Синтез дисперсий с гликозидными группами на поверхности полистирольных микросфер тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

БАКЕЕВА ИРИНА ВИКТОРОВНА

СИНТЕЗ ПОЛИМЕРНЫХ ДИСПЕРСИЙ С ГЛИКОЗИДНЫМИ ГРУППАМИ НА ПОВЕРХНОСТИ ПОЛИСТИРОЛЬНЫХ МИКРОСФЕР

02.00.06. - Химия высокомолекулярных соединений. АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук,профессор Грицкова И. А.

Официальные оппоненты:

1. член-корреспондент РАН, прфессор Зезин А.Б.

2. доктор химических наук,прфессор Штильман М.И.

Ведущая организация: Научно-исследовательский физико-химический институт им.Л.Я.Карпова

Защита состоится " 25" декабря 1997 г на заседании диссертационноп Совета Д 063.41.05 в Московской Государственной академии тонко! химической технологии им. М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке академии по адресу: Москва, ул. М.Пироговская, 1.

Отзывы на автореферат направлять по адресу:

117571, Москва, пр. Вернадского 86, МГАТХТ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " 25 " ноября 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук,профессор ' ^л..., ^о Грицкова И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы определяется необходимостью синтеза полимерных дисперсий с определенным размером сферических частиц однород-1ых по диаметру, содержащих функциональные группы на поверхности частиц, которые способны ковалентно связывать белки, для создания на IX основе диагностических тест-систем с высокой специфичностью и чувствительностью.

Цель работы: получение полистирольных микросфер с гликозидными группами на поверхности частиц для иммунохимических исследований. Научная новизна :

- Впервые методом гетерофазной полимеризации в присутствии декстрана 1 глицирама синтезированы полистирольные дисперсии с узким распреде-1ением частиц по размерам и гликозидными группами на поверхности и {а их основе созданы диагностические тест-системы, работающие по 1ринципу реакции латексной агглютинации.

- Установлены факторы, влияющие на размер полимерных микросфер и их распределение по диаметрам; получен набор полистирольных дисперсий с лзким распределением частиц по размерам и диаметрами в интервале: ), 1 - 1.0 мкм.

-Показано.что декстран выполняет роль стабилизатора частиц дисперсии 1 биолиганда только при получении исходной эмульсии путем смешения ггирольной суспензии декстрана с водой и инициировании полимеризации жислительно-восстановительной системой декстран-персульфат калия.

- Установлено, что при полимеризации стирола в присутствии глицирама ювышение рН среды от 5,5 до 8.0 приводит к возрастанию среднего ди-шетра микросфер от 0.4 до 0,9 мкм.

- Показано, что при получении эмульсии мономера путем смешивания ;тирольной суспензии глицирама и декстрана с водой образование ПМЧ фоисходит из микрокапель мономера и их диаметр практически не зави-:ит от конверсии мономера.

- Впервые радикальной сополимеризацией стирола и метакрилированной \пюкозы получены дисперсии с узким распределением частиц по диамет-)ам. которые использованы для создания антительных тест-систем.

Практическая значимость: Разработаны способы синтеза полимерных шсперсий с гликозидными группами на поверхности частиц, пригодные ш использования в качестве носителей белков при создании меди-шнских диагностикумов. На способы получения дисперсий получены па-

тенты в Республике Польша. Созданные диагностические тест-систе?. опробованы в институте физико-химической медицины Российской Федерг ции.

Автор защищает:

- Условия синтеза полимерных микросфер с гликозидными группами ь поверхности частиц для иммунохимических исследований.

- Новые стабилизаторы частиц полистирольных дисперсий и лиганды д/ ковалентного связывания с белками - декстран и глицирам.

- Кинетические закономерности полимеризации стирола в присутстви декстрана и глицирама в качестве стабилизаторов частиц, а также ег сополимеризации с метакрилированной глюкозой.

