Синтез полистирольных суспензий для иммунохимических реакций тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

п ь \ \ С' '-/ ' '

V

НАУЧНО-ИСагДОВАТЕЛЬСгаЙ «ИЗИНО-ХИИИЧЕШЙ ИНСТИТУТ ИМ. Л.Я. КАРПОВА

Специализированный Совет Д-138.02.02

Для служебного пользования экз.

КРАШЕНИННИКОВА ИРИНА ГЕННАДЬЕВНА

•уда 678.061.06:615.4

СИНТЕЗ ПОДИСТИРОЛЬНЫХ СУСПЕНЗИЙ .для ИММУНОХШИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ.

Специальность 02.00.06 - Химия высокомолекулярных

соединений.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1991.

Работа выполнена в НИВХИ им. Л.Я.Карпова и в Московском ордена Трудового Красного Знамени институте тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор И.А. Грицкова доктор медицинских наук С.А.. Гусев

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор А.Б. Зезин

кандидат химических наук Е.В. Нусс

Ведуцая организация: Научно-исследовательский институт резиновых и латексных изделий.

30

Защита состоится "10"ФОН& 1991 года в Ю часов на заседании Специализированного Совета Д-138.02.02 при Научно-исследовательском физико-химическом институте имени Л.Я. Карпова по адресу: 103064-, г. Москва, ул. Обуха Д. Ю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИФХИ им. Л.Я. Карпова.

Автореферат разослан У О" гифе, 1,0 1991 года

"30*

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат химических наук Селихова В.И.

ОЩАЯ ХА.РАКТЛРЖТИКА. РАБОТЫ

Актуальность Работы определена необходимостью создания простых надежных методов экспресс-диагностики различных заболеваний внут-гаих органов на основе реакции латекс-агглютинации.

Цель работы состояла в находцении•оптимальных условий синтеза яистирольных суспензий для иммунохимических реакций.

Научная новизна работы:

- предложен новый тип поверхностно-активного вещества.ДГК для пользования его в качестве стабилизатора яри суспензионной полиме-зации стирола, найдены условия синтеза полистлрольных суспензий зного диаметра с узким распределением частиц по размерам;

- показано, что при проведении суспензионной полимеризации стиро-с использованием ди-п-толил-о-карбалкокеяфеншшарбинола в ка-

зтве стабилизатора отсутствует коагуляция частиц на стадии форми-вания полшэрно-моношрных частиц (1Ю);

- изучена адсорбция различных белков на поверхность лолисти-яьных частиц, стабализарованннх ОТК, с цель» нахождения оптималь-к условий иммобилизации, а именно: концентрации белка, времени и шературы иммобилизации;

- найдены условия получения диагностику!® с высокой чувствитель-зтьго и специфичностью.

Практическая ценность работы. Разработан и внедрен в НИИ ФШ аздрава РСФСР рецепт синтеза полистиролъныг суспензий с узким определением часгид ао размерам и на основе шлисгдрошшх еус-азий предложен способ экспресс-диагностики■экзогенного аллерги-зкого альвеолита.

Автор зашивает

- новое ПАВ для использования в качестве стабилизатора и гатора, ДГК, его коллоидно-химические свойства и дисперсный et эмульсий стирола, стабилизированных ДГК;

- кинетические закономерности суспензионной полимеризации рола в присутствии ДГК;

- способы получения полистирольных суспензий с узким расп; лением частиц по размерам, диаметр которых находится в интерна 0,45-1,2 мкм;

- применение полистирольных суспензий для приготовления дк стикуиов на экзогенный аллергический альвеолиг.

Апробация работы.

Основные результаты работы были доложены и обсуздены на Bei юзной конференции "Радикальная полимеризация", Горький, 1989 г на 1У Всесоюзной конференции молодых ученых по физической уими "Физхишя-30", Иосква, 1990.

Публикации. По теш диссертации получено 2 авторских еввде сгва АС СССР H5I2976 "Способ получения монодисшреных полном] нис лагексов для иммунологических исследований", Б.И. № 37, 19! АС СССР № 4193208 "Способ■иммунологической экспресс-диагностик: эгзогеннохо аллергического альвеолита птицеводов", 1987г. Опуб; ваны 3 печатные работы. На способ получения полистирольных сус: зий разработаны и утвервдены в 1ШХП СССР технические условия ж синтез долистирольной суспензии.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ¿2 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, литературный обзор, исходные вещества, методы исслед< ния, результаты и их обсуздениа, выводы, включает таблиц, рисунков. Библиография содержит 4S¥ наименований.

Исходные вещества. Стирол марки "ч" очищали от сгабилизан со известной методике. ДГК, хлороформ, ацетон, толуол и другие реагенты марки "хч" и "ч" использовали баз дополнительной очпеу 2

пероионная среда - вода дистиллят.

