Получение и физико-химическая характеристика модифицированных флуоресцентными метками альбумина, инсулина и моноклональных антител к инсулину тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РТ5 О»

, ^ ¡(¿\\ V:'- АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

' ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

ЦС 577.112.4.083.3

Петроченко Евгений Васильевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ФИЗИК0-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ МЕТКАМИ АЛЬБУМИНА, ИНСУЛИНА И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ИНСУЛИНУ.

2.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МИНСК 1996 г.

Работа выполнена в Институте биоорганической химии Академии наук Беларуси.

Научный руководитель: доктор химических наук Киселев П.А.

Официальные оппоненты; доктор химических наук Усанов С.А.,

кандидат биологических наук Курченко В.П

Оппонирующая организация: Институт фотобиологии АН Беларуси.

Защита состоится " 1996 г. в /О .ч. на заседани

совета по защите диссертаций Д 01.21.01 в Институт

биоорганической химии Академии наук Беларуси по адресу: 220141, Минск, ул.Жодинская, 5/2.

р диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт биоорганической химии АН Беларуси.

Автореферат разослан "_

11996 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций,

кандидат химических наук Н.М.Литвинко

Институт биоорганической химии АН Беларуси

Актуальность темы диссертации. Модификация белков уореецентными метками имеет разнообразное научное и актическое применение. Введение флуоресцентных репортерных упп в молекулы белков позволяет получать уникальную информацию конфирмационной динамике белка, межбелковом и белок-липидном аимодействии, характеризовать надмолекулярную организацию и ее ль в реализации функционально важных процессов биологических руктур. Использование Флуоресцентной модификации антител и гигенов привело к появлению флуоресцентной гистохимии и гохимии, флуоресцентного иммуноанализа, флуоресцентных готоксических иммуноконыогатов. Дальнейшее развитие химии 1?оресцентныя меток и модификации белка позволит расширить сгпериментальну» базу как исследования функционирования белковых аекул, так и применения флуоресцентных коньюгатов белков, веналравленная флуоресцентная модификация антител важна для аснения выраженности и роли конформационной динамики и гментной подвижности антител при взаимодействии с антигеном и глизацни эффекторных функций. Яа использовании коньюгирования »ков с флуоресцентными метками основано создание новых схем <огенного Флуоресцентного анализа и биосенсоров. Использование горесцентных коньюгатов имеет большое значение для разработки зых лекарственных агентов для фотодинамической терапии рака, гчения молекулярных механизмов фототоксического действия горофоров, построения фотоактивируемых молекулярных

1СТРУКЦИЙ.

Связь работы с крупными научными программами, темами. гсертационная работа выполнялась в рамках плановых научных гледований лаборатории механизмов и кинетики ферментативных >цессов института биоорганической химии АНБ, включенных в »есоюзную программу 0.74.05 "Разработать новые направления гледований генетического аппарата, биополимеров и структур ;тки и внедрить достижения молекулярной биологии в народное $яйство", в рамках республиканской научно-технической программы 1форматика".

Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась разработке новых подходов получения Флуоресцентно меченых 1Ков, выяснения принципов их функционирования и создании схем •екцни белок-белкового и белок-лигандного взаимодействия. [Вились следующие задачи исследования: 1) получить

высокочувствительную к изменению полярности микроокружени флуоресцентную метку с максимумом флуоресценции в красной облает спектра и изучить возможность детекции с ее помощью межбелковог взаимодейевия и взаимодействия антиген-антитело; 2} разработат подходы к получению селективно модифицированных антигено и антител; 3) изучить физико-химические свойства коньюгато флуоресцентных Фотосенсибилизаторов с белками.

Научная новизна полученных результатов. Впервые на основ нильского красного синтезирована флуоресцентная метка уникальной чувствительностью параметров люминисценции микроокружению . Показана возможность ее использования дл селективной модификации белков и применения полученных коньюгато для детекции бедок-белкового взаимодействия. Получен: флуоресцентно меченые моноклональные антитела, чувствительные взаимодействию с немодифицированным антигеном. Разработана схем однокомпонентной детектирующей системы инсулина на основ селективно модифицированных анти-инсулиновых антител. На основ метода обратно-фазовой ВЭЖХ разработан новый подход для получени набора селективно модифицированных распространенным

Флуоресцентными метками белков. Дано дальнейшее развити представлению о поверхность-опосредованном взаимодействи модифицированных белков с обратно-фазовым сорбентом. Впервы изучены фотофизические параметры ковалентных коньюгатов хлорин еб с альбумином и иммуноглобулииом человека. Установлена обратна зависимость квантового выхода синглетного и триплетного состояни фотосенсибилизатора в коньюгате от молярного соотношения порфири : белок без изменения времени жизни возбужденного состояния Исследован механизм фотохимических реакций комплексов альбумина хлорином еб и триптофаном в близких к in vivo условиях. Впервы показана возможность вовлечения лигандов сывороточного альбумин человека в фотосенсибилизированные окислительные реакции.

