Физико-химические закономерности взаимодействия пероксидазы хрена с поликлональными и моноклональными антителами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

КИМ Борис Борисович

УДК 576.8.077:543.426

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА С ПОЛИКЛОНАЛЬНЫМИ И МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ

(02.00.15 — химическая кинетика и катализ)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва —1990

работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета московского государственного университета им. м. в. Ломоносова.

научный руководитель: д. б. н., в. н. с. Егоров А. н. научный консультант : к. б. н., ст. н. с. Гаврилова Е. Н.

официальные оппоненты: доктор химических наук, в. н. с.

специализированного Ученого совета н д. 053.05, 76 при московском государственном университете им. Н. В. лононосова по адресу: П9699, гсп-з, Москва, ленинские горы, химический факультет МГУ, аудитория гог корп. кафедры химической энзимологии.

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета игу им. м. В. Ломоносова.

Автореферат разослан: " /? " ¿/-ТУ 1990 г.

Зайцев С. В.

доктор химических наук, профессор Метелица д. и.

защита состоится

заседании

ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

0. А. Кост

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. важнейшим паранетрон, определяющим свойства и практическую пригодность антител является аффинность. Одним из перспективных подходов для ее определения, появившимся в последнее время, является метод твердофазного иммуноферментного анализа, однако до сих пор не были проанализированы ограничения этого метода, неполный учет которых ножет привести к артефактам, представляет большой интерес также расширить указанный подход для определения констант диссоциации комплексов антигенов с поликлональными антителами (ПкА).

Актуальной проблемой является создание математических методов обработки экспериментальных данных по связыванию антиген-антитело с целью получения достоверных оценок его параметров (констант диссоциации и концентраций активных центров) и дискриминации механизмов. в связи с этим внимание исследователей привлекают методы непараметрической статистики, имитационного моделирования и т. д.

пероксидаза (ГОО, использованная в качестве модельного фермента широко применяется в качестве маркера в методах иммуноферментного анализа. ноноклональные антитела широко используются в т.н. ПАП (пероксидаза-анти-пероксидаза) разновидности иммуноферментного анализа (ИФА). представляло интерес также изучить механизн ингибирования фермента специфическими антителами.

целью работы явилось изучение физико-химических закономерностей взаимодействия пх с поликлональными и ноноклональными антителами (на). в связи с поставленной проблемой в работе решаются задачи определения параметров и дискриминации моделей взаимодействия антиген-антитело, изучаются свойства на и ПкА, механизм ингибирования специфическими антителами ПХ в реакции усиленной хемилюнинесценгош.

научная новизна работы, в работе предложены новые методы и модификации известных процедур для определения констант диссоциации комплексов антиген-антитело, позволяющие в случае на получать значения Кф близкие к истинным, а в случае поликлон альных - к среднечисловой га.

впервые для получения оценок параметров связывания (констант

диссоциации и концентрации центров) и для дискиминации механизмов связывания использован метод бутстрэп. Разработаны методы построения планов эксперимента в соответствии с критериями 1>- и Е- оптимальности, позволяющие уточнять оценки параметров взаимодействия антиген-антитело.

исследовано взаимодействие пх с четырьня типами на мыши и ПкА кролика. Получены предварительные данные о локализации антигенных детерминант. Полученные на могут быть использованы в амплифицированном варианте ПАП-модификации ИФА, т.к. направлены против различных эпитопов пх, и в качестве структурного зонда, специфически распознающего щелочные изоформы Фермента.

изучен механизм ингибирования ПХ специфическими антителами в реакции усиленной хемшпоминесценции. предложен гомогенный метод иммуноанализа антител к гаптенам, основанный на эффекте ингибирования ПХ специфическими антителами.

Научная и практическая значимость работы, разработаны экспериментальные и теоретические процедуры определения параметров взаимодействия антиген-антитело, которые могут быть использованы в прикладных и фундаментальных исследованиях: для оценки качества иммунореагентов, изучения иммунохимических свойств белков, изучены свойства на к пероксидазе, которые могут быть использованы в иммуноферментном анализе и в качестве структурного зонда, распознающего кислые щелочные изоформы пх. изучен механизм ингибирования ПХ в реакции усиленной хемшпоминесценции специфическими антителами, на основе которого разработан принцип гомогенного анализа с использованием ПХ в качестве метки, на примере анализа антител к тринитрофенильной группе и м-карбоксифталевой кислоте показана возможность практической реализации метода. .

