Лазерная флуориметрия ансамблей локализованных донорно-акцепторных пар тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

003 169132

На правах рукописи

БАНИШЕВ Александр Александрович

ЛАЗЕРНАЯ ФЛУОРИМЕТРИЯ АНСАМБЛЕЙ ЛОКАЛИЗОВАННЫХ ДОНОРНО-АКЦЕПТОРНЫХ ПАР (НА ПРИМЕРЕ БЕЛКОВ)

Специальность 01 04 21 - Лазерная физика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 5 К^И ®

Москва- 2008

003169132

Работа выполнена на кафедре квантовой электроники физического факультета Московского государственного университета имени М В. Ломоносова

Научный руководитель. доктор физико-математических наук,

профессор Фадеев Виктор Владимирович

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук,

профессор Саркисов Олег Михайлович

доктор физико-математических наук, доцент Чикишев Андрей Юрьевич

Ведущая организация- Институт спектроскопии РАН

Защита состоится " 21 " мая 2008 года в \г за часов на заседании диссертационного совета Д501.001 31 в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу 119991, ГСП-1, г Москва, Ленинские горы, МГУ, ул Академика Хохлова, д 1, корпус нелинейной оптики, аудитория им С.А Ахматова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ

Автореферат разослан " \ " апреля 2008 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Флуоресцентная спектроскопия (флуориметрия) широко используется в исследованиях сложных органических соединений (красителей, белков, фотосинтезирующих организмов, нефтяных углеводородов и т.д.). Однако традиционные (линейные) методы флуоресцентной спектроскопии обладают ограниченными информационными возможностями в анализе флуоресцирующих объектов из-за низкой избирательности (полосы флуоресценции большинства органических соединений при комнатной температуре широкие и бесструктурные), поэтому данных, получаемых этими методами, зачастую недостаточно для понимания структурной организации и диагностики сложного органического соединения (СОС) Задача диагностики СОС заметно усложняется, если макромолекула СОС содержит более одного флуорофора

Интересным и важным для практического применения подклассом многофлуорофорных систем являются молекулярные объекты с локализованной донорно-акцепторной (ЛДА) парой - макромолекулы, содержащие единичную пару флуорофоров, между которыми возможен перенос энергии возбуждения. Объекты подобного рода играют большую роль в получении информации о внутреннем состоянии макромолекул СОС: их пространственной организации, размерах, состоянии микроокружения и т.д, а также изменении этих характеристик при различных внешних воздействиях В частности, искусственно созданные системы, состоящие из пары красителей (меток), закрепленных на концах исследуемой молекулы СОС, лежат в основе так называемой «спектроскопической линейки», используемой для измерения расстояний в молекулах, и, как следствие, для наблюдения изменения конформаций, например, в белках, ДНК, полимерах. К объектам с ЛДА парой можно также отнести искусственно синтезированные бифлуорофорные красители.

Особый интерес представляют природные объекты, в которых ЛДА парами являются их собственные флуорофоры В этом случае не возникает проблем, свойственных искусственно созданным донорно-акцепторным (ДА) парам, неизменность структуры исследуемой молекулы при введении меток, стабильность комплекса молекула-метка и т.д К числу таких объектов относятся многие типы белков Их удобно использовать в качестве модельных объектов, содержащих локализованную пару флуорофоров Но белки представляют и самостоятельный интерес как неотъемлемые компоненты живых систем, обладающие к тому же свойством флуоресцировать, что открывает возможность использования белков в качестве индикаторов процессов в живых системах

При анализе белковой флуоресценции ограничения традиционной флуориметрии становятся особенно ощутимыми, тк флуоресценция белков может зависеть сразу от несколько факторов. Более того, белковая молекула часто изначально содержит несколько флуоресцирующих (и/или

поглощающих, но не флуоресцирующих) центров, а препарат белка (ансамбль молекул) представляет собой смесь нескольких, спектрально неидентичных, подансамблей молекул белка. Это приводит к тому, что получаемые традиционными флуоресцентными методами данные сложны для однозначной интерпретации и позволяют сделать, в основном, лишь качественные выводы о внутреннем состоянии объекта. Поэтому задача получения количественной информации in vivo, без каких-либо препаративных воздействий на объект, в ряде случаев не может быть решена методами классической флуориметрии

Возможности флуоресцентного анализа СОС значительно расширяются с применением лазерных методов, которые в дополнение к традиционным параметрам, описывающим форму и положение полос флуоресценции, позволяют определять молекулярные фотофизические параметры флуорофоров (время жизни, сечение поглощения, скорость межмолекулярного переноса энергии и др.) в условиях дефицита априорной информации, обязательной в классических методах Эти параметры могут быть использованы в качестве диагностических признаков.

Разработка новых эффективных подходов к исследованию свойств многофлуорофорных объектов и методов их диагностики в условиях окружающей среды является актуальной фундаментальной и прикладной задачей Разрабатываемые применительно к белкам инструменты необходимы в различных биологических и медицинских исследованиях и в перспективе, по-видимому, могут найти свои применения в практической медицине.

Цель работы

Целью работы является развитие новых подходов, которые открываются с применением к природным ансамблям с ЛДА парами лазерной флуориметрии -нелинейной флуориметрии (флуориметрии насыщения) и кинетической флуориметрии в нано- и субнаносекундном диапазонах.

В качестве объектов исследования были выбраны- белок бычий сывороточный альбумин (БСА), в каждой из молекул которого содержится пара природных флуорофоров - триптофановых остатков, и флуоресцентный белок mRFPl (monomeric Red Fluorescent Protein), в ансамбле молекул которого присутствуют три подансамбля ЛДА пар Предварительно методами лазерной флуориметрии были исследованы однофлуорофорные природные объекты, триптофан в воде и белок сывороточный альбумин человека ((САЧ) каждая молекула которого содержит один триптофановый остаток)

В диссертационной работе были поставлены следующие задачи: 1. Построить модель, описывающую флуоресцентный отклик ансамблей ЛДА пар при их импульсном лазерном возбуждении.

2. Разработать основанный на совместном применении нелинейной и кинетической флуориметрии метод определения фотофизических параметров флуорофоров в ЛДА парах

3. Апробировать методы лазерной флуориметрии на однофлуорофорных объектах и получить фотофизические параметры их флуорофоров

4. Провести экспериментальную проверку построенной модели и разработанного метода на примере природного моноансамбля с ЛДА парой (двухтриптофановом белке - БСА): получить кривые насыщения и кинетики флуоресценции, определить из них индивидуальные фотофизические параметры донора, акцептора и скорости переноса энергии между ними (с возбужденной молекулы донора как на невозбужденную, так и на возбужденную молекулу акцептора)

5 Провести экспериментальную проверку построенной модели и разработанного метода на примере природного объекта (флуоресцентного белка), ансамбль молекул которого является совокупностью нескольких (трех) подансамблей с ЛДА парой: получить кривые насыщения флуоресценции, определить долю каждого подансамбля в общем ансамбле, определить индивидуальные фотофизические параметры донора, акцептора и скорости переноса энергии в локализованной паре для каждого подансамбля.

Научная новизна работы

Предложена модель фотофизических процессов в молекулярных объектах с ЛДА парой, адекватно описывающая флуоресцентный отклик флуорофоров при возбуждении импульсами лазерного излучения Введено понятие коллективных состояний ЛДА пары Предложена модель, описывающая кинетику населенностей этих состояний и позволяющая рассчитать кривые насыщения и кинетики флуоресценции ансамбля ЛДА пар

Впервые совместно реализуемыми на одном лазерном спектрометре методами наносекундной кинетической и нелинейной флуориметрии определены значения индивидуальных фотофизических параметров флуорофоров белков тЕ1РР1, бычьего сывороточного альбумина и сывороточного альбумина человека. Для первых двух, на основе предложенной модели, впервые определена константа переноса энергии между флуорофорами. Для тЯРР1 определены парциальные концентрации постгрансляционных форм белка

Научная и практическая значимость

Предложенная методика определения фотофизических параметров, в частности, скорости переноса энергии в природных системах с ЛДА парами открывает новые возможности использования их в качестве сенсоров в живых организмах Определение индивидуальных фотофизических параметров молекул каждого из подансамблей флуоресцентных белков может быть

применено для контроля свойств получаемых флуоресцентных белков. Развитый подход, основанный на измерении фотофизических параметров флуорофоров белков т vivo, может применяться для изучения процессов в живых системах, а значения фотофизических параметров, полученные для конкретных объектов, использованных в работе - для диагностики конкретных биологических систем, содержащих эти белки.