- Влияние рН среды на устойчивость полистирольной дисперсии в про цессе её синтеза в присутствии декстрана и глицирама. диаметр части и их распределение по размерам.

- Диагностические тест-системы, полученные на основе полистирольны дисперсий с гликозидными группами на поверхности частиц.

Апробация работы. Основные результаты работы были изложены обсуждены на VIII Всесоюзной научно-технической конференции "Синте тические латексы и их применение и модифицирование" Воронеж,1991 на IX Всесоюзном научном симпозиуме "Синтетические полимеры меди цинского значения" Звенигород, 1991 год.

Публикации. По теме диссертации получено 2 авторских свиде тельства (Республика Польша) и опубликованы статьи в журналах "Высо комолекулярные соединения" и "Pollmery".

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на i%¿ страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: вве дение. литературный обзор, исходные вещества и методы исследования результаты и их обсуждение, выводы; включает \\ таблиц и S(. рисунков. Библиография содержит _148_наименований.

ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА

Стирол, технический продукт, очищали от стабилизатора по из вестной методике. Использовали фракцию, кипящую при 41°С (10 mi рт.ст.). d4zo=0,906 г/см3, nDz0=l,5450.

Декстран фирмы "Pharmacia"(Sweden) с Mw = 500000 (Т-500 использовали без дополнительной очистки. Метакрилированная глюкоза синтезирована в Воронежском университете, использовали без дополни

!льной очистки. Глицирам - получен в НПО "ВИЛАР", использовали без шолнительной очистки.

Ацетон, диэтиловый эфир, толуол, изопропиловый и этиловый спир-( - использовали марки (хч) и (ч). очищали по стандартным методи-im. Персульфат калия (хч) применяли без дополнительной очистки. |.трнй хлористый и гидроокись натрия (чда) использовали без дополни-¡льной очистки.

Иммуноглобулин G человека (IgG) и моноспецифическую сыворотку ютив IgG (As IgG) применяли без дополнительной очистки.

Дисперсионная среда: вода - бидистиллят.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Кинетику полимеризации изучали дилатометрическим методом. За-лнение дилатометров проводили в вакууме. Эмульсию создавали враще-ем магнитной мешалки в широкой части дилатометра. Полимеризацию оводили в бескислородных условиях при температурах 60°^0.5° С и 0 +0. 5° С.

Характеристическую вязкость растворов полимеров определяли з луоле при 25° С в вискозиметре Уббелоде. Средневязкостные молеку-рные массы расчитывали по формуле:

[пЬК-[М]\ где К=1, 7-10"4, а=0.69.

Устойчивость полимерных дисперсий к электролиту оценивали визу-ьной регистрацией образующихся агломератов частиц, полученных при вшивании равных объемов полимерной дисперсии и раствора хлорида трия определенной концентрации на темной стеклянной пластинке.

Средний размер частиц полистирольных дисперсий определяли метода электронной сканирующей микроскопии на приборе "Hitachi" S-570 1ютон-корреляционной спектроскопии на приборе "Malvern".

Отмывку частиц полистирольных дисперсий на всех стадиях приго-зления на их основе диагностических тест-систем проводили методом пьтрации на концентраторе фирмы "Amicon", используя фильтры фирмы /прог".

Ковалентную иммобилизацию белка на поверхность полистирольных зтиц проводили по стандартным методикам после реакции активации 1К0зидных групп способом периодатного окисления.

Чувствительность и специфичность тест-систем оценивали рекцией гексной агглютинации, которую наблюдали визуально на стеклянной

сн,

/I о

НС— о / / он \сн

НС\ | /

I НС— сн

ОН |

ОН

А. Декстран - 1, б-а-полиглкжозю с небольшим числом разветвлений (Дек).

С7Ни-п06

сн2=с-с I \ сн.

о //

Б. Высокозамещеннй метакрилзвый эфир метилглюкозида (МАГ).

