Поверхности потенциальной энергии и спектры хромофора зеленого флуоресцентного белка: от газовой фазы до белковой матрицы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.17 ВАК РФ

На правах рукописи

ЛЬ'

Поляков Игорь Вадимович

Поверхности потенциальной энергии и спектры хромофора зеленого флуоресцентного белка: от газовой фазы до белковой матрицы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степенн кандидата физико-математических наук

Специальность 02.00.17 - математическая и квантовая химия

-1 ДЕК 2011

Москва-2011

Работа выполнена на кафедре физической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

Григоренко Белла Людвиговна

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Уманский Станислав Яковлевич Институт химической физики имени H.H. Семенова РАН

кандидат химических наук Авакян Виталий Гайкович Центр фотохимии РАН

Ведущая организация: Институт биохимической физики

имени Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится 8 декабря 2011 года в 15:00 в аудитории 446 Химического факультета МГУ на заседании диссертационного совета Д 501.001.50 при МГУ имени М.В. Ломоносова (119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Химический факультет МГУ).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат диссертации размещен на сайте Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (www.chem.msu.ru) и на сайте Высшей Аттестационной Комиссии (vak.ed.gov.ru).

Автореферат разослан «7» ноября 2011 года. Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.50 /

кандидат химических наук Матушкина H.H.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Открытие и применение белков семейства зеленого флуоресцентного белка (ОРР) привело к лавинообразному всплеску интереса исследователей к этим объектам. Их практическая ценность объясняется возможностью маркировать цветными белками клеточные клоны и затем в буквальном смысле наблюдать за ходом внутриклеточных событий. Биотехнологические перспективы применения цветных белков связаны с многоцветной маркировкой и, в частности, с возможностями наблюдать за межбелковымц взаимодействиями в живых системах. Помимо широкого практического использования, цветные белки и их хромофоры являются интереснейшими объектами, изучению свойств которых посвящено большое число экспериментальных и теоретических работ; однако, множество проблем, связанных с особенностями строения и свойств хромофорных молекул белков семейства ОРР в разных окружениях, все еще требует детального исследования.

Хромофор зеленого флуоресцентного белка, 4-(п-гндроксибензилнден)-5-имидазолинон, представляет собой достаточно большую и сложную молекулу, моделирование свойств которой методами квантовой теории становится возможным лишь в последние годы благодаря доступу к современным суперкомпьютерам тера- и петафлопного уровня и прогрессу в развитии программного обеспечения. Численными решениями уравнений квантовой химии и комбинированных подходов квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) удается надежно рассчитывать фрагменты поверхностей потенциальной энергии в основном и возбужденном состояниях молекулярных систем, моделирующих хромофор ОРР в газовой фазе, растворе и в белковом окружении. Эти данные необходимы для интерпретации и уточнения результатов выполненных экспериментальных наблюдений н предсказаний свойств новых систем, включая и более эффективные в приложениях варианты цветных белков.

Цель работы - теоретическая интерпретация экспериментальных данных по спектральным свойствам хромофора зеленого флуоресцентного белка в газовой фазе, водном растворе и белке по результатам расчетов поверхностен

потенциальной энергии в основном и возбужденном состояниях современными методами квантовой химии. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Рассчитать фрагменты поверхностей потенциальной энергии основного и возбужденных состояний и оценить теоретически положения полос в спектрах хромофора ОРР в различных протежированных формах в газовой фазе.

2. Построить путь цис-транс изомеризации хромофора ОБР в основном состоянии в водном растворе.

3. Предложить уточненные трехмерные модели структур ОРР на основе расчетов методами КМ/ММ.

4. На основании рассчитанных поверхностей потенциальной энергии основного Бо, возбужденного 8[ состояний в газовой фазе и в белковой матрице объяснить спектральные свойства хромофора ОБР.

5. Предсказать влияние точечных мутаций на спектр вБР в белковой матрице. Научная новизна результатов:

1. Методами квантовой химии высокого уровня точности в рамках единой расчетной схемы рассмотрены все формы хромофора ОРР.

2. Уточнена интерпретация спектра анионной формы хромофора ОБР в газовой фазе. Показано, что энергия ионизации аниона хромофора ОРР в газовой фазе меньше, чем энергия оптически разрешенного перехода ж-ж*.

3. В рамках континуальной и дискретной моделей растворителя исследована цис-транс изомеризация хромофора ОРР в воде.

4. На основании расчетов комбинированными методами квантовой механики -молекулярной механики (КМ/ММ) построены трехмерные модели ОРР.

5. По результатам расчетов методом КМ/ММ фрагментов поверхностей потенцильной энергии основного и возбужденного состояний модельных белковых систем сопоставлены теоретические и экспериментальные спектры поглощения и флуоресценции ОРР для наиболее важных форм белка. Предложена новая интерпретация превращений ОРР при фотовозбуждении.

Личный вклад диссертанта заключается в сборе и анализе литературных данных, постановке задач, разработке путей решения поставленных задач, проведении вычислений методами квантовой химии, комбинированными методами квантовой механики и молекулярной механики, интерпретации результатов, подготовке публикаций и докладов по теме диссертационной работы.

Научная н практическая значимость данной работы заключается в том, что полученные результаты позволяют детализировать механизмы фотохимических реакций хромофора зелёного флуоресцентного белка в газовой фазе, растворах и белковой матрице. Результаты данной работы могут быть применены для прогнозирования свойств новых перспективных вариантов флуоресцентных белков.

Апробация работы н публикации. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Ломоносов» (Москва, 2011), Международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущнно 2008), VIII, IX и X ежегодных международных молодежных конференциях «Биохимическая физика» ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва 2008, 2009, 2010) , Симпозиумах «Современная химическая физика» (Туапсе 2009, 2010), 7-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2011), 2-й и 3-й Международных конференциях «Суперкомпьютерные системы и их применение» (Минск 2008, 2010).

Результаты опубликованы в 18 печатных изданиях, в том числе в 7 статьях в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень журналов ВАК РФ и в 11 тезисах докладов на конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитируемой литературы из наименований. Работа изложена на 95 страницах машинописного текста, включает 90 рисунков и 10 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 включает анализ научных работ, посвященных экспериментальному и теоретическому изучению структуры и спектров хромофора йРР в газовой фазе, водном растворе и белке, а также описание современных методов моделирования строения и свойств биомолекулярных систем.

В результате этого анализа были сформулированы проблемы, требующие исследования:

1) Разнородность литературных данных по экспериментальным и теоретическим исследованиям хромофора GFP в газовой фазе. Исходя из этого, возникает необходимость рассмотреть в единой расчетной схеме все протонированные формы хромофора GFP.

2) Отсутствие теоретической интерпретации экспериментов по цис-транс изомеризации хромофора GFP в водной среде.

3) Отсутствие убедительных трёхмерных моделей структуры GFP с различными формами хромофора.

4) Отсутствие последовательных теоретических исследований, интерпретирующих фотофнзические эксперименты с GFP. Согласно принятой гипотезе поглощение белком синего света в районе 400 нм происходит за счет структуры с нейтральной формой хромофора GFP (традиционно обозначаемой как структура А); поглощение света с максимумом при 476 нм происходит с анионной формой хромофора в структуре, обозначаемой как В. Зеленая флуоресценция наблюдается от анионной формы хромофора, независимо от того, какая из форм А или В поглощает свет. Предполагается, что белок с нейтральным хромофором в возбужденном состоянии переходит в структуру, обозначаемую I, с нерелаксированной белковой матрицей, но с анионной формой хромофора. С некоторой вероятностью форма I может перейти в форму В путём релаксации окружения хромофора. Предполагается, что это подразумевает изомеризацию глутаминовой кислоты Glu222 и поворот боковой цепи аминокислотного остатка Thr203 с образованием водородной связи с кислородом тирозинового кольца хромофора. В низкотемпературных спектрах GFP обнаруживают две полосы флуоресценции- с максимумами при 481 и 504 нм, тогда как при комнатной температуре максимумы полос флуоресценции соответствуют 504 и 508 нм для форм В и I, соответственно. Убедительных теоретических подтверждений этой гипотезы в части связи форм В и I в литературе не описано.