Методе исследование» Кинетику полимеризация исследовали ди-.'оттрачасиим штодом. Полимеризацию проводила в бескислородных ювют при температуре 70±0,5°С. Характеристическую вязкость ;творов полистирола определяли штодом вискозиметрии. Ыолекуляр-з тссы рассчитывала ло уравввяяо: Сц] =1,34.10-4 Ы^'.^ для растров полистирола в толуоле, при температура 25°С. Определенна зйазного натяжения проводили методом сталахмометрии. Устойчивость г/льсии определяли по времени её полного разрушения в ноле центро-лшых сил. Дисюрсний состав с г и рольных эмульсий и суспензий оце-[вали на автоттичесном анализатора частиц "Сочыей - 4ЬШ". 1.3меры частиц определяли методом сканирующей электронной микроско-ш на приборе "з-570 С ниосМ, Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЕСУЗДЕНШ

Из литературных данных известно, что синтез полимерных суспений с размерами частиц в интервале от 0,2 мкм и выше, пригодных дя иммунологических исследований, осуществляют методом суспензивной полимеризации гидрофобных; мономеров. В этом случае полимерно-юномерные частицы (1Ш) образуются из капель мономера, стабилизи-)ованяых ПВО, нзлатииой или другими стабилизаторами, при попадании з них радикала из водаой фазм идя при образовании их в объеме нагель.

характеризуются низкой стабильностью до относитэльно высоких конверсий мономера ( ЗЩ>), что приводит к их коалесценции и, в результате этого, к образованию частиц с широким распределением до размерам и часто неправильной формы. Было высказано предположение о том, что избегать эти нежелательные процессы и сузить распределение частиц по диаметрам можно при использовании в качестве стабилизаторов ПАВ, способных образовывать прочный маж^аэный адсор->~

ционвнй слой на поверхности частиц, который обеспечит их стабил ность при низких конверсия* мономера к, тем самым, позволит иск. чить стадии коалесценции частиц. В этом случае появится возможш управлять стадией формирования 1Ш и их размерами за счет измен* ния скорости перемешивания системы и меяфазного натяжения, onpej ляющих дисперсность, эмульсии.

В качестве таких стабилизаторов целесообразно использовать практически нерастворимые в воде, чтобы исключить возможность фс мировать ШЧ из клубков молекул стабилизатора или ассоциатов мол кул ПАВ, которая наблюдается при использовании для этой цели пол мерных стабилизаторов, растворимых в воде, а также, имеющих е се структуре заместители, способные при ориентации образовывать в и фазном адсорбционном слов (MAG) прочные структуры.

В данной работе в качестве такого стабилизатора предложен Д п-толил-о-карбалкожсифеншшарбинол, который в дальнейшем для удо ства будем называть ДТК. Для того, чтобы разработать условия смг за полимерных суспензий с узким распределением частиц по размера! правде всего необходимо было установить взаимосвязь между поверх ностно-активными свойствами стабилизатора, дисперсностью эмульси: мономера, размерами полимерных ыикросфер, их устойчивостью в про) синтеза и свойствами полимерных дисперсий в иммунохймических рэш ях.

Так как ДГК представляет собой новый тип стабилизатора, то вначале были изучена его свойства.

Ди-п-/голил-о-карбалкоксифенилкарбинол общей формулы CggH^gOc представляет собой продукт идкофазного окисления 3,3-ди-(п-толш фталвда и н.тетрадекана кислородом воздуха. Согласно данным гель-хроматографического. исследования ДГК представляет собой смесь веществ, средшвесовая молекулярная масса которых равна 288. Стабил затор практически нерастворим в воде и хорошо растворим в стироле коэффициент распределения, характеризующий отношение растворшост 4

с:

,' в воде к растворимости в стироле составляет 2,5.10 . Стабили-:ор обладав? поверхностно-активными свойствами я снижает межфазное 'яяение, d ^ g на границе стиральный раствор ДТК - вода до - 15 'м (11ВС снитает моафазное натяжение <0 ^ g до 20 мН/м) (рис.1).

;симальная адсорбция ДТК Г,^ составляет 4,84.10"® моль/м2, пло-

©

№ поверхности, занимаемая молекулой стабилизатора, равна 34,3 А, юверхностная активность G =2,63 мИ.г^/моль.

Дисперсный состав стирольных эмульсий, полученных при перемеши-пм стирольного раствора ДТК и воды в течение 5 минут при скорос-вращения ыеоалки, равной 500 об/мин,- приведен на рисунке 2, 3. ?я исходная стирольная эмульсия грубодисперсна, средний размер гель стирола меньше наблюдаемого в эмульсиях:, получаемых в анало-шых условиях, но при использовании в качестве стабилизатора ПВС DO мкм) и равен 17 мкм. Перемешивание эмульсии стирола, стабили-ванной ДТК, в течение 30 минут приводит к дальнейшему дроблению таль стирола, средний диаметр которых становится равным 10 мкм ас. 2). Дисперсность эмульсии стирола резко возрастает после ини-ирования процесса в ней и начала полимеризации: средний диаметр цель стирола при конверсии мономера 3-6% составляет менее I мкм ис. 3).

Так как ДТК практически нерастворим в воде, то микроэмульги-

вания на границе раздела стирольный раствор ДГК-вода не наблюда-

зя. Получить микроэмульсио в статических условиях удалось только

и введении ДТК в фазу, в которой он не растворим, то есть в воде.