где п=2-4

п

Рис. 1. Вещества, используемые в работе

ли полистирольной пластине черного цвета. Результаты реакции учиты-али через 10 минут.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проблема синтеза полимерных дисперсий является одной из акту-льных задач при создании носителей биологически-активных веществ ля иммунохимических исследований.

Их получают полимеризацией гидрофобных мономеров и их сополиме-изацией с функциональными сомономерами. Выбор условий проведения олимеризации и сополимеризации мономеров определяется необходи-остыо получения полимерных дисперсий с узким распределением частиц о размерам (РЧР). устойчивых в процессе синтеза, хранения, а также физиологических растворах.

1. ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ СТИРОЛА В ПРИСУТСТВИИ ДЕКСТРАНА.

Одним из перспективных методов получения полимерных дисперсий пя иммунохимических исследований оказалась гетерофазная полимериза-iя стирола в присутствии лиганда. одновременно выполняющего роль герического стабилизатора частиц, функциональные группы которого юсобны в мягких условиях ковалентно связываться с белком.

В качестве такого соединения в работе использовали гомополимер эиродного происхождения - декстран, мономерным звеном которого яв-штся а,Б-глюкоза (рис.1.А.). Известно, что антигенные свойства шсущи лишь декстрану с молекулярной массой в несколько десятков ,1сяч, поэтому для исследований был выбран декстран с средневесовой >лекулярной массой 500000 (Т-500).

Для того,чтобы лиганд находился на поверхности микросфер, жстран вводили в исходную систему в виде суспензии в стироле, юдполагая, что при полимеризации образование полимера высокой модулярной массы в поверхностном слое частиц, приведет к повышению [зкости в слое и заметно снизит диффузию декстрана в водную фазу, юме того, присутствие декстрана в межфазном слое будет способство-1ть повышению его прочности, т.е. увеличению стабильности ПМЧ за гет стерической стабилизации. Сочетание стерического фактора стаби-:зации частиц с электростатическим ( за счет ориентации на границе здела фаз ионногенных фрагментов молекул инициатора) обеспечит

концентрациях декстрана Т-500. Объемное соотношение фаз мономер:вода=1:10; Т«60°С, [К2320а]=0,5% мае. в расчете на стирол:

N кривой 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

[Дект _ 5 о о ^. Ямас. — 0.5 1.0 1.5 1.75 2.0 2,25 2.5 4.0 5.0 7,5

устойчивость частиц дисперсии. Участие декстрана в скислитель-ю-восстановительном инициировании полимеризации стирола ( К252О0 --декстран) дополнительно зафиксирует его наличие на поверхности.

Полимеризацию стирола проводили по рецепту, обычно используемому при синтезе полимерных дисперсий для иммунохимических исследований: объемное соотношение фаз мономер:вода - 1:10; температура=60°С; шнцентрация персульфата калия - 0.5% мае. в расчете на стирол. Концентрацию декстрана изменяли в широком интервале значений от 0. 5 до 7.5% мае. в расчете на мономер.

На рисунке 2 приведении кинетические кривые выхода полимера от зремени. Видно, что все они имеют одинаковую форму: на кривых кон-зерсия-время присутствует период, соответствующий стадии образования ШЧ (до конверсии стирола не выше 10%), далее полимеризация протекает с постоянной скоростью до конверсии 30-35%, после чего наблюдается ее резкое увеличение. Длина участка стационарной скорости на <ривых конверсия-время уменьшается при увеличении концентрации цекстрана из-за повышения вязкости среды в объеме ПМЧ. Особенно су-дественно это изменение при повышении концентрации декстрана в интервале значений от 2.5 до 1,Ъ% мае. в расчете на стирол.