Положения, выносимые на защиту

1 Совместное применение наносекундной кинетической и нелинейной лазерной флуориметрии позволяет одновременно определять значения всех основных фотофизических параметров молекул триптофана в воде (сечения поглощения в основном и возбужденном синглетном состояниях, время жизни возбужденного состояния; сумма скоростей интеркомбинационной конверсии и спонтанной ионизации из возбужденного синглетного состояния) и триптофана в однофлуорофорном белке сывороточный альбумин человека (сечение поглощения, время жизни возбужденного состояния, скорость интеркомбинационной конверсии)

2. Разработанная модель коллективных состояний локализованной донорно-акцепторной (ЛДА) пары позволяет описать флуоресцентный отклик ансамбля ЛДА пар при лазерном возбуждении.

3. Разработанным методом, использующим нелинейную и кинетическую лазерную флуориметрию, по предложенной модели коллективных состояний ЛДА пары, могут быть определены значения индивидуальных фотофизических параметров ее флуорофоров, в частности, значения фотофизических параметров (сечения поглощения и времена жизни донора и акцептора пары; скорость переноса энергии с возбужденного донора на невозбужденный и возбужденный акцептор) флуорофоров белков тИГЛ и бычий сывороточный альбумин, которые являются представителями природных объектов с ЛДА парой. Для белка тМЛ может быть определена доля молекул каждого подансамбля в общей смеси трех типов ЛДА пар.

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на следующих конференциях: IV Всероссийская конференция "Физические проблемы экологии (Экологическая физика)" (Москва, июнь, 2004), Международная конференция "Opto-Ireland 2005" (Дублин, апрель, 2005); IV Международная конференция молодых ученых и специалистов "0птика-2005" (Санкт-Питербург, октябрь, 2005); II Троицкая конференция. Медицинская физика и инновации в медицине (Троицк, май, 2006); Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2006" (Москва, апрель, 2006),

Международная конференция "Lasers, Applications and Technologies (LAT 2007)" (Минск, май-июнь, 2007), Международная конференция "Laser Applications in Life Sciences (LALS 2007)" (Москва, июнь, 2007)

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 8 статей, 4 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК России, и 6 тезисов докладов на конференциях Список работ приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы. Объем диссертации 125 страниц, в том числе 49 рисунков, 6 таблиц Список литературы включает 130 наименований

Личный вклад автора

Все результаты в диссертации получены автором лично, либо при его определяющем участии.

Исследования возможностей применения разработанных методов в биотехнологии флуоресцентных белков выполнены совместно с П В.Вржещем и Е.П.Вржещем, представляющими Международный биотехнологический центр МГУ им. М В Ломоносова

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обосновывается актуальность темы диссертации, формулируются цель и задачи исследований, приводятся положения, выносимые на защиту, кратко излагается содержание диссертации

В первой главе дан анализ литературы, посвященной применению флуоресцентной спектроскопии для исследования и диагностики ансамблей ЛДА пар Особое внимание уделено флуориметрии белков как, по-видимому, наиболее интересного и важного в практическом плане представителя такого рода систем. По этой причине в обзор включена информация и о структуре белков, макромолекулы которых содержат ЛДА пары и которые выбраны в работе в качестве объектов.

В разделе 1 1 описываются основные типы (искусственно созданные и природные), свойства и области применения объектов, содержащих ЛДА пару.

Впп 1.11, 1.12 приводятся примеры объектов с ЛДА парой (п 111), рассматриваются примеры изучения структурной организации органических соединений с использованием искусственных ЛДА пар, отмечаются основные трудности, которые возникают при этом (п. 1.1.2)

В п 1 1.3 анализируются перспективы использования природных систем с ЛДА парой на основе белков как индикаторов процессов в живых системах.

В разделе 1 2 представлены общие сведения о собственной флуоресценции белков. Даны сведения о флуоресцентных свойствах и

структуре белков сывороточный альбумин человека (САЧ) и бычий сывороточный альбумин (БСА)

В п 121 рассмотрены основные спектральные свойства природных флуорофоров белков (аминокислот триптофан, тирозин и фенилаланин) в водном растворе и в структуре белковой матрицы. Особое внимание уделено параметрам триптофановой флуоресценции как наиболее информативной при изучении свойств белковых молекул методами флуориметрии.

В п 1.2 2 даны сведения о строении белков САЧ и БСА Представлена модель трехмерной структуры молекулы этих белков (модель "сердца") Приведена информация о параметрах флуоресценции этих белков, которая определяется одним триптофановым остатком для САЧ (Тгр214) и двумя - для БСА (Тгр134 и Тгр212) Отмечено, что белок БСА является представителем широкого класса объектов - природных макромолекул, содержащих ЛДА пару флуорофоров (два триптофановых остатка)

В п. 1.2.3 рассмотрены фотохимические процессы, которые возникают в молекулах свободного триптофана и триптофан-содержащих белков при воздействии на них УФ света; описаны механизмы фотоионизации (одно- и двухступенчатой) и фотодеградации, свойственные этим объектам.

В разделе 1.3 представлены сведения об особом классе белков -флуоресцентных белках (ФБ), представители которого обладают следующими отличительными свойствами:

1. в отличие от других известных природных макромолекул данные белки формируют внутренний хромофор (особый участок белковой цепи), без каких бы то ни было вспомогательных кофакторов и ферментов (кроме молекулярного кислорода);

2. полосы поглощения и флуоресценции хромофора этих белков лежат в видимой области спектра.

Данные белки являются в настоящее время популярными флуоресцентными маркерами для работ in vivo.

В п. 13 1 описаны спектральные свойства и трехмерная структура флуоресцентных белков, на примере зеленного (GFP, максимум флуоресценции на 508 нм) и красного (DsRed, максимум флуоресценции на 583 нм) флуоресцентного белка Указано, что каждая мономерная субъединица молекулы этих белков (молекула белка не являются мономером) содержит ЛДА пару, триптофан в матрице белка и хромофор белка.

В п. 1.3 2 уделено внимание процессу формирования хромофора (созреванию) флуоресцентных белков (на примере белков GFP и DsRed) Процесс созревания ФБ - это сложный процесс, который проходит в несколько стадий На некоторых стадиях созревания ФБ образуются промежуточные интермедиаты (формы) белка, способные сохранять свое присутствие и в конечном препарате белка. A priori препарат ФБ представляют собой смесь нескольких неидентичных и как следствие, различающихся спектральными свойствами форм белка, т.е. ансамбль молекул ФБ является совокупностью нескольких неэквивалентных подансамблей молекул, содержащих ЛДА пару

В п. 1.3.3 даны сведения о спектральных свойствах красного (максимум флуоресценции на 607 нм) ФБ mRFPl, который является улучшенным аналогом (мутантом) белка DsRed, не проявляющим склонности к олигомеризации и тетрамеризации Отмечено, что в настоящее время ведутся работы по получению ФБ (в том числе и на основе белка mRFPl) с улучшенными свойствами

Вторая глава посвящена созданию модели, описывающей кинетику населенностей коллективных состояний ЛДА пар и позволяющей рассчитывать флуоресцентный отклик ансамбля локализованных ДА пар при его лазерном возбуждении

В разделе 2.1 на основе литературных данных приведена необходимая для изложения оригинальных результатов информация о флуоресценции СОС Рассмотрена модель формирования флуоресцентного отклика СОС для случая двухкомпонентной смеси однофлуорофорных молекул СОС такой, что между компонентами возможен межмолекулярный перенос энергии Рассмотрена модель формирования флуоресцентного отклика в случае слабоконцентрированного однофлуорофорного раствора СОС со спецификой, свойственной водному раствору триптофана Выписаны системы кинетических уравнений для населенностей энергетических уровней СОС, которые используются в гл. 3.

