Синтез полиглицидилметакрилатных суспензий с узким распределением частиц по размерам тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

61: 99-^/359- 0

/

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи УДК 678.061.06:615.4

АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ИШКОВ

СИНТЕЗ ПОЛИГЛИЦИДИЛМЕТАКРИЛАТНЫХ СУСПЕНЗИЙ С УЗКИМ РАСПРЕДЕЛЕНИЕМ ЧАСТИЦ ПО РАЗМЕРАМ

02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Грицкова И.А. кандидат химических наук, доцент Прокопов Н.И.

МОСКВА -1999

СОДЕРЖАНИЕ.

Стр.

¡.Введение................................................................... 4

2. Литературный обзор..................................................... 7

2.1. Применение монодисперсных микросфер для иммунодиагностических исследований........................ 7

2.2. Способы получение полимерных монодисперсных

суспензий.............................................................. Ю

2.2.1. Получение полимерных суспензий методом

дисперсионной полимеризации.............................. 11

2.2.1.1. Компоненты дисперсионной полимеризации........ 13

2.2.1.2. Влияние различных параметров на свойства полимерных суспензий в дисперсионной полимеризации 18

2.2.1.3. Дисперсионная сополимеризация....................... 32

2.2.1.4. Основные стадии формирования частиц в дисперсионной полимеризации................................. 33

2.2.1.5. Кинетические закономерности дисперсионной полимеризации..................................................... 36

2.3. Латекс-агглютинационной тест в диагностике инфекционных заболеваний....................................... 38

3. Экспериментальная часть.............................................. 43

3.1. Исходные вещества................................................. 43

3.2. Методы исследования.............................................. 43

4. Результаты и их обсуждение.......................................... 52

4.1. Синтез полиглицидилметакрилатных микросфер в отсутствие эмульгатора............................................. 52

4.2. Синтез полиглицидилметакрилатных микросфер методом дисперсионной полимеризации................................... 67

4.2.1. Влияние концентрации мономера на диаметр частиц полиглицидилметакрилатных суспензий и их распределение по размерам...................................... 73

4.2.2. Влияние концентрации инициатора на диаметр частиц

полиглицидилметакрилатных суспензий и их

распределение по размерам...................................... 77

4.2.3. Влияние концентрации метакриловой кислоты на диаметр частиц полимерных суспензий и их распределение по размерам...................................... 80

4.3. Синтез полимерных суспензий с эпоксигруппами

методом затравочной полимеризации........................... 86

4.3.1. Затравочная полимеризация стирола на частицах полиглицидилметакрилатных суспензий..................... 88

4.3.2. Затравочная полимеризация глицидилметакрилата на частицах полистирольных суспензий.......................... 98

4.4. Модификация эпоксидных групп на поверхности частиц полимерных суспензий............................................. 105

4.5. Использование полимерных микросфер с эпоксидными и альдегидными группами на поверхности для

имму но диагностических исследований........................ 111

5. Выводы..................................................................... 119

6. Литература................................................................. 121

Приложения.

I. ВВЕДЕНИЕ.

В последнее время большой интерес представляет синтез полимерных суспензий, которые могли бы успешно применяться в иммунодиагностических исследованиях. Интерес к таким суспензиям обусловлен как расширением комплекса проблем, решаемых с использованием таких систем, так и появлением новых типов полимерных микросфер и методов их синтеза. Применение модифицированных полимерных суспензий, несущих на поверхности частиц активные функциональные группы, позволяет иммобилизировать молекулы биолиганда на частицы полимерной суспензии путем ковалентного их связывания с носителем и способствует созданию нового поколения диагностикумов на основе полимерных носителей.

В связи с этим весьма перспективным представляется использование функциональных полимерных суспензий на основе глицидилметакрилата. Микросферы этих суспензий содержат на своей поверхности эпоксидные группы, которые имеют высокую реакционную способность и могут как непосредственно ковалентно связывать молекулы биолигандов, так и легко быть модифицированы в другие функциональные группы. Частицы таких суспензий обладают высокой плотностью, что делает возможным применение этих микросфер для проведения иммунохимических анализов в планшетах.