Практическая . значимость полученных результатов. Нова флуоресцентная метка, NHS-DBF, может быть применена для синтез коньюгатов физиологически активных веществ и изучения и специфического взаимодействия с биомолекулами. Схемы детекци взаимодействия антиген-антитело имеют прямое отношение технологиям Флуоресцентного иммуноанализа и биосенсоров Фотофизические характеристики коньюгатов хлорина еб с белкам являются основой для оптимизации модификации флуоресцентным

ф от о с ен си би л и за т оран и противоопухолевых моноклональных антител для использования в фотодинамической терапии рака. Результаты по окислению лигандов альбумина при фотосенсибилизации хлорином еб могут быть использованы для развития концепции применения Фотоактивируемых лекарств для лечения злокачественных образований.

Экономическая значимость результатов. Разработанные схемы гомогенного иммуноанализа могут быть использованы для создания коммерческих иммунодиагностикумов. Подходы получения наборов селективно модифицированных белков могут быть использованы для наработки коммерчески значимых флуоресцентных коныогатов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Синтез и применение Н-гидроксисукцинимидного эфира диэтиламинббензфеноксазиноноксиуксусной кислоты в качестве новой флуоресцентной метки, высоко чувствительной к полярности среды, с максимумом флуоресценции в красной области спектра.

2. Разработка схемы детекции взаимодействия антиген-антитело, основанной на частичном экранировании Флуоресцентной метки в области межбелкового контакта.

3. Разработка на основе представлений о поверхность-опосредованном взаимодействии флуоресцентно модифицированных эелков с обратно-фазовым сорбентом подхода для получения набора селективно меченых флуорофорами белков методом обратно-фазовой }ЭЖХ.

1. Исследование фотофизических характеристик белковых коныогатов флуоресцентного фотосенсибилизатора хлорина еб в зависимости от 1лотности посадки молекул флуорофора и природы бедка.

Изучение роди лигандов сывороточного альбумина человека в 1РОцессах окисления, фотосенсибилизированных хлорином еб.

Личный вклад соискателя. Результаты по активации флуорофоров, модификации антигенов и антител Флуоресцентными метками, разделению изомеров Флуоресцентно меченых белков, изучению :войств флуоресцентеных коныогатов и механизмов фотоокислмтельуадх 1роцессов получены лично автором. Синтез

1иэтиламино6ензфеноксазиноноксиуксусной кислоты осуществлен ИФ ЛЯ БССР, кривые кинетики затухания

[.Н.Алексеевым

флуоресценции получены к.Ф.-м.н. С.М.Бачило, ИМАФ АНБ. В эбсуаденин результатов, связанных с фотодинамической терапией >ака принимал участие к.ф.-м.н. Г.А.Кочубеев. В постановке темы

диссертационного исследования и обсуждении полученных результатов принимал участие д.х.н. П.А.Киселев.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации доложены на IV международном симпозиуме по количественной люминисцентной спектрометрии в биомедицинских науках (Гент, Бельгия, 1991), II съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1996), 12-ом международном конгрессе пс фотобиологии (Вена, Австрия, 1996), 15-ом Европейском совещания по метаболизму лекарств (Йена, ФРГ, 1996).

Опубанкованность_результатов. Основные результаты

диссертационной работы изложены в 2-х статьях, 7-ми тезиса? докладов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит и: введения, общей характеристики работы, обзора литературы, экспериментальной части, материалов и методов, списка использованных источников. Работа изложена на 136 страница) машинописного текста, содержит 43 рисунка и 4 таблицы. Список использованных источников включает 264 наименования.

СИНТЕЗ И СВОЙСТВА КОНЬКЗГАТОВ С НОВОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МЕТКОЙ -Н-ГИДРОКСИСУКЦИНШШДНШ ЭФИРОМ ДИЭТНЛАШНОБЕНЗОФЕНОКСАЗИНОН-ОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ (ШБ-БВР) .

Изменение параметров флуоресценции меток или зондов ) зависимости от микрсюкруження позволяет использовать их ка1 чувствительный инструмент для ряда биофизических исследований Особый интерес представляют флуоресцентные метки, квантовый выхо; и спектры флуоресценции которых сильно зависят от полярност! среды.

Представлялось интересным получить чувствительную 1 микроокружению флуоресцентную метку, пригодную для изучени; межбелкового взаимодействия и, в частности, взаимодействи: антиген-антитело. Основываясь на данных по ограничени) доступности воды в области антиген-связывающего центра антите, при взаимодействии с антигеном, мы рассчитывали, провед модификацию флуоресцентной меткой молекулы антитела вблиз активного центра, получить систему, откликающуюся н взаимодействие с антигеном.

