Моделирование структуры и спектров красных флуоресцентных белков методами квантовой химии и молекулярной динамики

Миронов, Владимир Андреевич

Моделирование структуры и спектров красных флуоресцентных белков методами квантовой химии и молекулярной динамики тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.17 ВАК РФ

Миронов, Владимир Андреевич АВТОР

кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.17 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Моделирование структуры и спектров красных флуоресцентных белков методами квантовой химии и молекулярной динамики»

Автореферат диссертации на тему "Моделирование структуры и спектров красных флуоресцентных белков методами квантовой химии и молекулярной динамики"

На правах рукописи

М'ШГ)

005060370

Миронов Владимир Андреевич

Моделирование структуры и спектров красных флуоресцентных белков методами квантовой химии и молекулярной динамики

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Специальность 02.00.17 — математическая и квантовая химия

3 О МАП 2013

Москва-2013

005060370

Диссертационная работа выполнена в лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Немухин Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Норман Генри Эдгарович Объединенный институт высоких температур РАН

кандидат химических наук, доцент Авакян Виталий Гайкович Центр фотохимии РАН

Ведущая организация:

Институт проблем химической физики РАН

Защита состоится 23 мая 2013 года в 15:00 в аудитории 446 Химического факультета МГУ на заседании диссертационного совета Д 501.001.50 при МГУ имени М.В. Ломоносова (119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Химический факультет МГУ).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: г. Москва, Ломоносовский проспект, д. 27.

Автореферат диссертации размещен на сайте Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (www.chem.msu.ru) и на сайте Высшей Аттестационной Комиссии (vak.ed.gov.ru).

Автореферат разослан «22» апреля 2013 года. Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.50 кандидат химических наук

ят

Матушкина Н.Н.

У {/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Флуоресцентные белки находят широкое применение в современной биотехнологии в качестве маркеров для исследования процессов в живой клетке. Общим структурным элементом флуоресцентных белков семейства зеленого флуоресцентного белка (ОБР) является хромофор, формирующийся на стадии посттрансляционной модификации белка. Именно молекуле хромофора флуоресцентные белки обязаны своими уникальными оптическими свойствами.

В последнее время активно исследуются красные флуоресцентные белки, полосы поглощения и флуоресценции которых лежат в области окна прозрачности (650-1300 нм) биологических тканей. С помощью красных флуоресцентных белков можно изучать намного более крупные объекты, чем при использовании ОРР. Особенно интересным классом красных флуоресцентных белков являются фотоактивируемые белки, которые способны к изменению своих фотофизических свойств под воздействием излучения с определенной длиной волны. Причиной такого поведения являются фотохимические процессы, одним из которых является изомеризация молекулы хромофора на поверхности потенциальной энергии (ППЭ) возбужденного электронного состояния. Использование белка с подобными свойствами в качестве флуоресцентной метки способно значительно повысить разрешающую способность методов детектирования и предоставляет новые возможности исследования биологических систем. Такие белки также являются перспективным материалом для изготовления трехмерных носителей информации.

Понимание процессов, протекающих во флуоресцентных белках необходимо для создания новых вариантов фотопереключаемых белков с нужными свойствами и расширения границ их применения. Современные методы компьютерного моделирования предоставляют данные, существенно дополняющие экспериментальные результаты и позволяющие прогнозировать более эффективные биомаркеры.

Цель работы

Целью работы являлось исследование процессов, происходящих преимущественно в красных флуоресцентных белках с помощью современных методов квантовой и вычислительной химии. В частности, планировалось;

1. Соотнести наблюдаемые экспериментальные полосы поглощения темной и активной форм красного белка азРР595 с различными вариантами протонирования хромофорной молекулы.

2. Исследование фотоактивации и поиск каналов безызлучательной релаксации на ППЭ возбужденного электронного состояния хромофора авРР595 в белковом окружении.

3. Исследование механизма тушения флуоресценции и термической деактивации активной формы белка азБР595.

4. Изучение влияния высокого давления на фотофизические свойства красных флуоресцентных белков семейства тРгикв.

Научная новизна результатов:

1. На основании рассчитанных энергий электронных переходов установлено, что анионная форма хромофора преобладает как в темной, так и в активной форме белка азРР595. Показано соответствие наблюдаемой полосы поглощения, ответственной за тушение флуоресценции, нейтральной форме хромофора.

2. Найдены и характеризованы структуры конических пересечений для двух конкурирующих каналов безызлучательной релаксации темной формы белка. Показано различие фотофизических свойств темной и активной форм белка азРР595.

3. Установлен механизм разгорания флуоресценции азРР595, в основе которого лежит фотоиндуцированная реакция изомеризации аниона хромофорной группы, связанная с одним из каналов быстрой безызлучательной релаксации темной формы белка через коническое пересечение возбужденного и основного электронных состояний.

4. Изучено влияние белкового окружения на положение максимума в спектре поглощения анионной формы хромофора аБрР595.

5. С помощью методов молекулярной динамики найдены структурные факторы, обуславливающие зависимость от давления таких фотофизических свойств, как длина волны поглощения и квантовый выход флуоресценции белков тргикз.

6. Построены профили энергии для процессов термической изомеризации хромофора красных флуоресцентных белков аБрР595 и КРР в белковой матрице.

Личный вклад диссертанта

Сбор и анализ литературных данных, постановка задач, разработка путей решения поставленных задач, проведение вычислений методами квантовой химии, комбинированными методами квантовой механики и молекулярной механики, методом классической молекулярной динамики, интерпретация результатов, подготовка публикаций и докладов по теме диссертационной работы.

Научная и практическая значимость

Полученные результаты позволяют детализировать механизмы фотохимических реакций протекающих в красном флуоресцентном белке азРР595, а также влияние структурных факторов на свойства белков тРгикз. Результаты данной работы могут быть применены для прогнозирования свойств новых перспективных вариантов красных флуоресцентных белков. Результаты работы могут быть рекомендованы к использованию в научно-исследовательских организациях и учебных заведениях, где выполняются исследования флуоресцентных белков, в частности, в Институте биохимии РАН, в Центре фотохимии РАН, в Институте биохимической физики РАН и Институте биоорганической химии РАН.

Публикации

Результаты работы опубликованы в 10 печатных изданиях, в том числе в 4 статьях в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов ВАК РФ, и в б тезисах докладов на конференциях.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Ломоносов» (Москва 2009), 7-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва 2011), IX ежегодной международной молодежной конференции "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва 2009), Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе 2011), 9-м Конгрессе-триеннале Всемирной ассоциации специалистов по теоретической и вычислительной химии \VATOC (Испания 2011), XIX конференции «Последние достижения в исследовании водородных связей» (Германия 2011).

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и списка цитируемой литературы из 152 наименований. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и включает 32 рисунка, 11 формул и 15 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе приведен краткий обзор современных вычислительных подходов к исследованию белковых систем.