Актуальность данной работы определяется отсутствием в настоящее время доступных и простых методов синтеза функциональных полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам, которые могли бы быть использованы в медицине, биологии и биотехнологии

Научная новизна заключается в следующем:

1. Предложен принципиально новый подход к синтезу полимерных микросфер с узким распределением частиц по размерам методом дисперсионной полимеризации. На примере полимеризации глицидилметакрилата (ГМА) показано, что при создании условий протекания полимеризации мономера на активных центрах полимерной цепи матрицы (ПВП-МАК) при определенной длине молекул ПГМА, за счет гидрофобных взаимодействий между его макромолекулами, происходит образование полимерных глобул. Эти глобулы самостабилизированы в результате образования привитого сополимера ПВП-ПМАК-ПГМА якорного типа - самого эффективного для стерической стабилизации частиц при осадительной полимеризации мономеров.

2. Впервые методами дисперсионной и затравочной полимеризации синтезированы полиглицидилметакрилатные суспензии с узким распределением частиц по размерам и диаметрами в интервале 1-3 мкм

3. Предложены пути регулирования концентрации эпоксидных групп в интервале 5-100 мкмоль/г полимера на поверхности частиц полимерных суспензий

4. Определены условия модификации эпоксидных групп на поверхности частиц полиглицидилметакрилатных суспензий до гидроксильных и альдегидных групп без изменения устойчивости суспензии при сохранении узкого распределения частиц по размерам.

Целью данной диссертационной работы являлось разработка методов синтеза и модификации полиглицидилметакрилатных суспензий для получения полимерных микросфер с эпоксидными, гидроксильными, альдегидными, карбоксильными группами на поверхности, в широком интервале диаметров с узким распределением частиц по

размерам и с регулируемой концентрацией функциональных групп на поверхности частиц.

II. Литературный обзор.

2.1 Применение монодисперсных микросфер для иммунодиагностических исследований.

Монодисперсные полимерные микросферы представляют собой частицы полимера сферической формы и одинакового размера, диспергированные в воде [1]. Значения коэффициента вариации частиц по размерам (меры отклонения диаметров частиц от среднего значения) колеблются в пределах 1% - 3% для частиц с диаметром в интервале 0.1-10 мкм [2-4] и до 10% - 30% для частиц с диаметром в интервалах менее 0.06 и более 10 мкм [2,5].

Монодисперсные полимерные микросферы находят широкое применение в различных областях науки и техники, например, как калибровочные эталоны в электронной и оптической микроскопии, при счете аэрозольных частиц, светорассеивании, при малоугловой рефракции рентгеновских лучей, для счета вирусных частиц, определения размеров пор фильтров, для стимулирования клеточного продуцирования антител и их очистки [6-9], а также в качестве модельных коллоидных систем для изучения их реологии [10-11], стабильности и седиментации [11] и т.д.

Также монодисперсные полимерные суспензии находят свое применение в медицине для иммунодиагностических исследований [2]. В основе такого рода анализов лежит иммунохимическая реакция между антигенами (веществом, специфическим для каждого вида чужеродных организмов) и антителами, белками, относящимися к классу иммуноглобулинов, образующимися в ответ на появление антигенов) с образованием комплекса "антиген - антитело" [12]. Реакция образования такого комплекса является высоко иммуноспецифической, так как на появление в организме определенного

антигена, иммунная система вырабатывает антитела строго определенного строения, которые могут взаимодействовать только с данным антигеном. При этом вследствие того, что и антиген и антитело могут взаимодействовать одновременно с несколькими молекулами друг друга, образуются пространственные сетки, узлами, которой служат молекулы антигена.

