Разработка иммунодиагностических тест-систем на основе моноклональных антител для индикации фитовирусов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА И Ю. А. ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

од

(• !•'•*- • • ' ■ Г

О , ■> ■

• На правах рукописи

Ерохина Татьяна Николаевна РАЗРАБОТКА ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКНХ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ФИТОВИРУСОВ

02.00.10 - биоорганическая химия,

химия природных соединений и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии наук.

Научный руководитель: кандидат биологических наук С.М.Амбросова

Официальные оппоненты: доктор химических наук.

профессор В.П.Зубов доктор биологических наук Н.П. Родионова

Ведущая организация: ВНИИ фитопатологии РАСХН

Защита состоится февраля 1995г. в

часов на

заседании специализированного ученого совета Д. 002.35.01 при Институте биоорганической химии РАН по адресу: 117871. Москва, В-437. ул.Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института биоорганической химии РАН.

Автореферат разослан января 1995г.

Ученый секретарь Специализированного совета

ИБХ РАН кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Общеизвестным является тот факт, что большинство сельскохозяйственных культур заражены вирусами, бактериями и другими инфекционными агентами. Это приводит к снижению урожайности на 25-303 не только при выращивании в открытом грунте, но и при хранении. Наиболее эффективной мерой защити растений от патогенов является их оздоровление с последующим выращиванием в условиях, не депускзвъих псзтоснсго инфицирования.

В связи с этим на первый план выдвигается задача разработки быстрого, надежного и высокочувствительного теста, позволяющего определять вирус в начальной стадии заражения. 3 полной ::ере редить эту проблему позволяет гибридсмная технология. Мсноклональные антитела (МкАт) взаимодействуют, как правило, с одном антигенной детерминантом белка оболочки вируса. Поэтому они являются высокоспецифичными реагентами и могут быть получены в неограниченном количестве, что создает основу для широкомасштабной диагностики сельскохозяйственных растений.

Основными объектами исследования данной работы являются: А-ви-рус картофеля (гр.Potyvirus), вирус мозаики резухи (гр.Nepovirus) и вирус желтой карликовости ячменя (гр.Luteovirus). А-вирус картофеля относится к наиболее обширной группе потивирусов. Ежегодный ущерб, наносимый вирусными болезнями урожаю картофеля, составляет не менее 25%. Вирус мозаики резухи поражает широкий спектр плодовых и ягодных растений, некоторые овощные культуры. Вирус желтой карликовости ячменя поражает зерновые культуры - ячмень, овес, пшеницу, рис и кукурузу, а также кормовые трасы. Он распространен в Европе, Северной Америке и Австралии. Данных о распространении ВЖКЯ в России очень мало из-за отсутствия диагностических средств. Диагностика ВЖКЯ затруднена. так как вирус накапливается в растениях в очень низких концентрациях.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлось получение МкАт к ВНР. АВК и ВЖКЯ. отбор МкАт. которые отвечают всем требованиям к иммунологическим реагентам в ИФА и на их основе разработка диагностических тест-систем для определения ВМР, АВК и ВЖКЯ в растительном материале методом ИФА. В ходе работы решались следующие задачи:

1. Получение и характеристика МкАт к BMP, АВК и ВЖКЯ.

2. Определение эпитопной специфичности МкАт методом конкурентного ИФА.

3. Подбор оптимальных комбинаций антител, обеспечивающих максимальную чувствительность тест-системы как для очищенного вирусного препарата, так и для зараженного растительного материала.

4. Исследование специфичности взаимодействия МкАт к АВК и ВЖКЯ с различными штаммами и изолятами гомологичных вирусов.

5. Разработка иммуноферментных тест-систем с использованием прямого ИФА и латекс-теста для диагностики указанных вирусов.

Научная новизна.

Впервые в России получены и охарактеризованы МкАт к BMP, АВК и ВЖКЯ, которые обладают высокой аффинностью и специфически взаимодействуют как с очищенными препаратами соответствующих вирусов, так и с зараженным растительным материалом.

На базе МкАт к BMP, АВК и ВЖКЯ разработаны высокочувствительные диагностические тест-системы для определения этих вирусов в растительном материале методом ИФА с использованием конъюгатов МкАт с пе-роксидазой хрена (ПХ).

Впервые для диагностики фитовирусов применен метод латекс-агглютинации с использованием МкАт.

С помощью МкАт выявлено четыре различных эпитопа на поверхности белка оболочки BMP и по крайней мере четыре различных эпитопа на поверхности белка оболочки ВЖКЯ.

Практическая ценность работы.

Полученные в работе результаты представляют несомненный научный и практический интерес. Разработанные на основе МкАт тест-наборы для диагностики BMP, АВК и ВЖКЯ детектируют указанные вирусы с высокой чувствительностью (2-10 нг/мл) и успешно прошли биологические испытания в МГУ им.Ломоносова. Главном Ботаническом саду РАН (BMP), ВНИИ по картофелеводству РАСХН (АВК), НИИ фитопатологии РАСХН (ВЖКЯ). Кроме того, тест-наборы были применены при получении безвирусного посадочного материала во ВНИИ садоводства им. Мичурина (г.Мичуринск) и Исследовательском институте селекции и технологии садоводства (г.Кишинев, Молдова).

Апробация работы.

Основные положения диссертации были доложены на Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту-Кяэрику, Эстония, сентябрь 1938г.). международных конференциях "Роль клеточных культур в биотехнологии" (г. Нойебранденбург, ГДР, сентябрь 1989г.) и "Фундаментальные и прикладные проблемы фитовирусологии" (г.Ялта. Украина, 1994г.).

Публикация результатов исследований.

По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на &£ страницах машинописного текста (без списка литературы) и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов экспериментов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает /^"наименований. Текст иллюстрирован ^ таблицами и рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Введение.