Известны следующие подходы для моделирования свойств данных макромолекул, состоящих из тысяч атомов:

1. Методы молекулярной механики. В рамках данного подхода макромолекула описывается с помощью выбранного набора параметров связей, углов и межмолекулярных взаимодействий, называемого силовым полем. Основным недостатком подхода является сложность моделирования химических и фотохимических процессов.

2. Методы квантовой механики. Данный подход основывается на решении электронного уравнения Шредингера, с помощью которого рассчитываются силы, действующие на атомы белка. Решение этого уравнения требует большого количества вычислительных ресурсов, поэтому данный метод ограниченно подходит для моделирования белковых систем. В отличие от методов молекулярной механики квантово-механический подход позволяет изучать процессы, сопровождающиеся образованием и разрывами связей, а также протекающие в возбужденных электронных состояниях.

3. Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ). В рамках данного подхода система разделяется на две части, одна из них описывается с помощью методов квантовой механики, а другая — с помощью силовых полей. Этот метод позволяет моделировать локализованные процессы в больших системах, при этом точность результатов близка к таковой для методов квантовой механики. Количество вычислительных ресурсов при этом ограничивается размером подсистемы, моделируемой на высоком (квантовом) уровне теории.

В зависимости от исследуемого процесса использование различных подходов позволяет добиться приемлемой точности результатов за оптимальное время. В данной работе использовались все описанные выше подходы.

Во второй главе приведен обзор литературных сведений о свойствах некоторых красных флуоресцентных белков.

Способность поглощать и испускать свет в красной области спектра объясняется особенностью хромофоров данных цветных белков, сопряженная 71-система которых расширена по сравнению с хромофором зеленого флуоресцентного белка (ОБР). На текущий момент известно большое количество флуоресцентных белков, способных к изменению своих свойств под воздействием внешнего излучения (фотоактивации). В большинстве из них этот процесс наиболее эффективно протекает под воздействием ультрафиолетового излучения высокой интенсивности и является необратимым. Эффект фотоактивации объясняется различными фотохимическими процессами разрывов ковалентных связей, в частности, декарбоксилирования боковой цепи остатка 01и222 в варианте белка ОБР, или разрыва основной цепи белка (КаесЗе и т.д.).

<ЗІУ65

транс-изомер темная форма

цис-изомер активная форма

Я-С1у65

Рис. 1. Предполагаемая схема фотопереключения белка а.чРР595 -фотоизомеризация хромофора.

Уникальной способностью флуоресцентных белков авРР595 и Эгопра, а также их производных, является способность к фотопереключению - обратимой фотоактивации. Данные белки могут существовать в одной из двух форм, только одна из которых способна к флуоресценции. Переход между ними протекает под воздействием света видимого диапазона и имеет иной механизм, чем в остальных фотоактивируемых белках. Предполагается, что причиной фотопереключения является изменение конфигурации мостиковой связи хромофора (Рис. 1). При этом не происходит образования или разрушения ковалентных связей белка, что и объясняет обратимость процесса. Косвенным подтверждением данной гипотезы являются исследования различных мутантов белка авРР595 по ключевым позициям 143 и 158. Также изучение рентгенографических структур мутанта а5рР595-А1435 показало накопление г/ис-изомера хромофора при условиях фотоактивации.

Флуоресцентный белок авРР595 изначально находится в нефлуоресцирующей форме и поглощает и флуоресцирует в красной области спектра (565 и 610 нм соответственно). Переход из темной в активную форму происходит под воздействием интенсивного облучения зеленым светом (~530 нм), при этом квантовый выход флуоресценции возрастает на несколько порядков. В отличие от белка Вгопра активная форма белка Э8РР595 нестабильна и за довольно короткое время (-10 с) превращается обратно в темную форму. Также активную форму можно перевести в темную с помощью интенсивного облучения синим (-450 нм) светом.

В литературе представлена гипотеза, что процесс фотопереключения можно объяснить наличием нескольких протонированных форм хромофора - анионной, нейтральной и цвиттерионной, которые находятся в равновесии друг с другом

(Рис. 2). Предположительно только одна из этих форм способна к фотоактивации, причем ее содержание мало ввиду низкого квантового выхода реакции фотопереключения. Следует отметить, что существование цвитгерионной формы является только гипотезой, поскольку пока что не существует достоверных экспериментальных подтверждений ее существования. Расчеты показали, однако, что эту форму трудно различить в эксперименте с анионной формой, ввиду близости максимумов их поглощения. В некоторых работах было высказано предположение о том, что наблюдаемое в спектре поглощения темной формы белка азРР595 плечо 530 нм свидетельствует о равновесном существовании аниона и цвитгериона хромофора, однако данная гипотеза не была исследована детально.

сАо

к'

о-н.....О" ^^ г//

о ч<

/ >

н /:

NN 1

2'У«

—мн2 Су£62

нейтральный

цвиттерион

Рис. 2. Вверху: строение активного центра белка аиРР595. Внизу: возможные протонировапиые состояния хромофора.

Изучение свойств флуоресцентных белков, под действием высокого давления предоставляет ценные сведения о влиянии структуры хромофорного центра на фотофизические свойства белка. Флуоресцентные белки весьма устойчивы к действию высоких давлений: например, белок GFP не денатурирует и сохраняет способность к флуоресценции до ~1.5 ГПа. В то же время влияние давления на оптические свойства отличается для различных представителей данного класса белков. У большинства флуоресцентных белков воздействие высокого давления приводит к падению квантового выхода флуоресценции. Однако для некоторых флуоресцентных белков при промежуточных значениях внешнего давления (0.1-0.3 ГПа) может происходить улучшение их оптических свойств. Так, у красных флуоресцентных белков (mStrawberry, mOrange2, TagRFP-S, TagRFP-T) величина квантового выхода существенно возрастает (до 2.5 раз). Также у некоторых белков при повышенных значениях давления изменяется положение максимума флуоресценции (Citrine (+0.09 эВ), mOrange2 (-0.08 эВ), mStrawberry (+0.10 эВ)). Для белка Citrine' показано, что причиной наблюдаемого сдвига являются вызванные высоким давлением деформации бочонка хромофора, приводящие к искажению структуры хромофорного центра. Для белков mOrange2 и mStrawberry такие данные отсутствуют.

Третья глава посвящена исследованию хромофора asFP595 в белке и расчетам электронных спектров различных его протонированных форм.

Результаты расчетов показали, что образование цвитгерионной формы хромофора, предполагаемой ранее одним из основных участников фотохимических процессов в asFP595, энергетически невыгодно в основном электронном состоянии. Таким образом, можно утверждать, что цвиттерион хромофора не является преобладающим протонированным состоянием в белке и не может отвечать за пик поглощения темной формы белка. Чтобы подтвердить данный вывод, для полученных с помощью метода КМ/ММ (PBE0/cc-pVDZ//CHARMM) равновесных геометрических конфигурациях, соответствующих аниону и цвитгериону хромофора в белке, были вычислены параметры электронных S0-Si переходов с помощью расширенного метода многоконфигурационной квазивырожденной теории возмущения второго порядка (XMCQDPT2//CAS SCF (1 б, 14)/cc-pVDZ), реализованного в программном пакете Firefly.