Апробация работы, натериалы работы были . представлены на V всесоюзном симпозиуме' по инженерной энзимологии (Кобулетти, 1985), всесоюзном симпозиуме "Биолюминесценция в медицине и сельском хозяйстве" (Ташкент, 1966), I всесоюзном симпозиуме по иммунобиотехнологии (Таллинн, 1987), VI всесоюзном синпозиуне по инженерной энзимологии (Вильнюс, 1988), V неждународном сипоэиуме по биолюминесценции и хемилюминеспенции (Флоренция, 1988), XIV ненделеевском съезде по общей и прикладной химии (Ташкент, 1989), I всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989).

-з-

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Объен работы, диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части. описывающей материалы -и методы исследования, результатов и их обсуждения (5 глав), выводов, списков цитируемой литературы и сокращений. Работа изложена на ¡¡^ страницах, содержит//^рисунков и таблиц, список литературы включает_ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Материалы и нетодн исследования

Хроматографические разделения проводили на системе fplc (Pharmacia). Для аналитической и полупрепаративной гель-фильтрации ИСПОЛЬЗОВаЛИ КОЛОНКИ TSK G3000SW, tsk G3000SW и tsk Gaooo SW, (7.5x600 мм) (PHarmacla), для ионнообменной хроматографии использовали носители HonoQ, Monos (колонки HR 5/5, Pharmacia) и deae TSK (Toyo Soda). Для иэоэлектрофокусирования, sds-электрофореза, электроиимуноблоттинга использовали установки и реактивы Bio-Rad по предлагаемый фирмой методикам, оптическую плотность измеряли на спектрофотометрах DU8B (вескюап) и vmax (кикропланиетный, Molecular Devices), спектры кругового дихроизма записывали на дихрографе Нагк III (Jobin Yvon) при комнатной температуре, хемилюминесценцию измеряли на люминометрах 1251 (LKB) и ML1000 (микроплашетный, Dynatech). для определения констант элементарных стадия в работе использовали установку "остановленной струи" RA-401 (Union Giken). спектрофото-метрические измерения проводили в изобестической точке форм Е и Е1 *тах:426 нн- в работе использовали такие концентрации реагентов, которые обеспечивали псевдопервый порядок реакции по субстрату-восстановителю. Концентрация раствора ПХ составляла около Ю"бМ. В случае изучения кинетики реакции восстановления Е4 до Ег выбирали концентрацию перекиси водорода намного большую концентрации фермента (обычно ю~3М), а в случае изучения кинетики восстановления Ei до Е концентрация раствора перекиси водорода выбиралась равной начальной концентрации фермента, концентрации растворов изучаемых субстратов-востановителеи (люминола, параиодфенола, н2ог) варьировали в диапазоне, ограниченном нижней границей необходимостью выполнения условия псевдопервого порядка реакции

по субстрату, и верхней границей невозможностью регистрации быстрых процессов, выходящих за "мертвое время" установки.

применение твердофазного иммунофернентного анализа для опеределения констант диссоциации комплексов антиген-антитело. использованная нами экспериментальная схема включала взаимодействие антигена с антителон в растворе; затем, после установления равновесия, концентрация несвязавшихся антител определялась в стандартной процедуре непрямого ифа. к преимуществам использованной схемы можно отнести то, что взаимодействие происходит между немеченными молекулами антигена и антитела в растворе, т. е. при этом не нарушается нативная антигенная структрура белков.

Теоретическое рассмотрение схемы позволяет вывести уравнение для определения константы диссоциации комплексов антигена с НА, т.е. в приближении одного типа центров связывания:

aq - а авф

где а0 - оптическая плотность, измеренная в ифа в отсутствие антител в растворе, а - в присутствии антител в растворе, Ag0 - начальная концентрация антител.

очевидно, что найденное просто из наклона прямой значение константы диссоциации является эффективным, что может быть следствием нескольких причин, во-первых, зависимость сигнала в ифа от концентрации антител может быть нелинейна, во-вторых, антитела двухвалентны и поэтому комплекс антиген-антитело в соотношении г. i может через свободный Fab-фрагмент связываться с антигеном, сорбированным на твердой фазе и тем самым, конкурировать со свободныни антителами, и, наконец, в-третьих, взаимодействие свободных антител с; антигеном, сорбированным на твердой фазе может приводить к смещению равновесия в растворе, влияние первых двух факторов можно нивелировать, подбирая соответствующие экспериментальные условия, в частности, начальную концентрацию антител нужно выбирать на линейном участке зависимости сигнала ифа от концентрации антител и использовать значительный избыток антигена, с тем, чтобы уменьшить относительную долю комплексов антиген-антитело в соотношении ui.

Для анализа третьего фактора была привлечена натематическая

модель, с помощью было показано, что эффективная константа диссоциации, определяемая методом ИФА выражается следующим образом:

Ха'-.Кд ( 1 ♦ А80< !*)

где К^ - истинная константа диссоциации комплекса антиген-антитело в растворе, к"! - константа ассоциации антитела с 1-тим типом антигена на твердой фазе, Ag0 ^ -начальная концентрация 1-того типа антигена на тЬердой Фазе.