этом случае образование тонкого, визуально определяемого слоя

кроэмульсии на границе дисперсия ДТК в воде - стирол обнаружено

лько на четвертые сутки контакта двух фаз. Отсутствие микроэмуль-

рования было подтверждено и результатами опытов по оценке устойчи-зти эмульсии стирола, стабилизованных Д1К, в поле центробежных

л яри d= 875^ . Зги исследования показали, что эмульсии стирола,

абилизованные ДТК, в поле центробежных сил крайне неустойчивы и

зруыаются практически в первые минуты.

м

40

30 ■ 20

10

мН

О

30

20 10

II

10

15

20 " 10

О

70 60 50

40 М 10

с 10° моль/л

20 <ймкм

20 % мкм

10 15 20 <2),мкм

Рис.1. Изотерма меж|аэного тякешя на границе стироль раствор ДГК/вода.

Рис.2. Зависимость циеперс состава эмульсий стироля о времени перемешивания ("¿):

1 - исходная эмульсия;

2 = ЗОминут.

Рло.З. Зависимость диспер

состава эмульсий стирола

глубины полимеризации в п

ствии ДТК: I - исходная з ( см. рис.2

2 - р=2,0?,; 3 - р*5,<Й.

10 15

20 О,мкм.

м

2

5

■ Особый интерес представляют данные по прочности (/£) меяфаз-сс адсорбционных слоев, сформированных на поверхности раздела ютвор полистирола молекулярной масон 500 в стирола / вода. Ока-шэсь, что на этой границе Р^ составляет 20 мН/м, что значитель-5 выше наблюдаемого значения Р4 для ионогеиного эмульгатора.

Гадим образом, ди-п-толил-о-карбалкоксафеналкарбинол со по-зрхностно-активным свойствам шло отличается от традиционно ис-ользуемих стабилизаторов эмульсии, таких как, например, желатин, знако, эмульсии стирола, полученные в его присутствии, характери-уются более высокой дисперсностью капель мономера, что, по-види-ому, обусловлено отсутствием их коалесценции из-за большой проч-ооти мехфазных адсорбционных слоев ДГК вследствие существенного клада в нее структурно-механического фактора стабилизации.

Можно думать, что при формировании полимерно-мономерных час-нц (1Ш) аз капель мономера, стабилизованных ЯГК, их устойчивость а начальной стадии процесса будет существенно выша наблюдаемой ( присутствии типичных стабилизаторов, стация коалесценции Ш? не ¡удет наблюдаться и их размер будет определяться дроблением мо-:омера на стадии инициирования полимеризации, практически не изменяясь в ходе процесса.

Эти предположения были подтверждены результатами исследования :ависимосги размера частиц полимерной суспензии, стабилизованной СГК, от степени превращения мономера. Начиная с конверсия мономе-1а средний размер частиц полимерной суспензии, практически ¡охраняется постоянным и равным 0,45 мкм. Частицы на всех стадиях юлимеризации характеризуются узким распределением по размерам, [ри конверсии мономера менее размер частиц определить не удаюсь из-за присутствия большого количества мономера.

Влияние концентрации персульфата калия на скорость процесса, яолекулярные массы полимеров, размер частиц и их устойчивость к различным воздействиям изучали при постоянной концентрации ДТК,

равной 1,7.10"^ моль/л мономера (10 масс, в расчете на стирол) г объемном соотношении стирол:вода, равном 1:9 и температуре 70°С. Концентрацию инициатора изменяли в широком интервале значений: от 3,35.Ю"3 до 13,4.10"® моль/л мономера (0,1 до 4,0$ масс, в расчете на стирол).

На рис. 4 представлены кривые конверсия-время. Видно, что полимеризация стирола протекает с небольшим индукционным периоде и постоянной скоростью до высоких конверсий. Зависимость скорост полимеризации стирола от концентрации инициатора в степени 0,5 наблюдается в широком интервале значений концентраций персульфат калия. Молекулярные массы полистирола изменяются обратно пропорх онально концентрации К2$20д в степени 0,5 (рис.5). Средний разме полимерных макросфер практически не зависит от концентрации перс фата калия до его содержания, равного 3% масс, в расчете на стщ (10,05.10-2 моль/л). Полимерные суспензий характеризуются узким распределением частиц по размерам, содержание частиц с размерам! 0,4-0,5 мкм составляет.90$ частиц, а с размерами менее 0,5 мкм составляет Увеличение концентрации персульфата калия более £ масс, в расчете на стирол приводит к появлению значительного чис ла частиц о диаметром 0,2-0,3 мкм (до 25%), по-видимому, вследс^ вне 'Протекания эмульсионной полимеризации.