В разделе 2 2 разрабатывается модель, описывающая флуоресцентный отклик ансамбля ЛДА пар (в предположении, что возбуждение происходит наносекундными импульсами лазерного излучения) с учетом переноса энергии с возбужденного донора на: а) невозбужденный акцептор, б) возбужденный акцептор (синглет-синглетная аннигиляция)

Введем обозначения Sod, Sm - основное и первое возбужденное синглетные состояния донора, Soa, S]A - синглетные состояния акцептора. Молекулы СОС, содержащие ЛДА пару, под действием излучения могут находиться в одном из четырех состояний

Состояние 1 - донор и акцептор молекулы находятся в состоянии Sod и Soa - концентрацию таких молекул будем обозначать л, = п, (t,r);

Состояние 2 - донор молекулы находится в состоянии Sid, з ее акцептор в Soa - концентрацию таких молекул будем обозначать n2 = n2 (t,r);

Состояние 3 - донор молекулы находится в состоянии Sods ^ ££ акцептор в Sia - концентрацию таких молекул будем обозначать n3 sn3(t,r);

Состояние 4 - донор и акцептор молекулы находятся в состоянии Sid и Sia-концентрацию таких молекул будем обозначать n4 =n4(t,r);

Определенные таким образом состояния будем называть коллективными состояниями ЛДА пары Динамика изменения концентраций приведенных выше четырех коллективных состояний ЛДА пары математически описывается следующей системой кинетических уравнений:

от т3 т3

^ = -Р(1,Г) • стА • п2 - % - К0А • п2 + Г) ■ ств ■ п, + ^

(71 Т3 Т3

п, п4

дп

а

= -Р(1,Т) • стп • п3 - ^ + Р(и) • Стд • п, + 3 + К0А • п2 + К88 • п4

О)

т3 х3

™4 _ г?/* „ П4 П4

п, +п, +п3 +п4 = п0,

: г) ■ Стд • п2 + Р(1, Г)-о„-Пз—-4--К

где символы О и А относятся к донору и акцептору соответственно; По - полная концентрация молекул СОС; ст0 - сечение поглощения донора, стА - сечение поглощения акцептора, соответствующие переходу 80—>8ь КИА - скорость переноса энергии с возбужденного донора на невозбужденный акцептор; К38 -скорость переноса энергии с возбужденного донора на возбужденный акцептор (синглет-синглетная аннигиляция); Тз - время жизни флуорофора в возбужденном состоянии; Р(1:,Т) - плотность потока фотонов возбуждающего излучения в момент времени I в точке с координатой Г = {х, у} в плоскости, перпендикулярной направлению падающего излучения (зависимостью параметров от координаты х вдоль направления пучка пренебрегаем, т.е. используем приближение оптически тонкого слоя).

Описанные четыре возможные коллективные состояния можно проиллюстрировать следующими энергетическими диаграммами, рис. 1а.

Состояние 1 Состояние 2 Состояние 3 Состояние 4

а)

вгд Эта

б)

Рис. 1. а) коллективные состояния локализованной донорно-акцепторной пары (без учета синглет-синглетной аннигиляции); б) процесс синглет-синглетной аннигиляция в модели коллективных состояний (переход > происходит за времена порядка пикосекунд).

Перенос энергии по механизму синглет-синглетной аннигиляции в предложенной модели четырех коллективных состояний схематически изображен на рис 16 Такой процесс возможен в ЛДА парах, которые находятся в состоянии 4. После элементарного акта синглет-синглетной аннигиляции молекула из состояния 4 переходит в состояние 3.

В разделе 2.3 рассматриваются теоретические основы методов нелинейной и кинетической лазерной флуориметрии СОС при их возбуждении наносекундными лазерными импульсами. Приводятся алгоритмы решения обратных задач кинетической и нелинейной флуориметрии, результатом применения которых является определение молекулярных фотофизических параметров флуорофоров СОС (сечения поглощения, скорости внутри- и межмолекулярного переноса энергии и др) из кривых насыщения флуоресценции (<D'1(F)=NRtf/NFi, где N^f - реперный сигнал; Nn - сигнал флуоресценции) и кинетических кривых (I(t<jei), где I - норм, сигнал флуоресценции; t^i - задержка строба приемника относительно лазерного импульса) Указано, что данные методы позволяют производить диагностику белковых молекул (в том числе содержащих ЛДА пару) в условиях дефицита априорной информации, обязательной в традиционных методах

Третья глава посвящена экспериментальному определению фотофизических параметров природных макромолекул, содержащих локализованную донорно-акцепторную пару, методами лазерной флуориметрии. В качестве объектов исследования были выбраны белок бычий сывороточный альбумин и флуоресцентный белок mRFPl. Каждая молекула этих белков содержит ЛДА пару, причем ансамбль последнего представляет собой смесь нескольких неидентичных подансамблей молекул, содержащих ЛДА пару Предварительно методы лазерной флуориметрии были апробированы на однофлуорофорных природных соединениях: триптофане в водном растворе и белке сывороточный альбумин человека.

В разделе 3.1 описывается универсальный лазерный флуориметр/ флуорометр (п. 3.1.1), позволяющий реапизовывать нелинейную и кинетическую флуориметрию. В отдельных пунктах описаны основные блоки и элементы установки: система лазерного возбуждения на основе импульсного HAT:Nd лазера (1.06 мкм, частота следования импульсов 10 Гц) с набором нелинейных кристаллов для получения гармоник основного излучения (532, 355 и 266 нм); система регистрации, на основе стробируемого многоканального анализатора спектра с УФ CCD камерой (длительность строба - 10 не, шаг перемещения - 2,5 не). Приведены основные характеристики лазерного излучения, показано, что распределения излучения в поперечном сечении пучка и во времени хорошо аппроксимируются гауссовыми распределениями. Описана (п. 3.12) дополнительная аппаратура, которая использовалась в работе, пикосекундный лазерный флуорометр, спектрофотометр и спектрофлуориметр.

Раздел 3.2 посвящен определению фотофизических параметров молекул триптофана в слабоконцентрированном водном растворе при возбуждении импульсами лазерного излучения с длиной волны 266 нм.

В п. 3.2.1 измеряются и анализируются спектры поглощения и флуоресценции триптофана, делается вывод о необходимости учета двухступенчатых процессов при обработке кинетических кривых и кривых насыщения

В п 3 2 2 измеряются и анализируются кривые насыщения и кинетики раствора триптофана, из которых (решением обратной задачи по модели, представленной в разделе 2.1) определяются значения фотофизических параметров молекул триптофана:

а) время жизни возбужденного состояния молекулы триптофана (в моноэкспоненциальном приближении, при низком уровне возбуждения) Тз=(2.8±1) не;

б) сечение поглощения молекулы триптофана ст=(1 6±0 3)х 10"17 см2,

в) суммарная скорость интеркомбинационной конверсии и ионизации из первого возбужденного синглетного состояния 81 (Кз2+К31)=(6±2)х 107 с'1, которой соответствует сумма квантовых выходов в триплет и ионизации (Лт+Л.)=(0 17+0 05),

г) суммарное сечение обратимого и необратимого фотопревращения при поглощении возбуждающего излучения (266 нм) молекулами в возбужденном состоянии Б! (ст31+стР]0=(2 2+0 7)х10"18 см2.

Таким образом, видно, что совместное применение нелинейной и кинетической флуориметрии позволяет производить диагностику сложных органических соединений, фотофизические процессы в которых описываются значительным числом (в данном случае четырьмя) параметров

Раздел 3 3 посвящен определению фотофизических параметров триптофан-содержащих белков, таких как сывороточный альбумин человека и бычий сывороточный альбумин в водном растворе, методами лазерной флуориметрии. Последний является представителем широкого класса объектов - макромолекул, содержащих локализованную донорно-акцепторную пару

В п. 3 3.1 производится измерение и анализ спектров поглощения и флуоресценции этих белков Из анализа спектров поглощения делается вывод о том, что в общем случае, не корректно сечению поглощения триптофанового остатка в белке приписывать значение сечения поглощения свободного триптофана в растворе, считая, что этот параметр является консервативным и слабо зависит от его окружения Из анализа спектров флуоресценции делается вывод, что в БСА два флуорофора (триптофаны Тгр134 и Тгр212) находятся в разном локальном окружении

В п. 3.3 2, на основе материала, изложенного в п. 3 3 1 и литературном обзоре, делается вывод, что в ЛДА паре белка БСА донором энергии является Тгр212, а акцептором Тгр134. Далее, измеряются и анализируются кинетические кривые и кривые насыщения флуоресценции белков САЧ и БСА, из которых путем решения обратной задачи нелинейной и кинетической флуориметрии определяются фотофизические параметры флуорофора САЧ и флуорофоров БСА. При обработке экспериментальных кривых использовалась трехуровневая модель формирования флуоресцентного отклика,

представленная в разделе 2.1 (для САЧ), и модель коллективных состояний (1) (для БСА). При проведении экспериментов с белком БСА регистрация флуоресценции производилась на длинах волн 310 нм (при построении кинетических кривых и кривых насыщения флуоресценции донора) и 390 нм (при построении аналогичных кривых для акцептора). Измеренные кривые насыщения и кинетики для белка БСА представлены на рис 2. Определенные значения фотофизических параметров флуорофоров белков приведены в таблице 1.

1 о

00^

2 4

Р,(10"см'с')

5 10 Задержка, не

Рис. 2. Кривые насыщения (слева) и кинетические кривые (справа) для белка БСА, квадраты - длина волны регистрации 390 нм, круги - 310 нм, линии -теоретические кривые, построенные по модели (1) для параметров, приведенных в таблице 1.