В настоящее время существуют методы культивирования ткани и выращивания растений из верхушечной меристемы, позволяющие получить здоровые растения-регенераты из исходных зараженных растений. Клетки апикальной меристемы, как правило, свободны от многих вирусов. Но этот метод позволяет достигнуть лишь частичного (30-50%) оздоровления растений. Совершенно очевидно, что оздоровленный таким образом посадочный материал должен быть обязательно подвергнут анализу для выбраковки зараженных растений с использованием достоверных методов.

Итак, главная задача безвирусного растениеводства - диагностика зараженных растений. Данная работа по получению МкАт к фитовирусам и разработке на их основе тест-систем является частью програ1:мы "Безвирусное растениеводство", которая осуществляется под руководством акад. И.Г.Атабекова в Московском государственном университете совместно с рядом академических и отраслевых институтов. В настоящее время моноклональные антитела для диагностики фитовирусов в России не производятся. В Европе лидером по выпуску коммерческих тест-кабо-ров на основе поликлональных антител для определения фитовирусоп яп-

ляется фирма "Boehringer-Mannheim" (Германия). Цены на эти наборы высоки, поэтому существует необходимость создания в России собственного производства диагностических наборов для контроля над вирусными заболеваниями растений. В настоящее время в группе фитоиммунодиаг-ностики ИБХ РАН разработаны тест-системы на основе МкАт для диагностики 9 фитовирусов, относящихся к различным таксономическим группам.

В данной работе объектами исследования были: вирус мозаики резухи (гр.Nepovirus) - изометрический РНК-содержащий вирус с размером частиц 28 им. переносимый нематодами (Murant, 1981); А-вирус картофеля (rp.Potyvirus). нитевидный РНК-содержащий вирус с размером частиц 730x11 нм (Hollings & Brunt, 1981), передающийся в полевых условиях тлей. Обычно А-вирус передается совместно с Х-вирусом картофеля, т.е. наблюдается смешанная инфекция, что затрудняет диагностику заболевания (Hollings Brunt, 1981); и вирус желтой карликовости ячменя (гр.Luteovirus), изометрический РНК-содержащий вирус с размером частиц 23-30 нм, который переносится с помощью тли (Rochow & Duffus, 1981). ВЖКЯ является флоэмоограниченным вирусом и накапливается в растениях в очень низких концентрациях, поэтому выявить его в растениях сложно. Различают 5 штаммов этого вируса - PAV, MAV, RPV, RGV и SGV, между которыми есть серологические отличия. ВЖКЯ интенсивно изучается в последние годы во всем мире. Некоторые авторы получили МкАт к различным штаммам ВЖКЯ (Hsu et al., 1984; Diaco et al., 1986; Pead & Torrance, 1988). Эти МкАт в основном были использованы для изучения серологических отличий между штаммами ВЖКЯ и внутри группы Luteovirus. Публикации о разработке тест-систем на их основе нам неизвестны. Таким образом, перед нами стояла задача создания высокочувствительных тест-систем для диагностики упомянутых выше вирусов, а также изучение возможности применения МкАт для изучения антигенной структуры вирусных белков с использованием метода конкурентного ИФА.

Материалы и методы.

Вирусы. Очищенные препараты вирусов и зараженный растительный материал были любезно предоставлены н.с. О.В.Борисовой (BMP, каф. вирусологии биологического факультета МГУ), ст.н.с. Ю.А.Варицевым (ABK. ВНИИ по картофелеводству. Московская обл.), ст.н.с. Т.Б.Кас-тальевой (ВЖКЯ, НИИ фитопатологии. Московская обл.).

Получение МкАт. МкАт против BMP, АВК и ВЖКЯ были получены методом гибридомной технологии по методике описанной в работе Kohler & Milstain, 1975, с некоторыми модификациями. Мышей линии BALB/c иммунизировали очищенным препаратом BMP непосредственно в селезенку (Spitz et al., 1984) для получения МкАт класса IgM, или внутрибрю-шинно 2-3 раза с адъювантом Фрейнда для получения МкАт класса IgG. При иммунизации ВЖКЯ третью инъекцию проводили без адъюванта внутривенно в хвостовую вену. Отбор положительных гибридом проводили тестированием культуральных жидкостей (ICH) методом непрямого "сэндвич" ИФА (Koenig & Paul, 1982).

Очистка антител. Очистку МкАт класса IgG из асцитных и культуральных жидкостей проводили методом осаждения 50% сульфатом аммония с последующей хроматографией на белок-А сефарозе (Плечко и др., 1991). Антитела класса IgM очищали осаждением из асцита 50% раствором полиэтиленгликоля ( м.в.6000) в 0.1 M фосфатно-солевом буфере, pH 7.2. Поликлональные антитела получали из сыворотки крови кроликов осаждением сульфатом аммония как описано в работе Gugerli & Fries, 1983.

Определение подклассов МкАт. Изотипы МкАт определяли с помощью набора антител против подклассов иммуноглобулинов мыши (Calbiohem. США), согласно прилагаемой к набору инструкции.

Конъмгирование МкАт с пероксидазой. Конъюгирование МкАт с ПХ (Boehringer-Mannheim Grad I. Германия) проводили как описано в работе (Плечко и др., 1991).