Известно, что полимерные суспензии, получаемые при инициирс нии полимеризации персульфатом калия, характеризуются большей м бильностыэ в процессе синтеза и при хранений, чем суспензии, по; чанные в аналогичных условиях, но при использовании в качестве инициатора, наяример, лероксида бензоила или динитрила азоизомас ляной кислоты. Повышение устойчивости суспензии объясняется допо, нательной стабилизацией частиц за счет ориентации на их поверхно' ти раздела фаз концевых сульфогруш. Представлялось интересным оценить вклад концевых сульфогрупп макромолекул, ориентирующихся на поверхности частиц, в стабильность полимерной суспензии, полу 8

¡иной в присутствий ДГК. В таблице I приведены значения потенциа-часуиц полимерных суспензий, полученных при разных концвнтраци-с инициатора.

Таблица Г.

гачения у-потенциала частиц полимерных суспензий, полученных ?и различных концентрациях Кд$2°8* (Соотношение фаз мономер:вода= :9 {ЙГК^ =1,7.10"® моль/л мономера).

Концентрация KgS^Og У-потенциал

о моль/л мономера 10е

13,4 -87,80

6,70 -84,62

3,35 -78,01

1,675 -68,74

1,005 -43,54

0,335 -43,83

пдо, что с увеличением концентрации инициатора ^,-готенциал час-5 заметно возрастает от -43,7 мВ до -78,8.Ш. В аналогичных ус-виях, но при использовании в качестве инициатора динитрилаазо-омасляной кислоты, были синтезированы полистирольнне микросферы узквы распределением яо размерам, средний диаметр которых состав-1 0,4 мкм, } -потенциал 'частиц равен -43,47 мВ.

Необходимо отметить, что все полученные полимерные суспензии, ¡ависимо от типа и концентрации инициатора в реакционной системе, вдали высокой стабильностью ло отношению к растворам ЫаС1 и нз-юнвю температуры в широком интервале (от 20°С до -273°С).

Таким образом можно считать установленным тог факт, что яроч-!ть межфазных адсорбционных слоев, обусловленная образованием >унгуры из молекул ДГК и полимера высокой молекулярной массы, ¡таточна для обеспечения стабильности частиц в физиологическом ¡творе и при хранении.

Рис.4. Зависимость выхода п< лимера от времени при разни? концентрациях K^SgOg,моль/л

о

стирола 10 :

I - 0,335; 2 - 1,005 ; 3-1 4 - 3,35; 5 - 6,7; б - 14,4, Соотношениеф£аз мономер:вод; =1:9. ГДТК]=1,7-1(Г2моль/л < рола , Т=70°С. -

0 100

К, ю-5 W<£

5 ■ 0.5: ■

4 " 0.4 ■

з • 0.3 "

2 ■ 0.2 ■

I 0.1 '

время,мин.

Рис.5. Зависимость сноросте! лимериэации и молекулярных полистирольньк суспензий от концентрации персульфата Kaj

К2 2°8'

^масс.в расчете на стирол

100 80

60

40

20

0 10

Рис.6. Зависимость выхода ш мера от времени при разных I центрацияс ДГК:моль/л сгиро; I -0Л25 ; 2 -О,¡50 ; 3 ~1,Ю 4 -¿,Ю ; 5 -3,10 ;

Соотношение фаз стирол:вода-'СГ!<]

время,мин.

Приведенные выше данные по влиянию концентрации т ско~

!ть полимеризации в размеры частиц полистирольной суспензии, поз-

шли выбрать концентрацию инициатора, при которой в процессе по-

.иризации получаются полимерные микросферы с наиболее узким расо

»делением по диаметрам - 1% масс, в расчете на стирол (3,35.10 а/я).

Влияние концентрации ДТК на скорость полимеризации стирола, яекулярные массы полимеров, размеры частиц полимерной суспензии, распределение по диаметрам, устойчивость полимерной суспензии и хранении и н действию электролитов было изучено при объемном отношнии мономер:вода, равном 1:9 и концентрации KgSgOg, равной 35.10~2иоль/л {1% масс. в расчете на стирол). Концентрацию ДТК меняли в широком интервале значений: от 4,25.1er3 до 5,28.1o-2 ль/л мономера (0,25$ до 4,С$ масс, в расчете на стирол). На рис. приведены кривые конверсия - время. Видно, что полимеризация прока ет с небольшим индукционным периодом с постоянной скоростью до гсоких конверсий мономера. Длина участка стационарной скорости на 1йвой конверсия-время возрастает при увеличении концентрации ДГК. .висимость скорости полимеризации от концентрации ДТК явно просле-¡вается в области его концентраций от 0,25 до 2,0$ масс, в расчете а стирол. Дальнейшее повышение концентрации ДГК (до 0,4/5 масс, расчете на стирол) на приводит к изменения скорости лолимериза-ии. Характер зависимости скорости полимеризации от концентрации габилизагера отличается от наблюдаемого при эмульсионной (ско-ость процесса линейно возрастает с увеличением концентрации эмуль-атора) я суспензионной (скорость процесса не зависит от концент-ацив стабилизатора) полимеризации стирола. Средние размеры поли-зрных микросфер практически m зависят от концентрации ДГК и оставляют 0,45 мкм. 85-90^ частиц имеют диаметр 0,45-0,50 мкм. астицы имеют сферическую форму и узкое распределение по разме-ам. Содержание частиц меньшего диаметра (0,2-0,3 mis) ничтожно ало (xIO%).