последний член описывает влияние антигена, сорбированного на носителе, очевидно, он представляет собой максимально возможную ошибку, рассчитанную в предположении, что все стадии эксперимента осуществляются в равновесном режиме.

Большой интерес представляло также расширить указанный подход для определения констант диссоциации антигенов с поликлональными антителами. Поскольку последние характеризуются различной аффинностью, речь может идти об определении величины, усредненной по совокупности антител. использовав модель связывания лиганда с несколькими типами центров связывания, можно получить следующее выражение для Кд*

21 = 1П АЬ^ о

где - константа диссоциации комлекса антигена с 1-тым типом антител, аъ1(0 - начальная концентрация 1-того типа антител.

Таким образом, метод

позволяет определять среднечисловую константу диссоциации, характеризующую пул антитез.

проверка валидности метода была проведена с помощью системы инсулин -НА, афинность которых была ранее определена методом люминесцентного иммунокофакторного анализа (Рис. 1, Табл. и

2 4 6 1/(1пзи11 л 1,

РИСУНОК X ОярвММШМ КОМТ1ИТЫ ЖМСОПМШО, НОШ1ЛЙНС« ЫЛСУЛММ '

номок*ояимо« МТЯТ«|0 (»о* КЮ). начыыои

ентатеж! Ш| - ,.....- ' "

1С» - ». 1ЧО-® к.

' К. №1 - Ь »мй-

.начиьшм конпеятмш * и. (»1 - »«ю-» а.

как видно, значения констант, полученные обоими нетодами с точностью до ошибки совпадают. метод ифа позволяет также определять аффинность антител, если неизвестна их начальная концентрация (например, в аспитной жидкости). значения, полученные этим методом мало изменяются при варьировании начальной концентрации антител.

На рисунке г показаны результаты определения среднечисловои константы диссоциации для взаимодействия инсулина с поликлональными антителами.

таблица 1. значения констант диссоциации комплексов антаген-антатело.

Антаген КЛОН концентрация антител, м значение константа диссоциации, «ю9, м

метод ш Метод ЛИКА

очщ. антитела асдагная ашк

инсулин С7 г. 5» ю"в 1.25« 10'® 6.13«10~9 1. 9+/-0. 5 0. 9+/-0.5 1. 2*/-0.1 г. 1+/-0, г 1. 2+/-0.4 1.5+/-о. г 1.

Е6 1.3«Ю*в 0.65« 10"® 8.0+/-0.5 . 5. 2+/-0.7 3.+/-1 7. +/-0. 5 . 5.

Пспок С определение среднеоаыомм коасгееш шхтш комплексе шсушие с ^шюомеышш еаттелемш. Мишмше

1:К>00, .».

разработка матенати-нетодов оценки параметров взаимодействия антиген-антитело и дискриминации моделей. В связи с этими проблемами, внимание исследователей в последнее время привлекают методы непараметрической статистики, управления выборкой, имитационного моделирования. В нашей работе был использован наиболее общий подход, известный под названием бутстреп. суть его схематически показана на рис.3

в результате получают гистограмнную оценку плотности распределения интересующего нас параметров -константы диссоциации

4 в в 1/ПгаиПп!, пМ

иммунного коиплекса - ^ и начальной концентрации центров связывания антител - о0, рис.4) из которых ножно определить их среднее значение и дисперсию.

в таблице 2 показаны результаты применения для анализа связывания двух нетодов определения параметров - традиционного

нелинейного метода наименьших квадратов (ННК) и метода бутстреп. для анализа были взяты псевдо-экслериментальные точки, полученные для ноделей разной сложности с заданной ошибкой. как видно с усложнением нодели и увеличением ошибки измерения оценки параметров связывания, полученные кнк все более смещаются от истинных, а дисперсия растет и доходит в значении коэффициента вариации до нескольких тысяч г. в тех же условиях оценки, полученные методом

Таблица 2. Применение методов нелинейного ННК и бутстреп для оценки параметров взаимодействия антиген-антитело.