Иммуноферментнын анализ. "Сэндвич" ИФА"проводили как списано в работе Clark & Adams, 1977 с некоторыми кодификациями, в непрямом "сэндвич" НФА к комплексу антитело-антиген добавляли вирус-специфичные МкАт, которые после инкубации проявляли конъюгатом антивидОБЫХ антител с ПХ (Thomas et al., 1936). Непрямой И JA проводил;! как списано в работе Murphy & D'Arcy, 1991. На поверхности псгчстироловнх плат иммобилизовали антиген, затем добазллли МкАт ;: после и:!г.убаг,ип комплекс антиген-антитело проявляли ксиъпгатсм о:т:гидсп:х аткгсл с ИХ. Реакции останавливали 1Н П.SO,, Количественно результ-тг и;л измеряли на вертикальном сото.четре Titertc!-: üultiacan (Fie Lab., Шотландия) при длине полны .192 ил-; 150 км, если реа;нл;а ну ссталаалааа-лп.

Проведение реакции латекс-агггсчнилции. Лнтлглн, носладсаателл-но риссдешшй в 0.1 M Сос.;а'хпс-солево:! буфера (¡Л! 7.П) гнссили s

лунки полистирольных плат с U-образным дном, после чего добавляли МкАт, иммобилизованные на окрашенных частицах латекса как описано в работе Плечко и др., 1991. При положительной реакции частицы латекса образовывали "зонтик" на дне лунки, при отрицательной - точки.

Конкурентный ИФА. Конкурентный ИФА проводили как описано в работе Van den Heuvel et al., 1990 с некоторыми модификациями: вместо системы МкАт-биотин-стрептавидин-щелочная фосфатаза использовали конъюгаты МкАт с ПХ.

Определение Ка. Ка МкАт с антигеном определяли с помощью неконкурентного ИФА как описано в работе Torrance & Pead, 1986 согласно формуле:

1

Ка = _ ,

4[МкАт']- 2[МкАт]

где [МкАт] - концентрация антител . соответствующая 50% связыванию при определенной концентрации антигена, [МкАт'] - концентрация антител, соответствующая 50% связыванию от максимального при вдвое меньшем количестве антигена.

Результаты и обсуждение.

Получение и характеристика моноклональных антител.

В настоящей работе было описано и охарактеризовано четыре ан-ти-ВМР (ЗВ4, 4А2, 1А10 и 3G3). два анти-АВК (5.3, 11.4) и пять ан-ти-ВККЯ (4В5, ЗСЗ, 1D3, 1С5 и ЗС2) моноклональных антител. Для МкАт был определен их класс и подкласс, титр в культуральной и асцитной жидкостях, Ка с антигеном (таблица 1).

Таблица 1.

Свойства моноклональных антител

МкАт Класс и Титры* КЖ Титры асцитных Ка с

подкласс жидкостей антигеном,

м-1

анти-ВМР:

ЗВ4 IgG2b 4.0 ,io-3 -** 4.1 .1011

4А2 IgG2b 2.0 • 10-3 - 2.3 .1011

1А10 IgM 1.5 . 10"3 10"5 2.1 .ÎO10

3G3 IgM 1.2 .10"3 10"5 2.3 ,1010

анти-АВК

5.3 IgGl 2.0 .10"3 10" 5 8.3 .1011

11.4 IgM 1.5 . 10"3 10"5 H.0.***

анти-ВЖКЯ

4В5 IgG2b 4.0 .10"4 10"6 1.5 .1011

ЗСЗ IgG2a 4.0 .10"4 10"6 8.8 .10e

1D2 IgG3 2.0 .10"4 10"6 1.1 .10'2

1С5 IgG2a 2.5 . 10"3 10"5 1.6 .1011

ЗС2 IgG2a 2.0 .10"4 10"5 H. 0.

* - За конечный титр принимали разведение культуральной или ас-цитной жидкостей, при котором А492> 0.2. Отрицательный контроль составлял А492 < 0.1.

** - Клеточные линии не образуют асцитов. *** - не определяли.

Разработка моноклональной тест-системы для определения вируса мозаики резухи (Arabis mosaic virus).

BMP не относится к вирусам, которые интенсивно исследуются многими научными коллективами. Автору известно только две работы по получению МкАт к BMP (Dietzgen, 1986: Frison & Stace-Smith. 1992). В обоих работах МкАт использовались для характеристики антигенной структуры и изучения взаимодействия полученных МкАт с различными

изолятами BMP и близкородственных вирусов. В России и странах СНГ многие садоводческие и цветоводческие хозяйства нуждаются в диагностическом наборе для определения BMP, который достаточно распространен и поражает ягодные, плодовые, овощные культуры и цветы.

В нашей работе панель из 4 МкАт к BMP была использована как для разработки тест-системы (Плечко и др.. 1991), так и для характеристики эпитопов связывания МкАт с помощью метода конкурентного ИФА.

Были получены конъюгаты МкАт 1А10 (IgM) и ЗВ4 (IgG) с ПХ. МкАт 4А2 (IgG) после конъюгации с ферментом теряли свою активность, МкАт 3G3 (IgM) не конъюгировали с ПХ. С помощью МкАт и поликлональных кроличьих антител к BMP было проведено сравнение различных вариантов определения BMP в очищенном препарате и растительных экстрактах методом прямого и непрямого ИФА.

При использовании антител класса IgM как основы для тест-системы чувствительность (минимальная определяемая концентрация) с использованием очищенного препарата BMP составляла 30-60 нг/мл, уровень неспецифического связывания б контрольных образцах с гетероло-гичными вирусами составлял А492 0.2-0.3 (рис.1). При использовании в качестве субстрата вместо о-фенилендиамина аминоантипирина, уровень как специфического, так и неспецифического связывания был несколько ниже, но чувствительность была примерно одинакова в обоих случаях. Однако при постановке аналогичного варианта ИФА с соком зараженного BMP растения в контрольных пробах с соком здорового растения наблюдался высокий уровень неспецифического связывания (А^эг 0.4-0.6 ед.). Таким образом, мы сделали вывод о непригодности полученных нами МкАт класса IgM для разработки тест-системы.