Полимерные суспензии, полученные при полимеризации стирол; при концентрациях ДТК, в интервале 0,5-4,масс, в расчете на стирол, были устойчивы в 0,1-0,3 М растворе NaCI, и при хране: в течение 6 месяцев.

Представлялось интересным выяснить возможность применения ДТК в качестве стабилизатора при суспензионной полимеризации с рола при более высоких концентрациях мономера и соответственно полимера в частицах. С этой целью были проведены опыты по поли» ризации стирола при объемном соотношении стирол:вода, равном I: 1:4 и 3:2 при прочих равных условиях." Кривые конверсия-время л£ ведены на рис. 7. Видно, что полимеризация протекает с неболыга индунционным периодом и постоянной скоростью до конверсии стирс 80%. Устойчивость реакционной системы при увеличении содержала стирола уменьшилась и уже при объемном соотношении стиролгвода, равном 1:6, образовался коагулюм при конверсии стирола 30?.

Увеличение концентрации ДТК до 2% масс, в расчете на моном и концентрации Kji^B ~ д0 ^ масс, в расчете на мономер позвол! ло повысить стабильность реакционной системы в процессе синтеза получить полимерные суспензии с узким распределением частиц по ! мерам и.диаметрам 0,5, 0,85 и 1,2 мкм соответственно при объем соотношении стирол/вода, равном 1:6, 1:4 и 1:2.

JCCK мояно применять и в качестве эмульгатора при эмульсиош полимеризации стирола. В этом случае для обеспечения формирован! полимерно-мономорных частиц из микрокапель мономера ЛТК надо вв( дить в ту фазу, в которой он менее растворим, то есть в воду. П< лимеризацю проводили при концентрации KgSgOg, равной 1% масс, з расчете на стирол, при объемном соотношении стирол:вода, равном 1:9, перемешивании реакционной системы оо скоростью 500 об/мин. и температуре 70°С. В этом случае полимеризация протекает без ш 12

укционного периода о достоянной скоростью до конверсии стирола

0%.

Реакционная система в процессе синтеза была устойчива, образо-ания коагулюма не наблюдалось. Распределение частиц по размерам имодально: основная фракция частиц имеет диаметр 0,15 мкм., вто-ж фракция - большие частицы - имеет средний диаметр 0,45 мкм, з ссть полимеризация стирола протекает по двум механизмам: эмуль-ионному и суспензионному, что и определяет бимодальный характер аспределения частиц полимерной суспензии по размерам.

Одним из методов получения частиц с узким распределением по азмерам является затравочная полимеризация. Этот метод был опро->ван для получения частиц с размерами более 0,6 мкм. В качестве ггравки использовали полистирольнуга суспензии, полученную в при-¡гтствии ДТК с диаметром частиц, равном 0,45 мкм. Получить частицы размером 0,9 мкм удалось при набухании их мономером, взятым в зличестве 100$ от исходного, и интенсивном перемешивании системы течение трех суток с последующей полимеризацией. Однако частиц узким распределением по размерам получить на удалось. Частицы :леют бимодальное распределение по размерам, что, по-видимому, вязано с образованием новых частиц при полимеризации. Так как азмеры микросфер отличаются друг от друга, их (ложно легко разделить а две фракции, имеющие разный размер частиц. Проведенные исследо-ания позволили разработать рецепт синтеза долистирольной суспон-ии, пригодной для приготовления диагностикумов, работающих по ринципу реакции латекс-агглютинации.

Наработку опытной партии долистирольной суспензии проводили а установке института Промышленной химии Республики Польша в дно- л двухлитровых реакторах. Способ синтеза полистирольннх успензий запатентован в Республике Польша, защищен авторским видетельством № 1512976, 1987 г. в СССР. Полученные полистироль-го суспензии соответствовали требованиям, предъявляемые к полимерии суспензиям для иклунохшических исследований.

Рис.7. Зависимость выхода полимера от времени. ДГК =1,7'Ю"2моль/л Г^гРа! =6,7« ю-2моль/л стирола.

Соотношение фаз: I - 1:2; 2 - 1:4; 3 - 1:6

700 »нин.

Рис.8. Зависимость титра реакции латекс-агглстинаг от концентрации альбумина при различных значениях р I - рН=6,1; 2 - рН=7,2; 3 - рН=8,3.

1_ г-

4096

204В

1024 512

4.0 6.0 В.О 10.0 Альб.

мг/мл

Рис.9. Зависимость титра реакции латекс-агглютина! от времени иммобилизации микросфер антигеном при различных температурных режимах.

150 180 время,мин.

При создании диагностикумов на основе частиц полистирольной суспензии особое внимание обращается на такие важные моменты, как:

1) количество частиц полимерной суспензии в единице объема, поскольку от этого параметра, по-видимому, зависит величина и время образования видимых невооруженным глазом агрегатов;

2) выбор оптимальных условий для взаимодействия мезду частицами и белками.