ис1инныз ОТНОСИ- оценга параметров и стандартных отклонения

ИШЬ значения тельная нелинейный кнк бутстрзп

парамет- ешбга. среднее аь СУ., среднее а в., сл.,

роа у. е. г

един центр связывания" Оо, 1:1 М:5 10 00:1.9 М:3.9 0.3 3. 15.7 76. 9 00:1. 15 К<1:4. 5 0.06 г. 5 44

два центра связыва- гая" 00,1:1 И. 1:5 00, 2:5 Х(Х 2:15 2.5 00,1:0.5 00,2:5.5 М, 2:14.4 0.8 3.3 0.7 г.9 160 127 12.7 20. ОО, 1:0.9 К4 1:3. 3 00, 2:5. 1 ВД 2:14. 9 0.07 1.3 0.3 1.8 7.7 23 5.8 12.0

пи центра связывания"» 00, 1:.25 И, 1=1 00, 2:1 Х42:5 Оо,3:5 И. 3:15 1 00,1:0. 53 Хв, 1:1. 5 Оо, 2:0. 8 И,2:6. 5 00.3:5 £1,3:14 3.7 5.8 69 340 92 84 700 366 1112 5230 1640 600 00, 1:0.3 £<Х 1:1.1 00, 2:0. 95 Г4 2:6. 00, 3:5. 3:14. 6 0.05 0.1 0.05 1. 0. 1 0, 1 16.7 9. 1 5.2 16.6 2 2

число псещоэкспедментальных точек в ияодной аяорге, т * - 15, ** - зо

Рис. -3 Схеме применения метод! бутстрэп для определения параметров лкганд-рецеп-торных взаимодействий

бутстреп близки к истинным значениям а коэффициент вариации не превышает гзг. Бутсгреп позволяет получать оценки совместного распределения параметров связывания и тем самым расширяет возможности метода имитационного моделирования. Ранее было показано что для функции вида:

Кй ♦ I

где в - концентрация связанного антигена, ь-концентрация свободного антигена.

»60

я.а

А>. V

полученные методом о/тстрэп моноклонаяьными

Рисунок 4 частотные гистогранны, для параметров взаимодеиств* лерокекдазы с антителаки (клон КЗ) конпентрации активны» центров -константы диссоциации комплекса - о.

гг.2

ь. • ...... ■ «..«

рисунок 5 оолвка разброса оценок параметров связывания для взаинодеястви» перокскдазн с ноноклонааышш антителами (клон ЕЛ. < - модель с одним центром связывания, б - с двумя центрами связывания.

характерна высокая корреляция между и о0. это свойство можно использовать для дискриминации моделей связывания: в случае адекватной модели будет наблюдаться высокая степень корреляции, а

в случае переусложненной - нет.

Модельные эксперименты позволили сформулировать граничное правило согласно которому средний коэффициент корреляции Спирмена (непараметрический аналог обычного коэффициента корреляции) нежду к и о, ■ определяемый как среднеарифметическое коэффициентов корреляции для всех центров связывания в случае адекватной модели долвен быть не ниже о, 6. на рис. 5 показаны облака разброса оценок параметров при использовании адекватной и неадекватных моделей для взаимодействия ПХ с НА, как видно, в первом случае коэффициент корреляции составил о. 75 , а во втором о. 43.

изучение свойств моноклональных и поликлональных антител к пероксидазе хрена.

описанные подходы были использованы нами при изучении свойств моноклональных и поликлональных антител к пероксидазе (табл. 3).

таблица з. свойства нонокдональных и поликлональных антител к пероксидазе

ВН каш I, я Ы-Еасс нш № йшзйста с детая КРВДЯ Взггад&тга снял1, с. оа 4 ЙИВД СП'г . I, 0 1 йаввд с азофе^- ЙЯЯЯ Впбда-вим и- !№СП, I

ге да ■ 15! 9.« 1:1 1; г I 111! М 15.1 ! 0.3) |ешж 0

те да (ЦП 105| 2:1 1:1 1: г 1 (1.5! Ш (!! 0.И! Китая 30

¡г (59! И 1! Г 1: г I («!2| (51 131 щош 0

13 да^ 11,0 ii.il 1:1 1; г II (1.(10.151 (11 ! 0.2) |Н0Ш Ве(трш- ВК 0

ш да, кот пщт ковш, и арии. не охред. 100

¡одно шше агап-а да (10Ш11 1:1 1: г нов I н В05*В1 вида Щош МТИИг ш 100

1 им! - шерощца ' й' - кшшша а 3 - ооедемво гиюгегая иевди ' -даиеташ! юггип ршщвд

дополученные МА ■ ногут быть использованы в ПАП методе ИФА, т. к. характеризуются высокими значениями афинности.

молекулярно-массовый состав иммунных комплексов изучали с помощью жидкостной хроматографии на предварительно огкалиброванных колонках тек в 4000 вы и зооо (рис.б), в зависимости от мольного отношения, все клоны антител способны образовывать комплексы состава (аь.-пх) 1:1 и 1:2. этот Факт можно объяснить, учитывая бивалентность антител и сравнительно небольшие размеры пх (радиус 29 а), позволяющие двум молекулам фермента независимо связываться с Гаь-фрагментами антител, моноклональные антитела 7 а, взятые в избытке, образуют комплексы состава 2:1, . что говорит о возможном присутствии в молекуле пх повторяющихся антигенных детерминант. Расчеты внутренней гомологии показывают, что в полипептидной цепи фермента имеется з области полной или частичной гомологии.