Сравнительные результаты определения BMP методами прямого и непрямого "сэндвич" ИФА приведены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что лучшие результаты получаются в двух случаях: 1) в прямом моноклональном "сэндвич"-ИФА с МкАт ЗВ4 и конъ-югатом ЗВ4-ПХ; 2) в непрямом комбинированном "сэндвич"-ИФА с использованием поликлональных антител. МкАт ЗВ4 и антивидового конъюгата.

Для окончательного варианта тест-системы мы остановили свой выбор на моноклональном прямом "сэндвич" ИФА, так как для него не требуется получать поликлональные антитела из сыворотки животных (Рис. 2а, б).

[вирус], нг/ил

Рис. 1. Определение BMP с помощью "сэндвич"-ИФА. В подложке МкАт 1А10. Конъюгат 1А10-ПХ. Субстраты - о-фенилендиамин (1,2) и ами-ноптерин (3,4). Контрольные кривые с вирусом мозаики люцерны (2,4).

Таблица 2.

Сравнительные результаты ИФА с использованием моно- и поликлональных антител.

Нижние Ат

Верхние Ат

Конъюгат

Чувствит. нг/мл

Максим, разведен.

растительного

экстракта

поликлональ-ные антитела против BMP

поликлональ-ЗВ4 ные Ат козла против Ig мыши

2-3

1 : 1280

то же ЗВ4

4А2

то же ЗВ4 - ПХ

6-8 2-3

1 : 640 1 : 1280

4А2

ЗВ4 - ПХ

4-6

1 : 640

1А10 или 3G3

1А10 - ПХ

30 - 60

1 : 12800

1 1

[вирус], нг/ил [вирус], нг/ыл

Рис.2. Определение BMP с помощью "сэндвич"-ИФА (А) и непрямого ИФА (Б). А - в подложке МкАт ЗВ4 (1) и 4А2 (3). конъюгат ЗВ4-ПХ. Контрольные кривые с вирусом огуречной мозаики (2,4); Б - в подложке ПкАт кролика против BMP, вторые антитела ЗВ4 (1), конъюгат антивидовой. Контрольная кривая с вирусом мозаики ксеноподиума (.2).

Использование реакции латексной агглютинации для диагностики BMP.

Для латекс-теста использовали МкАт, иммобилизованные на полимерных микросферах диаметром 1.7 мы-!. полученных путем полимеризации акролеина и окрашенных в красный цвет. Полимерные латексы были любезно предоставлены ст.н.с. Ю.В.Лукиным (лаб. "Полимеры для биологии" ИБХ РАН).

Определение BMP проводили в микропланшетах с U-образными лунками с помощью реакции латексной агглютинации (PJIA) (Лукин и Плечко. 1988). BMP определяли в очищенном препарате и в соке зараженных растений. Образцы, содержащие вирус, раститровывали в лунках микропланшет. в которые затем добавляли равный объем суспензии латексных частиц с иммобилизованными на них МкАт. Через несколько часов инкубации при комнатной температуре проводили визуальный учет РЛА. При использовании МкАт ЗВ4 в очищенном препарате BMP определялся до концентра-

ции 6 нг/мл, в соке растений до разведения 1:160. В случае использования МкАт класса IgM (1А10) предел чувствительности составлял 1-2 мкг/мл. Таким образом, латекс-тест может быть широко использован в диагностике фитовирусов. Чувствительность метода сравнима с ИФА, метод прост и доступен.

Конкуренция моноклональных антител за связывание с антигеном.

Для выяснения вопроса, связываются ли полученные МкАт с одним и тем же участком вирусного белка оболочки (эпитопом) или с различными, мы использовали метод конкурентного ИФА, при котором пара антител, одно из которых немеченое, а другое конъюгировано с ПХ, конкурировали за связывание с антигеном, сорбированном на твердой фазе (Van den Heuvel et al., 1990). В качестве исходного уровня связывания брали величину оптической плотности (А492 ) при взаимодействии конъюгата в рабочем разведении с антигеном. К антигену, сорбированному на плате, добавлял немеченые антитела ЗВ4, 4А2, 1А10, 3G3 в различных концентрациях от 200 мкг/мл до 90 нг/мл и после инкубации в течение часа вносили конъюгат'в рабочем разведении без отмкзкн платы. При отсутствии конкуренции между меченьзд и немечеными антителами связывание оставалось на уровне исходного. Если меченые и немеченые МкАт конкурировали между собой, то при больших концентрациях немеченых антител наблюдалось значительное понижение уровня А492, а с уменьшением концентрации немеченых антител уровень связывания постепенно повышался до исходного.

На (рис. 3 А) представлены данные по конкуренции МкАт к BMP с мечеными антителами ЗВ4. Уровень исходного связывания составлял 1.6 o.e. По данным ИФА. МкАт 1А10 и 3G3 не конкурировали за связывание с антигеном с ЗВ4-ПХ - уровень связывания при любых концентрациях этих антител оставался на уровне исходного (данные на рисунке не показаны). Как и следовало ожидать. МкАт ЗВ4 конкурируют с ЗВ4-ПХ и при больших концентрациях немеченых антител уровень связывания понижается до фоновых значений (Рис. 3 А. кривая 2). При больших концентрациях немеченых МкАт 4А2 уровень связывания падает до 0.5-0.6 o.e. (т.е. на 60-70%), постепенно повышаясь до исходного с уменьшением концентрации 4А2 (Рис. 3 А, кривая 1). Видимо эпитопы, с которыми связываются МкАт ЗВ4 и 4А2 находятся рядом или частично перекрываются.