Чтобы понять влияние декстрана на механизм формирования ПМЧ, в зыбранных условиях проведения полимеризации стирола, было изучено изменение диаметра частиц и их распределения по размерам в зависимости от конверсии мономера. По мере полимеризации мономера распределение частиц по размерам и их средний диаметр меняются незначительно (рис.3), а молекулярная масса полимера возрастает. Полученные результаты позволяют высказать следующую гипотезу об образовании ПМЧ з присутствии декстрана. Полимеризация начинается и в водной фазе, и на поверхности капель мономера. В водной Фазе эмульсии стирола образуются поверхностно-активные олигомерные радикалы и олигомеры с разной длиной цепи, которые адсорбируются на поверхности капель и переводят в мономерную фазу, если они в ней растворимы, одновременное лротекание химической реакции инициирования полимеризации, адсорбции товерхностно-активных олигомерных радикалов и олигомеров и их массо-теренос. приводящие к заметному снижению межфазного натяжения, является причиной турбулизации поверхности и интенсивного дробления ка-тель мономера. Известно,что дисперсность эмульсий стирола, полученных при низких конверсиях мономера в отсутствие ПАВ при инициировании персульфатом калия высока, однако она недостаточно устойчива.

к -103

1,1

о,

2,0 л й&я&а

у

¿л;,"

Л л; /'

и

ода

К

м ф,-

О ,-0,30, * '100

и-Ц

Рис. 3. Гистограммы распределения по размерам и микрофотографии частиц полистирольной дисперсии, полученной в присутствии декстрана Т-500. в зависимости от степени превращения мономера. Объемное соотношение фаз мономер: вода=1:10; Т=60°С; [КгБгОв]=0,5% мае. в расчете на стирол: [Дект.500]=2,5% мае. в расчете на стирол.

и

- n -

Таблица 1.

Влияние концентрации декстрана Т-500 на характеристики процесса полимеризации и свойства полистирольной дисперсии объемное соотношение стирол: вода = 1:10; Т=60° С; [К2В20а]=0.5% мае. в расчете на мономер.

[Т-500] кон- общее ско- коа- [N301]. не Среднее

вер- время рость гу- вызывающая значение dn

% мае. в сия син- полиме люм агрегации

расчете теза риз. дисперсии 10"5

на стирол % ч. %/ит % М мкм

70 20,0 0.04 4,5 0.05 7.7 0,54

0,50 70 20,0 0.06 8,0 коагул. 5.0 0. 70

1,00 87 17,0 0,065 3,5 коагул. 5,2 0,55

1,50 90 16,5 0,065 2,5 0.01 5.8 0.40

1,75 95 15. 0 0.07 2.0 0.30 5,5 0. 50

2. 00 92 13. 5 0, 07 2.5 0,30 5. 6 0. 40

2, 25 95 12. 5 0.07 1.5 0,30 5.7 0. 35

2. 50 95 12. 5 0,08 2,0 0,30 6. 0 0. 30

4. 00 90 10. 0 0. 12 1.0 0. 30 6, 5 0, 25

5,00 92 9.0 0. 12 <1.0 0.30 9.0 0. 24

7. 50 98 5. 0 1. 20 <1.0 0, 30 12, 0 0. 20

Таблица 2.

Влияние концентрации персульфата калия на характеристики процесса полимеризации и свойства полистирольной дисперсии, объемное соотношение стирол:вода = 1:10; Т=60°С; [Дек]=2.5% мае. в расчете стирол;