Рассчитанное положение максимума поглощения аниона хромофора (561 нм в темной форме белка и 576 нм в активной) сдвинуто в красную область по сравнению с соответствующим пиком цвиттериона (528 нм в активной форме белка) и лучше всего совпадает с результатами экспериментов. Следовательно, хромофор преимущественно находится в виде аниона, как в темной, так и в активной форме белка asFP595. Также в работе показано, что наблюдающееся в

спектре поглощения темной формы белка asFP595 плечо 530 нм является колебательным спутником пика поглощения аниона (Рис. 3). Согласно расчетам наибольший вклад вносят несколько колебательных мод с частотами 830, 999 и 1285 см"1, относящиеся к плоским деформационным колебаниям хромофора. Первая частота соответствует колебаниям мостикового атома углерода, вторая и третья - деформациям имидазолинонового цикла.

Для модели изолированного аниона хромофора скрученные вдоль мостиковых связей конформации (Рис. 4) на возбужденном электронном состоянии Si энергетически существенно более выгодны, чем плоская конформация. Однако было обнаружено, что для модели активной формы белка в присутствии белкового окружения существует структура с плоским строением хромофора, находящегося в анионной форме, соответствующая минимуму на ППЭ состояния Si. При этом для модели темной формы белка подобная структура не локализуется. На основании данных наблюдений был сделан вывод о том, что причиной разницы в квантовом выходе флуоресценции темной (транс-хромофор) и активной (i/2/с-хромофор) форм белка asFP595 является различие в стабильности плоской конформации хромофора. Действительно, сила осциллятора электронного перехода SrSo для скрученного минимума мала (-0.01), что свидетельствует об отсутствии флуоресценции. Напротив, Si-S0 переход активен в плоском минимуме t/uc-хромофора, причем рассчитанная энергия электронного перехода (605 нм) близка к экспериментальному значению (610 нм).

Эксперименты по изучению эффективности фотохимического тушения флуоресценции активной формы белка asFP595 показали существование слабой полосы поглощения в синей области спектра с максимумом 445 нм. У аниона и цвиттериона хромофора не было найдено активного электронного перехода, энергия которого соответствовала бы такой длине волны. Таким образом, ответственной за наблюдаемую полосу поглощения в синей области спектра может быть нейтральная форма хромофора. Для оценки параметров электронных переходов с помощью метода теории функционала электронной плотности (B3LYP/6-31G*) были оптимизированы геометрические параметры нейтрального хромофора в белковом окружении. Модельные системы представляли собой молекулярные кластеры, состоящие из хромофора остатков 20 аминокислот (Gln39, Met41, Ser59, Thr60, Ser61, Cys62, Ser66, Lys67, Arg92, Glnl06, Alal43, Glul45, Serl58, Metí60, Leu 174, Glul95, Hisl97, Ilel99, Gln213 и Glu215) и 10 молекул воды. Координаты С "-атомов соответствующих остатков при этом были фиксированы. Параметры электронных переходов были определены с помощью полуэмпирического метода ZINDO.

Длина волны, нм

Рис. 3. Колебательный спутник при 530 нм. Черные и красные линии -экспериментальный и рассчитанный спектр соответственно.

Рис.4. Плоская (в центре) и скрученные структуры хромофора белка азРР595. Координаты вращения двугранных углов мостиковых связей: слева - <р (мостик-бензолъное кольцо), справа — в (мостик-имидазолиновое кольцо).

Образование нейтрального хромофора приводит к изменению сетки водородных связей в его окружении, что может привести к изменению состояния протонирования боковых цепей аминокислотных остатков, особенно ближайших к хромофору в1и215 и Ив 197. В данной работе были рассмотрены все варианты протонирования этих остатков. Расчеты показали, что длина волны электронного Эд-Э 1 перехода нейтральной формы хромофора в белковом окружении составляет 418-437 нм в зависимости от выбранной модели. Наилучший результат (по сравнению с экспериментальным значением) наблюдается в модели с непротонированным остатком Шз197 и протонированным 01и215, однако различие между полученными для этих моделей результатами мало. Таким образом, фотохимическое тушение флуоресценции может быть объяснено поглощением нейтральной формы хромофора, находящейся в равновесии с анионом, которое

существенным образом смещено в сторону последнего. Анализ структуры белка asFP595 показывает наличие канала, ведущего от кислорода фенольного фрагмента хромофора к внешней среде, который и может быть ответственен за это равновесие.

В четвертой главе приведены результаты исследований реакции фотопереключения хромофора белка asFP595. В качестве стартовой точки была взята равновесная структура, содержащая транс-анион хромофора в белке. Для исследования процессов релаксации мы использовали модель молекулярного кластера, состоящего из хромофора, боковых цепей ближайших к нему полярных аминокислотных остатков (Hisl97, Serl58, Glu215, Tyrl78, Lys67, Glul45, Thrl76, Arg92) и молекул воды. При этом координаты концевых атомов углерода этих остатков фиксировались. Поиск стационарных точек на поверхности возбужденного электронного состояния и конических пересечений So/Si проводился с помощью многоконфигурационного метода самосогласованного поля CASSCF( 12,11 )/cc-pVDZ, с активным пространством из я-орбиталей хромофора. При необходимости для обеспечения стабильности процедуры ССП использовалось усреднение по первым двум синглетным состояниям. Согласно литературным данным, переход хромофора белка GFP в возбужденное электронное состояние сопровождается увеличением основности атома азота имидазольного кольца, поэтому цвиттерион может оказаться стабильным в возбужденном электронном состоянии, в отличие от основного.

Описанная в литературе для хромофора белка GFP модель релаксации на состоянии Si по сложной двухмодовой координате реакции подходит и для хромофора белка asFP595. Согласно этой модели процесс протекает формально в две стадии. Первая стадия, для которой характерна релаксация вдоль моды плоских колебаний двойных связей, является сверхбыстрой (характерное время« 1 пс). Подобный процесс наблюдается для многих сопряженных систем, и его причиной является характерный для таких систем эффект альтернирования двойных и одинарных связей, возникающий при переходе электрона с ВЗМО на НСМО при фотовозбуждении. Для хромофора белка asFP595 подобный процесс протекает за время < 80 фс и сопровождается появлением колебательной прогрессии в спектре фотоиндуцированного поглощения. Расчет показал, что колебательная структура этой полосы поглощения действительно соответствует плоскому деформационному колебанию, локализованному на мостиковом фрагменте хромофора (Рис. 5). Для tyuc-изомера аниона хромофора в белковом окружении полученная плоская структура является минимумом на ППЭ состояния Si, и переход в основное состояние протекает далее по излучательному механизму. Для /и/лзис-хромофора подобного минимума найдено не было.