о.о

0.0

200 67 22 7.4 2.S .62 .27 .09 [Ат], ыхг/мл

200 67 22 7.4 2.5 0.82 0.27 0.08 [Ат], vixr/ыл

Рис. 3. Конкуренция немеченых МкАт 4А2 (1) и ЗВ4~(2) с конъюгатом ЗВ4-ПХ за связывание с BMP (А). Конкуренция немеченых антител 1А10 (1) и 3G3 (2) с конъюгатом 1А10-ПХ (Б).

На (рис. 3 Б) представлены данные конкуренции меченых МкАт 1А10-ПХ с немечеными МкАт к BMP. Уровень исходного связывания составлял 2.0 o.e. МкАт ЗВ4 и 4А2 не конкурировали с 1А10-ПХ за связывание с антигеном - уровень связывания при любых концентрациях антител оставался на уровне исходного (данные на рисунке не показаны). Немеченые МкАт 1А10 понижали уровень связьвания 1А10-ПХ до уровня фона в интервале концентраций 22-200 мкг/мл, при уменьшении концентрации 1А10 до 90 нг/мл уровень связьвания постепенно повышался до исходного (Рис. 3 Б, кривая 1). МкАт 3G3 в интервале концентраций 90 нг/мл - 7.4 мкг/мл не влияли на уровень связывания, а при повышении концентрации 1А10 до 200 мкг/мл постепенно снижали уровень связывания до 0.6 o.e. Эти данные мы интерпретировали как отсутствие конкуренции между МкАт 1А10 и 3G3 (Рис. 3 Б, кривая 2). Понижение уровня связывания при высоких концентрациях 3G3 можно объяснить стерически-ми ограничениями для связыания 1А10-ПХ, т.к. оба МкАт относятся к классу IgM и являются пентамерами.

Таким образом, все четыре МкАт к BMP связываются с различными эпитопами на поверхности вирусного белка, два из которых - для ЗВ4 и 4А2 находятся рядом или частично перекрываются.

Получение и характеристика МкАт к вирусу желтой карликовости

ячменя. Моноклональная тест-система для диагностики вируса.

Разработка тест-системы для диагностики ВККЯ являлась наиболее сложной частью данной работы по нескольким причинам: во-первых, вирусы группы Luteovirus, к которым относится ВЖКЯ. являются флоэмоог-раниченными, т.е. в растениях присутствуют и накапливаются только во флоэме (Rochow & Duffus, 1981); этим объясняется чрезвычайно низкий выход очищенного препарата вируса при выделении (в среднем 100 мкг из 1 кг растительного материала); это потребовало усовершенствования схемы иммунизации с целью использования минимальных количеств антигена. Во-вторых, известно 5 штаммов ВЖКЯ: PAV. MAV, RPV, RGV и SGV, отличающихся по виду переносящей их тли и способу переноса (Brakke 8= Rochow, 1974). Между штаммами существуют серологические отличия (Fargette & Lister, 1982). В третьих, в „анном случае препарат вируса. использованный для иммунизации, был выделен из полевого растительного материала, а не из тепличных растений, зараженных известным штаммом ВЖКЯ. Поэтому целью этой части работы было не только получение МкАт к ВЖКЯ и разработка тест-системы на их основе, но и определение штамма вируса, к которому получены МкАт.

По причинам, указанным выше, в процессе работы использовали два различных изолята ВЖКЯ, выделенных из растительного материала, собранного в Московской области в 1992 и 1993 годах. В дальнейшем они будут называться "Учхоз-92" и "Немчиновка-93". Для иммунизации животных и отбора клонов-продуцентов МкАт использовали изолят "Уч-хоз-92". а для окончательной разработки тест-системы и конкурентного ИФА - изолят "Немчиновка-93". К какому из штаммов ВККЯ относятся эти изоляты можно было выяснить только с помощью опытов -по искусственному заражению растений в теплице, используя различные виды тлей-переносчиков. Однако в процессе работы мы получили ряд важных косвенных доказательств того, что данные изоляты содержали PAV-ВЖКЯ (или смесь штаммов PAV и MAV, которые серологически родственны). Во-первых, во время сбора растительного материала в 1992 и 1993 гг. на посевах злаков были обнаружены только тли видов Rhopalosiphum padi (переносит штаммы PAV и RPV) и Macrosiphum avenae (переносит штаммы MAV и PAV). Во-вторых, опыты с препаратом штамма RPV. любезно предоставленном ст.н.с. Всероссийского института защиты растений В.С.Обручко-

вым, показали, что полученные нами МкАт не взаимодействуют с RPV-ВЖКЯ. Эти результаты хорошо согласуются с данными авторов, впервые описавших ВЖКЯ и его штаммы (Rochow &= Duffus, 1981) об отсутствии перекрестных реакций поликлональных антител, полученных к PAV и MAV, с сыворотками, полученными к RPV. Таким образом, полученные МкАт и тест-снстема на их основе предназначены для диагностики PAV-ВЯКЯ, который присутствует примерно в 50% образцов злаков, зараженных ВЖЫЯ и собранных в центральных регионах России. В остальных 50% образцов присутствует штамм RPV, в редких случаях MAV и SGV, RMV не обнаружен (информация от ст.н.с. НИИ фитопатологии Т.Б.Касталь-евон).

Свойства 5 МкАт к ВЖКЯ представлены в таблице 1. Отбор положительных клонов проводили методом непрямого ИФА; МкАт 4В5, ЗСЗ и 1D2 были конъюгированы с ПХ. Сравнение всех возможных вариантов прямого "сэндвич"-ИФА показало, что наибольшая чувствительность определения достигается при использовании в качестве проявляющих верхних антител МкАт 4В5.• В качестве нижних, сенсибилизирующих антител некоторые МкАт вели себя по-разному при определении различных изолятов ВЖКЯ (рис. 4, А, Б). МкАт ЗСЗ слабо реагировали с изолятом "Учхоз-93" (рис. 4, А), а МкАт 1D2 не работали в качестве нижних антител с изолятом "Немчиновка-93" (рис. 4, Б). В качестве сенсибилизирующих были выбраны îîkAt 4В5. дающие хорошие результаты с обоими изолятами ВЖКЯ.