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

ГЕКСАН СНС!3 ДМФА ЭТАНОЛ ВОДА

Ацетон/вода, об./об., % О возбуждение, эмиссия:;

I

I

500

_1 800

600 700

Длина волны, нм Рис. 1. Структура и спектральные свойства ОВР.

Выбор был остановлен на флуоресцентных красителях гноксазмнового ряда, характеризующихся максимумами поглощения в •1 дим ой, г! испускания в красной областях спектра. Широко звестным флуоресцентным зондом этой группы, чувствительным к олярности среды, является оксазин-17, или нильский красный, яя введения активированной Функциональной группы в молекулу яуорофора было осуществлено алкилирование исходного -гидроксипроизводного оксазина-17 третбутиловым эфиром онохлоруксусной кислоты с последующей активацией карбоксигруппы - гидрокси сукцийимидом.

Для подтверждения реакционной способности полученной метки

3 125

ровели модификацию серина [ Н], тироксина [ I] и

осфатидилэтаноламина в водно-органической среде.

Спектры флуоресценции коныогатов аминокислот совпадали с аковыми для свободного карбокси-производного феноксазина. охранялась также и зависимость флуоресцентных параметров от олярности растворителя (рис. 1). Это указывает на то, что оныогация с визкомолекулярными соединениями не сказывается на нейтральных свойствах флуорофора и параметры флуоресценции

Длина волны, нм

Рис. 2. Изменение флуоресценции T4-DBP при взаимодействии с альбумином.

коньюгатов определяются микроокружением феноксазиновой части молекулы. Проведенная Функционализация по третьему положению не изменяет чувствительности флуорофора к полярности среды,

характерной для нильского красного, по-видимому, не препятствуя

j

разделению зарядов и изменению дипольного момента при возбуждении.

Таким образом, была получена высоко реакционная флуоресцентна! метка, репортерные свойства которой не изменяются при коньюгацт и по чувствительности к микроокружению соответствуют известномз флуоресцентному зонду нильскому красному.

Основываясь на том, что конъюгация NHS-DBF i низкомолекулярными соединениями не изменяет спектральны: характеристик флуорофора, было решено исследовать взаимодейетви< низкомолекулярного коньюгата NHS-DBF с белками. В качеств! низкомолекулярного соединения, модифицированного NHS-DBP выбра] L-тироксин.

Добавление альбумина к водному раствору свободног карбоксипроизводного оксазина-17 и DBP-тироксина . приводило усилению флуоресценции и к сдвигу максимума спектра флуоресценци от 660 до 640 нм (рис. 2).

Флуоресценция T4-DBP не изменялась при добавлен» тироксин-связывающего глобулина, незначительно изменялась пр добавлении аффинно очищеных антител к тироксину, однако существенно возрастал?» при добавлении анти-тироксиново

1ная поверхности (Р) и области взаимодействия с аншилами. при взаимодействии с антителами.

антисыворотки и липопротеиновых тироксин-связывающих белков .

Учитывая зависимость интенсивности флуоресценции от полярности микроокружения DBP, возгорание Флуоресценции может быть обусловлено степенью экранирования, или глубиной погружения зонда в белхову» глобулу.

Вероятность возгорания флуоресценции DBF при локализации в области межбелкового контакта послужила основанием для модификации белкового антигена с целью изучения взаимодействия полученного коньюгата с антителами. В качестве антигена был выбран инсулин.

Вероятными 'сайтами ковалентного присоединения NHS-DBP к инсулину могут являться прежде всего М-концевие а-аминогруппы GlyAl, PheBl и аминогруппа LysB29 (рис. 3). Возгорание флуоресценции и сдвиг максимума.спектра испускания при добавлении к коныогату липосом и ПАВ в концентраций выше ККМ указывает на то, что флуорофор не внедрен в белковую глобулу и доступен для дополнительного экранирования от воды такими макромолекулярными структурами как мицеллы и липосомы.

Взаимодействие с антителами приводит к характерному изменению параметров флуоресценции (рис. 4). Выраженность эффекта зависит от эпитопной специфичности антител и уменьшалась в ряду моноклональные антитела МИК-7 > поликлональные антитела морской свинки > моноклональные антитела Ml. Антитела Ml реагировали с пентапептидом В-цепи (по данным П.Г.Свешникова, ЦМД МЗ РСФСР).