'к, нм

Рис. 5. Колебательная структура спектра фотоиндуцированного поглощения белка азРР595 и ответственная за колебательную прогрессию мода нормального колебания.

70 -

60 -

л 50 Ц

о 2

со

5 30-

о.

СП

Рис. 6. Энергетический профиль аниона и цвиттериона транс-изомера хромофора белка азРР595 в состоянии полученный методом СЛЗЗСР. Обозначения: АЫ - анион; - цвиттерион; Р, I — скрученные по углам <р и 9 структуры; С1 — коническое пересечение; тт. - минимум; р1тт. - минимум с зафиксированными значениями (р и в, соответствующими равновесной структуре транс-изомера аниона хромофора в состоянии

Дальнейшая эволюция транс-изомера аниона хромофора по поверхности состояния Б] протекает вдоль одной из двух возможных координат, соответствующих вращению мостиковых связей хромофора (<р и 6 на Рис. 4). Таким образом, путь релаксации хромофора темной формы белка авРР595 разделяется на

две ветви, только одна из которых отвечает реакции транс-цис изомеризации (что соответствует вращению связи моетик-имидазол, угол 8 на Рис. 4). С каждой из ветвей связан соответствующий скрученный минимум на ППЭ состояния Б] и коническое пересечение состояний 80 и Б]. Для транс-аниона хромофора с помощью метода 8А2-СА88СР(12,11)/сс-рУ02 были найдены геометрические конфигурации и энергии (Рис. 6) всех этих точек. Из рассчитанного энергетического профиля видно, что возможно протекание процесса вдоль координаты 0, соответствующей реакции изомеризации; однако энергетически более выгодна релаксация вдоль координаты ф. Этот факт качественно соотносится с невысоким квантовым выходом реакции фотопереключения и дополнительно свидетельствует о корректности выбранной нами модели. Для транс-цвиттериона, как и для аниона, также не было найдено стационарных точек с плоской структурой хромофора на поверхности Б]. Следует отметить, что энергия плоского минимума цвиттериона транс-изомера хромофора в состоянии Б] (при фиксированных значениях координат <р и 0) выше таковой для аниона на 1.6 ккал/моль. Коническое пересечение для цвиттериона, соответствующее координате ф вращения мостиковой связи также лежит выше по энергии, чем аналогичное коническое пересечение для аниона. Таким образом, цвиттерион энергетически менее устойчив относительно аниона не только в основном, но и в возбужденном электронном состоянии и его формирование при фотовозбуждении маловероятно. В данной работе мы привели объяснение реакции фотопереключения с помощью только анионного протонированного состояния хромофора.

Рис. 7. Карты разностной SrSo электронной плотности для равновесных структур аниона хромофора в белке asFP595 в основном электронном состоянии (XMCQDTP2, изолированный хромофор). Красный и синий цвета - увеличение и уменьшение электронной плотности при электронном переходе S0-Si.

При детальном сравнении структур скрученных минимумов со структурами

конических пересечений видно, что изомеризация сопровождается таким

изменением конфигурации боковой цепи остатка His 197, что он образует

водородную связь с атомом кислорода фенольного фрагмента хромофора. На

энергетической диаграмме это проявляется в виде значительной (~5 ккал/моль)

стабилизации конического пересечения по сравнению с соответствующим

минимумом, в котором подобная связь отсутствует. Хотя подобное изменение конфигурации остатка И$197 в реальной системе и должно быть весьма редким явлением, оно свидетельствует о том, что окружение хромофора может оказывать существенное влияние на эффективность изомеризации. Таким образом, введение определенных мутаций может существенно повысить квантовый выход реакции фотопереключения.

Пятая глава посвящена анализу влияния внешнего окружения на оптические свойства хромофора белка азРР595.

Для оценки влияния окружения на спектр аниона хромофора была проведена серия расчетов с различными вариантами квантовой подсистемы (Табл. 1). Результаты показывают, что хотя по отдельности ближайшие к хромофору аминокислотные остатки заметно сдвигают его максимум поглощения по сравнению с газовой фазой, эффект их суммарного влияния мал. Водородные связи с фенольным атомом кислорода и одним из атомов азота имидазолинонового кольца (Рис. 7 — области 1 и 2) приводят к красному сдвигу в спектре поглощения, а водородная связь с атомом кислорода имидазолинонового кольца - к синему сдвигу (Рис. 7 — область 3). Причиной этому является различная энергия взаимодействия хромофора в основном и возбужденном электронном состоянии с полярными группами: направление сдвига спектра полностью соответствует картине перераспределения электронной плотности при фотовозбуждении (Рис. 7). В первом случае электронная плотность в этих областях (1 и 2) больше в состоянии вь чем в во, поэтому энергия образования соответствующей водородной связи в возбужденном состоянии больше, чем в основном. Следовательно, относительная энергия этого состояния понижается, как и энергия фотовозбуждения. Во втором случае электронная плотность в области 3 в состоянии 8! меньше, чем в во, и энергия электронного перехода увеличивается.

Эффект влияния окружения, не входившего в КМ-подсистему, моделировался с помощью эффективных зарядов на атомах белка, величины которых были взяты из силового поля СНАНММ. Из полученных результатов (Табл. 1) также следует то, что для точного моделирования спектра флуоресцентных белков необходимо учитывать электростатическое влияние всего белка, поскольку оно сопоставимо с суммарным вкладом в энергию электронного перехода ближайших аминокислотных остатков. Величина энергии фотовозбуждения, рассчитанная с помощью метода КМ/ММ в варианте электронного внедрения, существенно сдвинута в красную сторону и ближе к экспериментальному значению по сравнению с результатами расчетов, полученных с использованием кластерных моделей фотоактивного центра.

Табл. 1. Рассчитанные (ХМС0ВРТ2) параметры вертикальных &'ГГХ] электронных переходов для хромофора темной и активной форм белка аэРРЗЯб.