[К,320а] % мае. кон общее ско- коа- рН №С1]. не Среднее

вер время рость гу- ла- вызывающая значение dn

сия син- поли- люм тек- агрегации М„ -10"5

в расчете теза мериз % са дисперсии

на стирол % ч. %/мин М мкм

0, 1 32 20 0. 03 42,0 8.0 0,3 13, 0 0.60

0,25 93 15 0.09 7.5 4. 1 0,3 9.2 0.40

0.5 95 12.5 0,08 2.0 3.3 0.3 6.0 0,30

1.0 95 9 0. 18 2.5 3.4 0.3 4.2 0.30

2.0 95 8 0, 18 2.0 3. 1 0.3 3.0 0. 16

4.0 95 8 0,18 1.5 2.6 0.3 1.8 0.08

5.0 95 9 0. 18 <1.0 2,5 0.3 1.0 0.07

Данные по влиянию концентрации декстрана Т-500 на скорость полимеризации стирола, молекулярные массы полимеров, размеры частиц полимерной дисперсии, их устойчивость при хранении и к действию электролитов приведены в таблице 1. Характер зависимости молекулярных масс полистирола от концентрации декстрана подтверждает влияние гель-эффекта. Значения молекулярной массы возрастают от Му = 5-Ю5 до 1,2-10® при увеличении концентрации декстрана с 0,5% мае. до 7,5% мае. в расчете на стирол. Следует отметить также существенное влияние концентрации декстрана на средние размеры полимерных микросфер, которые уменьшаются от 0,7 до 0,2 мкм при увеличении концентрации декстрана с 0,5% мае. до 7,5% мае. в расчете на стирол.

Влияние концентрации персульфата калия на процесс полимеризации стирола и на свойства дисперсии полимера изучали в присутствии декстрана Т-500 при его постоянной концентрации, равной 2,5% мае. в расчете на стирол, при объемном соотношении стирол: вода, равном 1:10, и температуре 60°С. Концентрацию персульфата калия изменяли в широком интервале значений от 0,1 до 5,0% мае. в расчете на стирол.

Как видно из данных, приведенных в таблице 2, даже при очень низких концентрациях инициатора устойчивость дисперсии в процессе синтеза остается выше по сравнению с дисперсиями, получаемыми в аналогичных условиях, но в отсутствие декстрана; средний размер полимерных микросфер с увеличением концентрации персульфата калия значительно уменьшается от 0,6 до 0,07 мкм.

Чем сильнее проявляется вклад каждого из факторов стабилизации в устойчивость дисперсии и чем раньше происходит формирование межфазного адсорбционного слоя, тем выше устойчивость частиц и меньше вероятность их коалесценции при низких конверсиях мономера, а значит ниже диаметр частиц. Диаметр микросфер уменьшается с увеличением концентрации декстрана и персульфата калия, т. е. с повышением вклада стерического и электростатического факторов стабилизации в устойчивость частиц дисперсии. Безусловно то, что увеличение в исходной системе и концентрации декстрана, и персульфата калия усиливает дробление капель мономера.

Анализ содержания декстрана в водной фазе дисперсии показал, что во времени хранения более 4*месяцев он появляется в водной фазе, что приводило к снижению чувствительности и специфичности тестов и требовало дополнительной очистки системы. Были проведены исследования по изучению роли дисперсионной среды в процессе полимеризации.

Лля этого дистиллированную воду с рН=6 заменяли боратными буферами с рН- 8.0; 9.0; 10,0 и 11,0. Изменение гидрофильных свойств декстрана происходит из-за формирования молекулярных комплексов благодаря образованию поперечных связей между боратными анионами и моносахарид-ными фрагментами полисахарида. Это должно способствовать "высаливанию" декстрана из воды, понижению его растворимости в ней и увеличению содержания декстрана на поверхности частиц. А как следствие, можно было ожидать повышения стабильности полистирольной дисперсии.

Полученные полимерные дисперсии оказались агрегативно устойчивыми. как в процессе синтеза-количество коагулюма не превышало 3.0%. так и по отношению к действию растворов соли в диапазоне концентраций NaCl от 0,05 до 0,30 моль/л. Размеры частиц полистирольных дисперсий в боратном буфере, совпадали со средним диаметром микросфер, синтезированных в воде.

Полимеризацию стирола изучали также в присутствии смесей цетил-пиридинийхлорида (ЦПХ) и декстрана при различном составе компонентов. Высшие гомологи четвертичных алкил аммонийных солей эффективно взаимодействуют с анионными группировками полисахаридов, значительно уменьшая их гидрофильность. Было показано, что при мольном соотношении звеньев декстрана к ЦПХ равном 6: 1. получаются устойчивые как в процессе синтеза . так и по отношению к действию электролитов по-листирольные дисперсии с узким РЧР. Об этом свидетельствуют данные сканирующей электронной микроскопии и данные фотон-корреляционной спектроскопии полученные на на приборе " Malvern ".