Было проведено сравнительное определение вируса в 13 образцах зараженных растении, собранных в четырех областях России: Московской, Калужской, Тамбовской и Белгородской. Сравнивались 3 конъюгата: 4В5-ПХ, ЗСЗ-ПХ и 102-ПХ (рис. 5). Как видно из рисунка, лучшие результаты были получены в системе 4В5 - ВНКЯ - 4В5-ПХ. Этот вариант оказался наиболее чувствительным и универсальным как в опытах с различными изолятами очищенного вируса, так и при определении в растительном материале. Минимальная определяемая концентрация ВЖКЯ составила 7-8 нг/мл (рис. 4, Б). В экстрактах зараженных растений вирус определялся до разведений 1:16-1:32, что связано с чрезвычайно низ-кон его концентрацией в растениях (рис. 5). Для увеличения концентрации ВНКЯ'в экстрактах мы применили метод обработки растительного материала жидким азотом перед измельчением (Henry & Francki, 1992). В результате этого чувствительность определения ВЖКЯ повысилась в лучших случаях до разведения экстракта 1:128.

Рис. 4. Определение ВЖКЯ с помощью различных вариантов "сэнд-вич"-ИФА. Конъюгат 4В5-ПХ. В подложке МкАт ЗСЗ (1), 1D2 (2), ЗС2 (3), 1С5 (4), 4В5 (5). Контрольная кривая (6) с вирусом мозаики резухи. А - изолят "Учхоз-92", Б - изолят "Немчиновка-93".

2.0

1.6

1.2

с о

о.в

0.4

0.0

1/25« 1/1Е0 1/64 1/32 1/18 1/8 1/4

Разведение сока

i/г

Рис. 5. Определение ВЖКЯ в экстрактах из листьев овса с помощью различных вариантов "сэндвич"-ИФА. В подложке МкАт 4В5. Конъюгаты 4В5-ПХ (1), ЗСЗ-ПХ (2), Ю2-ПХ (3). Контрольная кривая с экстрактом из листьев здорового овса (4).

Из полученных экспериментальных данных нами был сделан вывод, что единственные антитела, работающие во всех опробованных вариантах ИФА с обоими изолятами вируса и растительными экстрактами - 4В5. Они были отобраны для использования в моноклональной иммуноферметной тест-системе. Использование МкАт ЗСЗ дало такие же результаты, как и 4В5 при определении изолята "Немчиновка-93" и немного худшие при определении ВЖКЯ в экстрактах растений. Другие полученные МкАт были использованы для изучения антигенной структуры ВЖКЯ и вьивления се-рологичесих отличий между изолятами и штаммами ВЖКЯ.

"Сэндвич" ИФА с 4 изолятами вируса скручивания листьев картофеля (Невский, Ашерслебен, Приор и Укана), который тоже относится к группе Ы^еоу1гуз, показал отсутствие перекрестных реакций с ВСЛК для всех 5 МкАт к ВЖКЯ. Этот результат подтверждает специфичность взаимодействия МкАт с ВЖКЯ.

Изучение антигенной структуры белка оболочки ВЖКЯ с помощью конкурентного ИФА.

Эксперименты по конкуренции меченых ПХ и немеченых МкАт за связывание с антигеном проводились также, как описано выше (см. стр. 11). Для опытов использовались все 5 МкАт и 3 конъюгата - 4В5-ПХ, ЗСЗ-ПХ и Ю2-ПХ. Конкурентный ИФА проводили с тремя изолятами ВЖКЯ: "Учхоз-92", "Немчиновка-93" и "Тамбов". Результаты принципиально не различались для всех 3 изолятов. На рис. 6 представлены результаты конкуренции МкАт с 4В5-ПХ (рис. 6 А), ЗСЗ-ПХ (рис. 7 Б) и Ю2-ПХ (рис. 6 В) для иьолята "Немчиновка-93".

На (рис. 6 А) МкАт 4В5, 1С5 и ЗСЗ конкурируют с 4В5-ПХ за связывание с антигеном, понижая связывание конъюгата на 90-97% при концентрации 200 мкг/мл. Уровень связывания постепенно повышается до исходного с уменьшением концентрации свободных МкАт. 1D2 в диапазоне концентраций 200 - 2.5 мкг/мл понижают связывание на 35-55%, при меньших концентрациях 1D2 - на 15-25%. МкАт ЗС2 только при больших (67-200 мкг/мл) концентрациях уменьшают связывание 4В5-ПХ. В диапазоне 22.5-0.09 мкг/мл связывание фактически на уровне исходного. Таким образом, МкАт 4В5. 1С5, ЗСЗ и 1D2 конкурируют с 4В5-ПХ, а ЗС2 -нет. На основании этих данных можно выделить по крайней мере 3 раз-

личных эпитопа: эпитоп связывания МкАт 4В5, 1С5 и ЗСЗ; эпитоп связывания 1D2, который находится рядом или частично перекрывается с первым, и эпитоп связывания ЗС2.

Таблица 3.

Конкуренция МкАт за связывание с антигеном.

Конъюгаты МкАт

МкАт 4В5-ПХ ЗСЗ-ПХ 1D24IX

4В5 + + +

ЗСЗ + + -

1D2 + + +

1С5 + + +

ЗС2 - - -

Аналогичным образом на (рис. 6 Б) можно выявить по крайней мере 2 эпитопа: связывания МкАт 4В5, ЗСЗ, 1D2, 1С5 и связывания ЗС2. На рис.бВ видны по-крайней мере 4 различных эпитопа: для 1С5 и 4В5, для 1D2, для ЗСЗ и для ЗС2. Причем ЗСЗ проявляют в этом случае эффект "положительного кооперативного связывания", что отличает эти МкАт от 4В5 и 1С5.