Таблица 1 Фотофизические параметры флуорофоров белков БСА и САЧ

Белок Параметры* Тгр214

САЧ т3,нс ст, 10"17 см2 К32, с1 4 5±1 1.3+0 2 <10-7

Тгр134 Тгр212

БСА Т3, НС 6.2±1 5±1

ст, 10"17 см2 3±0 4 1+0 2

Кса, с" <10-'

к^, С"1 <10"

в таблице •

- т% - время жизни возбужденного состояния флуорофора, -а - сечение поглощения флуорофора,

- Кол и К® - скорость переноса энергии с возбужденного донора (Тгр212) на невозбужденный и возбужденный акцептор (Ггр134), соответственно

В раздел 3.4 описан основанный на лазерной флуориметрии (совместном применении нелинейной и кинетической флуориметрии) комплексный метод

определения индивидуальных фотофизических параметров флуорофоров подансамблей ЛДА пар флуоресцентных белков. Для белка тЫФ1 как представителя природных объектов с ЛДА парами установлена схема фотофизических процессов и определены1 доля молекул каждого подансамбля ЛДА пар в конечном препарате белка, фотофизические параметры ЛДА пар.

В п 3 4 1 измеряются и анализируются спектры поглощения, флуоресценции и возбуждения флуоресценции ансамбля молекул флуоресцентного белка тКРР1 Показано, что возбуждение раствора белка тЫЛ УФ светом (270 нм) приводит к появлению не только флуоресценции в УФ области (максимум 330 нм), которая соответствует флуоресценции триптофана белковой матрицы, но и флуоресценции в видимом диапазоне (максимум 607 нм) Таким образом, молекула белка тКРР1 представляет собой объект с ЛДА парой, донором возбуждения в которой является триптофан матрицы белка, а акцептором - хромофор белка, причем данные стационарной спектроскопии свидетельствуют о наличии эффективного переноса энергии внутри ЛДА пар.

Показано, что конечный препарат белка тЕРП - это ансамбль молекул с ЛДА парой, состоящий из трех подансамблей, молекулы которых условно обозначаются как И, й и В формы белка Действием внешних факторов (изменением кислотности раствора и облучением светом с длиной волны 488 нм (п. 3.4.2)) можно сократить количество форм белка до двух (Л и й или К. и В)

В п 3.4 3 разработан метод, основанный на совместном применении абсорбционной спектроскопии и наносекундной лазерной флуориметрии с возбуждением на длине волны 532 нм Метод позволил сформировать первый блок информации, описывающий фотофизические процессы в подансамблях ЛДА пар белка тИРР1, а именно, индивидуальные фотофизические параметры акцептора ЛДА пары (хромофора белка) в каждой из трех форм бежа1 сечение поглощения, квантовый выход в триплетное состояние (только для И. формы), квантовый выход флуоресценции (только для Я формы) и время затухания флуоресценции (только для Я формы). Помимо этого, определяется соотношение концентраций молекул трех подансамблей ЛДА пар в общем препарате белка

Разработанный метод имеет практическое значение как метод контроля направленного мутагенеза тКРР1 и поиска мутантов белка с необходимыми для конкретных применений оптическими свойствами. Информация, получаемая методом, также необходима для определения остальных фотофизических параметров (п 3.4 5), фигурирующих в предложенной модели коллективных состояний (1).

В п. 3 4.4 изложенный в п. 3 4 3 метод применен для определения влияния на соотношение концентраций и индивидуальные фотофизические параметры хромофора белка тЮП точечных мутаций по 66 положению-белки шНРРУдббБ и тКРР1/С)66С. Показано, что индивидуальные значения коэффициентов экстинкции хромофоров коррелируют с объемами боковых радикалов по 66 положению (коэффициент корреляции >0.9).

В п. 3.4.5 развит метод, формирующий второй блок информации, описывающей фотофизическаие процессы в подансамблях ЛДА пар белка тЮ?Р1, а именно, скорости переноса энергии с донора на акцептор в ЛДА паре каждой из трех форм бежа и время внутрихромофорной релаксации донора (для Вив форм). Для этого разработанный в п. 3.4.3 метод был дополнен измерениями кривых насыщения и кинетических кривых (с пикосекундным возбуждением) при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 266 нм. Регистрация флуоресценции при этом производилась в УФ (флуоресценция акцептора ЛДА пары, максимум на 330 нм) и видимой областях спектра (флуоресценция донора ЛДА пары, максимум на 607 нм). Для уменьшения числа одновременно присутствующих в растворе форм белка (для облегчения анализа данных лазерной флуориметрии) применялась процедура, предложенная в п.п. 3.4.2, 3.4 3. Полученные кривые насыщения изображены на рис. 3 (для случая раствора с К и В формами). Определенные фотофизические параметры представлены в таблице 2.

20

1 6-

- 12 ■0

08-

0.4

I »# « »"

Л ■'! Г"

Р. (10й см V)

Рис. 3. Кривые насыщения донора (круги) и акцептора (квадраты) в белке тЯРР1 для Ли В форм

Таблица 2. Значения фотофизических параметров ЛДА пар белка тЯГР1.

Параметр* Значение Значение Значение

параметра для К формы параметра для В формы параметра для в формы

сцАяг266), 10"16 см2 1±0.2

Ква.НРС1 3.7±0 7 7.8±1 2.5±0.7

Е 0 89 0.94 0.84

т3А, не 3±1 1 9+0 4 1 7+0.4

в таблице

- <Тц(Хех—2бб) - сечение поглощения донора на длине волны 266т;

- Коа и Е- скорость и эффективность переноса энергии с донора на акцептор,

- т/ - время жизни возбужденного состояния акцептора

В заключении сформулированы основные результаты работы.

1 Методом лазерной флуориметрии, использующим согласованно наносекундную кинетическую и нелинейную флуориметрию, одновременно определены значения фотофизических параметров молекул триптофана в воде- сечений поглощения в основном и возбужденном синглетном состояниях, времени жизни возбужденного состояния, суммы скоростей интеркомбинационной конверсии и спонтанной ионизации из возбужденного синглетного состояния. Определены значения фотофизических параметров триптофана в однофлуорофорном белке сывороточный альбумин человека: сечения поглощения, времени жизни возбужденного состояния, скорости интеркомбинационной конверсии.

2. На основе совместного применения абсорбционной спектроскопии, классической и нелинейной лазерной флуориметрии разработан метод определения индивидуальных фотофизических параметров (сечения поглощения, скорости интеркомбинационной конверсии, времени жизни возбужденного состояния) флуоресцирующего хромофора флуоресцентного белка тЮЛ и родственных ему флуоресцентных белков. Метод позволяет также определять долю флуоресцирующего хромофора в смеси хромопротеинов.

3. Введено понятие коллективных состояний локализованных донорно-акцепторных пар (ЛДА пар) Предложена модель, описывающая кинетику населенностей коллективных состояний ЛДА пар и позволяющая рассчитывать кривые насыщения и кинетики флуоресценции ансамблей ЛДА пар при лазерном возбуждении

4 Предложена методика определения фотофизических параметров флуорофоров в ЛДА паре, основанная на совместном применении нелинейной и кинетической лазерной флуориметрии Методика применена к растворам двухтриптофанового белка бычьего сывороточного альбумина и флуоресцентного белка поШЛ Установлена схема фотофизических процессов в них как в представителях систем с локализованными донорно-акцепторными парами. Определены значения индивидуальных фотофизических параметров флуорофоров (хромофоров) указанных белков-сечения поглощения, времени жизни возбужденного состояния, скорости внутримолекулярного переноса энергии.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Банишев А.А., Маслов Д.В., Фадеев В.В Наносекундный лазерный флуорометр // Приборы и техника эксперимента, 2006, №3, с. 143-148.

2. Банишев А.А., Вржещ Е П, Дмитриенко Д.В., Друца В Л, Маслов Д В , Пащенко В.З., Ширшин Е.А., Вржещ П.В., Фадеев В.В. Метод определения индивидуальных оптических характеристик посттрансляционных флуоресцентных форм флуоресцентных белков с использованием нелинейной флуориметрии. // Биофизика, 2007, т. 52, № 5, с 792-798.

3. Банишев А А., Ширшин Е.А, Фадеев В В Определение фотофизических параметров молекул триптофана методами лазерной флуориметрии // Квантовая электроника, 2008, т. 38, №1, с. 77-81.