Подикловальная антисыворотка морской свинки, полученная лр иммунизации свиным инсулином, представляет собой набор антител направленных прежде всего к областям максимальных различий первичной структуре инсулина морской свинки и свиньи (рис. 3) Это прежде всего область В18-В22 изгиба В-цепи и петля Л8-А1 А-цепи. Монокдопальные глнтитела МИК-7 пониженно кросс-реагировал с бычьим инсулином (данные Л.К.Михеевой, ВИИИГПК), что указывав на вовлечение в область контакта антиген-антитело участка А8-А10

Таким образом, изложенные данные согласуются с гипотезой тон, что Флуоресцентная метка коньюгирована с остатком В1 выраженность возгорания флуоресценции при взаимодействи флуоресцентно меченого инсулина с антителами коррелирует близостью внедренной метки и эпитопа взаимодействия с антителами

Учитывая данные по изменению флуоресценции меченого инсулин при взаимодействии с антителами, было решено создат чувствительную к взаимодействию антиген-антитело систему, но уж с модифицированными антителами и свободным антигеном. Такая схем могла бы саужить прототипом однокомпонентной детектирующе системы, не требующей для измерения добавления меченого антигена

В качестве пары антиген - антитело был выбран инсулин моноклопальные антитела И1, взаимодействующие с С-концевы сегментом В-цепи. Участок поверхности молекулы инсулина включающий пентапептнд В23-В27, является областью связывания рецептором, или димер-образующей поверхностью, и представляе собой преимущественно неполярную часть поверхности белка. Контак флуоресцентной метки с такой областью должен сказываться н изменении флуоресценции вследствие уменьшения полярност микроокружения флуорофора.

Проблема заключалась в целенапрвленном введении флуоресцентно метки в молекулу антитела так, чтобы флуорофор включался область взаимодействия с антигеном и в то же время не затрагива функционально важные аминокислотные остатки активного цент£ антитела.

Исходя из рентгеноструктурных данных для комплексе антиген-антитело было решено провести избирательную модификац* Н-концеьых аминокислот ННБ-ПВР в расчете на внедрен» флуоресцентной метки в непосредственной близости от облает контакта антиген-антитело и, в то же время не затрагивая ег активный центр антитела.

Длина волны, нм Длина волны, им

Рис. 5. Спектры флуоресценции, модифицированных ЫНЗ-ОВР моноклональных антител М1 при взаимодействии с инсулином.

Основными конкурирующими группами в реакции модификации 33-ЮР являются «-аминогруппы остатков лизина. Уменьшение гроатности им участия в реакции и увеличение избирательности в гновении Н-концевых аминогрупп достигалось путем проведения еакцни модификации при пониженных значениях рК.

Действительно, оказалось, что добавление инсулина к луоресцентно модифицированным при разных рН антителам приводит к зменевию параметров люминесценции (рис. 5). Однако, степень зменений значительно больше для антител, модифицированных при Н=6.0, чем при рН=7.0. Это указывает на то, что в первом случае луорофор скорее всего располагается ближе к области межбелкового онтакта и лучше откликается на взаимодействие антиген-антитело.

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ВЭЖХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НАБОРА СЕЛЕКТИВНО МОДИФИЦИРОВАННЫХ БЕЛКОВ.

Исследование взаимодействия модифицированных ННЭ-СВР инсулина I антиинсулиновых моноклональных антител еде раз показало, что >ешающее значение для успешного конструирования флуоресцентных гистем, чувствительных к взаимодействию антиген-антитело, имеет 1еленаправленное введение Флуоресцентной метки в желаемый сайт юлекулы белка. Как правило, селективность модификации юстигается применением реагентов с узким спектром реакционной

способности, обратимого блокирования функциональных групп белка, варьированием условий проведения реакции, а в последнее время, использованием молекулярно-биологических приемов. Мы решил* исследовать возможность применения альтернативного подхода: не добиваться полной селективности введения флуоресцентной метки на стадии проведения реакции модификации, а разделить продукта модификации, получив тем самым набор селективно модифицировании! Флуоресцентных коньюгатов белка.

Для этой цели был применен метод обратно-фазовой ВЭЖХ. Учитывая данные по хроматографическому разделению DBP-инсулина, было решено апробировать избранный подход на примере инсулина, «пользуа набор наиболее распространенных Флуоресцентных меток: дансилхлорид (DNSC1), флуоресцеинизотиоцианат (FITC), тетраметмлродаминизотиоцианат (TRITC).

Оказалось, что инсулин и его moho-, ди- и три-замещенные производные значительна отличаются по времени удерживания даже i условиях градиентной элюцни 1%/мин. Так, нем одифицированны» инсулин, его moho-, ди- и три-производные с дансилхлоридом и FITC элюировались при 35%, 40-44%, . 45-50%, ЬЬ-60% ацетонитрила, соответственно (рис. 6). Общая картина разделения сохраняется дл£ различных флуоресцентных меток: каждое последующее введение дополнительной Флуоресцентной метки ощутимо увеличивает сродствс молетали к неподвижной фазе.