Образование такого рода сеток - агломератов, а, следовательно, и обнаружение того или иного вида антигенов может быть зарегистрировано различными методами: спектрофотометрии, турбидиметрии, нефелометрии, и.т.д. Все вышеизложенные методы требуют применения специального дорогостоящего оборудования, что затрудняет их применение для широкой повседневной лабораторной практики диагностики заболеваний. В тоже время, связывание антигенов (антител) с нерастворимым носителем, который выполняет исключительно индикаторную функцию, позволяет обнаружить появление комплексов даже невооруженным глазом как скопления агломератов частиц носителя, что позволяет просто и быстро проводить полуколичественный и качественный анализ физиологических жидкостей на предмет наличия в них определенных антител (антигенов).

Первое сообщение об успешном применении монодисперсных полимерных микросфер на основе поливинилтолуола и полистирола в качестве нерастворимого носителя для диагностики ревматоидного артрита появилось в 1956 году [13]. Сообщалось, что взаимодействие антигенов сыворотки крови пациента с гамма-глобулином, адсорбированным на поверхности микросфер, привело к агглютинации полимерных частиц с образованием крупных агломератов, легко различимых невооруженным глазом. Далее появился ряд работ по использованию полистирольных и полиметилметакрилатных суспензий для диагностики различных заболеваний [14-24].

Дальнейшее использование полимерных суспензий для иммунодиагностики было ограничено малой воспроизодимостью результатов что, было обусловлено, по мнению ряда авторов [24], тем, что белок, физически адсорбированный на поверхности частиц, десорбировался в водную фазу даже при небольшом изменении условий: рН, ионной силы раствора, температуры и.т.д., что существенно снижало чувствительность и приводило к неспецифическим реакциям с другими биологическими объектами.

Свободными от вышеперечисленных недостатков оказались полимерные суспензии, содержащие гидрофильные частицы с функциональными группами на поверхности, способные к ковалентному связыванию биолигандов [24-29]. Такие полимерные суспензии были синтезированы на основе 2-гидроксиэтилакрилата, акриловой и метакриловой кислот, акриламида, винилпиридина и.т.д. Такого рода полимерные суспензии имели следующие преимущества по сравнению с гидрофильными суспензиями:

1. Отсутствие неспецифической адсорбции биолигандов из-за гидрофильности

поверхности частиц.

2. Отсутствие десорбции белковых молекул с поверхности частиц вследствие ковалентной связи между биолигандом и функциональными группами на поверхности частицы.

3. Возможность ковалентного связывания биолигандов плохо сорбирующихся на поверхность гидрофобных частиц.

4. Открывается возможность создания условий для оптимальной ориентации биомолекул на поверхности микросфер для обеспечения максимальной чувствительности синтезируемых диагностикумов.

2.2. Способы получения полимерных монодисперсных суспензий.

Полимерные суспензии, используемые в иммунодиагностике, классифицируют по типу химических групп, находящихся на поверхности частиц. По этому признаку их можно разделить на два типа. К первому типу относятся суспензии, частицы которых содержат на поверхности группы, способные непосредственно реагировать с амино, карбоксильными или сульфгидрильными группами биомолекул. Ко второму типу относятся суспензии с функциональными группами, которые неспособны к прямому взаимодействию с белками, однако могут образовывать с ними химическую связь после относительно простой реакции активации.

К числу функциональных полимерных суспензий первого типа можно отнести суспензии, частицы которых на поверхности содержат хлорметильные [30-33], хлорсульфоновые [30], альдегидные [34-37], эпоксидные [38,39] и сульфгидрильные [39,40] группы. Такие группы реагируют с биомолекулами в водной среде при умеренной температуре.

Ко второй группе относятся полимерные суспензии, микросферы которых на поверхности содержат карбоксильные [2,26,27,41-44], гидроксильные [24,45], аминные [24,27], амидные [27,46-49], гликолевые [50] и другие группы.