Система нм Г

Хромофор 539 1.3

Хромофор + Ащ92(+) 509 1.3

и 2 Хромофор + 01и215(-) 554 1.24

со я і Хромофор + 8ег158 555 1.00

3 Й с^ Хромофор + Из197(+) 537 0.99

о Хромофор + Агб197(+) + аи215(-) 522 1.24

2 а. с Хромофор + Аг§197(+) + Бег158 541 0.97

5 ж г и ь Хромофор + Аг§197(+) + аи215(-) + 8ег158 546 1.00

Хромофор + Аг§197(+) + 01и215(-) + 8ег158 + Кз197(+) 537 0.93

Хромофор + Аг§197(+) + С1и215(-) + 8ег158 + Ш197(+) + заряды ММ 561 0.95

Хромофор 555 1.1

о. и 2 Хромофор + Аг§92 (+) 467 1.2

о СО я а о я я С Хромофор + Аг§197(+) + 01и215(-) + 8ег158 + Ш197(+) 542 0.99

а-м" з 8- Хромофор + Аг£197(+) + С1и215(-) + 8ег158 + Ш197(+) + заряды ММ 576 0.96

о -©• x и в я Хромофор 549 0.81

о я а. и £ Хромофор + А^197(+) + 01и215(-) + 8ег158 + Из197(+) 495 1.11

< я со !=Г Хромофор + Аг§197(+) + 01и215(-) + 8ег158 + Н1з197(+) + заряды ММ 528 1.12

Поскольку электростатическое влияние окружения дает существенный вклад в энергию фотовозбуждения, изменение протонированного состояния ближайших остатков должно сказываться на спектрах поглощения и флуоресценции белка. Экспериментально была показана рН-зависимость максимумов абсорбции и флуоресценции мутанта А143С белка аБрР595. Согласно этим данным при значении рН = 10 наблюдается синий сдвиг положения максимума поглощения на 10 нм. Из ближайшего окружения только сульфидная группа остатка Су б 62 обладает необходимым рКа для такого перехода, поэтому было решено проверить влияние его состояния протонирования на спектр поглощения хромофора. Поскольку поправки в энергию перехода, вносимые отдельным окружением практически аддитивны, было решено провести моделирование в упрощенном

варианте: спектр был рассчитан только для модельной системы, состоящей из хромофора и остатка Cys62 в протонированной или непротонированной форме. Координаты тяжелых атомов были взяты из геометрической структуры, полученной с помощью метода КМ/ММ. Для варианта депротонированного Cys62 дополнительной оптимизации не проводилось. В результате была получена величина сдвига 15 нм в синюю сторону, что хорошо соотносится с результатами эксперимента.

Шестая глава посвящена исследованию влияния давления на спектры красных флоуресцентных белков.

С целью объяснить наблюдаемые изменения в свойствах красных флуоресцентных белков мы провели молекулярно-динамическое исследование двух белков из семейства mFruits — mStrawberry и mCherry. Обладая схожим строением, они отличаются по своему поведению при воздействии высокого давления. Для mStrawberry наблюдается рост квантового выхода флуоресценции при повышении давления до 300 МПа; при дальнейшем повышении давления квантовый выход флуоресценции падает. Для mCherry характерно лишь уменьшение квантового выхода флуоресценции с ростом давления. Для обоих белков максимум флуоресценции постепенно сдвигается в синюю область с ростом давления, причем в случае mStrawberry при 190 МПа происходит его скачкообразное (на ~0.09 эВ) изменение.

Исследование подвижности отдельных аминокислотных остатков белка и влияния давления на общую его структуру проводилось в рамках метода молекулярной динамики. Для этого из банка данных PDB были взяты структуры белков mCherry (PDB Ш: 2H5Q) и mStrawberry (PDB ID: 2Н5Р). Положения молекул воды в полостях белка недостаточно хорошо определяются с помощью рентгеноструктурного анализа, поэтому они были определены при помощи программы Dowser. Расчеты молекулярно-динамических траекторий были выполнены для нескольких значений внешнего давления в диапазоне от 0.1 до 1500 МПа с помощью программного пакета NAMD с использованием силового поля CHARMM. Для получения структур, пригодных к расчету спектров, с помощью программного пакета СР2К проводилась дополнительная КМ/ММ молекулярная динамика (BLYP-D/QZV2P//CHARMM) с последующей оптимизацией нескольких кадров траектории. Параметры электронных переходов были рассчитаны методом конфигурационного взаимодействия с однократными и выборочными двукратными возбуждениями с поправкой по теории возмущений второго порядка (SOS-CIS(D)/cc-pVDZ+//CHARMM), реализованным в программном пакете Q-Chem.

Анализ полученных классических молекулярно-динамических траекторий показал, что белки mStrawberry и mCherry существенно отличаются по

подвижности их структуры. У первого белка она больше, что проявляется в больших флуктуациях основной цепи, а также существовании двух конформеров тЗй-аи'Ьеггу (К1 и К2, Рис. 8) с различной ориентацией 8ег146 относительно хромофора. Следовательно, для белка тЗй-ахуЬегту стоит ожидать более выраженный эффект влияния давления на оптические свойства, по сравнению с белком щСИеггу.

В целом рост давления сопровождается уменьшением подвижности атомов обоих белков. При этом подвижность внешней части |3-бочонка больше, чем внутренней, что объясняется плотной структурой флуоресцентных белков. Повышение давления не приводит к какой-либо заметной деформации хромофора белка, которая могла бы объяснить наблюдаемые изменения в спектрах флуоресценции. Однако конфигурация сети водородных связей хромофорного центра и число молекул воды внутри белка в значительной мере зависят от внешнего давления. При высоких значениях (>900 МПа) давление становится достаточным, чтобы вдавить молекулы воды внутрь белка т81ха\уЬеггу, при этом наблюдается деформация бета-бочонка. Предположительно, наблюдаемое явление — первая стадия денатурации белка под действием высокого давления.

Рис. 8. Возможные положения остатка Бег146 в белке тБггаыЬеггу - К1 (сверху) и К2 (снизу).

Сдвиг положения максимума поглощения/флуоресценции можно объяснить двумя факторами: изменением энергии возбуждения отдельных конформаций белка с ростом давления (К1 — небольшой красный сдвиг, К2 — синий сдвиг) и изменением относительной концентрации двух конформаций. Оценка сдвига энергии фотовозбуждения (+0.04 эВ) согласуется с экспериментальным сдвигом максимума флуоресценции (+0.09 эВ). Рост квантового выхода флуоресценции белка т81галМэеггу можно объяснить как изменением соотношения конформаций К1 и К2, квантовый выход которых может отличаться, так и уменьшением числа молекул воды внутри белка, наблюдаемых при умеренных значениях давления (<900 МПа). Оба тренда соответствуют наблюдаемому росту и последующему падению квантового выхода флуоресценции. Согласно полученным в работе данным можно сделать вывод, что подобному эффекту подвержены в основном флуоресцентные белки с относительно подвижной структурой, тогда как у более жестких флуоресцентных белков квантовый выход флуоресценции уже при нормальном давлении близок к максимально возможному для данного белка значению. Существенное увеличение интенсивности флуоресценции для некоторых флуоресцентных белков может быть признаком существования нескольких конформеров данного белка при атмосферном давлении. Из результатов также следует то, что причина низкого квантового выхода некоторых флуоресцентных белков может иметь динамическую природу и зависит от подвижности структуры и флуктуаций в сети водородных связей фотоактивного центра, а не от их строения.

Седьмая глава посвящена моделированию процесса термической изомеризации хромофора белка азБР595 и его мутантов в основном электронном состоянии.