В данной работе были использованы следующие расчетные методы вычислительной химии:

1) Метод теории функционала плотности (DFT) с функционалом PBE0 (рассматривались также и другие функционалы). По литературным данным этот

вариант приводит к хорошим результатам при расчетах равновесных геометрических конфигураций органических молекул в основном электронном состоянии.

2) Многоконфигурационный метод самосогласованного поля в полном пространстве активных орбиталей (САБЗСР). Этот метод широко применяется при расчетах поверхностей потенциальной энергии (ППЭ) возбужденных состояний органических хромофоров.

3) Многоконфигурационная теория возмущений Меллера-Плессе второго порядка (М1ШР2), которая позволяет учитывать динамическую электронную корреляцию на основе расчетов методом САББСР. Этот вариант повышает точность результатов и позволяет достаточно надежно моделировать полосы в спектрах органических хромофоров.

4) Расширенный вариант квазивырожденной теории возмущений второго порядка (ХМССШРТ2). Данный метод позволяет получить точные результаты даже для тех случаев, в которых другие методы многоконфигурационной теории возмущений, в частности МЯМР2, могут приводить к неточностям.

Глава 2 посвящена расчетам поверхностей потенциальной энергии и оптических спектров хромофора ОБР в газовой фазе для всех вариантов протонированных форм: нейтральной, анионной, катионной и цвиттерионной. Молекула хромофора, 4-(п-гидроксибензилиден)-5-имидазолинона, в анионной форме показана на Рис. 1.

с

Рис.1. Хромофор вРР: 4-(п-гидроксибензилиден)-5-имидазолинон (НВ01). На этом и последующих цветных рисунках зеленым цветом изображены атомы углерода, красным - кислорода, синим - азота. Показаны координаты, соответствующие изменению двугранных углов мостиковых связей: Р (мостик-фенольное кольцо) и I (мостик- имидазолоновое кольцо).

На основании рассчитанных в данной работе ППЭ возбужденного состояния для всех форм НЕШ1 в газовой фазе показаны пути эффективной безызлучательной релаксации через конические пересечения и псевдопересечения. Особый интерес представляют результаты для анионной формы, приведенные на Рис. 2, так как считается, что именно она ответственна за флуоресценцию хромофора в белке.

ни

494 um

О

Mii»-S„

76

523 пш

69\

69

.....*уг-«г

"••f'46

32

цис

- 4.6 f'ian-S,

транс

TS-S

s, í wP-S' Twl-Sj MECl-l-S*,

Рис. 2. Энергетическая диаграмма для анионной формы HBD1. Расчет геометрических конфигураций проводился в приближении CASSCF( 12/11 )/сс-pVDZ, расчет энергий вертикальных переходов - XMCQDPT2//CASSCF(14/12)/cc-pVDZ. Значения приведены в ккал/моль.

Из рассчитанной диаграммы следует, что при движении по ППЭ возбужденного состояния из плоского минимума Plan-Si через небольшой барьер по координатам I и Р можно попасть либо в «скрученный» темновой минимум Tw-I-Sb либо на коническое пересечение ППЭ S0/S| (MECl-l-S0/i), либо в «скрученный» темновой минимум Tw-P-S]. В любом из этих случаев происходит безызлучательный переход с ППЭ Si на So, Данный рельеф потенциальной поверхности объясняет, почему хромофор GFP не флуоресцирует в газовой фазе.

Расчет спектров поглощения различных форм HBD1 проводился в рамках многоконфигурационной теории возмущений второго порядка на основе волновой функции CASSCF(14/12)/cc-pVDZ. В таблице 1 представлены результаты для анионной формы и их сравнение с экспериментальными данными.

Таблица 1. Энергии вертикальных переходов анионной формы НЕШ1 в газовой фазе.__

Метод расчёта энергий вотуждгния Метод расчёта геометрических параметров Энергии переходов

\тМР2//СА58СГ<( 14/12)/сс-р\'Ог М1ШР2//СА58СР(14/12)/(аик)-сс-рУОг ХМС(}ОРТ2//СА85СР(14/12)/(аиц)-сс-рУОг РВЕО/(аиц)-сс-р\Ог СА88СР(12/11)/сс-рУОг СА88СР(12/Н)/сс-р\'0г 491 им (2.52 зВ) 475 им (2.61 эВ) 494нм (2.51 зВ)

эксперимент 479 нм (2.59 >В)

Полученные значения энергии оптически разрешенного перехода Зо-в, хорошо согласуются с основным пиком поглощения в спектре НЕШ1. Значение рассчитанной вертикальной энергии ионизации составило 2.4 эВ, что на 0.2 эВ меньше, чем энергия вертикального перехода ж-п*. По нашим расчетам слабо интенсивный широкий пик в районе 2.4-2.8 эВ в экспериментальном спектре поглощения аниона НВ01 с максимумом при 2.59 эВ можно отнести к фотоотрыву электрона.

Результаты расчета ППЭ 81 нейтральной формы НВБ! в газовой фазе представлены на рис. 3.

А. т:

ж

цис

транс

мь-в. паи-й. тчм.

Рис. 3. Энергетическая диаграмма для нейтральной формы НВЭ!. Расчет геометрических конфигураций проводился в приближении СА88СР(12/11)/сс-pVDZ, расчет энергий вертикальных переходов - ХМСС®РТ2//СА88СР( 14/12)/сс-pVDZ. Значения приведены в ккал/моль.

В отличие от анионной формы, барьер на ППЭ возбужденного состояния по координате I здесь значительно выше и составляет 5 ккал/моль. Геометрическая конфигурация точки с минимальной энергией на поверхности конического пересечения поверхностей 80 и Б) (МЕСЫ-Бол) указывает на возможность цис-транс изомеризации при безызлучательной релаксации через коническое пересечение поверхностей Бо и 8|.

Для нейтрального хромофора в газовой фазе нет прямых экспериментальных данных для спектра поглощения. Подобные оценки были сделаны для соединения, несущего положительный заряд и предположительно имитирующего нейтральный хромофор. Предполагаемая структура этого катиона (называемого «нейтралъный+») изображена на левой части Рис.4. Как показано в наших расчетах, более вероятная структура соединения «нейтральный+» отвечает изомеру, изображенному в правой части Рис.4.

1 ->

Рис. 4. Структурные формы хромое Таблица 2. Положения максимумов протонирования НВ01 в газовой фазе. юра НВ01 «нейтральный+». полос погощения (в нм) для всех форм

Метод расчёта энергий возбуждения анион нейтральный нейтральный-*- цвитгерион катион

ХМСООРТ//СА88СГ(14/П)/сс-рУО£ 494 375 430 503 406

Эксперимент 479 415 406

В таблице 2 представлены результаты расчета спектров поглощения для всех форм НВБ1 и их сравнение с экспериментальными данными.