Изомеры инсулина, модифицированные по различным аминокислотных остаткам (А1,В1,В29) имеют различное время удерживания. В случае реакции дансилхлорида с инсулином при рН 9.5 разделяются все сем! изомеров Dns-иисулииа Al, Bl, В29, А14, А19, В26, В16.

Некоторое изменение ориентации обьемной неполярной rpynni Флуоресцентной метки на поверхности белковой глобулы сказываете! на удерживании. Так, коиыогаты инсулина с изомерами FIT( различаются по положению присоединения спейсерной группы > гидрофобному ядру флуорофора, приводя к более сильном! удерживанию на колонке 5'-FTC-инсулина, что может быть связано < более вытянутой конфигурацией и, следовательно, большей степень* экспонирования гидрофобного остатка 5'-флуоресцеина (рис. 7).

Кроме того, различное удерживание коньюгатов инеулинг замещенных по различным остаткам говорит в пользу вовлечения i процесс взаимодействия с неподвижной Фазой не только самой метки, но и окружающих ее поверхностных аминокислотных остатков.

га 15 го 25 зо зб Время, мин

5 10 15 20 25

Время, мин

б. Хроматохрамма продуктов реакции пита с DNSC1 прирН 8.0. 1-8 - пики

Рис. 7. Хромат-о грамма продуктов реакции инсулина со смесью томеров РГГС. 1- инеули

иина, DNS-Al, DNS-Bl, DNS-B29, DNS2-A1B1, 2- (5'-РТС>В1-инсулин, 3- (6'-FTC)-B 1-инсули ГВ1В29, DNS2-A1B29, DNS3-A1B1B29. 4"7" (5'(6>FTC)2-A1B 1-инсулкиы.

Полученные экспериментальные данные хорошо согласуются с предположением о том, что при использованных условиях хроматографии сохраняется основная третичная структура молекулы инсулина и процесс взаимодействия определяется поверхностными остатками коньюгатов. Вводимые гидрофобные заместители имеют определяющее значение во взаимодействии с обратио-фазовым сорбентом. Места модификации определяют, какие участки поверхности белковой глобулы будут преимущественно вовлечены во взаимодействие с неподвижной фазой. Время удерживания коррелирует с общей гидрофобностью поверхности в области введенной метки в случае монопроизводных и области стерически доступной поверхности заключенной между метками в случае ди- и три-производных.

Модификация белков К1ТС принципиально не изменяет хроматографического поведения более крупных исследованных белков. Эффект коньюгации на удерживание уменьшается в ряду лизоцим > альбумин > антитела, то есть с увеличением молекулярной массы. Таким образом, можно предположить, что с увеличением размера белка падает удельный вклад во взаимодействие с обратнофазовым сорбентом коньюгнрованной молекулы флуорофора.

МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРАМИ.

Одним из интереснейших применений флуоресцентно модифицированных белков является фотосенсибилизация окисления, основанная на свойстве некоторых флуорофоров продуцировать активные формы кислорода при возбуждении. Использование такого эффекта в практике привело к развитию и успешному применению при лечении опухолей так называемой фотодинамической терапии. Суть метода заключается в освещении опухоли пациента с предварительно введенным внутривенно фотосенсибилизатором. При поглощении света фотосенсибилизатором генерируются активные формы кислорода, запускается целый каскад окислительных и клеточных реакций, приводящих к повреждению опухолевой ткани и элиминации злокачественных новообразований.

Перспективным развитием метода является использование Флуоресцентных коньюгатов опухоль-специфичных моноклональных антител. При этом достигается двойная селективность повреждения опухолевых тканей по отношению к-нормальным: за счет освещения опухоли и преимущественной локализации фотосенсибилизатора, направленного антителами, в непосредственной близости к опухолевой клетке.

При конструировании иммунотерапевтических коньюгатов антител с фотосенсибилизаторами возникают важные для достижения оптимальных характеристик вопросы: способ присоединения флуорофора к молекуле антитела, количество вводимой метки на молекулу, использование спейсера, носителей и т.д.

Для того, чтобы оценить оптимальное для генерации активного кислорода соотношение вводимых флуорофоров на молекулу антитела или других белков-носителей, было решено провести модификацию альбумина и иммуноглобулина человека ННБ-эфиром хлорина еб и исследовать флуоресцентные свойства полученных коньюгатов.

Хлорин еб - один из порфиринов, применяющихся для Фотодинамической терапии опухолей. Оказалось, что с увеличение* количества молекул, (п), хлорина еб, ковалентно связанного с молекулой белка, квантовый выход флуоресценции падает, л зависимость удовлетворительно аппроксимируется функцией 1/п (рис. 8).