Время жизни активной формы разгорающегося флуоресцентного белка связано с барьером термической цис-транс изомеризации хромофора. У природного белка \vt-asFP595 время полупревращения флуоресцирующей формы весьма мало (не превышает 10 с), что затрудняет его применение в качестве флуоресцентного биомаркера. Попытки улучшить эту характеристику с помощью мутагенеза показали, что замена остатка А1а143 на глицин (мутант КРР) приводит к увеличению этого времени на порядок (~50 с). Для изучения данного процесса мы провели расчет профиля свободной энергии Гельмгольца вдоль координаты реакции изомеризации хромофора для белков аБрР595 и КРР с помощью метода зонтичной выборки. Молекулярно-динамические траектории были получены в программе СР2К с помощью приближения КМ/ММ. Силы на атомах КМ части, включавшей в себя хромофор, остатки Ьуэ67, А^92, С1и145, 8ег158, 01и195, Шб197, 01и215 и несколько молекул воды, были получены с помощью метода ОРТ (ВЬУР/£>2У2Р). ММ-подсистема описывалась силовым полем СНАЯММ. Профиль

свободной энергии был рассчитан с помощью метода взвешенного анализа гистограмм. Результаты расчета приведены в таблице 2.

Расчеты показывают хорошее качественное согласие с экспериментом. Следует отметить, что в отличие от белка азРР595, для мутанта КРР наблюдается существенное отличие рассчитанного значения времени полупревращения от экспериментальной величины Однако это соответствует ошибке при оценке энергии барьера в ~0.5 ккал/моль, что близко к погрешности используемого метода (ВЬУР). Таким образом, выбранная методика хорошо подходит для описания подобных процессов во флуоресцентных белках. Из полученных данных также следует то, что нейтральная форма хромофора не участвует в процессе изомеризации в основном состоянии: величина барьера составляет 38.8 ккал/моль, что на 19.8 ккал/моль больше, чем для анионного хромофора.

Табл. 2. Термодинамические характеристики процесса термической цис-транс изомеризации белка азРР595 и его мутанта КРР.

Модельная система ДР цис—транс» ккал/моль к. ДР# ш цис—транс» ккал/моль к, с"1 Ті/2, С Ті/2(зксп.), с

\vt-asFP595, анион 7.3 4.710-* 19.0 8.7 Ю-2 8.0 7

КРР, анион 11.8 2.5-1СГ9 20.7 4.7-Ю-3 148 -50

■^-азРР595, нейтр. 5.2 1.610"4 38.8 3.5 • 10"16 2.0 1015 -

Рассчитанные профили свободной энергии также могут быть использованы для расчета изменения рКа хромофора при изомеризации. Согласно полученным результатам транс-изомер хромофора является более сильной кислотой, по сравнению с і/ис-изомером, что приводит к повышению доли нейтрального хромофора в активной форме белка. Различие составляет 1.52 величин рКа. Согласно предыдущим исследованиям хромофора белка азРР595 в газовой фазе различие должно составлять 1.42 величины рК^. Таким образом, в данном случае окружение слабо влияет на кислотно-основные свойства изомеров хромофора.

Выводы:

1. Показано, что анионная форма хромофора преобладает как в темной, так и в активной форме белка азРР595. Подтверждено отнесение наблюдаемой полосы поглощения авРР595, ответственной за тушение флуоресценции, к нейтральной форме хромофора.

2. Причиной высокого квантового выхода флуоресценции активной формы белка азїїР595 является плоское строение г/гл>изомера хромофора в белке в возбужденном электронном состоянии. Для транс-изомера хромофора темной

формы белка характерны два основных канала безызлучательной релаксации в основное электронное состояние, связанных с вращением мостиковых связей. Оба канала отвечают коническим пересечениям поверхностей потенциальной энергии So и Si.

3. В основе процесса фотоактивации белка asFP595 лежит фотоиндуцированная реакция изомеризации аниона хромофора, связанная с одним из каналов быстрой безызлучательной релаксации. Низкий квантовый' выход фотоактивации объясняется особенностями топографий соответстйующего конического пересечения и потенциальной поверхности состояния Si вблизи точки вертикального электронного перехода.

4. Показано, что основной канал термической деактивации флуоресцирующей формы белка asFP595 соответствует структурам с анионной формой хромофора.

5. Основное отличие белков mCherry и mStrawberry по отношению к внешнему давлению объясняется различной подвижностью их структур. Изменение оптических свойств белка mStrawberry связано с наличием двух конформеров белка, соотношение которых зависит от внешнего давления.

Основные публикации по теме диссертации:

1. A.L. Rusanov, V.A. Mironov, A.S. Goryashenko, B.L. Grigorenko, А.У. Nemukhin, A.P. Savitsky Conformational partitioning in pH-induced fluorescence of the kindling fluorescent protein (KFP) II J. Phys. Chem. В 2011. V. 115. P. 9195- 9201.

2. I. Shelaev, V. Mironov, A. Rusanov, F. Gostev, A. Bochenkova, O. Sarkisov, A. Nemukhin, A. Savitsky The origin of radiationless conversion of the excited state in the kindling fluorescent protein (KFPb): femtosecond studies and quantum modeling II Laser Phys. Lett. 2011. V. 8. P. 469-474.

3. I. Topol, J. Collins, V. Mironov, A. Savitsky, A. Nemukhin Modeling absorption of the kindling fluorescent protein with the neutral form of the chromophore // Int. J Quant Chem. 2012. V. 112. P. 2947-2959.

4. A.D. Laurent, V.A. Mironov, P.P. Chapagain, A.V. Nemukhin, A.I. Krylov Exploring structural and optical properties of fluorescent proteins by squeezing: Modeling high-pressure effects on the mStrawberry and mCherry red fluorescent proteins // J. Phys. Chem. В 2012. V. 116. P. 12426-12440.

5. B.A. Миронов Моделирование фотофизических свойств разгорающегося флуоресцентного белка asFP595 // XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Россия, Москва 2009. Электронный ресурс ISBN 978-5-317-02774-2.

6. В.А. Миронов, А.В. Боченкова Моделирование структуры и спектров разгорающегося флуоресцентного белка asFP595 // IX ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы. Россия, Москва 2009. Материалы. С. 170.

7. V.A. Mironov, A.V. Bochenkova, A.V. Nemukhin Photophysical properties of the kindling fluorescent protein // Ninth Triennial Congress of the World Association Of Theoretical And Computational Chemists WATOC. Spain, Santiago de Compostela 2011. Book of abstracts. C.6. P.201.

8. V.A. Mironov, A.V. Bochenkova, A.V. Nemukhin Non-covalent interactions influence on asCP chromophore absorption spectra // XIX Conference on Horizons in Hydrogen Bond Research. Germany, Gottingen 2011. Book of abstracts. P. 188.

9. В.А. Миронов, К.Б. Бравая, А.В. Боченкова, А.В. Немухин Моделирование фотофизических свойств хромопротеина asFP595. // 7ая Всероссийская конференция «Молекулярное моделирование». Россия, Москва 2011. Материалы. С. 90.