N АА 3 9 34 37 181 186

■тг-РгйТПгРИеТугАЗрАЗП А1а5ег11еЬеи ме1АзрА1^ЬеиТугА8п

ТЫРГОГПГ11 еРПеАарАБП А1а5ег11еЬеи ме1АврАгвМе *с1уАвп

Замены « II к «

# АА 225 231 51 54 281 286

Процент

гомологии 72'/. 1007. 66/

кроме

могут

против гликозидных (см. также

сложной из полипеп-

того, антитела быть направлены

структурно-подобных остатков фермента ниже).

ПХ является молекулой, состоящей тидной части, простетической группы (протогем IX) и углеводного компонента. Поэтому представляло интерес выяснить, к какому именно компоненту получены НА. с этой целью изучали связывание антител с производными Фермента.

госувок 6 определение модекудярно-нассового состава юшукного комплекса клона ез с лерокспазоя гедь-^ильтрапнеш на колонке тзг зооо 5У. коипенграшм пероксидазы ы антител »чо"' и- »-аопзшшя детектора при гео ям. г- ври «оа «к. «мны в *»).

Константы диссоциации комплексов НА с апопероксидазой (ПХ без простетической группы) незначимо отличались от величин, характеризующих взаимодействие нативного Фермента с антителами, это свидетельствует о том, что антигенная структ ура апо-фермента незначительно отличается от нативного.

При исследовании взаимодействия антител с образцами дегли-козилированнои ПХ, также не было обнаружено значимых различий в константах диссоциации комплексов по сравнению с нативным ферментом.

Данные по мягкому протеолитическому расщеплению апо-лероксидазы свидетельствуют о наличии в молекуле фермента двух доменов. Первый домен, включающий N и с концевые участки фермента, объединяет аминокислотные остатки с го 150 и с 265 по 305, а второй домен - с 160 по 224. эксперименты, проведенные с протеолитическими фрагментами ПХ позволили установить к какому именно домену направлены НА.

На рис. 7а показаны результаты иммунобяотткнга для 4 типов НА и поликлональных антител. Видно, что три клона .антител взаимодействуют с I доменом ПХ, в то время, как клон ЕЗ связывается со II доменом. в поликлональной антисыворотке присутствуют антитела, связывающиеся с обоими доменами фермента. гА--ГБ

№

Ъ 9Г ТС 2С □

псупок 7А вготлшг с окравсшпки по белку (рг) к ■мкуяобтогпшг поме зоз-гме мекгахореза нишоюаа «мгисятоя ах.

Рксунок7Б Резуньтвти иниуноваотпогга кмгоклоямиоа (кдоиы Ез. 7 а, гс) и поликдонадышх (Р) аятятел с юклят (И. нсятрвяьшми |2> я «елочти* 1з> «ориакя мроксжизн.

Нами были проведены расчеты расположения антигенных детерминант в молекуле ПХ согласно различный шкалам антигенности

я

Р 9Р И 76 2С

1

2

3

: гидрофильное™ Хоппа-вуда и Паркера, акрофильности (поверхностной доступности) хоппа и сегментальной мобильности карпяуса- Еульца. отметин, что один из участков последовательности пх, с ги по зо остаток предсказан как ад во всех четырех шкалах. он относится к I домену ПХ, с которым связываются 3 из 4 исследованных клонов на.

Взаимодействие на с изоферментами пх изучено методом иммуноблоттинга после изозлектрофокусирования. Как видно из рис. 7б, поликлональкые антитела связываются со всеми изоформами пх, среди на клоны ез и 70 связываются ■■с нейтральными изоформами, и ни один из клонов не реагирует с кислыми пероксидазами. ' .1

При исследовании нескольких клонов на важно выяснить направлены ли они к одному и тону же или к разным эпитопам на поверхности белка. этот вопрос мы изучали с помощью конкурентного анализа. Оказалось, что антитела попарно не конкурируют друг сдругом за связывание с пх и, следовательно, направлены против независимых эпитопов фермента.

Было исследовано влияние антител на активность ПХ. Установлено, что поликлональные и некоторые на эффективно тушат хемшшминесценцию реакции совместного окисления люминола и парайодфенола. в зависимости от животного, цикла иммунизации, процент ингибирования активности варьировался в пределах чо -98/.. на рис. 6 показана кривая ингибирования специфическими

антителами (черные кружки), в качестве контроля использовали антитела, выделенные из сыворотки крови' неимнунного животного

(светлые треугольники).