Анализ кинетик затухания флуоресценции и триплетногс

1.0

г

з

¡

jo,

i н )

) 1

i

0.0

соотношений хлорин/САЧ.

|Огзотасния коиыогатов при различном соотношении метка : белок рис. 9} выявил наличие процессов тушения без изменения времен ;изни синглетного и триплетного состояний.

Это свидетельствует в пользу того, что изменение луоресцентных параметров коньюгатов хлорина с белками в ависимости от количества вводимой метки на белок определяется заимедействием между молекулами флуорофоров. не исключая, днако, возможности диссипации энергии и по механизму переноса лектрона.

Фотодинамическаа терапия предполагает внутривенное введение отосенсибилизатора и освещение через определенное время области тухолм светом в полосе поглощения флуорофора.

При введении в кровоток фотосенсибилизаторы» будучи, как завило, неполярными или амфифильными веществами, связываются с »лками плазмы и липопротеинами. Известно, что использованный ши в работе хлорин еб, главным образом связывается с авороточным альбумином. При терапевтических дозировках хлорина > - 5-10 мг/кг веса тела практически весь хлорин находится в >мпдексе с белком. В то же время, являясь универсальным >анспортным белком, альбумин имеет сродство к ряду важных ¡таболитов и лекарственных средств. Следовательно, при реальных i vivo условиях Фотодинамической терапии необходимо учитывать такции фотопревращеиия не столько свободного хлорина еб, сколько «плекса порфирин-белок-лиганд.

90 --

0 5 10 15 20

Метка/белок, моль/моль. Рис. 8. Зависимость выходов флуоресценции от мольного, соотношения хлорин еЛ^.

W30 --

100 200 300 Время, мкс Рис. 9. Кинетика триплетного поглощения коньюгатов САЧ-хлорин e¿ для различных

0.30 0.25

-©- Еб; -в- Тгр; -V- САЧ;

Еб, (Иа^);

-Я— Тгр, (КаЫ3); -у - САЧ(ЫаЫ3);

О 0.00

15 30 45 Время, мин

Рис. 10. Кинетика превращения реагентов в тройной системе САЧ-хлорин е^-тршггофан.

[Три], мкМ

Рис. 11. Зависимость доли связанного с С триптофана от соотношения компонентов

Для проверки указанного предположения была выбрана снстен, хлорин еб - альбумин - триптофан. Смесь с различным соотношение: реагентов при интенсивном перемешивании освещали свето; галогеновой лампы с пропускающим фильтром >560 нм . Продукт окисления анализировали методом обратио-Фазовой ВЭЖХ (рис. 10) Кинетику превращения реагентов оценивали по изменению амплитуд соответствующих пиков на хроматограмме.

Рассматривая тройную систему трнптоФан-ЧСА-хлорин еб, можн постулировать, что связывание использованных лигандов альбумином происходит в двух пространственно различных участка молекулы. Триптофан взаимодействует с индол-связывающим сайтом, то время как хлорин еб, имеющий структурное сходство билирубином, по-видимому, взаимодействует с билирубин-связывающи сайтом. Зная характеристики связывания каждого из лигандов альбумином, можно оценить зависимость концентрации тройног комплекса триптофан-альбумин-хлорин еб от соотношения концентрации исходных компонентов {рис. 11). Очевидно, что дол связанного с белком триптофана зависит от условий проведет реакции. Сравнивая эти величины с кривыми накопления свободны! т.е. ковалентно не связанных с белком, продуктов фотопревращет триптофана (рис. 12), можно отметить положительную корреляц> степени генерации этих веществ с долей свободного триптофана реакционной смеси. Напротив, при связывании с белком триптофа!

2.0

А

Б

0

15

30 45 60

0

15

30

45

60

Время, мин.

Время, мин.

Рис. 12. Накопление свободных (А) и связанных с САЧ (Б) фотопродуктов в зависимости от соотношения реагентов.

около 80%, в ситуации, имеющей место in vivo, свободные продукты $>отоокисления триптофана не образуются вообще.

Следовательно, лиганды сывороточного альбумина человека, присутствующие in vivo при Фотодинамической терапии, вовлекаются в Фотоокислительные реакции, сенсибилизированные хлорином еб. В результате фотоокисления образуются свободные и связанные с белком продукты, соотношение которых зависит от степени изначального связывания лиганда СйЧ.

1. Синтезирована флуоресцентная метка - Н-гидроксисукцинимидный эфир 9-ди этиламннобензофенок са зин-5-он-3-ок сиу к су сн ой ки сл оты (ШЭ-ЮБР) высоко чувствительная к полярности среды с максимумом люминесценции при 660 нм в водной среде. Изучены репортерные свойства коньюгатов №55-1©?. с серином, тироксином, инсулином при связывании с белками.