В качестве модельной системы для решения поставленных задач применительно к полученной суспензии была взята пара хорошо известных пммунохимичесхих реагентов: альбумин человека и кроличья коноспецпфическая антисыворогка к человеческому альбумину.

Принцип действия модельной системы заключается в том, что полимерные микросферк, на поверхности которых адсорбирован альбумин, агглютинируются антисывороткой к альбумину..Регистрация агглютинации осуществляется на стеклянной пластинке черного цвета. В этом случае альбкмия выступает в качестве антигена и, следовательно, данная система моделирует быстрый антигенный диагностикум, предназначенный для идентификации соответствующих антител в сыворотке крови. Б качестве среды для иммобилизации альбумина на поверхности мияросфэр полимерной суспензии и проведения реакции латекс-агглютинации были взяты буферы с различными значениями рН, которые изменялись в интервале от 5,0 до 8,1 (лимоннокислый - рН=5,0; фосфатный - рН=6,1 и фосфатный - рЯ=7,2; глициновый - рН=8,5). Моляр-ность выбранных буферов равнялась 0,05. Полученные данные свидетельствуют о том, что при рЕ—5,0 систеьа, состоящая из частиц полимерной суспензии, на поверхность которых адсорбируется белок, при концентрации, ьзятой в интервала от 1,0 до 1С, 0 мг/мл,' неустойчива и не может существовать.

Интересными представляются данные о том, что при рй, равном

6,1; 7,2; 8,3 (рис.8), кривые зависимости чувствительности диагнос тикума от концентрации альбумина имеют одинаковый вид. На этик кривых отчетливо виден максимум в области концентрации альбумина, равной приблизительно 3,0 мг/ш. Следует отметить, что отклонение от этого значения в сторону увеличения или уменьшения концентрации альбумина приводит к уменьшению титра реакции латекс-агглютинации. Максимальная чувствительность диагноетикума при концентрации альбумина, равной 3,0 мг/мл, возможно, объясняется тем, что именно при этой его концентрации обеспечиваются оптимальные условия для взаимодействия между АТ и альбумином, адсорбированном на поверхнос ти микросфер.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что максимальной чувствительностью обладает диагностикум, полученный при концентрации альбумина, равной 3,0 мг/ш в среде фосфатного буфера 0,05 полярности при рН, равном 7,2. С целью нахождения оптимального времени адсорбции альбумина на поверхности ыикросфер была изучена кинетика адсорбции. Адсорбция белка на поверхность микросфер проводили в течение 5,10,15,20,30,60,120 и 180 минут при комнатной температуре. Полученные данные показывают, что процесс взаимодействия альбумина с микросферами полимерной суспензии заканчиваются в первые 15 минут от начала их контакта.

Таким образом, в результате проведенных исследований был по-■ добран оптимальный режим иммобилизации альбумина на поверхность частиц полимерной суспензии, который заключается в следующем. Полученную суспензию трввдн отмывали фосфатным буфером, рН котороз равен 7,2, на фильтрационной ячейке типа Ат1соп о диаметром пор фильтра, равными 0,45 мкм. Потом полимерную суспензию разводили фосфатным буфером с рЕ, равным 7,2 до концентрации по сухому остат ку, равной 3,0$. Альбумин использовали в концентрации, равной 3,0 мг/ш. Далее сливали равные объемы латекса и альбумина, разведенного фосфатным буфером с рН=7,2 и в течение 15 минут тщательно пе-16

ремешивали этот раствор. Отмывку частиц полимерной суспензии от кесвязаввюгося белка тридцы проводили на концентрационной ячейке типа Атсоп 10-кратным объемом фосфатного буфера с рН=7,2. Концентрация частиц полимерной суспонзии в готовом диагностикуме составляла 1,5-2,СЙ по сухому веществу. Таким образом получили готовь® к применению диагностикум.

РПА. проводили смешиванием 20 мил антисыворотки в различных разведениях с 20 мкл диагностикума. Полученный диагностикум отличается еысоной споцжТ-ичностыо л чувствительностью.

Основываясь на ранее полученных результатах, была предпринята

попытка диагностировать с помощью реакции латекс-агглютинации такое заболевание как экзогенный аллергический альвеолит птицеводов. Экзогенный аллергический альвеолит - заболевание с диффузными поражениями легких, развитие которых чаще всего является результатом реакции легочной ткани на воздействие различных биологически активных пылей. Изучение этой легочной патологии было начато в 60-х годах. Характерной особенностью, определяющей клиничес-

кую значимость проблемы, важность выработки четких дифференциально-диагностических критериев, является битовая и профессиональная экологическая распространенность этиологических факторов этих заболеваний. Известно, что на ранних стадиях заболевания устранение или даже ограничение контакта с идентифицированным этиологическим фактором приводит к регрессированию легочных поражений, "самоизлечению" заболевания без применения медикаментозных средств. Целью настоящего исследования является увеличение чувствительности способа при сохранении высокой специфичности, упрощение процедуры его Еослроизведения, сокращение времени получения результатов, а, следовательно, и постановки днагноза.