Все данные по конкурентному ИФА обобщены в Таблице 3.

Таким образом, на основании экспериментальных данных удалось определить по-крайней мере 4 эпитопа, с которыми связываются МкАт к ВЖКЯ. МкАт 4В5 и 1С5 по-видимому связываются с одним и тем же эпито-пом. МкАт 1D2 связывается с эпитопом, находящимся рядом или частично перекрывающимся с первым. Эпитоп связывания МкАт ЗСЗ отличается от указанных двух эпитопов, т.к. при конкуренции с Ю2-ПХ МкАт ЗСЗ ведут себя отлично от 4В5 и 1С5. Только МкАт ЗС2 связывается с эпитопом, вероятно удаленном от остальных.

к <О

200 87 гг.5 7.5 2.5 О.ВЗ 0.27 0.00

[Ат], икг/ип

гоо 67 гг.5 7.5 г.5 о.аз о.г7 о.оэ [Ат], мкг/мл

20Э 37 22.5 7.5 2.5 0.B3 0.27 О.ОЗ [Ат], ыкг/ил

Рис. 6. Конкуренция немеченых МкАт 4В5 (1), ЗСЗ (2), 1D2 (3), 1С5 (4), ЗС2 (5) с конъюгатами 4В5-ПХ (А), ЗСЗ-ПХ (Б), Ю2-ПХ (В) за связывание с антигеном.

Иммуноферментная тест-система для диагностики A-вируса картофеля.

АВК - типичный представитель многочисленной группы потивирусов. имеющий однонитевые РНК-содержащие вирионы размером 730x11 нм. В природе он представлен тремя группами штаммов, различающихся по па-тогенности (Bartels, 1971). Диагностика АВК является сложной проблемой, поскольку этот вирус распределяется в растении неравномерно и накапливается в сравнительно низких концентрациях (Hollings & Brant. 1981). Получение поликлональных антител к АВК является трудоемким и тест-системы, основанные на использовании ПкАт, зачастую не дают желаемой чувствительности (Torrance, 1992). Из-за отсутствия надежных диагностических средств АВК в России выявлен пока только на Дальнем Востоке (Gnutova & Krylov, 1976). В Европе он широко распространен и вызывает снижение урожайности на 38-46% (Hunnius, 1976).

Целью этой части работы являлось получение МкАт к АВК и создание на их основе диагностической тест-системы. Все изоляты АВК, использованные в этой работе, а также зараженный растительный материал были любезно предоставлены ст.н.с. ВНИИ картофельного хозяйства Ю.А. Варицевым. Были использованы изоляты: Vocal, Чернатица из Центральной опытной станции по селекции и сортоподдержанию, (г.Пловдив, Болгария), Bolko, Leda из Института картофеля (г.Бонин, Польша), В—11 из Института фитопатологии (г.Ашерслебен, Германия), H от фирмы Mericlon (Венгрия). В результате 4 гибридизаций клеток селезенки мыши с миеломными клетками P3X63.Ag8.653 было получено 6 первичных гибридных линий, но после двух циклов клонирования были отобраны две стабильные линии: 5.3 и 11.4. Отбор клонов-продуцентов проводили двумя методами: непрямым ИФА, при котором вирус сорбировали на плату, а связавшиеся антитела выявляли антивидовым конъюгатом: непрямым "сэндвич" ИФА, при котором на плату сорбировали кроличьи ПкАт к АВК, затем вносили вирус, содержащийся в соке листьев табака, инфицированными различными изолятами АВК. Связавшиеся МкАт выявляли так же, как в первом случае.

После изотипирования и предварительных опытов по определению АВК в растительном материале выяснилось, что МкАт 11.4 класса IgM дают высокий уровень неспецифической реакции с экстрактами здоровых растений. Таким образом, для разработки тест-системы были использованы МкАт 5.3 (IgGl) и кроличьи поликлональные антитела к АВК. Были приготовлены коныюгаты МкАт 5.3 и поликлональных антител к АВК с ПХ.

[вирус], нг/мл

Рис. 7. Определение А-вируса картофеля в изолятах В-11 (1) и Н (2) с использованием "сэндвич"-ИФА. В подложке МкАт 5.3. Конъигат 5.3-ПХ. Контрольная кривая с вирусом мозаики резухи (3).

На Рис.7 представлены результаты определения АВК (изоляты В-11 и Н) с помощью моноклонального "сэндвич"-ИФА. Чувствительность в этом случае составляла около 40 нг/мл. Для повышения чувствительности тест-системы было проведено сравнение всех возможных вариантов "сэндвпч"-ПФА с МкАт 5.3 и ПкАт против АВК на изолятах Н и В-11. Данные этого эксперимента представлены в таблице 4.

Из представлении данных следует, что комбинированные тест-сис-гемы (с использованием Мк и Пк антител) в целом позволял;; определять АВК с бояшей чувствительностью. Яри этом для всех описанных вариантов н>А урсзень неспецнфнческих реакций был крайне низким (Aibl, < 0.05). При определении АВК в экстрактах растений, зараженных 6 различнее! кзолятаи! АВК, с использованием всех 4 вариантов "сэндзнч" II.Л, указанных такне било по:сазано преимущество тест-системы

типа П:;Ат-АЗК-5.3-ПХ (Таблица 5)

Таблица 4.

Сравнение различных вариантов "сэндвич" ИФА при определении АВК-Н и АВК В—11 в очищенных препаратах.