2. Разработана схема детекции взаимодействия антиген-антитело на примере инсулина и ан'ти-инсулиновых моноклоназьных антител, основанная на частичном экранировании Флуоресцентной метки в области межбелкового контакта антиген-антитело. Показана возможность создания однокомпонентной аналитической системы с использованием только Флуоресцентно меченых антител.

ВЫВОДЫ.

3. Развиты представления о поверхность-опосредованно* взаимодействии флуоресцентно модифицированных белков « обратно-Фазовым сорбентом и на этой основе разработан подход дл! получения набора селективно меченых флуорохромами белков методо> обратно-фазовой БЭЖК.

4. Установлена обратная зависимость квантового выходг Флуоресценции коныогатов хлорина еб с сывороточным альбумино» и иммуноглобулином человека от мольного соотношения хлорин еб белок при неизменном времени жизни флуоресценции.

5. На примере триптофана показано, что лиганды сывороточноп альбумина человека (САЧ) вовлекаются в окислительные реакции фотосенсибилизированные хлорином еб. В результате фотоокисдени: образуются свободные и ковалентно связанные с белком продукта соотношение которых зависит от степени изначального связывани: лиганда САЧ.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Петроченко Е.В., Гореленко А.Я., Алексеев H.H., Ахрем А.А Синтез и свойства новой флуоресцентной метки N-гидроксисукцинимидного эфира 9-диэтиламинобензофеноксазин-5-он З-оксиуксусной кислоты. Доклады АН БССР, 1991, т.35, N10 с.918-922.

2. Петроченко Е.В., Киселев П.А. ВЭЖХ флуоресцентных Коньюгато инсулина. Биоорганическая химия, 1996, т.22, ИЗ, с.175-179.

3. Кочубеев Г.А., Кочубеева Н.Д., Петроченко Е.В., Бачило С.M Фотофизическое исследование коныогатов хлорина еб с белками Тезисы докладов II съезда белорусского общества Фотобиологов биофизиков. Минск, 1996, с.95.

4. Петроченко Е.В., Вачило С.М., Кочубеев Г.А. Исследовани белок-опосредованного фотосенсибилизированного хлорином е окисления триптофана. Тезисы докладов II съезда белорусског общества фотобиологов и биофизиков. Минск, 1996, с.115.

5. Бачило С.М., Кочубеева Н.Д., Петроченко Е.В., Кочубеев Г.Я Генерация обратимого фотохимического продукта хлорином еб растворах. Тезисы докладов II съезда общества фотобиологов биофизиков. Минск, 1996, с.82.

6. Bachilo S.M., Petrotchenko E.V., Kochubeeva N.D., Kochubee G.A. Reversible generation of a photochemical product by chlorJ еб in solutions. In: 12th International congress on photobiolog*

¡atracta. Vienna.. 1996. P. 271.

Kochubeev G.A., Kochnbeeva N.D., Petrotchenko E.V., Bachilo M. Analysis of photophysic&l and photochemical properties of -otein conjugates with chlorin еб. In: 12th International mgreaa on photobiology. Abstracts. Vienna. 1996. P. 288.

Petrotchenko E.V., Bachilo S.M., Kochubeev G.A. Human serum Lbumin-mediated tryptophan oxidation photosensibilised by l lor in In: 12th International cotvgress on photobiology. jstracts. Vienna. 1996. P. 291.

. Petrotchenko E.V., Kochubeev G.A., Kiselev P.A. Modelling ot man serum albumin lisands photooxidation sensibiliaed by llorin ев on example of tryptophan. Exp, Toxic. Pathol. 1996. )1. 48. H 5. P. 382-383.

РЕЗЮМЕ.

гтроченко Евгений Васильевич. Получение и физико-химическая »рактеристика модифицированных флуоресцентными метками аьбумина, инсулина и м он склона лыш я антител к инсулину, иочевые слова; инсулин, антитела, флуоресцентные метки, ВЭЖК, вуоресцентные коньюгаты, альбумин, хлорин еб.

Работа посвящена получению и исследованию свойств яуоресцентно модифицированных белков. Синтезирована и применена ля изучения межбелкового взаимодействия высоко чувствительная к олярности среды флуоресцентная метка - N-гидроксисукцинимидный imp 9-диэтиламинобензофеноксазин~5-он-3-оксиуксусной кислоты ffiS-DBP). Разработана схема детекции взаимодействия нтиген-антитело на примере инсулина и анти-инсудиновых оноклональных антител, основанная на частичном экранировании луоресцентной метки в области межбелкового контакта. Показана озможность создания однокомпонентной аналитической системы с спользованием только флуоресцентно меченых антител.

Предложен подход для получения с помощью обратно-фазовой ВЭЖХ абора селективно меченых флуорояромами белков.