На основании проведенных нами исследований разработаны оптимальные условия синтеза полистирольных дисперсий для иммунохими-ческих исследований с гликозидными группами на поверхности частиц. Наиболее агрегативно устойчивой и монодисперсной оказалась полимерная дисперсия, полученная при концентрациях персульфата калия 0.5% мае. и декстрана Т-500 2.5% мае. в расчете на стирол.

2. ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ СТИРОЛА В ПРИСУТСТВИИ МЕТАКРИЛИРОВАННОЙ ГЛЮКОЗЫ.

В настоящем разделе представлены результаты синтеза полимерных дисперсий путем сополимеризации стирола с полифункциональным углеводом - высокозамещенным метакриловым эфиром метилглюкозида (МАГ) (формула изображена на рис. 1.Б). Наличие метакриловых фрагментов в молекуле МАГ позволяет сополимеризовать его со стиролом и получать

полимерные микросферы со свойствами, необходимыми для их использования в качестве носителей белка при создании диагностических тест-систем.

Радикальную сополимеризацию стирола с МАГ проводили при объемном соотношении мономер:вода, равном 1:9, и температуре 70° с. концентрация МАГ составляла 1% мае. в расчете на стирол, а инициатора (К23208) - 1% мае. в расчете на стирол. При проведении сополимериза-ции стирола с МАГ в этих условиях в реакционной системе образовывался коагулюм из сферических шариков, размеры которых колеблются в интервале от 100 до 300 мкм. а их вес составляет .11% от веса конечной дисперсии, что свидетельствует о протекании суспензионной полимеризации, при которой на начальной стадии полимеризации интенсивно протекает коалесценция ПМЧ из-за их недостаточной агрегативной устойчивости. Частицы полимерной дисперсии характеризовались правильной сферической формой и очень широким распределением частиц по размерам. Увеличение концентрации МАГ до 2,0 - 4.5% мае. приводило к снижению количества коагулюма, содержание которого не превышало 4,5%, и образованию частиц неправильной сферической формы. Полученные результаты трудно объяснить из-за отсутствия данных по распределению компонентов реакционной системы между фазами и формированию межфазного адсорбционного слоя на начальной стадии процесса.

Оказалось, что при сополимеризации стирола с МАГ распределение частиц полимерной дисперсии по размерам и их устойчивость существенно зависят от объемного соотношения мономер: вода. Так, при синтезе полимерных дисперсий в условиях низкой концентрации стирола { при объемном соотношении фаз - 1:15 и 1:9, образуются полимерные дисперсии с явно выраженным бимодальным распределением частиц по размерам. Наряду с частицами, средний диаметр которых составяет 1.2 мкм, присутствуют частицы с размерами, не превышающими 0.3 мкм. Доля мелких частиц велика и составляет 25% и 45% от общего числа частиц соответственно. Увеличение концентрации стирола в эмульсии (до объемного соотношения мономер:вода=1:5) приводит к образованию устойчивой полистирольной дисперсии с узким распределением частиц по размерам. Другими словами, повышение концентрации стирола в эмульсии при прочих равных условиях приводит к получению более стабильных реакционных систем, начиная с низких конверсии мономера. Это может быть связано как с существенным вкладом полистирола в упрочнение межфаз-цого адсорбционного слоя ПМЧ. что уменьшает их коалесценцию, так и с

вменением содержания ионогенных фрагментов на межфазной поверх-

{ОСТИ.

Для создания модельных диагностических тест-систем была выбрана юлимерная дисперсия, полученная при объемном соотношении Фаз мономер: вода, равном 1:5,концентрации инициатора и МАГ-1 % мае. в расчете -1а мономер и температуре полимеризации - 70°С.

3. ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ СТИРОЛА В ПРИСУТСТВИИ ГЛИЦИРАИА.