10. В.А Миронов, А.В. Боченкова, А.В. Немухин Исследование фотофизических свойств белка asFP595 методами квантовой химии. // XXIII Симпозиум «Современная химическая физика». Россия, Туапсе 2011. Материалы. С. 235236.

Подписано в печать 15 апреля 2013 г.

Формат 60x90/16

Объём 1,0 п л.

Тираж 150 экз.

Заказ № 190413469

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт»

ИНН/КПП 7728572912X772801001

Адрес: г. Москва, улица Ивана Бабушкина, д. 19/1.

Тел. 740-76-47, 989-15-83.

ИПр://ит\л\\ ип1\егрпп1. ш

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата физико-математических наук, Миронов, Владимир Андреевич, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

МИРОНОВ ВЛАДИМИР АНДРЕЕВИЧ

МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И СПЕКТРОВ КРАСНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ МЕТОДАМИ КВАНТОВОЙ ХИМИИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ

Специальность 02.00Л 7 - математическая и квантовая химия

ОФ Диссертация на соискание ученой степени

^ кандидата физико-математических наук

«о со

Ю £ СО 8

см

q Научный руководитель

доктор химических наук профессор A.B. Немухин

Москва-2013

Оглавление

Введение................................................................................................................4

1. Современные методы моделирования структуры и свойств белковых систем...................................................................................8

1.1. Моделирование структуры белков........................................................8

1.1.1. Метод молекулярной механики......................................................8

1.1.2. Методы квантовой механики........................................................10

1.1.3. Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ).....................................................................................11

1.2. Методы исследования возбужденных электронных состояний.........................................................................................................13

1.3. Классическая молекулярная динамика...............................................17

2. Экспериментальные и теоретические исследования красных флуоресцентных белков а8РР595 и семейства шРгийв.................................................................................................................19

2.1. Структура и фотофизические свойства белка азРР595 .....................20

2.1.1. Общие сведения о фотопереключаемых белках..........................20

2.1.2. Строение белка азРР595.................................................................22

2.1.3. Схема фотопереключения..............................................................27

2.1.4. Оптические свойства белка азРР595.............................................28

2.1.5. Теоретические исследования белка аэРР595 ...............................33

2.2. Белки семейства тРшИэ.......................................................................39

3. Моделирование спектров белка азЕР595..............................................42

3.1. Анион и цвиттерион хромофора..........................................................42

3.1.1. Равновесные геометрические конфигурации..............................42

3.1.2. Спектры поглощения......................................................................44

3.2. Нейтральная форма хромофора...........................................................48

3.3. Колебательная структура спектров поглощения белка азРР595.............................................................................................................52

3.4. Флуоресценция активной формы белка азРР595 ...............................54

4. Исследование процессов безызлучателыюй деактивации хромофора белка а8ГР595................................................................................57

4.1. Методика расчетов................................................................................57

4.2. Результаты..............................................................................................58

4.2.1. Влияние фотовозбуждения на электронную структуру хромофора....................................................................................................58

4.2.2. Изучение процесса релаксации транс-изомера хромофора на ППЭ состояния Б і...............................................................61

5. Влияние окружения на оптические свойства хромофора.................67

5.1. Зависимость энергий электронных переходов от окружения хромофора....................................................................................67

5.2. Влияние окружения на возбужденное состояние хромофора........................................................................................................70

6. Исследование влияния давления на белки семейства тРгиШ.................................................................................................................72

6.1. Методика расчетов................................................................................72

6.2. Результаты..............................................................................................76

6.2.1. Проверка модели.............................................................................76

6.2.2. Зависимость структурных факторов от давления.......................78

6.2.3. Спектры поглощения белка т81га\уЬеггу.....................................87

6.3. Заключение.............................................................................................95

7. Термическая изомеризация хромофора белка авЕР595 и

его мутантов.......................................................................................................97

7.1. Методика расчетов................................................................................97

7.2. Результаты...........................................................................................100

7.2.1. Анион хромофора в белках азРР595 и КїїР..............................100

7.2.2. Нейтральная форма хромофора в белке азРР595 ..................... 101

Выводы.............................................................................................................104

Список литературы.......................................................................................105

Список сокращений.......................................................................................120

Введение

Флуоресцентные белки находят широкое применение в современной биотехнологии в качестве маркеров для исследования процессов в живой клетке. Общим структурным элементом флуоресцентных белков семейства зеленого флуоресцентного белка (вРР) является хромофор, формирующийся на стадии посттрансляционной модификации белка. Именно молекуле хромофора флуоресцентные белки обязаны своими уникальными оптическими свойствами.

В последнее время активно исследуются красные флуоресцентные белки, полосы поглощения и флуоресценции которых лежат в области окна прозрачности (650-1300 нм) биологических тканей. С помощью красных флуоресцентных белков можно изучать намного более крупные объекты, чем при использовании вРР. Особенно интересным классом красных флуоресцентных белков являются фотоактивируемые белки, которые способны к изменению своих фотофизических свойств под воздействием излучения с определенной длиной волны. Причиной такого поведения являются фотохимические процессы, одним из которых является изомеризация молекулы хромофора на поверхности потенциальной энергии (ППЭ) возбужденного электронного состояния. Использование белка с подобными свойствами в качестве флуоресцентной метки способно значительно повысить разрешающую способность методов детектирования и предоставляет новые возможности исследования биологических систем. Такие белки также являются перспективным материалом для изготовления трехмерных носителей информации.

Понимание процессов, протекающих во флуоресцентных белках необходимо для создания новых вариантов фотопереюпочаемых белков с нужными свойствами и расширения границ их применения. Современные методы компьютерного моделирования предоставляют данные, существенно дополняющие экспериментальные результаты и позволяющие прогнозировать более эффективные биомаркеры.

Цель работы - исследование процессов, происходящих преимущественно в красных флуоресцентных белках с помощью современных методов квантовой и вычислительной химии. В частности, планировалось:

2. Исследование фотоактивации и поиск каналов безызлучательной релаксации на ППЭ возбужденного электронного состояния хромофора аэРР595 в белковом окружении.

3. Исследование механизма тушения флуоресценции и термической деактивации активной формы белка азРР595.

4. Изучение влияния высокого давления на фотофизические свойства красных флуоресцентных белков семейства тРгикз.

Научная новизна результатов:

4. Изучено влияние белкового окружения на положение максимума в спектре поглощения анионной формы хромофора азРР595.

6. Построены профили энергии для процессов термической изомеризации хромофора красных флуоресцентных белков азРР595 и КБР в белковой матрице.

Личный вклад диссертанта заключается в сборе и анализе литературных данных, постановке задач, разработке путей решения поставленных задач, проведении вычислений методами квантовой химии, комбинированными методами квантовой механики и молекулярной механики, методом классической молекулярной динамики, интерпретации результатов, подготовке публикаций и докладов по теме диссертационной работы.

