J., Prescott M., Rossjohn J. The 2.0 A crystal structure of eqFP611, a far-red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 44626-44631.

70. Piotto M., Saudek V., Sklenar V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. // J. Biomol. NMR 1992. V. 2. P. 661-665.

71. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., and Cormier M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Gene. 1992. V. 111. P. 229-233.

72. Prescott M., Ling M., Beddoe Т., Oakley A.J., Dove S. The 2.2 A crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation. // Structure (Camb.) 2003. V. 11. P. 275-284.

73. Quillin M.L., Anstrom D.M., Shu X., O'Leary S., Kallio K., Chudakov D.M., Remington S.J. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: Dark-state structure atl.38 A resolution. // Biochemistry 2005. V. 44. P. 5774-5787.

74. Ranee M., Sorensen O.W., Bodenhausen G., Wagner C., Ernst R.R., Wuthrich K. Improved spectral resolution in COSY 1 H NMR spectra of proteins via double quantum filtering. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. V. 117. P. 479-485.

75. Reeves R.L. (Patai, S. ed.) Formation of carbon-nitrogen double bonds In: The chemistry of the carbonyl group // Interscience Publishers, 1966. V. 1. Chapter 7. P. 600-614.

76. Reid B.G., Flynn G.C. Chromophore formation in green fluorescent protein. // Biochemistry 1997. V. 36. P. 6786-6791.

77. Remington S.J. Negotiating the speed bumps to fluorescence. // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. P. 28-29.

78. Remington S J., W achter R .M., Y arbrough D .К., В ranchaud ВAnderson D.C., Kallio K., Lukyanov K.A. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. // Biochemistry 2005. V. 44. P. 202-212.

79. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977. V. 74. P. 5463-5467.

80. Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N., Palmer A.E., Tsien R.Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. P. 1567-1572.

81. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y.J. Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from luminous hydromedusan, Aequorea. II Cell. Сотр. Physiol. 1962. V. 59. P. 223-239.

82. Shimomura O., Johnson F.H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978. V. 75. P. 2611-2615.

83. Shimomura O. Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein. // FEBS Lett. 1979. V. 104. P. 220-222.

84. Shimomura O. A short story of aequorin. // Biol. Bull. 1995. V. 189. P. 1-5.

85. Smith P.A.S. The Chemistry of Open-Chain Organic Nitrogen Compounds // New York; Amsterdam: W.A.Benjamin Inc., 1965.

86. Sollenberger P.Y., Martin R.B. Carbon-nitrogen and nitrogen-nitrogen double bond condensation reactions. In: The chemistry of the amino group (S.Patai, ed.) // Interscience Publishers. 1968. Chapter 7. P. 349-406.

87. States D.J., Habercorn R.A., Ruben D.J. 2D NOE with pure absorption phase in four quadrants. // J. Magn. Reson. 1982. V. 48. P. 286-292.

88. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A.V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., and Siebert P. Fluorescent timer: protein that changes color with time.// Science. 2000. V. 290. P. 1585-1588.

89. Thornton J.W. Resurrecting ancient genes: experimental analysis of extinct molecules. // Nat. Revs. Genet. 2004. V. 5. P. 366-375.

90. Tsien R.Y. The green fluorescent protein. // Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 509-544.

91. Verkhusha V.V., Lukyanov K.A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. P. 289-296.

92. Vincent F., Lobel D., Brown K., Spinelli S., Grote PBreer H., Сambillau С., Tegoni M. Crystal structure of aphrodisin, a sex pheromone from female hamster. // J. Mol. Biol. 2001. V. 305. P. 459-469.

93. Wall M.A., Sokolich M., Ranganathan R. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 1133-1138.

94. Ward, W.W., Cody, C.W., Hart, R.C., and Cormier, M.J. Spectrophotometric identity of the energy-transfer chromophores in Renilla and Aequorea green-fluorescent proteins. 0 Photochem. Photobiol. 1980. V. 31. P. 611-615.

95. Ward W.W., Bokman S.H. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. // Biochemistry 1982. V. 21. P. 4535-4540.

96. Ward W.W., Chalfie M. A bioluminescent indicator for gene expression and detection of mutagenesis b ased upon the expression о f a gene for a modified green fluorescent protein: U.S. Patent 5741668 // April 21, 1998.

97. Wachter R.M., Elsliger M.A., Kallio K., Hanson G.T., Remington S.J. Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein. // Structure 1998. V. 6. P. 1267-1277.

98. Weinreb S.M., Scola P.M. N-Acyl Imines and Related Heterodienes in 4+2. Cycloaddition Reactions. // Chem. Rev. 1989. V. 89. P. 1525-1534.

99. Wiedenmann J., Ivanchenko S., Oswald F., Schmitt F., Rocker C., Salih A., Spindler K.D., Nienhaus G.U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. V. 101. P. 15905-15910.

100. Wiehler J., von Hummel J., and Steipe B. Mutants of Discosoma red fluorescent protein with a GFP-like chromophore. // FEBS Lett. 2001. V. 487. P. 384-389

101. Wishart D.S., Bigam C.G., Yao J., Abildgaard F., Dyson H.J., Oldfeld E., Markley J.L., Sykes B.D. 'H, 13C,and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. // J.Biomol. NMR 1995. V. 6. P. 135-140.

102. Wolinski K., Hinton J.F., Pulay P. Efficient implementation of the gauge-independent atomic orbital method for NMR chemical shift calculations. // J. Am. Chem. Soc. 1990. V. 112. P. 82518260.

103. Wuthrich, K. NMR of Proteins and Nucleic Acids // John Wiley Sons, New York. 1986.

104. Yampolsky I.V., Remington J., Martynov V.I., Potapov V.K., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. //Biochemistry 2005. V. 44. P. 5788-5793.

105. Yang, F., Moss, L., and Phillips G. The molecular structure of green fluoresce nt protein. // Nat. Biotechnol. 1996 V.14. P. 1246-1251.

106. Yanushevich Y.G., Staroverov D.B., Savitsky A.P., Fradkov A.F., Gurskaya N.G., Bulina M.E., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. A strategy for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluorescent proteins. // FEBS Lett. 2002. V. 511. P. 11-14.

107. Yarbrough D., Wachter R.M., Kallio K., Matz M.V., Remington S.J. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. V. 98. P. 462-467.