Как и для хорошо исследованного случая анионной формы, для катиона и «нейтрального+» разница между рассчитанными и экспериментальными

величинами составляет менее 15 нм. Следует отметить, что для нейтральной и «нейтральной+» форм эта разница составляет 55 нм; при этом экспериментально их максимумы поглощения лежат в пределах 10 нм. Согласно Рис. 4 «нейтральный+» хромофор представляет собой скорее изомер катиона. Экстраполяция литературных данных по поглощению нейтрального НЕШ1 в различных растворителях приводит к значению в области 350 нм для газовой фазы. Таким образом, «нейтральный+» не является адекватной моделью нейтрального НЕШ1, а истинный спектр поглощения нейтральной формы хромофора йРР в газовой фазе сдвинут в синюю область относительно белка, хотя ранее считалось, что они должны практически совпадать.

В главе 3 рассматривается реакция цис-транс изомеризации хромофора ОИР в газовой фазе и в водной среде в основном электронном состоянии. Были применены как континуальные модели среды, так и метод КМ/ММ в варианте эффективных фрагментов для достаточно большого кластера молекул воды, окружающих хромофорную молекулу. Результаты моделирования для анионной формы хромофора, представлены в таблице 3.

Таблица 3. Энергетические характеристики реакции изомеризации анионной

СА55СГ(12/11)/сс-рУОг РВЕО/сс-рУО/.

Барьер Е(цис)-Е(транс) Барьер Е(инс)-Е(транс)

гтовая фат 22 3,5 34,5 2,3

коти нуяльаяя модель: 8УРЕ(1,5) 9,9 2,6 24,в 2,1

в кластере и* молекул воды 11,1 2,1 26,0 5,0

Эксперимент (в 0,1 ими раствор) 15,4 2,3

Важно отметить, что использование метода БРТ для описания реакции изомеризации дает сильно завышенные барьеры, а также неверную форму профиля сечения ППЭ по координате изомеризации. Многоконфигурацнонный метод САББСР в этом отношении более надежен. В рамках приближения САББСР

реакция изомеризации была изучена для всех форм НЕШ1; результаты представлены в таблице 4 и на Рис. 5.

Таблица 4. Энергетические характеристики реакции изомеризации всех форм протонирования хромофора, полученные в приближении континуальной модели 8\ФЕ; волновая функция описывалась методом СА88СР(12/11)/сс-р\Т)2. Значения приведены в ккал/моль._

Форма хромофора Барьер энергии Е(цис)- Е(транс)

Анион 9,9 2,6

Цвиттерион 6,8 1,4

Нейтральная 47,8 6,8

Катион 45,7 5,7

аниона хромофора в кластере из молекул воды.

Снижение энергетического барьера реакции изомеризации аниона НВЭ1 в водном растворе (11.1 ккал/моль) относительно газовой фазы (22.5 ккал/моль) происходит за счет усиления сольватации переходного состояния (Рис. 5) относительно реагентов и продуктов реакции. По экспериментальным данным барьеры реакций изомеризации анионной, катионной и нейтральной форм НВБ! отличаются незначительно. Однако, согласно оценкам в газовой фазе и континуальной модели растворителя, для нейтрального и катионного хромофора они должны быть значительно выше, чем для анионного и цвиттерионного. Таким

образом, можно предположить, что в растворе изомеризация нейтральной и катионной форм происходит через анионную или цвиттерионную формы.

Глава 4 посвящена описанию спектральных свойств хромофора ОГР в белковой матрице для белка дикого типа и мутанта 865Т. На основе кристаллографической структуры с кодом 1ЕМА базы данных белковых структур (РОВ) была построена модель для расчетов методом КМ/ММ. В квантовую часть модельной системы был включен хромофор, боковые цепи аминокислотных остатков А^96, 8ег205, 01и222, №з148 и молекула воды, образующая водородную связь с кислородом фенольного кольца хромофора и ОН-группой серина. В результате оптимизации геометрических параметров были получены структуры, отвечающие нейтральной А (Рис.6) и анионной формам хромофора в основном состоянии. Мы будем использовать обозначения для структур с анионной формой хромофора В1 и В2, для которых характерны конфигурации, отвечающие син-(В1) и анти-изомерам (В2) группы СООН в боковой цепи аминокислотного остатка С1и222.

Рис. 6. Фрагмент хромофор-содержащей области ОБР со структурой, хромофора в нейтральной форме. Расстояния указаны в ангстремах; в скобках для сравнения приведены значения из кристаллографической структуры ШРЬ.

Энергетическая диаграмма для рассчитанных стационарных точек на поверхности основного состояния, которые мы соотносим со структурами А, В1 и В2, а также с разделяющими их переходными состояниями ТБ! и Т82, представлена на Рис. 7 .

Е, ккал/моль

ТЭ1

и —<

I \

ТБ2

I—

12.9

А 0 /

В1

нейтральная

анионная

В21иМ.

Рис. 7. Энергетическая диаграмма стационарных точек на ППЭ основного состояния.

По нашим результатам структура В1 возникает в результате переноса протона по цепочке водородных связей; получается анионная форма хромофора и антиизомер 01и222. Результаты расчетов для ППЭ возбужденного состояния Б) позволяют построить энергетическую диаграмму, показанную на Рис. 8. В, ккал/моль

А 19.5/'

ТБ1 МЛ ——\

нейтральная

Т52 12.6

Ш/

'Э2 о

Рис. 8. Энергетическая диаграмма стационарных точек на ППЭ возбужденного состояния Б].

Эти данные позволяют предложить уточненную интерпретацию экспериментальных исследований спектров ОРР. На поверхности основного состояния ниже всех форм по энергии лежит А, тогда как В1 и В2 находятся несколько выше, причем все уровни энергии близки - в пределах 1 ккал/моль. Таким образом, при комнатной температуре конформации А, В1 и В2 будут заселены, а в спектре поглощения ОРР будут наблюдаться полосы поглощения, соответствующие как нейтральной, так и анионной форме хромофора. Переходы

между тремя формами А, В1 и В2 должны осуществляться быстро за счет низких барьеров.

На поверхности возбужденного состояния картина меняется полностью -энергетически структуры, соответствующие анионным формам В1 и В2, находятся гораздо ниже, чем нейтральная форма А. Также значительно понижается барьер переноса протона Т81. Следует отметить, что перенос протона по цепочке водородных связей между хромофором и 01и222 протекает по одностадийному механизму через переходное состояние ТБ1 (рис. 9).

Рис. 9. Фрагмент хромофор-содержащей области вРР для структуры, отвечающей точке Т81(А-В1) на ППЭ Б]. Все расстояния указаны в ангстремах.

С полученными геометрическими конфигурациями были рассчитаны вертикальные энергии переходов S0-S, для структур А, В1 и В2 методом XMCQDPT2//CASSCF(12/11 )/cc-pVDZ//AMBER. Результаты приведены в табл. 5.

Таблица 5. Длины волн (нм), соответствующие вертикальным переходам Sn-S| для структур А, В1, В^__

А В1 В2

Поглощение 370 461 481

Испускание 451 502 509

Схема, показанная на Рис.10, суммирует результаты моделирования превращений хромофора в белке.

А

Рис 10. Схема фотофизических превращений хромофора ОРР в белковой матрице. В скобках приведены экспериментальные значения максимумов полос поглощения и флуоресценции в спектрах ОРР при комнатной температуре.

Согласно этим данным при возбуждении нейтральной формы А синим светом хромофор переходит в состояние Эь и он может как флуоресцировать (460 им), так и через небольшой барьер передать протон по цепочке водородных связей, образуя анионную форму (В1 или В2), которая флуоресцирует зеленым светом. После испускания кванта света хромофор возвращается в основное состояние Бо, в котором нейтральная форма А энергетически лежит ниже остальных форм.