Исследованы фотофизические характеристики коньюгатов луоресцентного фотосенсибилизатора хлорина еб с сывороточным льбумином (САЧ) и иммуноглобулином G человека. Установлена братная зависимость квантового выхода Флуоресценции коньюгатов т мольного соотношения хлорин еб : белок.

На примере триптофана показано вовлечение лигандов САЧ окислительные реакции, фотосенсибилизированные хлорином еб. результате фотоокислениа образуются ^свободные и ковалент) связанные с белком продукты, соотношение которых зависит < степени изначального связывания лиганда САЧ.

РЭЗЮМЭ.

Петрачэнка Яуген Вас1льев1ч. Атрыманне 1 Ф1з1ка-х1м1чн; характерыстыка мадыф!каваных флуарэсцэнтным! меткам! альбум1нг 1нсул3.на I монакланальных антыцелау да 1нсул1ну. Ключавыа словы: 1нсул1н, антыцелы, Флуарэсцэнтныя метк1, ВЭВ) флуарэсцэнтныя кан'югаты, альбум1н, хларын еб.

Работа прысвечана ат£>ыманню 1 даследванню уласц1васщ Флуарэсцэнтна мадыФ1каваных бялкоу. С1нтэзавана 1 применена д; вывучзння М1Жбялковлга узаемадзеяння высока адчувальная ; палярнасц! асяроддзя флуарэсцэнтная метка - К-г1дрокс1сукцы) 1мз.дный эф!р 9-дыэц1лам1набензафенаксаз1н-5-он-3-окс1воцатн< к1слаты (ННБ-ОВР). Распрацавана схема дэтэкцых узаемадзеяш антыген - антыцела на прыкладзе 1нсул1на 1 анты-з.нсул1наВ1 монакланальных антыцелау, заснаваная на частковам экранаван] Флуарэсцэнтнай метк! у вобласца м!хбялковага кантакту. Паказа) магчымасць стварэння аднакампанентнай анал!тычнай састэмы ухываннем тольк! флуарэсцэнтна мечаных антыцелау.

Прапанаван падыход для атрымання с дапамогай адваротна-фазав; ВЭВХ набора селектыуна мечаных Флуарахромам! бялкоу.

Даследаваны фотаф!з!чныя характэры стык! кан'югат; Флуарэсцэнтнага фотасенс!бал1затара хларына еб з сываратачн] альбум1нам (САЧ) л 1мунагдабулд.нам в чалавека. Знойдзе] адваротная залежнасць квантавага выхаду флуарэсцэнцы! кан'югат; ад мольных суаднос!н хларын еб : бялок.

На прыкладзе трыптафана па.казана уцягненне дагандау САЧ ак!сляльныя рэакцы1, фотасенс1бл.л1заваныя хларынам еб. У вын1] Фотаак1слення ствараюцца свабодныя 1 кавалентна звязаныя з бялк прадукты, суаднос1ны як!х залежаць ад ступен! першапачаткова; звязвання л!ганда САЧ.

SUMMARY.

trotchenko Evgenii Vasilievich. Obtaining and physico-chemical aracterisation of modified by fluorescent labels albumin, sulin and monoclonal antibodies to Insulin.

y words: insulin, antibodies, fluorescent labels, HPLC, uorescent conjugates, albumin, chlorin e6.

The work i3 devoted to obtaining and investigation of operties of fluorescently modified proteins. The highly nsitive to environment polarity label N-hydroxysuccinimide ter of 9-diethylai»inoben20phen-oxasine-5-one-3-oxoacetic acid HS-DBP) was synthesized and applied for study of otein-protein interactions. Scheme of detection of tigen-antibody interaction was developed on the example of sulin and anti-insulin monoclonal antibody, based on partial otection of the fluorescent label in protein-protein contact gion. Possibility of realisation of single-component analytical stem using only fluorescently labeled antibodies was mon strated.

The approach for obtaining with rever3ed-phase HPLC of a 3et selectively labeled by fluorophores proteins was proposed. Photophy3ical features of conjugates of fluorescent otosensibilizator chlorin e6 with human serum albumin (HSA) and munoglobulin G were investigated. Reverse dependence on molar lorin e6 : protein ratio of fluorescence quantum yield for njugate3 was found. On example of tryptophan, involvement of HSA ligand3 in lorin e6 photosen3ibilised reactions was shown. In consequence photooxidation, free and covalently protein-bound products are rmed, which ratio is dependent on proportion of initial ligand nding by HSA.

Подписано в печать 25.10.96 Бумага типографская Усл. печ. д. 1.4 Тираж 100 Зак.

Формат 60x90 1/16 Печать офсетная Учет. изд. л. 4,1 Бесплатно.

Отпечатано на рйЭОГрасре

Минск, пр. Ф, Скорм ы, 68. Лицензия ЛВ ст2Ш.93г