Для создания диагностикума в качестве антигена была использована снесь белков куриной сыворотки (Н$). Подбор оптимальных условий иммобилизации антигена Н5 на частидо полимерной суспензии

осуществлялся аналогично выбору условий иммобилизации альбумина.

Правде всего было изучено влияние среды, в которой осуществляется иммобилизация белка на поверхность частиц полимерной сусиен зии, на чувствительность диагностинума, Подходящей средой для иммобилизации антигена HS л реакции о аятиснворотной (титр РЛА= 1:4096) является FBS о рН=7,2. Темп увеличения титра реакции латекс-агглютинации при росте концентрации HS постепенно замедляется и при разведении HS PBS в соотношении 1:2 прекращается, остава.

таким т и при использовании цельной сыворотки. Оптимальным является разведение Е$ 1:2, так как дальнейшее увеличение концентрат* белка не влияет на величину титра реакции латекс-агглютинации.

Как было установлено ранее, адсорбция альбумина на иоверхнос микросфер полимерной суспензии происходит в течение первых 15 мин; с момента смешивания реагентов, и дальнейшее увеличение времени контакта не приводит к возрастании чувствительности реакции латек агглютинации с Аз. В связи с этим была проведена иммобилизация ан тигена HS на поверхность частиц полимерной суспензии в течение 5, 10,15,20,30,60,120 и 180 минут в разных температурных условиях (Т=4°С и T=3G°G). .

Как следует из данных, приведэнных на рисунке 9, при 2 и 3 часовом контакте чувствительность диагкосгикума, полученного при Т=£Ю°С и при Т=4°С не отличаются друг от друга. Однако, процесс иммобилизации белка на поверхность частиц полимерной суспензии при 20°С проходит с более высокой скоростью, чем при 4°С, достигая максимального значения чувствительности через 15 минут. Поэте му процесс адсорбции целесообразно проводить при температуре 20°С Таким образом, проведенные исследования позволяют предложить оптимальную схему приготовления диагностического препарата: 3$ взвеси полимерной суспензии трехкратно промывали EBS рН=7,2 nyrei центрифугирования (7000 об/мин), частицы росусшинировали в PES рН=7,2. Затем к очищенной полимерной суспензии добавляли равный объем HS антигена, разведенного PES в объешом соотношении 1:2, 18

при постоянном перемешивании. Через Г5 минут полимерную суспензию, частица которой адсорбировали белок Н5 , отмывали четыре раза ЕВв рН=7,2 осадцанием при 7000 об/мин., ресуспевдировали до 3% взвеси, посла чего полученный диагностикум готов для использования в реакции латекс-агглютинации.

Учитывая данные литературы и результаты собственных исследований, приведенных выше, процедура определения наличия антител в исследуемых сыворотках должна проводиться следующим образом: к 20 мкл исследуемой сыворотки (на стекле, на черном фоне) в диагностическом тигре добавляли 20 мкл иммобилизованного 3% латекса, перемешивали стеклянной палочной и через 10 минут учитывали результат, считая его положительным при отчетливой агглютинации частиц полимерной суслензии. Каддое определение проводят с соответствующими контролями:

1) 3% взвесь частиц полимерной суспензии + исследуемая сыворотка;

2) диагностикум + РВБ рН=7,2;

3) диагностикум н- положительный гест-сыворотка (кроличья моноспецифическая антисыворотка к Н5 антигену).

Учет результатов реакции может проводиться при отрицательном I и 2 контролях и положительном контроле 3. Наличие агглютинации диагностикума в исследуемой сыворотке свидетельствует о присутствии в ней антител к Н5 антигену, что позволяет диагносцировать у данного пациента экзогенный аллергический альвеолит (например, таблица 2)

Таблипа 2.

Специфичность, чувствительность диагностикума в реакции с сывороткой пациента.

С+аДй сыво»«»ка ! больного Г....... !.................. ! С.+РВ5 ! Сн+ а/:*; , и , » 1 Сн сыворотка ! ' больного

_ 1:4096 1:4096

Из приведенных выше результатов видно, что дпагностикум характеризуется достаточной специфичностью (нет агглютинации в контролях I и 2) и высокой чувствительностью (агглютинация с Ав идет до титра 1:4093 с сывороткой больного до тигра 1:4096).

Оценка диагностической ценности созданного теста была проведена на базе центрального научно-исследовательского института туберкулеза Минздрава РСФСР. Б институте имеется банк сывороток больных экзогенным аллергическим альвеолитом с известным окончательным диагнозом, установленным на основании совокупности клинических данных иммунологического анализа, которые включает результаты РПГА. (реакции пассивной геммагглютинацли) и иммуноФерментного метода.

Кроме того, для анализа специально были отобраны две группы сывороток: сыворотки больных туберкулезом легких и сыворотки здоровых доноров. Результаты проведенного анализа представлены в таблицей.

Таблица 3.

Результаты реакции латекс-агглютинации созданного диагностику!® с сыворотками больных пациентов и сыворотками здоровых доноров.