Эффект ингибирования ферментативной активности специфическими поликлональными антителами часто бывает связан с образованием олигомерных комплексов

антиген-антитело, в которых -доступ субстратов или транспорт продуктов из актив-

0.0 0.5

—®£ftf/>®" 1.0

2.5

[Ab], [Fab], mg

рисунок 8 • Ингиеирование пероксидаэы в реакции усиленной хммшжикескекцки специфическими антителами ( о I. Г»ь-»рагиентвни »тктел1«| (4 i - контрольные эксперименты с bsa. концентрация мроксидазы 5чо-'о и. концентрации суостраго»: шшаи - 5.ю-5 ». п-!-»енол S40-» н, нгОг - 540-* к.

ного центра фермента диффузионно затруднен, для проверки этого предположения мы провели эксперименты с Fab- фрагментами специфических антител. Поскольку Fab- фрагменты являются одновалентными, они неспособны образовывать полимолекулярные агрегаты. Результата опыта показаны на рис. 8 темными кружками. Как видно из графиков Fab фрагменты антител также обладают антикаталитическими свойствами.

На примере ряда ферментов (лизоцин, нейраминидаза вируса гриппа В) ранее было показано, что при связывании с антителами фермент претерпевает информационные изменения, приводящие к модулированию активности. в нашей работе конформапионные, изменения ПХ, происходящие при связывании с антителами изучены методом спектроскопии кругового дихроиз ма (КД).

Спектры кд отражают ассиметрию окружения хромофоров фермента, наличие в молекуле ПХ природного хромофора - гемина наряду с остатками ароматических аминокислот позволяет использовать спекроскопию КД для исследования структуры нативной и модифицированной пх.

спектры нативной ПХ (сплошная линия) и комплекса с фермента с антителами (пунктир) приведены на рис. 9. . наиболее

рисунок Q спектр кругового дихроизма нативной пероксидазы (слдолная л инк я) и комплекса пероксидазы с раь-фрагментами специфически» антителам кролика (пунктирная линия)■_

информативной является

видимая область, в которой все полосы относятся к генину. Как видно из рисунка, в присутствии антител увеличивается интенсивность полосы при 540 нм (на 50z), и полос при 620 и 652 нм. Сравнение спектров свидетельствует о конФормапионных изменениях, происходящих в пероксидазе при связывании со специфическими ангителани. При зтон изменяется симметрия окружения гемина. Судя по увеличению интенсивности полос, можно говорить об усилении "жесткости" белкового окружения простетической группы- В целом, отмеченные конформапионные изменения могут приБ1дить к изменению каталитических свойств

Де,М

450 500 550 600 650 700 Л т> m

. -14- . '

фермента. с целью выяснения механизма ингибирования хемилюминесценгош специфическими антителами изучали ферментативные свойства комплекса ПХ с антителами методом остановленной струи,

спектры поглощения форм ПХ Е, Б{, Ег в области Соре разрешены, что позволяет, выбирая изосестическую точку спектра двух из форм, следить за изменением третьей.

нами были измерены константы скоростей реакций псевдопервого порядка окисления ПХ в соединение Е! {К4 *) и взаимодействия субстратов-восстановителей с окисленными формами фермента (К'2 и К'3) для нативной ПХ и комплекса;ПХ с антителами (Табл.4). !

таблица <4. Результаты определения элеменарных констант скоростей реакций окисления люминола и пара-йодфенола для ПХ и комплекса ПХ с антителами, стационарные скорости генерации радикалов.

параметр нативная пероютвза комплекс перонлщаза-актигело

ЛКМИНОЙ п-1-Феиол лшинол п-1-фенол

к 1 к-1 сек"1 1.9«107 1.9»107 (1.710.05)«107 (1,710.05) «107

к 2 Н-1 сек-1 8.0« 10® (2.810.12) «107 (4. 310.04) «105 (1,010.05) «107

К 3 и"1 сек-1 1.2*1& ■1 (3.410.09) »10® (0.310,07) «10* (1.910.01) «105

V в, АН 1 0.070

2 » «* С1 ' 1 0.02

* * даны не абсолютные значения, а отношения к величине, найденной для ПХ,

измерено при концентрации ПХ - ю~10 н, аффинновыделенных антител -5*10"® с тем, юоу. фермента находилось в конплексе с антителами.

Из представленных данных видно, что константы скорости окисления фермента в соединение Е! для нативной ПХ и комплекса ПХ с антителами значимо не отличаются. В то хе время значения кг и к3 для комплекса ПХ с антителами существенно ниже, чем для нативного фермента, особенно ярко этот эффект проявляется в реакции восстановления комплекса Бг пара-иодфенолом.