Актуальным для исследования свойств ОРР является вопрос о том, почему его хромофор флуоресцирует в белковой матрице, поскольку ни в газовой фазе, ни в водном растворе при комнатной температуре флуоресценция не наблюдается. По нашим результатам для ППЭ возбужденного состояния (глава 2) хромофор НВВ1 в газовой фазе не должен флуоресцировать из-за низких потенциальных барьеров, отделяющих точку минимума. Подобные же расчеты фрагментов ППЭ в возбужденном состоянии были выполнены в приближении КМ/ММ для белка; эти результаты представлены на Рис. 11.

1311' 100°

V

9\ккал/моль

51

f

У

транс

SO

транс

Рис. 11. Фрагмент поверхности возбужденного Si состояния анионного хромофора GFP в белковой матрице.

В отличие от газовой фазы, барьер, возникающий при движении по координате I, значительно увеличивается; таким образом, предпочтительным путем перехода хромофора из возбужденного на основное состояние является флуоресценция, а не колебательная релаксация через коническое пересечение или псевдопересечение ППЭ. По результатам расчетов методом КМ/ММ можно констатировать факт сближения поверхностей основного и возбужденного состояний при изменении координаты I. Если предположить, что структура хромофора в белке для точки конического пересечения MECI-S0/i похожа на полученную ранее в газофазных расчетах, то вероятно допущение, что в части белковых молекул, претерпевших безызлучательную релаксацию с ППЭ состояния S| на Sn, хромофор будет участвовать в цис-транс изомеризации.

В описанной модели нельзя интерпретировать два экспериментальных факта - фотоактивацию GFP, при которой уменьшается интенсивность синей полосы поглощения нейтральной формы и увеличивается интенсивность полосы поглощения анионной формы хромофора, а также низкотемпературные спектры GFP, в которых присутствует полоса излучения с максимумом при 482 нм. В литературе предложена гипотеза, что эти явления объясняются релаксацией боковой цепи аминокислотного остатка Thr203, который не образует водородной связи с хромофором GFP в нейтральной форме, но, вероятно, образует ее с

анионной формой. В рамках нашей модели для структуры В1 был проанализирован поворот боковой цепи Thr203. Результатом расчетов являются энергии вертикальных переходов So-Sb отвечающие длинам волн 500 нм для поглощения и 515 нм для испускания. Эти данные позволяют отвергнуть раннюю гипотезу по следующим причинам: релаксация из такой структуры в структуру А не должна происходить в течение нескольких часов, так как и возвращение боковой цепи Thr203 в начальное положение, и переход из В1 в А не сопровождаются высокими барьерами. Флуоресценция в данном случае не может соответствовать экспериментальной полосе 482 нм, так как образование дополнительной водородной связи хромофором должно смещать полосы в спектрах поглощения и флуоресценции в красную область.

Явление цис-транс фотоизомеризации хромофора в белковой матрице известно для различных GFP-подобных белков, в частности для белков asFP595, Dronpa. В рамках нашей работы мы выдвигаем гипотезу, что форма, объясняющая и низкотемпературные эксперименты, и эксперименты по фотоактивации - это транс-изомер хромофора GFP - назовем ее Т. В рамках нашей модели методом КМ/ММ были оценены равновесные геометрические параметры формы Т, представленные на Рис. 12.

Для формы Т был произведен расчет энергии вертикального Si-S0 перехода в рамках приближения XMCQDPT2//CASSCF(12/11)/cc-pVDZ//AMBER.

Полученный результат (487 нм) хорошо согласуется с максимумом полосы флуоресценции в низкотемпературном спектре йРР 482 нм, которую обычно относят к флуоресценции анионной формы хромофора в цис-конфигурации. Следует отметить, что обратный процесс транс-цис изомеризации хромофора в белке, по всей видимости, сопряжен с высоким барьером. Таким образом, как по энергетическим характеристикам, так и по спектру, транс-изомер анионной формы СИР хорошо подходит для интерпретации экспериментальных фактов.

Схема на Рис. 13 отражает возможные фотопревращения различных форм йРР, учитывая приведенные в данной главе результаты.

цис-транс изомеризация

Рис. 13. Схема предполагаемых процессов, происходящих при фотовозбуждении GFP. Структуры, оптимизированные на поверхности возбужденного состояния, помечены звездочкой. В скобках приведены экспериментальные значения максимумов полос поглощения и эмиссии в низкотемпературных спектрах GFP.

Схема на рис. 13 позволяет провести однозначную структурную интерпретацию экспериментальных данных по спектральным свойствам дикого типа GFP. Принципиальным её отличием от классической схемы трёх состояний является учет цис-транс изомеризации хромофора GFP, что позволяет более полно и правильно интерпретировать экспериментальные данные.

Для расчета структуры мутанта S65T нами была использована геометрическая конфигурация анионной формы GFP (В1), для которой проводилась замена серина на треонин в 65-й позиции. Для полученной структуры проводилась оптимизация геометрических параметров методом КМ/ММ в варианте электронного внедрения. Белковая матрица была описана силовым полем AMBER,

квантовая часть описывалась методом PBE0/6-31G* и состояла из хромофора, боковых цепей аминокислотных остатков Arg96, Ser205, Glu222 и кристаллической молекулы воды. Согласно полученным результатам, энергетически ниже всех форм лежит анионная В2, на 4.2 ккал/моль выше анионная В1, в то время как нейтральная А - на 12.7 ккал/моль выше, чем В2. Таким образом, мутация S65T сдвигает протонное равновесие в сторону анионной формы хромофора в белке, модифицируя спектр поглощения - из него фактически полностью пропадает синяя полоса, соответствующая поглощению нейтральной формы. Рассчитанные значения энергий S0-Si переходов для анионной формы В мутанта GFP S65T составили 473 и 513 нм для поглощения и флуоресценции, соответственно, и хорошо совпадают с экспериментальными значениями 490 и 510 нм.

Выводы

1. Рассчитанные рельефы поверхностей потенциальной энергии возбужденного состояния хромофора GFP согласуются с наблюдаемым экспериментально отсутствием флуоресценции анионной формы в газовой фазе. Для всех протонированных состояний хромофора GFP показаны пути колебательной релаксации через конические и псевдопересечения поверхностей основного и возбужденного состояний.

2. Показано, что вертикальная энергия ионизации анионной формы хромофора GFP в газовой фазе (2.4 эВ) меньше, чем энергия возбуждения ж-п* (2.6 эВ). Наблюдаемый экспериментально малоинтенснвный широкий пик в спектре поглощения анионной формы хромофора с максимумом при 2.59 эВ можно отнести к фотоотрыву электрона.

3. Показано, что спектр модельного соединения, использованного для имитации нейтральной формы хромофора GFP в газовой фазе, соответствует катионной форме. Полоса поглощения нейтрального хромофора в газовой фазе в действительности сдвинута в сторону меньших длин волн относительно белка.

4. Построены профили реакции цис-транс изомеризации хромофора GFP в основном электронном состоянии в газовой фазе и водной среде. Для

анионной формы хромофора значительное снижение барьера в воде по сравнению с газовой фазой связано с сольватацией переходного состояния.

5. Предложенные по результатам расчетов методом КМ/ММ трехмерные модели структур белка с различными состояниями хромофора уточняют параметры известных структур в базе данных PDB.