4. Банишев А. А, Маслов Д В , Фадеев В В Определение квантового выхода синглет-триплетной конверсии в молекулах сложных органических соединений методом нелинейной лазерной флуориметрии // Вестник Московского Университета. Серия 3. Физика, астрономия, 2008, №3, с.69-71

5. Банишев А А, Маслов Д.В., Мешканцов А.А., Остроумов Е Е , Фадеев В В Кинетическая флуориметрия природных вод. // Сб. статей «Физические проблемы экологии (экологическая физика)», М.. МАКСПресс, 2005, №12, с.138-147

6. Ostroumov Е Е, Bamshev А А , Fadeev V.V., Maslov D.V Determination of photophysical parameters of organic compounds and their complexes by methods of laser fluonmetry. // Conference on Spectroscopy, Dublin, Ireland, 4-6 April, 2005, Conf. Digest, p 80

7 Fadeev V.V, Dolenko T.A., Banishev A.A., Litvinov P.N, Maslov DV, Ostroumov E E. Matrix method m laser fluonmetry of organic compounds. // Proc. of SPIE, Opto-Ireland 2005. Optical Sensing and Spectroscopy, 2005, v 5826, p.44-55.

8. Банишев А А., Маслов Д.В., Литвинов П.Н. Определение фотофизических параметров сложных органических соединений методом лазерной флуориметрии // Труды четвертой международной конференции молодых ученых и специалистов "0птика-2005", Санкт-Петербург, Россия, 2005, с.306-307

9 Фадеев В В., Вржещ П.В., Маслов Д В., Банишев А А, Вржещ Е П., Дмитриенко ДВ., Ширшин Е.А. Флуоресцентные характеристики и молекулярные фотофизические параметры красного флуоресцентного белка mRFPl // Труды конференции «Альманах клинической медицины», издается МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва, 2006 Том XII, с. 42.

10 Ширшин Е.А., Банишев А.А, Вржещ Е П. Фотофизические параметры и механизмы флуоресценции белка // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-

2006»,секция "Физика", Москва, Россия, апрель 2006, Тезисы докладов, с 157.

11 Banishev А.А, Shirshm Е.А., Fadeev V.V. Non-linear fluonmetry of fluorescent proteins // Technical Digest of International Conference on Lasers, Applications and Technologies, Minsk, Belarus, May 28-June 1, p L06/II-4 (on CD-ROM) 2.00-7

12.Banishev A.A., Shirshin E.A., Fadeev V.V., Non-linear fluorimetry of fluorescent proteins. // Proc. of SPIE, International Conference on Lasers, Applications and Technologies, Minsk, Belarus, May 28-June 1, V 6733, p 6733 IB. 2 CO?

13.Banishev A.A., Shirshin E.A., Fadeev V V The investigation and laser control of a new class of biosensors - fluorescent proteins. // Technical Digest of International Conference on Laser Applications in Life Sciences (LALS 2007), Moscow, Russia, June 11-14, 2007, p TuL03P14 (on CD-ROM).

14 Банишев А.А., Загидуллин В Э., Пащенко В.З., Ширшин Е.А, Фадеев В.В. Лазерная флуориметрия белков // Сб статей «Физические проблемы экологии (экологическая физика)», М . МАКСПресс, 2007, №14, с.43-61.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 17 04 2008 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 1,0 Тираж 90 экз Заказ 178 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им MB Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Принятые сокращения.

Введение.

Глава I. Объекты с локализованными донорно-акцепторными (ЛДА) парами и их флуоресцентные свойства (обзор литературы).

Введение.

1.1 Некоторые объекты с ЛДА парой.

1.1.1 Основные типы объектов с ЛДА парой.

1.1.2 Применение искусственно созданных объектов с ЛДА парой.

1.1.3 Перспективы использования белков как объектов с ЛДА парой.

1.2 Собственная флуоресценция белковых молекул.

1.2.1 Общие сведения о собственной флуоресценции белков.

1.2.2 Структура и спектральные свойства сывороточного альбумина человека (однотриптофановый белок) и бычьего сывороточного альбумина (двухтриптофановый белок).

1.2.3 Фотохимические реакции триптофана и триптофан-содержащих белков.

1.3 Флуоресцентные белки.

1.3.1. Общие сведения о флуоресцентных белках (на примере зеленного - GFP и красного - DsRed флуоресцентного белка).

1.3.2 Посттрансляционные формы флуоресцентных белков.

1.3.3 Мономерный аналог белка DsRed - белок mRFPl. Получение новых мутантов mRFPl.

Глава II. Определение фотофизических параметров ЛДА пар сложных органических соединений (теория).

2.1 Модель фотофизических процессов в сложных органических соединениях.

2.2 Модель фотофизических процессов в ансамбле молекул с ЛДА парой.

2.3. Нелинейная и наносекундная кинетическая флуориметрия ЛДА пар.

Глава III. Определение фотофизических параметров флуорофоров/хромофоров в ЛДА парах (эксперимент).

3.1 Экспериментальная техника.

3.1.1 Наносекундный лазерный флуориметр/флорометр.

3.1.2 Классические спектральные измерения.

3.2 Определение фотофизических параметров триптофана в водном растворе.

3.2.1 Анализ спектров поглощения и флуоресценции.

3.2.2 Анализ кривых насыщения и кинетических кривых.

3.3 Определение фотофизических параметров триптофан-содержащих белков (на примере человеческого и бычьего сывороточного альбумина) в водном растворе

3.3.1 Анализ спектров поглощения и флуоресценции.

3.3.2 Анализ кинетических кривых и кривых насыщения.

3.4 Определение фотофизических параметров подансамблей ЛДА пар на примере белка mRFPl.

3.4.1 Анализ спектров поглощения, флуоресценции и возбуждения флуоресценции ансамбля молекул белка mRFPl.

3.4.2 Анализ воздействия лазерного излучения на ансамбль молекул белка mRFPl.

3.4.3 Определение концентраций и индивидуальных фотофизических параметров хромофора белка mRFPl.

3.4.4 Определение концентраций и фотофизических параметров флуоресцирующего хромофора белков mRFPl/066S и mRFPl/ОббС (мутанты белка mRFPl).

3.4.5 Перенос энергии в ЛДА парах подансамблей белка mRFPl.

Флуоресцентная спектроскопия (флуориметрия) широко используется в исследованиях сложных органических соединений (красителей, белков, фото синтезирующих организмов, нефтяных углеводородов и т.д.). Однако традиционные (линейные) методы флуоресцентной спектроскопии обладают ограниченными информационными возможностями в анализе флуоресцирующих объектов из-за низкой избирательности (полосы флуоресценции большинства органических соединений при комнатной температуре широкие и бесструктурные [1]), поэтому данных, получаемых этими методами, зачастую недостаточно для понимания структурной организации и диагностики сложного органического соединения (СОС). Задача диагностики СОС заметно усложняется, если макромолекула СОС содержит более одного флуорофора.

Интересным и важным для практического применения подклассом многофлуорофорных систем являются молекулярные объекты с локализованной донорно-акцепторной (ЛДА) парой - макромолекулы, содержащие единичную пару флуорофоров, между которыми возможен перенос энергии возбуждения. Объекты подобного рода играют большую роль в получении информации о внутреннем состоянии макромолекул СОС: их пространственной организации, размерах [2], состоянии микроокружения [1] и т.д., а также изменении этих характеристик при различных внешних воздействиях [3]. В частности, искусственно созданные системы, состоящие из пары красителей (меток), закрепленных на концах исследуемой молекулы СОС, лежат в основе так называемой «спектроскопической линейки» [4], используемой для измерения расстояний в молекулах, и, как следствие, для наблюдения изменения конформаций, например, в белках [5], ДНК [6], полимерах [7]. К объектам с ЛДА парой можно также отнести искусственно синтезированные бифлуорофорные красители [8].

Особый интерес представляют природные объекты, в которых ЛДА парами являются их собственные флуорофоры. В этом случае не возникает проблем, свойственных искусственно созданным донорно-акцепторным (ДА) парам: неизменность структуры исследуемой молекулы при введении меток, стабильность комплекса молекула-метка и т.д. К числу таких объектов относятся многие типы белков. Их удобно использовать в качестве модельных объектов, содержащих локализованную пару флуорофоров. Но белки представляют и самостоятельный интерес как неотъемлемые компоненты живых систем, обладающие к тому же свойством флуоресцировать, что открывает возможность использования белков в качестве индикаторов процессов в живых системах.

При анализе белковой флуоресценции ограничения традиционной флуориметрии становятся особенно ощутимыми, т.к. флуоресценция белков может зависеть сразу от несколько факторов. Более того, белковая молекула часто изначально содержит несколько флуоресцирующих (и/или поглощающих, но не флуоресцирующих) центров, а препарат белка (ансамбль молекул) представляет собой смесь нескольких, спектрально неидентичных, подансамблей молекул белка [10,11]. Это приводит к тому, что получаемые традиционными флуоресцентными методами данные сложны для однозначной интерпретации и позволяют сделать, в основном, лишь качественные выводы о внутреннем состоянии объекта. Поэтому задача получения количественной информации in vivo, без каких-либо препаративных воздействий на объект, в ряде случаев не может быть решена методами классической флуориметрии.