Группы Г Гятр | Количество

снвоооток 1 РМ ! сывороток

Больные ЕМ1 I : 64 2

I : Г28 I

I : 512 I

I :1С24 6

I :2048 9

I :4096 3

Больные I : 2 7

туберкулезом I : 4 8

легких I : 8 2

Доноры отрщ. 4

Данные, приведенные в таблице, позволяют сделать следующие заключения:

1) у группы больных туберкулезом легких положительная реакция с диагностикумом наблюдается в титрах до 1:8;

2) у группы больных экзогенным аллергическим альвеолитом титры РЛА. составляют 1:64 - 1:4096.

Это означает, что при использовании сыворотки с разведением I:32 можно всегда разделить две группы больных экзогенным аллергическим альвеолитом и туберкулезом легких. Следовательно 1:32 является диагностическим тигром.

Определение диагностического титра в реакции латекс-агглктв-нации позволило провести сравнение эффективности созданного диаг-ностккума а нонтрэлектроиммунофореза, который в настоящее время используется в клинике. Данные о сравнительной характеристике РИА и КИФ представлены в таблице V.

Таблица 4.

Метод |положительный (Отрицательный

!результат 'результат

РЛА. . 42 4

ШФ 25 21

Всего исследовано 43 сывороток больных. Анализ данных показывает, что при проведении РЛА положительный результат был получен при исследовании 42 сывороток (91,3©, тогда как при КИФ - лишь в 25 сыворотках (54,45?).

Поскольку в течение 6 месяцев титр не изменился, диагности-хум может быть использовал в течение полугода со дня изготовления.

Таким образом, высокая чувствительность реакции латекс-агглютинации в сочетании с технической простотой проведения реакции, гстротой получения результатов, малым объемом крови, необходимым ш исследования, делают его чрезвычайно удобным при проведении

массовых обследований производственных коктингентов птицеводов. Применение созданного диагяостикума в реакции латекс-агглютинацю имеет таклв большое значение для динамического наблюдения за к 01* тингентом лишь с профессиональным риском заболевания экзогенного аллергического альвэолита.

■ вквода

1. Предложен новый тип стабилизатора эмульсий гидрофобные ы номеров, обеспечивавший высокую их устойчивость в процоссе суспе зионной долимаризациа за счет образования структуры в меле аз ком адсорбционном слое, и получение полимерной суспензии с узким рас пределением частиц ло размерам,

2. Установлены особенности суспензионной полимеризация сти! ла в присутствии да, а именно - отсутствие коалзоцонции частиц стадии их образования, увеличение скорости полимеризации при по: шении концентрации стабилизатора в интервале от 0,425.10"*^ до 6,80.10"^ моль/л стирола, обусловленное увеличением числа части постоянство размеров частиц и их распределение по размерам в хо процесса полимеризации.

3. Разработаны способы синтеза полистирольнкх суспензий с узким распределением частиц по размерам с диаметрами в интервал от 0,45+1,2 шш и различным содержанием сухого вещества в суспе

4. Показана возможность использования ДТК в качестве эмул; тора эмульсионной полимеризации стирола.

5. Выявлены особенности адсорбции различных белков на пов< ность полимерных микросфер, стабилизированных ЦК.

6. Еа основе синтезированных полистирольных суспензий, раз ботан способ получения латекс-агглютинациошой иммунологическо

тест-системы, пригодной для экспресс-диагностики экзогенного аллергического альвэолита птицеводов.

Основное содержание диссертации оцуешкозано в сдодуадвс ре

1. Грицкова Ii.А.,Зубов В.Д., Каданцева А.И., Капки а В.Д., Богаче-ва А.Я., Крашенинникова И.Г. Способ получения монодисперсных поли стиральных латексов дая иммунологических исследований. Азтор-C:COQ свидетельство i<i 151 ¿976, Б.И. ¡Ш, 1989.

2. Xowoixo А.Г., Лопухин Ю.У., йубов JJ.il., Грацкова И.А., Каданцова А.И, Гусоа O.A., Ильина И.Н., Крашенинникова 11.Г. Способ иммунологической зкскросс-диашостики экзогенного аллергического аяьвеолита памцозодов. Заявка Jj4I9320ö. I9Ö7.

3. Кадаицоза А.П., Кровешганикоиа И.Г;, iycoa С.А., Повалим Т.И. Роль природа стабилизатора при синтезе ыоно,дисперсных полистироль-ных суспензий.// ¡даторла/ш Всесоюзной конференции "'Радикальная поллнериоация": Tornau/ Горький.-I9Ö9.-с.218.

4. Gusev S.A.,, Povalii J.M., Doroohova В.Л., ?etrunin D.D., Krase-ninnikova I.G, Adsorbtion of proteins at polystyrene microspheres. // Polymery.-1990.-Nr.5.-P.157-159.

5. пеолидовашю структуры пашшорных шпфосфер, используемых в jiisiy-шшшш. Дорохова ¿i.A., Крашенинникова И.Г., Бахарев В.Н.-// "•йизхш.шя-90" 1У Всесоюзная конференция молодых ученых и специалистов но (¡извчоекоЗ хшши: Тезисы/ Москва.-1990.-с.39.