6. По результатам расчетов методом КМ/ММ фрагментов поверхностей потенциальной энергии основного и возбужденного состояний модельных белковых систем сопоставлены теоретические и экспериментальные спектры поглощения и флуоресценции GFP для наиболее важных форм белка. Предложена уточненная интерпретация превращений в структурах GFP при фотовозбужденин.

7. Изменение спектра поглощения дикого типа GFP при точечной мутации S65T связано со стабилизацией анионной формы хромофора за счет перестройки сетки водородных связей в хромофор-содержащей области.

Основные публикации по теме диссертации:

1. Epifanovsky Е., Polyakov I., Grigorenko В., Nemukhin A., Krylov A.I, Quantum Chemical Benchmark Studies of the Electronic Properties of the Green Fluorescent Protein Chromophore.l. Electronically Excited and Ionized States of the Anionic Chromophore in the Gas Phase // J. Chem. Theory Comput. 2009. V. 5. P. 18951906.

2. Polyakov 1., Epifanovsky E., Grigorenko В., Krylov A. I., Nemukhin A. Quantum Chemical Benchmark Studies of the Electronic Properties of the Green Fluorescent Protein Chromophore: 2. Cis-Translsomerization in Water // J. Chem. Theory Coinput. 2009. V. 5.P. 1907-1914.

3. Epifanovsky E., Polyakov I., Grigorenko B„ Nemukhin A., Krylov A.I. The Effect of Oxidation on the Electronic Structure of the Green Fluorescent Protein Chromophore// J. Chem. Phys. 2010. V. 132. P. 115104(1)-115104(9).

4. Topol I., Collins J., Polyakov I., Grigorenko В., Nemukhin A. On photoabsorption of the neutral form of the green fluorescent protein chromophore

// Biophys. Chem. 2009. V. 145. P. 1-6.

5. Polyakov I.V., Grigorenko B.L., Epifanovsky E.M., Krylov A.I., Nemukhin A.V. Potential Energy Landscape of the Electronic States of the GFP Chromophore in Different Protonation Forms: Electronic Transition Energies and Conical Intersections // J. Chem. Theory Comput. 2010. V. 6. P. 2377-2387.

6. Грнгоренко Б.Л., Поляков И.В., Савицкий А.П., Немухин A.B. Структурные формы зеленого флуоресцирующего белка по результатам моделирования методами квантовой и молекулярной механики// Изв. Ан. Сер. Хим. 2010. Т. 1. С. 62-67.

7. Немухин A.B., Грнгоренко Б.Л., Поляков И.В., Морозов Д.И., Хренова М.Г. Алгоритмы метода конформационно-подвижных эффективных фрагментов для моделирования превращений в активных центрах ферментов // Вестник Моск. Ун-та. Сер. Химия 2010. Т. 65. С. 427-429.

8. Немухин A.B., Грнгоренко Б.Л., Поляков И.В., Бравая К.Б., Боченкова A.B., Савицкий А.П. Моделирование строения, спектров и свойств флуоресцентных и фоторецепторных белков // Международная конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе». Россия, Пущино 2008. Материалы конференции. С. 188.

9. Поляков И.В., Грнгоренко Б.Л., Немухин A.B. Применение проблемно-ориентированной грид-среды для расчетов методами молекулярного моделирования и квантовой химии // Третья международная конференция «Суперкомпьютерные системы и их применение». Республика Беларусь, Минск 2010. Материалы конференции. С. 59.

10. Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., Polyakov I.V., Granovsky A.A. Simulations of photochemical reactions at low temperatures// 7th International Conference of Low Temperature Chemistry. Finland, Helsinki 2008. Book of Abstracts. P. 105.

11. Поляков И.В, Грнгоренко Б.Л., Немухин A.B. Моделирование цпс-транс изомеризации хромофора зеленого флуоресцентного белка // Международная конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе». Россия, Пущино 2008. Материалы конференции. С. 191.

12. Поляков И.В., Грнгоренко Б.Л., Немухин A.B. Моделирование поверхностей потенциальной энергии основного и возбужденных состояний хромофора зеленого флуоресцентного белка// VIII ежегодная международная молодежная конфернецня

ИБХФ-РАН Вузы «Биохимическая физика». Россия, Москва 2008. Материалы конференции. С. 174.

13. И.В. Поляков, Б.Л. Григоренко, А.В. Немухин. Структурные формы зеленого флуоресцирующего белка по результатам моделирования методами квантовой н молекулярной механики// XXI симпозиум «Современная химическая физика». Россия, Туапсе 2009. Материалы конференции. С. 89.

14. Поляков И. В., Григоренко Б.Л., Немухин А.В. Моделирование структуры и спектров зеленого флуоресцентного белка с помощью методов комбинированной квантовой и молекулярной механики // IX ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ-РАН Вузы «Биохимическая физика». Россия, Москва 2009. Материалы конференции. С. 205.

15. Поляков И.В. Исследование структуры и свойств зеленого флуоресцентного белка с помощью комбинированных методов квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) // Международный молодежный форум «Ломоносов-2011», секция «Химия». Россия, Москва 2011. Материалы конференции. С. 448.

16. Grigorenko B.L., Polyakov I.V., Nemukhin A.V. Modeling properties of the chroraophore from the green fluorescent protein // 1MA Annual Program Year Workshop «Mathematical and Algorithmic Challenges in Electronic Structure Theory». USA, Minneapolis MN 2008. Электронный ресурс. URL http://www.ima.umn.edu/2008-2009/W9.29-I0.3.08/abstracts.html.

17. Поляков И.В., Григоренко Б.Л., Немухин А.В. Исследование структуры и свойств зеленого флуоресцирующего белка по результатам моделирования методами квантовой и молекулярной механики // XXII симпозиум «Современная химическая физика». Россия, Туапсе 2010. Материалы конференции. С. 67.

18. Поляков И.В., Григоренко Б.Л., Немухнн А.В. Структурные формы зеленого флуоресцентного белка и его мутантов по данным комбинированного метода квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) // 7-я Всероссийская конференция «Молекулярное моделирование». Россия, Москва 2011. Материалы конференции. С. 36.

Подписано в печать 02 ноября 2011 г.

Формат 60x90/1 G

Объём 1,50 п.л.

Тираж 150 экз.

Заказ №031111398

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт»

ИНН/КПП 7728572912X772801001

Адрес: г. Москва, улица Ивана Бабушкина, д. 19/1.

Тел. 740-76-47, 989-15-83.

http ://www.univerprint.ru

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Структура и спектральные характеристики GFP.

1.2. Экспериментальные исследования хромофора GFP в газовой фазе и водной среде.

1.3. Квантово-химическое моделирование возбужденного состояния хромофора GFP в газовой фазе и водной среде.

1.4. Квантово-химическое моделирование возбужденного состояния хромофора GFP в белковой матрице.

1.5. Комбинированные методы квантвой и молекулярной механики (КМ/ММ).

1.6. Квантово-химические методы расчёта электронных спектров.

2. Моделирование поверхностей потенциальной энергии и оптических спектров хромофора GFP в газовой фазе.

2.1. Исследование поверхности возбужденного состояния S1 хромофора GFP в газовой фазе.

2.2. Моделирование спектров хромофора GFP в газовой фазе.

3. Исследование реакции цис-транс изомеризации хромофора GFP в газовой фазе и в водном окружении.

3.1. Моделирование цис-транс изомеризации хромофора GFP в газовой фазе.

3.2. Исследование цис-транс изомеризации хромофора GFP в водном растворе.

4. Спектральные свойства хромофора GFP в белковой матрице.