Научная и практическая значимость данной работы заключается в том, что полученные результаты позволяют детализировать механизмы фотохимических реакций протекающих в красном флуоресцентном белке азРР595, а также влияние структурных факторов на свойства белков тРгикэ. Результаты данной работы могут быть применены для прогнозирования свойств новых перспективных вариантов красных флуоресцентных белков.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Ломоносов» (Москва 2009), 7-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва 2011), IX ежегодной международной молодежной конференции "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва 2009), Симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе 2011), 9-м Конгрессе-триенпале

Всемирной ассоциации специалистов по теоретической и вычислительной химии \\^АТОС (Испания 2011), XIX конференции «Последние достижения в исследовании водородных связей» (Германия 2011).

Результаты опубликованы в 10 печатных изданиях, в том числе в 4 статьях в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень журналов ВАК РФ и в 6 тезисах докладов на конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и списка цитируемой литературы из 152 наименований. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и включает 32 рисунка, 11 формул и 15 таблиц.

1. Современные методы моделирования структуры и свойств белковых систем

В данной главе приведен краткий обзор современных методов вычислительной химии, используемых для моделирования процессов, протекающих в белках. Ввиду большого размера и сложности таких систем теоретическое и экспериментальное их исследование сопряжено со значительными трудностями. Поскольку полностью макромолекулу белка практически невозможно описать с помощью традиционных методов квантовой химии, широкое распространение в данной области получили параметрические методы, использующие для описания белка силовые поля, и гибридные методы. Поскольку единого подхода для решения всех классов задач, связанных с белками, не существует, критически важен правильный выбор метода для решения поставленных задач. В то же время, правильно комбинируя различные подходы можно моделировать системы любой сложности и получать при этом корректные результаты.

1.1. Моделирование структуры белков

1.1.1. Метод молекулярной механики

В основе метода молекулярной механики лежит идея о том, что энергию системы можно представить в виде простой параметрической функции, зависящей только от координат ядер атомов, входящих в систему [1-3]. При этом все необходимые параметры определяются заранее и постоянны в ходе моделирования. Обычно, потенциальная энергия системы представляется следующим образом:

= ^хСг "1" Еьепс1 "I" Еуйу, + Ее1ес + (1)

где Еш - полная энергия молекулы; Е$1г - энергия деформации связей; ЕЪспс1 — энергия деформации валентных углов; Е,0ГЗ - энергия деформации торсионных углов; - энергия ван-дер-ваальсовых взаимодействий; Ее!ес - энергия электростатического взаимодействия. Подобное представление часто называют в литературе моделью «шариков и пружин», где шариками являются атомы системы, а пружины - связи между ними. Набор

независимых параметров, входящих в уравнение потенциальной энергии системы называют силовым полем.

Энергетический вклад деформации связей и валентных углов выражают через следующие уравнения:

Е5(г=~Ь(Ь-Ь0)2, (2)

где кь - силовая константа растяжения связи; Ьо - стандартная длина связи; Ь - текущая длина связи.

Еьепа ~ ~ ~ (3)

где кд - силовая константа деформации валентных углов; 0О - равновесное значение валентного угла; 0 - текущее значение валентного угла.

Вклад вращения двугранных углов в потенциальную энергию является периодической функцией от величины соответствующего угла и обычно задается с помощью суммы потенциалов следующего вида:

ЕЬогз = + совСп?» - (ро)), (4)

где к<р - торсионный барьер (барьер вращения); ср - текущее значение торсионного угла; п - период (число минимумов энергии на один полный цикл); сро - стандартное значение торсионного угла.

Ваи-дер-ваальсовы взаимодействия между не связанными атомами обычно выражаются потенциалом Леннарда-Джонса:

^уйю ~ ¿-I 12 6' 7 Ч Ч/

где Ау - коэффициент вклада отталкивания, Ву - коэффициент вклада притяжения; - расстояние между атомами / и у.

Электростатические взаимодействия описываются кулоновским потенциалом:

ье1еа —

где е - диэлектрическая проницаемость; Q¡, ()2 - заряды на взаимодействующих атомах; г - межатомное расстояние.

Главным достоинством метода молекулярной механики является простота описания системы, низкие требования к вычислительным

ресурсам и высокая вычислительная масштабируемость. Это позволяет изучать системы, содержащие сотни тысяч и даже миллионы атомов, а также исследовать их динамическое поведение (молекулярная динамика).

Гармоническое приближение, лежащее в основе современных силовых полей, существенно ограничивает использование для моделирования химических процессов и систем, значительно возмущенных по сравнению с равновесным состоянием. Также в подавляющем большинстве силовых полей отсутствуют перекрестное влияние различных компонентов друг на друга. Все это приводит к тому, что разрыв и образования связей сложно описать с помощью методов молекулярной механики [1]. Для исследования каждой реакции необходимо конструировать отдельное силовое поле, что является весьма трудоемким процессом. Репараметризация силового поля также необходима при исследовании возбужденных электронных состояний. Для таких целей значительно более удобным и точным (но и более трудоемким) является квантовомеханический подход. Также, важным ограничивающим фактором применения этих методов является зачастую низкая точность результатов.

1.1.2. Методы квантовой механики

Квантовомеханические методы широко используются для исследования химических реакций и возбужденных электронных состояний небольших систем. В большинстве методов квантовой химии используется так называемое адиабатическое приближение, позволяющее отделить электронные переменные от ядерных в уравнении Шредингера. Таким образом, для каждой интересующей исследователя геометрической конфигурации атомов решается электронное уравнение Шредингера, в которое ядерные координаты входят в качестве параметров. На текущий момент существует достаточно большой набор используемых методов квантовой химии. К ним относятся такие методы, как метод Хартри-Фока, метод конфигурационного взаимодействия (КВ), многоконфигурационный метод самосогласованного поля (МКССП), теория функционала плотности

и различные методы теории возмущений. Существует большое количество обзоров и книг (например, [1,4]), посвященных теоретическим аспектам этих методов, поэтому останавливаться на описании отдельных методов мы не будем. Отдельно лишь будут обсуждаться методы исследования возбужденных электронных состояний.

Основным недостатком данных методов является огромные вычислительные ресурсы (по сравнению с методами молекулярной механики), необходимые для их применения. На текущий момент традиционные неэмпирические методы квантовой механики можно использовать для изучения систем, содержащих не более нескольких сотен атомов. В то же время большинство белков состоят из тысяч атомов, что делает их исследование квантовохимическими методами чрезвычайно сложной задачей.

Одним из подходов, позволяющих изучать процессы внутри белка с помощью квантовой химии, является приближение внедренного кластера [5]. В данном приближении из всей белковой системы выделяется лишь интересующая исследователя часть и ее ближайшее окружение. При этом взаимодействие выделенного фрагмента с остальным белком игнорируется. Основной идеей метода является то, что основной влияние на интересующий процесс внутри белка оказывает небольшое число белковых остатков. Чтобы удержать выделенный фрагмент в соответствии с белковой стр