В настоящее время создано большое количество полимерных суспензий с различными химическими группами на поверхности. Выбор метода синтеза определяется как требованиями к самим полимерным суспензиям (диаметр частиц, узкое распределение частиц по размерам (РЧР), стабильность в физиологических растворах, наличие функциональных групп на поверхности частиц), так и областью их применения (концентрация и тип функциональных групп, их распределение по объему частиц, наличие окраски и т.п.). Методы синтеза функциональных полимерных суспензий могут

быть поделены на два вида [48]: одностадийные методы, в которых полимерные суспензии с реакционоспособными группами 1-ого типа (см. выше) получают непосредственно в процессе синтеза микросфер; 2) двух и более стадийные методы, которые предполагают на первой стадии синтез полимерных микросфер заданного диаметра с узким распределением частиц по размерам и определенными химическими группами на поверхности частиц (1 или 2-ого типа), а на второй стадии - проведение реакции полимераналогичных превращений, позволяющих получить химические группы, способные непосредственно реагировать с молекулами биолигандов.

Получение полимерных микросфер с теми или иными группами на поверхности, как уже отмечалось, является обязательной стадией как в одностадийном, так и в многостадийном способе синтеза полимерных суспензий с той лишь разницей, что в первом случае в результате полимеризации получаются микросферы с группами, не нуждающимися в дальнейшей активации. Для получения полимерных микросфер могут быть использованы различные способы проведения гетерофазной полимеризации (эмульсионный, суспензионный, дисперсионный и т.д.), выбор которого определяется требованиями по размерам и узости РЧР синтезируемых частиц.

2.2.1. Получение полимерных суспензий методом дисперсионной полимеризации.

Дисперсионная полимеризация - это один из способов осуществления гетерофазной полимеризации, который позволяет получать полимерные частицы с размером от 1 до 15 мкм с большой скоростью и высокой конверсией. В дисперсионной полимеризации непрерывная фаза выбирается таким образом, чтобы она могла растворять мономер, а образующийся в процессе полимеризации полимер был в ней нерастворим.

Для создания стабильной коллоидной дисперсии обычно используют стабилизаторы, обеспечивающий стерический фактор стабильности. В отсутствии стабилизатора процесс протекает в макрочастицах полимера с неконтролируемым размером частиц, такой процесс известен как осадительная полимеризация.

Под это общее определение подходят разнообразные механизмы полимеризации, так формально возможна дисперсионная полимеризация с катионным или анионным инициированием, ступенчатая дисперсионная полимеризация. В обзоре [103] рассмотрена поликонденсация, осуществляемая дисперсионным методом. Однако эти типы дисперсионной полимеризации менее исследованы и выходят за рамки этого обзора, который главным образом посвящен системам с использованием инициаторов радикального типа.

На первый взгляд может казаться, что связь между эмульсионной и дисперсионной полимеризациями является незначительной, но исторически дисперсионная полимеризация разрабатывалась как логическое продолжение эмульсионной полимеризации [52], и связь между этими двумя методами выдвигается на первый план в этом обзоре, который охватывает литературу с 1976 до настоящего времени. С тех пор как в 1975 году появилась книга Барретта [54] взгляды на дисперсионную полимеризацию регулярно пересматривались [52-53]. Эта книга включала в себя литературу до середины 70-х годов (ранние работы фирмы ICN) и исчерпывающий перечень патентов, показывая четкие перспективы промышленного применения этой технологии. Активное участие в области научных исследований и промышленного освоения этого метода, кроме фирмы ICN , принимают компания Xerox и университет Lehigh (США).

2.2.1.1. Компоненты дисперсионной полимеризации.

Неотъемлемыми компонентами дисперсионной полимеризации являются мономер, растворитель/нерастворитель, инициатор и стерический стабилизатор. В ряде работ показано использование низкомолекулярных эмульгаторов

Как уже указывалось выше, основным требованием к мономеру является его растворимость в дисперсионной среде и, напротив, н