Возможности флуоресцентного анализа СОС значительно расширяются с применением лазерных методов, которые в дополнение к традиционным параметрам, описывающим форму и положение полос флуоресценции, позволяют определять молекулярные фотофизические параметры флуорофоров (время жизни, сечение поглощения, скорость межмолекулярного переноса энергии и др.) в условиях дефицита априорной информации, обязательной в классических методах [12,13]. Эти параметры могут быть использованы в качестве диагностических признаков.

Разработка новых эффективных подходов к исследованию свойств многофлуорофорных объектов и методов их диагностики в условиях окружающей среды является актуальной фундаментальной и прикладной задачей. Разрабатываемые применительно к белкам инструменты необходимы в различных биологических и медицинских исследованиях и в перспективе, по-видимому, могут найти свои применения в практической медицине.

Целью работы является развитие новых подходов, которые открываются с применением к природным ансамблям с ЛДА парами лазерной флуориметрии — нелинейной флуориметрии (флуориметрии насыщения) и кинетической флуориметрии в нано- и субнаносекундном диапазонах.

В качестве объектов исследования были выбраны: белок бычий сывороточный альбумин (БСА), в каждой из молекул которого содержится пара природных флуорофоров - триптофановых остатков, и флуоресцентный белок mRFP 1 (monomeric Red Fluorescent Protein), в ансамбле молекул которого присутствуют три подансамбля ЛДА пар. Предварительно методами лазерной флуориметрии были исследованы однофлуорофорные природные объекты: триптофан в воде и белок сывороточный альбумин человека ((САЧ) каждая молекула которого содержит один триптофановый остаток).

В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

1. Построить модель, описывающую флуоресцентный отклик ансамблей ЛДА пар при их импульсном лазерном возбуждении.

2. Разработать основанный на совместном применении нелинейной и кинетической флуориметрии метод определения фотофизических параметров флуорофоров в ЛДА парах.

3. Апробировать методы лазерной флуориметрии на однофлуорофорных объектах и получить фотофизические параметры их флуорофоров.

4. Провести экспериментальную проверку построенной модели и разработанного метода на примере природного моноансамбля с ЛДА парой (двухтриптофановом белке — БСА): получить кривые насыщения и кинетики флуоресценции, определить из них индивидуальные фотофизические параметры донора, акцептора и скорости переноса энергии между ними (с возбужденной молекулы донора как па невозбужденную, так и на возбужденную молекулу акцептора).

5. Провести экспериментальную проверку построенной модели и разработанного метода па примере природного объекта (флуоресцентного белка), ансамбль молекул которого является совокупностью нескольких (трех) подансамблей с ЛДА парой: получить кривые насыщения флуоресценции, определить долю каждого подансамбля в общем ансамбле, определить индивидуальные фотофизические параметры донора, акцептора и скорости переноса энергии в локализованной паре для каждого подансамбля.

Содержание диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы.

Заключение

В работе получены следующие основные результаты:

1. Методом лазерной флуориметрии, использующим согласованно наносекундную кинетическую и нелинейную флуориметрию, одновременно определены значения фотофизических параметров молекул триптофана в воде: сечений поглощения в основном и возбужденном синглетном состояниях, времени жизни возбужденного-состояния, суммы скоростей интеркомбинационной конверсии и спонтанной ионизации из возбужденного синглетного состояния. Определены значения фотофизических параметров триптофана в однофлуорофорном белке сывороточный альбумин человека: сечения поглощения, времени жизни возбужденного состояния, скорости интеркомбинационной конверсии.

2. На основе совместного применения абсорбционной спектроскопии, классической и нелинейной лазерной флуориметрии разработан метод определения индивидуальных фотофизических параметров (сечения поглощения, скорости интеркомбинационной конверсии, времени жизни возбужденного состояния) флуоресцирующего хромофора флуоресцентного белка mRFPl и родственных ему флуоресцентных белков. Метод позволяет также определять долю флуоресцирующего хромофора в смеси хромопротеинов.

3. Введено понятие коллективных состояний локализованных донорно-акцепторных пар (ЛДА пар). Предложена модель, описывающая кинетику населенностей коллективных состояний ЛДА пар и позволяющая рассчитывать кривые насыщения и кинетики флуоресценции ансамблей ЛДА пар при лазерном возбуждении.

4. Предложена методика определения фотофизических параметров флуорофоров в ЛДА паре, основанная на совместном применении нелинейной и кинетической лазерной флуориметрии. Методика применена к растворам двухтриптофанового белка бычьего сывороточного альбумина и флуоресцентного белка mRFPl. Установлена схема фотофизических процессов в них как в представителях систем с локализованными- донорно-акцепторными парами. Определены значения индивидуальных фотофизических параметров флуорофоров (хромофоров) указанных белков: сечения поглощения, времени жизни возбужденного состояния, скорости внутримолекулярного переноса энергии.

В заключение автор считает своей приятной обязанностью выразить благодарность своему научному руководителю - профессору кафедры квантовой электроники физического факультета МГУ Виктору Владимировичу Фадееву за предоставление интересной темы исследований, постоянное внимание к работе и плодотворное обсуждение результатов.

Автор выражает благодарность в.н.с. НИИ «Полюс» Ляшенко А.И. за помощь в наладке лазерной техники. v

Автор выражает признательность П.В. Вржещу и Е.П. Вржещу, представляющих Научный биотехнологический центр МГУ, за предоставление образцов белков и ценные советы.

Автор также признателен всем сотрудникам, аспирантам и студентам лаборатории лазерной спектроскопии водных сред кафедры квантовой электроники за создание творческой атмосферы и постоянную поддержку в работе.

1. Lakowicz J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. /Kluwer Academic/Plenum, New York, 1999,710 р.

2. Stryer L. Proximity relationship in rhodopsin. //Proc. Natl. Acad. Sci., 1972, v. 69, p. 1104-42.

3. Stryer L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. //Annu. Rev. Biochem, 1978, v. 47, p. 819-846.

4. Truong K., Ikura M. The use of FRET imaging microscopy to detect protein-protein interactions and protein conformational changes in vivo. //Review article, Curr. Opin. Sturct. Biol., 2001, v 11, p.573-8.

5. Reid B.G., Flynn G.C. Single-Pair FRET Characterization of DNA Tweezers. //Biochemistry, 1997, v. 36, p. 6786-6791.

6. Srinivas G., Yethiraj A., Bagchi B. FRET by FET and Dynamics of Polymer Folding. //J. Phys. Chem. B, 2001, v. 105, №13, p. 2475 -2478.

7. Siling S.A., Shamshin S.H., Ronova I.A., Kovalevskii A.Yu., Grachev A.V., Tsiganova O.Yu., Yuzhakov V.I. Synthesis and Photophysical Properties of Azomethines-Bifluorophores. //Intern. J. Polymeric. Mater, 2000, v.46, p.775-791.

8. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. /М. Наука, 1980, 320 с.

9. Baird G.S., Zacharias D.A., and Tsien R.Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. //PNAS, 2000, v. 97, p. 11984-89.

10. Verkhusha V.V., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Common Pathway for the Red Chromophore Formation in Fluorescent Proteins and Chromoproteins. //Chemistry & Biology, 2004, v. 11, p. 845-854:

11. Dolenko T.A., Fadeev V.V., Gerdova I.V., Dolenko S.A., Reuter R. Fluorescence diagnostics of oil pollution in coastal marine waters using artificial neural networks. //Applied Optics, 2002, v.41, №24, p.5155-5166.

12. Fadeev V.V., Dolenko Т.A., Filippova Е.М., Chubarov V.V. Saturation spectroscopy as a method for determining the photophysical parameters of complicated organic compounds. //Optics Communications, 1999, v.166, p. 25-33.

13. Маслов Д.В., Остроумов E.E., Фадеев В.В. Флуориметрия насыщения сложных органических соединений с высокой локальной концентрацией флуорофоров (на примере фитопланктона), //Квантовая электроника, 2006, т. 36, №2, с. 163-168.

14. Volkov P. A., Drozdov A. Yu., and Fadeev V. V. Nanosecond Laser Fluorometry of Humic Substances. //Laser Physics, 2007, v.17, №10, p. 1-7.

15. Агранович В. M., Галанин М. Д. Перенос энергии электронного возбуждения в конденсированных средах. /М.: Наука, 1978, 383 с.

16. Пермяков Е.А. Метод собственной люминесценции белка. /М:2003, 195 с.