Если предположить, что линитируюшими для реакции окисления люминола являются ферментативные, а не постферментативные стадии превращения радикалов, то интенсивность излучаемого света должна быть пряно пропорциональна стационарной скорости генерации радикалов люминола. Ее значение можно вычислить, рассмотрев схему Чанса для окисления двух субстратов в стационарном режиме. Рассчеты показывают, что отношение этих скоростей в присутствии и отсутствии антител равно о. 078.

Таким образом, исходя из стационарного приближения мы можем объяснить более чем десятикратное уменьшение интенсивности излучения реакции усиленной хемилюминесценции в присутствии специфических антител.

Гомогенный нетод анализа антител к гаптенам, основанный на эффекте регуляции антителами активности пх.

принцип метода состоит в следующем. Антитела к ферменту, связываясь с коньюгатом ПХ с гаптеном, ингибируют его ферментативную активность. При добавлении в систему антител к гаптену последние конкурируют с антителами к ферменту за связывание с коньюгатом и ферментативная активность восстанавливается. _________

Рисунок ХО восстановление активности пероксндаэы в конпдексе антител против »ериентв с коньюгатом ♦ермент-тринитро»енильна* группа в присутствии антител к тринитроФенидьноя группе-

1200 1000 800 600 400 200 О

м

Модельный эксперимент с антителами к тринитро-

бензолсульфокислоте показан на рис. ю. второй системой, для которой был разработан гомогенный ифа были антитела к и-карбокси-Фталевой кислоте, задача определения уровня антител актуальна в целях ранней диагностики аллергических заболевания у работников предприятий, производящих анги-

дриды карбоксифталевых кислот, нихний предел детекции составил 9»ю~10 н (рис. на). При анализе образцов сыворотки человеческой крови возникают проблемы, связанные с присутствием в сыворотке белков, обладающих пероксидазной активностью, кроме того, антитела, вырабатываемые в крови людей могут обладать меньшей аффинностью по сравнению с теми, которые были получены иммунизацией кроликов коныогатами соответствующих гаптенов с не-

рисунок 11а Гомогенный метод анализа антител к и-карбоксифталевоя кислоте, концентрации: коныогата ьно"11 и, ГаЬ-»рагментов антител к лероксидазе гчо"8 м.

Рисунок 116 Анализ сывороток с высоким <Н> и низким (М содержанием антител к карбокснфталевоя кислоте. разведение сыворотки 1:30. доверительные интервалы рассчитаны из 1 повторов. концентрации те же. что и для рис. ю. ю.

несущин белком. Оба эти фактора приводят к понижению чувствительности метода. однако в целях предварительной диагностики часто бывает достаточно полуколичественных измерений уровня антител в крови. На рисунке (рис. Пб) представлены результаты анализа двух сывороток с высоким (Н) и низким (Ь) содержанием антител (по данным твердофазного ИФА). полуколичественный анализ - в рамках +/- может быть основан на сравнении данных, полученных при анализе сывороток крови пациентов с результатами для этих двух стандартов.

Преимуществом гомогенных методов анализа антител является отсутствие"стадии разделения свободного и связанного компонентов иммунологической реакции, что ускоряет и позволяет легко автоматизировать процедуру проведения анализа, в тоже время при реализации изложенного выше принципа построения гомогенных тес-

-17-

тов неизбежны следующие затруднения:

И присутствие в исследуемых образцах веществ с пероксидаэной активностью.

2) коныогат фермента с анализируемын веществом должен быть свободен от примесей несвязавшегося фермента. Фактически, эта примесь может играть ту же роль, что и эндогенная пх, уменьшая чуствительность метода. Поэтому для получения коньюгата необходимо либо использовать активные агенты, : либо применять тонкие методы очистки полученного коньюгата.

выводы

1. показана возможность использования метода непрямого твердофазного ифа для характеристики аффинности • антител, содержащихся в асцитной жидкости и в поликлональных антисыворотках. определены условия, в которых получаеная эффективная константа близка к истинной в случае взаимодействия с на или к среднечисловой константе диссоциации в случае взаимодействия антигена с поликлональными антителами.

2. Разработаны методы построения планов эксперимента в соответствии с критериями ь- к Е- оптимальности, позволяющие уточнять опенки параметров взаимодейтсвия антиген-антитело.

3. предложено использовать метод бутстреп для анализа взаимодействий антиген-антитело: дискриминации неделей и получении оценок параметров взаимодейтствия. разработана программа для микроэвм, реализующая указанный алгоритм.

4. исследовано взаимодействие пх с четырьмя типами на мыши и пка кролика. Получены предварительные данные о локализации антигенных детерминант.

5. полученные на могут быть использованы в амплифшшрованнон варианте ПАП-модиФикации ифа, т. к. направлены против различных эпитопов ПХ, ив качестве структурного зонда, :специфически распознающего щелочные иэоформы фермента.