4.1. Моделирование структуры и спектров белка дикого типа.

4.2. Исследование влияния мутации S65T на структуру и спектры GFP.

Открытие и применение белков семейства зеленого флуоресцентного белка (ОБР) привело к лавинообразному всплеску интереса исследователей к этим объектам. Их практическая ценность объясняется возможностью маркировать цветными белками клеточные клоны и затем в буквальном смысле наблюдать за ходом внутриклеточных событий. Биотехнологические перспективы применения цветных белков связаны с многоцветной маркировкой и, в частности, с возможностями наблюдать за межбелковыми взаимодействиями в живых системах. Помимо широкого практического использования, цветные белки и их хромофоры являются интереснейшими объектами, изучению свойств которых посвящено большое число экспериментальных и теоретических работ; однако, множество проблем, связанных с особенностями строения и свойств хромофорных молекул белков семейства вРР в разных окружениях, все еще требует детального исследования.

Хромофор зеленого флуоресцентного белка, 4-(п-гидроксибензилиден)-5-имидазолинон, представляет собой достаточно большую и сложную молекулу, моделирование свойств которой методами квантовой теории становится возможным лишь в последние годы благодаря доступу к современным суперкомпьютерам тера- и петафлопного уровня и прогрессу в развитии программного обеспечения. Численными решениями уравнений квантовой химии и комбинированных подходов квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) удается надежно рассчитывать фрагменты поверхностей потенциальной энергии в основном и возбужденном состояниях молекулярных систем, моделирующих хромофор вРР в газовой фазе, растворе и в белковом окружении. Эти данные необходимы для интерпретации и уточнения результатов выполненных экспериментальных наблюдений и предсказаний свойств новых систем, включая и более эффективные в приложениях варианты цветных белков.

Цель работы - теоретическая интерпретация экспериментальных данных по спектральным свойствам хромофора зеленого флуоресцентного белка в газовой фазе, водном растворе и белке по результатам расчетов поверхностей потенциальной энергии в основном и возбужденном состояниях современными методами квантовой химии. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Рассчитать фрагменты поверхностей потенциальной энергии основного и возбужденных состояний и оценить теоретически положения полос в спектрах хромофора ОБР в различных протонированных формах в газовой фазе.

2. Построить путь цис-транс изомеризации хромофора ОБР в основном состоянии в водном растворе.

3. Предложить уточненные трехмерные модели структур ОБР на основе расчетов методами КМ/ММ.

4. На основании рассчитанных поверхностей потенциальной энергии основного Бо, возбужденного 81 состояний в газовой фазе и в белковой матрице объяснить спектральные свойства хромофора ОБР.

5. Предсказать влияние точечных мутаций на спектр ОБР в белковой матрице. Научная новизна результатов:

1. Методами квантовой химии высокого уровня точности в рамках единой расчетной схемы рассмотрены все формы хромофора ОБР.

2. Уточнена интерпретация спектра анионной формы хромофора ОБР в газовой фазе. Показано, что энергия ионизации аниона хромофора ОБР в газовой фазе меньше, чем энергия оптически разрешенного перехода тг-7г*.

3. В рамках континуальной и дискретной моделей растворителя исследована цис-транс изомеризация хромофора ОБР в воде.

4. На основании расчетов комбинированными методами квантовой механики -молекулярной механики (КМ/ММ) построены трехмерные модели ОБР.

5. По результатам расчетов методом КМ/ММ фрагментов поверхностей потенцильной энергии основного и возбужденного состояний модельных белковых систем сопоставлены теоретические и экспериментальные спектры поглощения и флуоресценции ОБР для наиболее важных форм белка. Предложена новая интерпретация превращений ОБР при фотовозбуждении. Личный вклад диссертанта заключается в сборе и анализе литературных данных, постановке задач, разработке путей решения поставленных задач, проведении вычислений методами квантовой химии, комбинированными методами квантовой механики и молекулярной механики, интерпретации результатов, подготовке публикаций и докладов по теме диссертационной работы.

Научная и практическая значимость данной работы заключается в том, что полученные результаты позволяют детализировать механизмы фотохимических реакций хромофора зелёного флуоресцентного белка в газовой фазе, растворах и белковой матрице. Результаты данной работы могут быть применены для прогнозирования свойств новых перспективных вариантов флуоресцентных белков.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Ломоносов» (Москва, 2011), Международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино 2008), VIII, IX и X ежегодных международных молодежных конференциях «Биохимическая физика» ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва 2008, 2009, 2010) , Симпозиумах «Современная химическая физика» (Туапсе 2009, 2010), 7-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2011), 2-й и 3-й Международных конференциях «Суперкомпьютерные системы и их применение» (Минск 2008, 2010).

Результаты опубликованы в 18 печатных изданиях, в том числе в 7 статьях в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень журналов ВАК РФ и в 11 тезисах докладов на конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитируемой литературы из наименований. Работа изложена на 95 страницах машинописного текста, включает 90 рисунков и 10 таблиц.

Выводы

1. Рассчитанные рельефы поверхностей потенциальной энергии возбужденного состояния хромофора вРР согласуются с наблюдаемым экспериментально отсутствием флуоресценции анионной формы в газовой фазе. Для всех протонированных состояний хромофора вРР показаны пути колебательной релаксации через конические и псевдопересечения поверхностей основного и возбужденного состояний.

2. Показано, что вертикальная энергия ионизации анионной формы хромофора вРР в газовой фазе (2.4 эВ) меньше, чем энергия возбуждения п-п* (2.6 эВ). Наблюдаемый экспериментально малоинтенсивный широкий пик в спектре поглощения анионной формы хромофора с максимумом при 2.59 эВ можно отнести к фотоотрыву электрона.

3. Показано, что спектр модельного соединения, использованного для имитации нейтральной формы хромофора вРР в газовой фазе, соответствует катионной форме. Полоса поглощения нейтрального хромофора в газовой фазе в действительности сдвинута в сторону меньших длин волн относительно белка.

4. Построены профили реакции цис-транс изомеризации хромофора ОРР в основном электронном состоянии в газовой фазе и водной среде. Для анионной формы хромофора значительное снижение барьера в воде по сравнению с газовой фазой связано с сольватацией переходного состояния.

5. Предложенные по результатам расчетов методом КМ/ММ трехмерные модели структур белка с различными состояниями хромофора уточняют параметры известных структур в базе данных РОВ.

6. По результатам расчетов методом КМ/ММ фрагментов поверхностей потенциальной энергии основного и возбужденного состояний модельных белковых систем сопоставлены теоретические и экспериментальные спектры поглощения и флуоресценции вРР для наиболее важных форм белка. Предложена уточненная интерпретация превращений в структурах вРР при фотовозбуждении.

7. Изменение спектра поглощения дикого типа вБР при точечной мутации Б65Т связано со стабилизацией анионной формы хромофора за счет перестройки сетки водородных связей в хромофор-содержащей области.

1. Tsien R. Y. The Green Fluorescent Protein // Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 509544.

2. Zimmer M. Green Fluorescent Protein (GFP): Applications, Structure, and Related Photophysical Behavior// Chem. Rev. 2002. V. 102. P. 759-781.

3. Matz M. V., Fradkov A. F., Labas Y. A., Savitsky A. P., Zaraisky A. G., Markelov M. L., and Lukyanov S. A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species.// Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. P. 969-973.

4. Labas Y. A., Gurskaya N. G., Yanushevich Y. G., Fradkov A. F., Lukyanov K. A., Lukyanov S. A., and Matz M. V. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family //Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 2002. V. 99. P. 4256-4261.