17. Wu P., Brand L. Resonance energy transfer: methods and applications. //Anal. Biochem., 1994, v. 218, №1, p. 13-23.

18. Selvin R. Fluorescence resonance energy transfer. //Meth. Enzymol., 1995, v. 246, p.300-34.

19. Cabor C. Radiationless energy transfer through a polypeptide chain. //Biopolymers, 1967, v. 60, №116, p. 809-830.

20. Haugland R. Conformational changes in human serum albumin studied by fluorescence and absorption spectroscopy Distance measurements as a function of pH and fatty acids. //Biochem. J, 1989, v. 258, p. 199-204.

21. Das P., Mallick A., Haldar В., Rabarty A. and Chattopadhyay N. Fluorescence resonance energy transfer from tryptophan in human serum albumin to a bioactive indoloquinolizine system. //J. Chem. Sci., 2007, v. 119, №. 2, p. 77-82.

22. Vanderkooi I.M., Nakamura H., Martinosi A. Fluorecscence energy transfer between Ca2+ transport ATPase molecules in artificial membranes. //Biochemistry, 1977, v. 16, p.1262-1280.

23. Shaklai N., Ranney I. Interaction of hemoglobin with red blood cell membranes as shown by a fluorescent chromophore. //Biochemistry, 1977, v. 16, p. 5585-5601.

24. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M. and Tsien R.Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. //Nature, 1997, v. 388, p. 882-887.

25. Tsien R.Y. The green fluorescent protein. //Annu. Rev. Biochem., 1998, v. 67, p. 509544.

26. Зубова H.H., Булавина А.Ю., Савицкий А. П. Спектральные и физико-химические свойства зеленого (GFP) и красного (drFP583) флуоресцирующих белков. //Усп. Биол. Хим., 2003, т. 43, 163-224.

27. Undine Lauf, Patricia Lopez, Matthias M. Falk. Expression of fluorescently tagged connexins: a novel approach to rescue function of oligomeric DsRed-tagged proteins. //FEBS Letters, 2001, v. 498, p. 11-15.

28. Prendergast F. G. Biophysics of the green fluorescent protein. //Meth. in cell biol., 1999, v. 58, p.1-18.

29. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. /М., Мир, 1986, 486 с.

30. Филькинпггейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. /М., КДУ, 2005, 456 с.

31. Burstein E.A., Permyakov E.A., Yashin V.A. et al. The fine structure of luminescence spectra of azurin. //Biochim. et biophys. acta., 1977, v. 491, № 1, p. 155-159.

32. Burstein E.A., Vedenkina N.S., Ivkova M.N. Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules. //Photochem. and Photobiol., 1973. v. 18, p. 263-279.

33. Eftnik M.R., Chiron C.A. Exposure of tryptophanyl residues and protein dynamics. //Biochemestry, 1977, v. 16, p. 5546-57.

34. Beechem J M, Brand L. Time resolved fluorescence decay in proteins. //Annu. Rev.Biochem, 1985, v. 54, p. 43-71.

35. Yves Engelborghs. Time Resolved Protein Fluorescence.Application to Multi-Tryptophan Proteins, Supramolecular Structure and Function. /Edited by Pifat-Mrzljak Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2004, 34 pp.

36. Weber G. and Teale F. W. J. Determination of the absolute quantum yield of fluorescent. //Trans. Faraday Soc., 1957, v. 53, p. 646-655.

37. Theodore Peters Jr. All About Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Applications. /San Diego, C.A., Academic Press, 1996,432 p.

38. Грызунова Ю.А. и Добрецова Г.Е. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. /М.:ГЭОТАР, 1998,440 с.

39. Vlasova I.M., Saletsky A.M. Raman spectroscopy in investigation of mechanism» of binding of human serum albumin to molecular .probe fluorescein. //Laser Physics Letters,2008, D0110.1002/lapl.200810004, p.1-6.

40. Spector A.A. Fatty acid binding to plasma albumin. //Journal of Lipid Research, 1975, v. 16, 165-179.

41. Hallivell B. Albumin an important extracellular antioxidant. //Biochem. Pharmacol. 1988, v. 37, p. 569-571.

42. Brown J. R. Structure of Bovine Serum Albumin. // Fed. Proc., 1975, v. 34, p. 591.

43. Carter D.C., Ho J.X. Structure of serum albumin. //Adv. Prot. Chm., 1994, v. 45, p.153-203.

44. Мельников М.Я., Иванов B.JI. Экспериментальные методы химической кинетики. Фотохимия. /Издательство Московского университета, 2004, 125 с.

45. Владимиров Ю.А. Инактивация ферментов ультрафиолетовым облучением. //Соросовский образовательный журнал, Биология, 2001, т.7, №2, с. 20-27.

46. Finstrom В., Tfibel F. and Lindqvist L. One- and two-photon ionization of aqueous tryptophan by the harmonics of the Nd laser. //Chem.Phys. Letters, 1981, v.71, №2, p312-316.

47. Dudley Bryant, Santus R. and Grossweiner L.I. Laser flash photolysis of aqueous tryptophan. //J. of Phys. Chem., 1975, v.79, №25, p. 2711-2716.

48. Sherin P.S., Snytnikova O.A., Tsentalovich Y.P. Tryptophan photoionization from prefluorescent and fluorescent state. //Chem. Phys. Letters, 2004, v.391, p. 44-49.

49. Klein R., Tatischeffl., Bazin M., Santus R. Photophysics of Indole. Comparative study of quenching, solvent, and temperature effects by laser flash photolysis and fluorescence. //J. Phys.Chem., 1981, v. 85, p. 670-677.

50. Pigault C. and Gerard D. Influence of the location of tryptophanyl residues in proteins on their photosensitivity. //Photochem. and Photobiol., 1984, v.40, №3, p-291-296.

51. Zubova Nadezhda N., Korolenko Vadim A., Astafyev Artem A., Petrukhin Andrew N., Vinokurov Leonid M., Sarkisov Oleg M., and Savitsky Alexander P. Brightness of

52. Yellow Fluorescent Protein from Coral (zFP538) Depends on Aggregation. //Biochemistry, 2005, v.44, p.3982-93.

53. Шелаев И.В., Саркисов O.M., Гостев Ф.Е., Савицкий А.П. Фемтосекундная динамика первичных процессов в флуоресцентном белке KFP. // Труды 50-ой научной конференции МФТИ, 23-27 ноября, 2007.

54. Chalfle М., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., and Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. //Science, 1994, v.263, p. 802-805.

55. Зубова H.H., Савицкий А.П. Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцирующих белков. //Успехи биологической химии, 2005, т. 45, с.391-454.

56. Верхуша В.В., Аковбян Н.А., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д., Вржещ П.В. Кинетический анализ созревания и денатурации красного флуоресцентного белка DsRed. //Биохимия, 2001, т. 66, №12, с.1656-1667.

57. Bevis B.J., Glick B.S. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). //Nat Biotechnol, 2002, v.20, p. 83-87.

58. Heim R., Cubitt A., Tsien R. Improved green fluorescence. //Nature, 1995, v.373, p.663-4.

59. Matz M.V, Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Antozoa species. //Nature Biotechnology, 1999, v. 17, p. 969-973.

60. Jens Wiehler, Julia von Hummel, Boris Steipe. Mutants of Discosoma red fuorescent protein with a GFP-like chromophore. //FEBS Letters, 2001, v. 487, p. 384-389.

61. Yarbrough D., Wachter R.M., Kallio K., Matz M.V., Remington S.J. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, v. 98, №2, p. 462-467.

62. Mizuno FI., Sawano A., Eli P., Hama H., and Miyawaki A. Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. //Biochemistry, 2001, v. 40, p. 2502-2510.

63. Nifosi Riccardo and Yi Luo. Origin of the Anomalous Two-Photon Absorption in Fluorescent Protein DsRed. //J. Phys. Chem. B, 2007, v. 111, № 3, p.505-507.

64. Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N., Palmer A.E., and Tsien R.Y. Improved monomelic red, orange, and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. //Nat. Biotechnol., 2004, v. 22, №12, p. 1567-72.

65. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., Tsien R.Y. Structure of the Chromophore within DsRed, a Red Fluorescent Protein from Coral. //PNAS, 2000, v. 97, №22, p. 11990-95.

66. Yampolsky I.V., Remington S.J., Martynov V.I., Potapov V.K., Lukyanov S., and Lukyanov K.A. Synthesis and Properties of the Chromophore of the asFP595 Chromoprotein from Anemonia sulcata. //Biochemistry, 2005, v. 44, p.5788-5793.

67. Kneen M., Farinas J., Li Y. and Verkman A.S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. //Biophysical J., 1998, v. 74, p. 1591-1599.

68. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., and Boxer S.G. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, p. 8362-8367.

69. Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. A monomeric red fluorescent protein. //PNAS, 2002, v. 99, p. 7877-7882.

70. Harald Otto et al. Time-Resolved Single Tryptophan Fluorescence in Photoactive Yellow Protein Monitors Changes in the Chromophore Structure during the Photocycle via Energy Transfer. //Biochemistry, 2005, v. 44, p. 16804-16.

71. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., and Lukyanov K.A. Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. //BMC Biochem., 2001; v. 2, p 6-15.

72. Друца B.JI., Вржещ Е.П., Дмитриенко Д.В., Вржещ П. В. Новые мутантные белки на основе mRFPl: мутагенез по 66 позиции и его влияние на свойства. //Биохимия, 2007, том 72, № 5. с. 1258-1265.

73. A.V. Terskikh, A.F. Fradkov, A.G. Zaraisky, A.V. Kajava and Brigitte Angres. Analysis of DsRed Mutants. //The Journal of Biological Chemestry, 2002, v.277, №10, p. 76337636.

74. Банишев A.A., Маслов Д.В., Фадеев B.B. Наносекундный лазерный флуорометр. // ПТЭ, 2006, №3, с. 143-148.

75. Dolenko S.A., Dolenko T.A., Fadeev V.V., Gerdova I.V., Kompitsas M. Time-Resolved

76. Fluorimetry of Two-Fluorophore Organic Systems Using Artificial Neural Networks. //Optics Communications, 2002, v.213, №4, p.309-324. .

77. Fadeev V.V., Dolenko T.A., Banishev A.A., Litvinov P.N., Maslov D.V., Ostroumov E.E. Matrix method in laser fluorimetry of organic compounds. //Proceedings of SPIE, Conference on Spectroscopy, Dublin, Ireland, April, 2005, v.5826, pp.44-55.

78. Фадеев B.B. Лазерная спектроскопия водных сред. /Дисс. докт. физ.-мат. наук, М. МГУ, физ. фак., 1983, 510 с.

79. Паркер С. Фотолюминисценция растворов. /М.: Мир, 1972, 510 с.

80. Маслов Д.В. Определение фотофизических параметров фитопланктона методом нелинейной лазерной флуориметрии. / Дисс. канд. физ.-мат. наук. М. МГУ, физ. фак., 2003, 125 с.

81. Пащенко В.З. Пикосекундная спектроскопия первичных процессов фотосинтеза, /дисс. докт. физ.-мат. наук, М. МГУ, биологический ф-т, 1986, 362с.

82. Банишев А.А., Ширшин Е.А., Фадеев В.В. Определение фотофизических параметров молекул триптофана методами лазерной флуориметрии. // Квантоваяэлектроника, 2008, т. 38, №1, стр. 76-80.

83. Банишев А.А., Маслов Д.В., Фадеев В.В. Определение квантового выхода синглет-триплетной конверсии в молекулах сложных органических соединений методомнелинейной лазерной флуориметрии. // Вестник МГУ, №3, 2008, с.69-71.

84. Банишев А.А., Маслов Д.В., Мешканцов А.А., Остроумов Е.Е., Фадеев В.В. ( Кинетическая флуориметрия природных вод. // Сб. статей «Физические проблемыэкологии (экологическая физика)», М.: МАКСПресс, 2005, №12, с.138-147.

85. Бойчук И.В., Доленко Т.А., Сабиров А.Р., Фадеев В.В., Филиппова Е.М. Исследование единственности и устойчивости решения обратной задачи флуориметрии насыщения. //Квантовая электроника, 2000, т.30, №7, с.611-616.

86. Grossweiner L.I., Brendzel A.M., Blum A. Multiple pathways of tryptophan photoionization. //Chem. Phys., 1981, v.57, p.147-155.

87. Szabo A. G. and Rayner D. M. Fluorescence decay of tryptophan conformers in aqueous solution. //J. Am. Chem. Soc., 1980, v. 102, p. 554-563.

88. Chen Y., and Barkley M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. //Biochemistry, v. 37, p.9976-9982.

89. Robbins R.J., Fleming G.R., Beddard G.S., Robinson G.W., Thistlethwaite P.J. and Woolfe G.J. The Photophysics of Aqueous Tryptophan: pH and Temperature Effects. //J. Amer. Chem. Soc., 1980, v. 102, p. 6271-77.

90. Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белка. Природа и применения. /М.: ВИНИТИ, 1977, Итоги науки и техники, Биофизика, т. 7.

91. Расе C.N., Vajdos F., Fee L., Grimsley G., Gray T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. //Protein Sci., 1995, v. 4, p. 2411-2423.

92. Gill S.C. and P.H. von Hippel. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. //Analytical Biochem. 1989, 182, p.319-326.

93. McCluskey K. The Fungal Genetics Stock Center: from molds to molecules. //Adv. Appl. Microbiol, 2003, v. 52, p.245-262.

94. Bradford M.M.' A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. //Anal- Biochem, 1976, v.72, p.248-54.

95. Chekalyuk A., Fadeev V., Georgiev G., Kalkanjiev Т., Nickolov Zh. Determination of fluorescence quantumyields using a spontaneous Raman scattering line ofsolvent as internal standard. //Spectr. Lett., 1982, v.15, №5, p.355-365.

96. Романов Н.П., Шуклин B.C. //Оптика и спектроскопия, 1975, т. 37, вып. 6, с. 11201124.

97. Banishev A. A., Shirshin Е. A., Fadeev V. V. Non-linear fluorimetry of fluorescent proteins. // Proceedings of SPIE, International Conference on Lasers, Applications and Technologies (LAT 2007), Minsk, May 28-June 1, 2007, v. 6733, 67331B.

98. Гердова (Бойчук) И.В. Лазерная флуориметрия смесей сложных органических соединений в водных средах. /Дисс. канд. физ-мат наук, 2002, М. МГУ, физ. фак., 115с.

99. Эльсгольц Л.Э., Дифференциальные уравнения и вариационное исчисление. /М:Наука, 1956, 456 с.

100. Banishev А.А., Shirshin Е.А., Fadeev V.V., Non-linear fluorimetry of fluorescent proteins. // Proc. of SPIE, International Conference on Lasers, Applications and Technologies, Minsk, Belarus, May 28-June 1, V.6733, p.67331B.

101. Shaner Nathan C., Steinbach Paul A. & Tsien Roger Y. A guide to choosing fluorescent proteins. //Nature Methods, 2005, v. 26, №126, p.905-1006.

102. Дмитриенко Д.В., Вржещ Е.П., Друца В.Л., Вржещ П.В. Получение новых мутантов белка mRFPl с заменой 66 аминокислотно остатка. //Биохимия, 2007, в печати.

103. Labas Y. A., Gurskaya N. G., Yanushevich Y. G., Fradkov A. F., Lukyanov K. A., Lukyanov S. A., Matz M. V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. // PNAS, 2002, v. 99, p.4256-4261.

104. Fischer Markus, Haase Ilka, Simmeth Evelyn, Gerisch Gunther, Muller-Taubenberger Annette. A brilliant monomeric red fluorescent protein to visualize cytoskeleton dynamics in Dictyostelium. //FEBS Letters, 2004, v. 577, p. 227-232.

105. Банишев A.A., Загидуллин В.Э., Пащенко B.3., Ширшин Е.А., Фадеев В.В. Лазерная флуориметрия белков. // Сб. статей «Физические проблемы экологии (экологическая физика)», М.: МАКСПресс, 2007, №14, с.43-61.

106. Борисевич Н.А., Толкочев В.А. Генерация излучения сложными молекулами в газовой фазе. //УФН, 1982, т. 138, вып. 4, с.545-72.

107. Berland К. M. Quantifying molecular interactions with fluorescence correlation spectroscopy, //in Molecular Imaging: FRET Microscopy and Spectroscopy, Periasamy, A.and Day, R. N. (eds.), Oxford University Press, New York, 2005, p.272-283.

108. Berney C. and Danuser G. FRET or No FRET: A quantitative comparison. //Biophysical Journal, 2003, v.84, p.3992-4010.

109. Ulrich Zachariae, Till von Feilitzsch, Jens Wiehler, Julia von Hummel, Boris Steipe, Maria E. Michel-Beyerle. Picosecond Time-Resolved FRET in the Fluorescent Protein from Discosoma Red (wt-DsRed). //ChemPhysChem. 2001, v.2, №5, p.325-28.

110. Qiu-Ping Qin, Olli Pel tola and Kim Pettersson, Time-resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer Assay for Point-of-Care Testing of Urinary Albumin. //Clinical Chemistry, 2003, v. 49, p. 1105-1113.

111. Valuer B. Molecular Fluorescence. Principles and Applications. /Wiley-VCH, Winheim, 2002, 254 p.590.