6. изучен механизм ингибирования ПХ специфическими антителами в реакции усиленной хемитоминесценции. показало, что нолекула Фермента при связывании с антителами претерпевает конформапионные изменения, приводящие к уменьшению ферментативной активности.

■ -18т. Преллохен гомогенный метол иммуноанализа антител к гаптенам, основанный на эффекте ингибирования ПХ специфическими антителами.

основные материалы диссертационной работы Кима Б. Б. отражены в 14 публикациях:

1. Ким Б. в., власенко с. Б.. гаврилова Е. н. гомогенный

люминесцентный иммуноаналиэ, основанный яа модуляции каталитических свойств пероксидазы в реакции совместного окисления люминола и люциферина// тезисы докладов всесоюзной конференции по инженерной : энзимологии, кобулетти, 1985, с. гоо !

г. власенко с. Б., Ким Б. Б., Гаврилова е. И., Егоров А. Н., Люминесцентный иммуноаналиэ с использованием пероксидазы// в сб. материалов Всесоюзного симпозиума "Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве", Ташкент, 1987, с. 7-9.

3. Колосова Л. в., ким Б. Б., чередникова Т. В., Садванова г. г.,

Гаврилова е. н., Егоров а. м. , получение и характеристика монокпональных антител к пероксидазе . из корней хрена// БИОХИМИЯ, 1988, Т. 53, N И, С, 1858-1863.

4. VlasenKo S. В., Arefiev a. a, Klimov A. D., Kim В. В., Gorovlts Б. L., oslpov А. Р., Gavrllova Е. М., Yegorov А. н. An investigation of Catalytic Hechanlsm of Enhanced cneml1илиnes-cence: immunochemical Application of this reaction// J. Bioiuro. Chemilm, V. 4., hi, P. 164-176,

5. кимБ.Б., власенко с. Б., Гаврилова Е. м., Егорова. И., ■ Оптимизация условий определения пероксидазы в реакции каталитического окисления люнинола и люциферина перекисью водорода// Биотехнология, 1989, т. 5, hi, с. 97-102.

6. Горовиц E. л., Ким Б. Б., Власенко с. Б., гаврилова E. И., Егоров а. и., Применение реакции усиленной хенилюминесценции

. в качестве системы детекции в твердофазных методах ИФА// Биотехнология, 1969, н. г, т. 5, с. гзз-гз9.

7. Ким Б.в., Егоров А.И. применение метода бутстреп для уточнения оценок параметров лиганд-рецепторных взаимодействий// вестник нгу, сер. "Химия", 1989, т. 30, N. 6, С. 596-601.

-19в. Кии Б. Б., Гаврилова Е. H. Эффект ингибирования пероксидаэной активности антителами к ферменту в реакции усиленной хемилюминесценпии// жвхо им. Л. и. Менделеева, 1989, н 1, с. 405-406.

9. кии в. в., гаврилова е. н., Егорова, н., планирование,

эксперимента с целью уточнения оценок параметров лиганд-рецепторных взаимодействии//Вестник МГУ, сер. "Химия", 1989, Т. 30, Н. 4, С. 419-423. : ю. Ким Б.Б., Еремин с.А., рыхов В.и. применение поляризационного флуоресцентного иммуноаналиэа для определения содержания гаптенов в биологических жидкостях и контроля качества иннунореагентов// Натериалы xiv менделеевского съезда по общей и прикладной химии, ташкент, 1989, М., "Наука", 1989 Г., С. 530. и. ким Б. Б., Дикова е. Б., гаврилова Е. м., Егоров А.м., определение констант диссоциации комплексов антигенов с антителами с помощью твердофазного иммуноферментного анализа//иммунология, 1989, н. 4, с. 31-35,

12. кин Б. Б. моноклональные антитела в исследовании ферментов // итоги науки и техники, 1989, сер. Биотехнология, т. го, С. 97-132.

13. ким Б. Б., Хегаил. А., Сорокина н. В. изучение взаимодействия пероксидаэы с поликлональными антителами//тезисы докладов I всесоюзного съезда иммунологов, Дагомыс, 1989, ч. I, с. 52.

14. ximB.B., Dlkova Е. В., sneller U., DlKov H.H. Gavrllova Е, M,, Egorov a. H., Evaluation og antlgen-antibody Mndlng constants by ELISA// J. Immunol. Methods, 1990, V. 82 ,H , P

СОКРАЩЕНИЯ

ифа - иммуноферментный анализ кд - круговой дихроизм

ка - константа диссоциации комплекса антиген-антитело ннк - метод наименьших квадратов на - моноклональные антитела пка - поликлональные антитела пх - пероксидаза из корней хрена

Пода, в до. 30.07.9Qf. Л-11186 ftpa» 120 i». зшшэ л 2559 Централизованная тжпаграфия ГА "Союзотройматериалов"