5. RCSB Protein Data Bank (PDB) // Электронный ресурс URL http://www.rcsb.org/pdb/.

6. Rao B.D., Kemple M.D., Pendergast F.G. Proton nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopic studies of segmental mobility in aequorin and a green fluorescent protein from Aequorea forkalea // Biophys. J. 1980. V. 32. P. 630-632.

7. Ward W. W., Bokman S. H. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: Physical separation and characterization of the renatured protein // Biochemistry. 1982. V. 21. P. 4535-4540.

8. Cubitt А. В., Heim R., Adams S. R., Boyd A. E., Gross L. A., Tsien R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins // TIBS. 1995. V. 20. P448-455.

9. Heim R., Prasher D. C., Tsien R. Y Wavelength mutations and postranslationalautoxidation of green fluorescent protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91.1. P. 12501-12504.

10. Dopf J., Horiagon T. M. Deletion mapping of the Aequorea victoria green fluorescent protein// Gene. 1996. V. 173. P. 39-44.

11. LiX., Zhang G., Ngo N., Zhao X., Kain S., Huang C.-C. Deletions of the Aequorea victoria green fluorescent protein define the minimal domain required for fluorescence // J.Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 28545-28549.

12. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W. W., Brasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science. 1994. V. 263. P. 802-805.

13. Brejc K.A., Sixma T.K., Kitts B.A., Kain S.R., Tsien R.Y., Ormo M., Remington S.J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Broc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 2306-2311.

14. Jung G., Wiehler J., and Zumbusch A. The Photophysics of Green Fluorescent Protein: Influence of theKey Amino Acids at Positions 65, 203, and 222 // Biophys. J. 2005. V. 88. P. 1932-1947.

15. Elsliger M.-A., Wachter R. M., Hanson G. T., Kallio K, and Remington S. J. Structural and Spectral Response of Green Fluorescent Protein Variants to Changes in Ph // Biochem. 1999. V. 3. P. 5296-5301.

16. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., and Boxer S.G. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein:Multiple states and proton transfer // Broc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 8362-8367.

17. Brejc K.A., Sixma T.K., Kitts B.A., Kain S.R., Tsien R.Y., Ormo M., Remington S.J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Broc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 2306-2311.

18. LUI M. A., Helms V. Proton shuttle in green fluorescent protein studied by dynamic simulations II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 2778-2781.

19. Weber, W.; Helms, V.; McCammon, J.; Langhoff, P. Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.1999. V. 96. P. 6177-6182.

20. Andersen L.H., Lapierre A., Nielsena S.B., Nielsen I.B., Pedersen S.U., Pedersen U. V., Tomita S. Chromophores of the green fluorescent protein studied in the gas phase // Eur. Phys. J. 2002. V. 20. P. 597-600.

21. Andersen L. H., Bluhme H., Boyet S., Jurgensen T. J. D., Krogh H., Nielsen I. B., Nielsena S. B., Svendsen A. Experimental studies of the photophysics of gas-phase fluorescent protein chromophores // Phys.Chem.Chem.Phys. 2004. V. 6. P. 2617 2621.

22. Lammich L., Petersen M. A., Nielsen M. B., and Andersen L. H. The Gas-Phase Absorption Spectrum of a Neutral GFP Model Chromophore.// Biophys. J. 2007. V. 92. P. 201-207.

23. Helms V., Winstead C., Langhoff P. W. Low-lying electronic excitations of the Green Fluorescent Protein chromophore // J. Molec. Struct. (Theochem). 2000. V. 506. P. 179189.

24. Bell A. F., He X, Wachter R. M., and Tonge P. J. Probing the Ground State Structure of the Green Fluorescent Protein Chromophore Using Raman Spectroscopy // Biochem.2000. V. 39. P. 4423-4431.

25. He X., Bell A. F., Tonge P. J. Ground state isomerization of a model green fluorescent protein chromophore // FEBSLett. 2003. V. 549. P. 35-38.

26. Vengris M., van Stokkum I. H. M., He X., Bell A. F., Tonge P. J., van Grondelle R., Larsen D. S. Ultrafast Excited and Ground-State Dynamics of the Green Fluorescent Protein hromophore in Solution II J. Phys. Chem. A. 2004. V. 108. P. 4587-4598.

27. Solntsev K. M., Poizat O., Dong J., Rehault J., Lou Y., Burda C., Tolbert L. M. Meta and Para Effects in the Ultrafast Excited-State Dynamics of the Green Fluorescent Protein Chromophores II J. Phys. Chem. B. 2008. V. 112. P. 2700-2711.

28. Toniolo A., Granucci G., Martinez T. J. Conical Intersections in Solution: A QM/MM Study Using Floating Occupation Semiempirical Configuration Interaction Wave Functions II J. Phys. Chem. A. 2003. V. 107. P. 3822-3830.

29. Martin M. E., Negri F., and Olivucci M. Origin, Nature, and Fate of the Fluorescent State of the Green Fluorescent Protein Chromophore at the CASPT2//CASSCF Resolution II J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 5452-5464.

30. Altoe P., Bernardi F., Garavelli M., Orlandi G., and Negri F. Solvent Effects on the Vibrational Activity and Photodynamics of the Green Fluorescent Protein Chromophore: A Quantum-Chemical Study II J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 3952-3963.

31. Olsen S., Smith S. C. Radiationless Decay of Red Fluorescent Protein Chromophore Models via Twisted Intramolecular Charge-Transfer States // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P.2054-2065.

32. Olsen S., Smith S. C. Bond Selectivity in the Photoisomerisation Reactions of Model GFP and KFP Chromophore Anions II J. Am. Chem. Soc. 2008. V. 130. P. 8677-8689.

33. Voityuk A. A., Michel-Beyerle M.-E., Rosch N. Protonation Effect on the Chromophore of Green Fluorescent Protein. Quantum Chemical Study of the Absorption Spectra. // Chem. Phys. Lett. 1997. V. 272. P. 162-167.

34. Olsen S., Lamothe K., Martinez T.J. Protonic Gating of Excited-State Twisting and Charge Localization in GFP Chromophores: A Mechanistic Hypothesis for Reversible Photoswitching // J. Am. Chem. Soc. 2010. V. 132. P. 1192-1193.

35. Sinicropi A., Andruniow T., Ferre N., Basosi R., Olivucci M. Properties of the Emitting State of the Green Fluorescent Protein resolved at the CASPT2//CASSCF/CHARMM Level // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 1153411535.

36. Yang F., Moss L.G., Phillips G.N. The molecular structure of green fluorescent protein // Nat. Biotech. 1996. V. 14. P. 1246 1251.

37. Zhang R.B., Nguyen M.T., Ceulemans A. A concerted mechanism of proton transfer in green fluorescent protein. A theoretical study // Chem. Phys.Lett. 2005. V. 404. P. 250256.

38. Vendrell O., Gelabert R., Moreno M., Lluch J.M. A Potential Energy Function for Heterogeneous Proton-Wires. Ground and Photoactive States of the Proton-Wire in the Green Fluorescent Protein II J. Chem. Theor. Comput. 2008. V. 4. P. 1138-1150.

39. O Vendrell O., Gelabert R., Moreno M., Lluch J.M. Operation of the Proton Wire in Green Fluorescent Protein. A Quantum Dynamics Simulation // J. Phys. Chem. B. 2008. V. 112. P. 5500-5511.

40. Jonasson G., Teuler J.-M., Vallverdu G., Merola F., Ridard J., Levy B., Demachy I. Excited State Dynamics of the Green Fluorescent Protein on the Nanosecond Time Scale II J. Chem. Theor. Comput. 2011. V. 7. P. 1990-1997.