Изоляты АВК Антитела в подложке Конъюгат Мин. определяе-

мая конц., нг/мл

АВК-Н 5.3 5. 3-ПХ 30 - 40

5.3 ПкАт-ПХ 10 - 16

ПкАт 5.3-ПХ 20 - 30

ПкАт ПкАт-ПХ 30 - 40

АВК В-11 5.3 5.3-ПХ 10 - 16

5.3 ПкАт-ПХ 8 - 10

ПкАт 5.3-ПХ 4 - 8

ПкАт ПкАт-ПХ 60 - 80

Таблица 5.

Определение изолятов АВК в экстрактах растений с помощью различных вариантов "сэндвич"-ИФА.

Изоляты АВК А450 при разведении экстракта 1 : 40. o.e.

Варианты ИФА*

1 2 3 4

Н 1.3 1.1 0.9 0.8

В-11 1.2 1.0 0.8 0.7

Leda 0.5 0.5 0.4 0.4

Bolko 0.3 0.25 0.15 0.1

Чернатица 0.7 0.3 0.3 0.3

Vocal 0.4 0.2 0.2 0.1

* варианты ИФА: 1 - ПкАт - АВК - 5.3-ПХ

2 - 5.3 -АВК - ПкАт-ПХ

3 - 5.3 -АВК - 5.3-ПХ

4 - ПкАт - АВК - ПкАт-ПХ

В качестве контроля использовали экстракт листьев здорового табака. Уровень неспецифического связывания не превышал 0.02 o.e. Вариант 1 (таблица 5) был отобран как наиболее чувствительный для окончательного варианта тест-системы. Комбинированная тест-система с сенсибилизирующими ПкАт и детектирующими МкАт 5.3 была испытана в сравнении с коммерческим диагностическим набором к АВК фирмы "Boeh-ringer-Mannheim". в котором использованы ПкАт, а в качестве детектирующей метки - щелочная фосфатаза. Определение предельных разведений сока табака, инфицированного АВК. не выявило существенных различий между разработанной тест-системой и коммерческим набором по чувствительности теста.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов сконструирована иммуноферментная диагностическая тест-система на основе моно- и поликлональных антител. При этом чувствительность определения АВК в очищенном препарате составляет 4-8 нг/мл, а в соке зараженного растения вирус определяется при разведении 1:1280. Использование ПкАт для сенсибилизации планшета расширяет спектр взаимодействия антител с различными изолятами АВК, а применение МкАт в составе конъ-югата обеспечивает специфичность определения, а также стандартность диагностической системы. Система испытана на 6 изолятах АВК и может служить основой для выпуска коммерческих диагностических наборов.

ВЫВОДЫ

1. Получены и охарактеризованы моноклональные антитела к А-вирусу картофеля, вирусу желтой карликовости ячменя и вирусу мозаики резухи.

2. На белке ободочки BMP локализованы 4 эпитопа, два из которых перекрываются.

3. Показано, что 5 моноклональных антител к ВИСЯ связываются по-крайней мере с четырьмя различными эпитопами на белке оболочки вируса.

4. Показано, что моноклональные антитела к ВККЯ специфичны к штамму PAV и не дамт реакции с штаммом RPV и родственным вирусом скручивания листьев картофеля.

5. На основе моноклональных антител впервые в России разработаны высокочувствительные иммуноферментные тест-системы для определения АВК, ВЖКЯ и BMP в очищенных препаратах и зараженном растительном материале.

6. Для индикации фитовирусов разработан простои и удобный латекс-тест с использованием моноклональных антител (на примере диагностики BMP).

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Лукин Ю.В., Плечко Т.Н. Полимерные реагенты для диагностики фитовирусов. Тезисы докладов Всесоюзного совещания по биологически активным полимерам и полимерным реагентам для растениеводства, Нальчик, 1988. стр. 87.

2. Plechko T.N., Kirillow А.V., Odinets A.G. Monoclonal antibodies against phytoviruses of Potyvirus and Hepovirus groups. Abstracts "14th International Congress of Biochemistry" Praga, 1988, FR:699.

3. Plechko T.N., Ambrosova S.M., Lukin Yu.V. Comparative characteristics of immunoglobulins of the IgG and IgM classes for phytoviruses diagnostics. Abstracts "6th Conference of young scientists on organic and bioorganic chemistry" Bechyne, 1989, p.161.

4. Плечко Т.Н., Кириллов А.В., Амбросова C.M., Борисова О.Б., Одинец А.Г. Использование моноклональных антител в диагностике фитовирусов. Биоорганическая химия, 1991, т.17, N 2, стр. 223-231.

5. Ерохина Т.Н., Амбросова С.М., Варицев ¡0. А., Малофеева Ю. С., Князева В.П., Кулявцев А.В. Комбинированная тест-система для иммуно-ферментного анализа А-вируса картофеля. Биоорганическая химия, 1993. т.19, N 10, стр. 941-948.

6. Erokhina T.N. Some characteristics of monoclonal antibodies to barley yellow dwarf virus. BYDV diagnostics on the field material. Epitope analysis of virus coat protein with monoclonal antibodies. Abst. International Conference "Fundamental and applied problems in phytovirology" Ukraine, Yalta. 1994. p. 48.

7. Kastalieva Т.B., Erokhina T.N., Vasilieva T.Ya., Mozhaeva K.A. Naturally infected oat and barley plants, used as immunogen source for monoclonal antibodies production against barley yellow dwarf virus. Abst. International Conference "Fundamental and applied problems in phytovirology" Ukraine, Yalta, 1994, p.52.

8. Ерохина Т.Н. Получение и характеристика моноклональных антител к вирусу желтой карликовости ячменя. Моноклональная тест-система для диагностики вируса. Биоорганическая химия (в печати).