41. Jensen F. Introduction to Computational Chemistry. John Wiley & Sons Ltd. 2007. 475 p.

42. Lin H., Truhlar D. QM/MM: what have we learned, where are we, and where do we go from here // Theor. Chem. Acc. 2007. V. 117. P. 185-199.

43. Bakowies D., Thiel W Hybrid Models for Combined Quantum Mechanical and Molecular Mechanical Approaches II J. Phys. Chem. 1996. V. 100. P. 10580-10594.

44. Rosta E., Klahn M., Wars he I A. Towards Accurate Ab Initio QM/MM Calculations of Free-Energy Profiles of Enzymatic Reactions // J. Phys. Chem. B 2006. V. 110. P. 2934-2941.

45. Gordon M.S., Freitag M.A., Bandyopadhyay P., Jensen J.H., Kairys V., Stevens W.J. The Effective Fragment Potential Method: A QM-Based MM Approach to Modeling Environmental Effects in Chemistry II J. Phys. Chem. A 2001. V. 105. P. 293-307.

46. Warshel A., Levitt M. Theoretical studies of enzymatic reactions: dielectric, electrostatic and steric stabilization of the caronium ion in the reaction of lysozyme // J. Mol. Biol. 1976. V. 103. P. 227-249.

47. Hall R.J., Hindle S.A., Burton N.A., Hiller I.H. Aspects of hybrid QM/MM calculations: the treatment of the QM/MM interface region and geometry optimization with an application to chorismate mutase // J. Comput. Chem. 2000. V. 21. P. 1433-1441.

48. Zhang Y., Lee T.-S., Yang W. A pseudobond approach to combining quantum mechanical and molecular mechanical methods II J. Chem. Phys. 1999. V. 110. P. 46-54.

49. Koch W., Holthausen M.C. A Chemist's Guide to Density Functional Theory // Wiley-VCH. 2001. 306 p.

50. Chai J., Head-Gordon M. Systematic optimization of long-range corrected hybrid density functional II J. Chem. Phys 2008. V. 128. P. 084016(1)-084106(15).

51. Adamo C., Barone V. Toward reliable density functional methods without adjustable parameters: The PBE0 model II J. Chem. Phys. 1999. V. 110. P. 6158-6170.

52. Perdew J. P., Burke K, Ernzerhof M. Generalized Gradient Approximation Made Simple II Phys. ReV. Lett. 1996. V. 77. P. 3865-3868.

53. Dunning, T. H. Gaussian Basis Sets for Use in Correlated Molecular Calculations. I. The Atoms Boron through Neon and Hydrogen //J. Chem. Phys. 1989. V. 90. P. 10071023.

54. Morokuma K. New challenges in quantum chemistry: quests for accurate calculations for large molecular systems. // Phil. Trans. R. Soc. Lond. A. 2002. V. 360. P. 1149-1164.

55. Jensen F. Introduction to Computational Chemistry. John Wiley & Sons. 2007. P. 74-77.

56. Day P., Jensen J., Gordon M., Webb S., Stevens W., Krauss M., Garmer D., Bäsch H., Cohen D. An effective fragment method for modeling solvent effects in quantum mechanical calculations II J. Chem. Phys. 1996. V. 105. P. 1968-1986.

57. Gordon M.S., Freitag M.A., Bandyopadhyay P., Jensen J.H., Kairys V., Stevens W.J. The Effective Fragment Potential Method: A QM-Based MM Approach to Modeling Environmental Effects in Chemistry II J. Phys. Chem. A 2001. V. 105. P. 293-307.

58. Granovsky A.A. Firefly version 7.I.G. // URL http://classic.chem.msu.su/gran/firefly/index.html.

59. Ponder J. W. TINKER-Sоftware Tools for Molecular Design. // URL http ://dasher. wustl. edu/tinker/.

60. Nemukhin A. V., Grigorenko B.L., Topol I.A., Burt S.K. Flexible effective fragment QM/MM method: Validation through the challenging tests // J. Comput. Chem. 2003. V. 24. P. 1410-1420.

61. Немухин A.B., Григоренко Б.Л., Грановский A.A. Молекулярное моделирование с программой PC GAMESS: от двухатомных молекул до ферментов // Вестник Моск. Ун-та, Сер. Химия 2004. Т. 45. С. 75-102.

62. Hollas J. M. Modern Spectroscopy II John Wiley & Sons, Ltd 2004. 483 p.

63. Медведев Э.С., Ошеров, B.B. Теория безызлучательных переходов в многоатомных молекулах. Москва: Наука. 1983. 280 с.

64. Foresman J.В., Head-Gordon M., Pople J.A., Frisch M.J. Toward a systematic molecular orbital theory for excited states II J. Phys. Chem. 1992. V. 96. P. 135-149.

65. ChaiJ., Head-Gordon M. Systematic optimization of long-range corrected hybrid density functionals II J. Chem. Phys 2008. V. 128. P. 084016(1)-084106(15).

66. Nakano H., Uchiyama R., Hirao K. Quasi-degenerate perturbation theory with general multiconflguration self-consistent field reference functions // J. Comput. Chem. 2002. V. 23. P. 1166-1175.

67. Granovsky A.A. Extended multi-configuration quasi-degenerate perturbation theory: The new approach to multi-state multi-reference perturbation theory // J. Chem. Phys. 2011. V.134. P. 214113(1)-214113(14).

68. Nemukhin A. V., Bochenkova A. V., Bravaya K.B., Granovsky A.A. Accurate modeling of the So-Si photo-absorption in biological chromophores // Proc. SPIE Int. Soc. Opt. Eng. 2007. V. 6449. P. 64490N1-5.

69. Nemukhin A. V., Topol I.A., Burt S.K. Electronic excitations of the chromophore from the fluorescent protein asFP595 in solutions // J. Chem. Theory Comput. 2006. V. 2. P. 292-299.

70. Das A.K., Hasegawa J.-Y., Miyahara T., Ehara M., Nakatsuji H. Electronic excitations of the green fluorescent protein chromophore in its protonation states: SAC/SAC-CI study HJ. Comput. Chem. 2003. V. 24. P. 1421-1431.

71. Bravaya K.B., Bochenkova A.V., Granovsky A.A., Nemukhin A.V. Modeling of the structure and electronic spectra of green fluorescent protein chromophore // Russ. J. Bhys. Chem. B. 2008. V. 2. P. 671-675.

72. Andersen M., Stiel A.C., Trowitzsch S., Weber G., Eggeling C., Wahl M.C., Hell S. W., Jacobs S. Structural basis for reversible photoswitching in Dronpa // Broc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007. V. 104. P. 13005-13009.

73. Nifosi R., Ferrari A., Arcangeli C., Tozzini V., Bellegrini V., Beltram F. Photoreversible Dark State in a Tristable Green Fluorescent Protein Variant // J Bhys Chem B. 2003. V. 107. P. 1679-1684.

74. Bizzarri R., Serresi M., Cardarelli F., Abbruzzetti S., Campanini B., Viappiani C., Beltram F. Single Amino Acid Replacement Makes Aequorea victoria Fluorescent Proteins Reversibly Photoswitchable II J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 132. P. 85-95.

75. Luin S., Valerio V., Lanza G., Bizzarri R., Nifosi R., Amat B., Tozzini V., Serresi M., and Beltram F. Raman Study of Chromophore States in Photochromic Fluorescent Proteins II J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 131. P. 96-103.