Микросферы полистирола, синтезированные в присутствии глицирама з качестве стабилизатора частиц дисперсии, интересны тем. что содер-кат на поверхности карбоксильные и гидроксильные функциональные группы. Их наличие позволяет ковалентно присоединить к полимерному носителю разные по природе белки и получить высокочувствительные диагностические тест-системы для определения различных видов антигенов лли антител в биологических средах.

Из структурной формулы глицирама. моноаммонийной соли глицирри-зиновой кислоты (смотри на рис.1.С.) видно, что он представляет со-5ой сложную амфифильную молекулу, в которой отчетливо выраженыены гидрофобная и гидрофильная составляющие. Основная доля полярных групп глицирама сосредоточена в углеводной части молекулы, которая является биозидом глюкуроновой кислоты. Гидрофобная часть молекулы, агликон, представляет собой глицирретиновую кислоту.

Известно.что молекулы глицирризиновой кислоты в воде образуют мицеллоподобные ассоциаты, свойства которых заметно зависят от рН среды. Изменяя рН среды, можно получать системы разной степени дисперсности: от практически молекулярных растворов до гетерогенных, частицы которых состоят из множества молекул.

Для поддержания постоянного значения рН использовали буферные растворы, которые готовили по стандартным методикам. В отличие от эаствора глицирама в дистиллированной воде, в буферной среде правильнее говорить о поведении глицирризинатов, солей глицирризиновой кислоты, которые образуются в результате ионного обмена. В таблице 3 представлены данные по влиянию рН среды на средний размер ассоциатов молекул глицирризинатов.

Видно, что диаметр частиц скачкообразно изменяется от в узком интервале значений рН. Наибольший размер частиц глициризинатов наблюдается при рН=7,0, а наименьший - при рН=8, 0. Высокое содержание

ионогенных групп в молекулах глициризинатов приводит к значительным электростатическим взаимодействиям и к образованию высокоструктурированных растворов.

Таблица 3.

Средний размер ассоциатов глицирризинатов

рН 5.5 7.0 8.0

б2. нм 153,4 743,3 11.8

Строение глицирама и полученные результаты позволяют предположить. что структурной единицей в растворах глицирама в дистиллированной воде будут являться димерные молекулы. Самоассоциация в растворе. возможно, приведет к тому, что гидрофобные части двух молекул сблизятся; прочному их взаимодействию будут способствовать метальные и метиленовые группы, которых много в составе тритерпенового аглико-на - глицирретиновой кислоты. В этом случае полярные группы окажутс? на внешней поверхности димера, обеспечивая контакт с водой. Такие образования, по-видимому, наиболее устойчивы и термодинамически выгодны, а остальные ассоциаты возникают уже на их основе. Когда степень гидратации полярных групп уменьшается за счет появления тре> неионизированных карбоксильных групп (при рН<5.5). димеры могут соединяться в крупные образования, стабильность которых поддерживаете? за счет образования водородных связей. При нейтральном значении рН, когда в растворе находятся только однозамещенные соли, создают« условия для формирования наиболее крупных агрегтов молекул. В щелочной среде (при рН=8,0) размеры ассоциатов меньше из-за полной ионизации карбоксильных групп.

Строение молекул глицирама позволяет предположить, что пр| использовании их в качестве ПАВ стабильность эмульсии будет обеспечиваться за счет создания как структурно-механического, так и элект ростатического барьеров стабилизации.

Синтез полистирольных дисперсий проводили при концентрация: глицирама и персульфата калия, равных 0.5% мае. в расчете на моно мер, при разных значениях рН водной фазы и при Т=60°с. Объемно' соотношение фаз мономер:раствор фосфатного буфера было равно1:Ю Вначале при перемешивании получали дисперсию глицирама в стироле, затем добавляли инициатор и приливали расчетное количество буферног раствора.

Таблица 4.

Характеристики процесса полимеризации и свойства полистирольных дисперсий, полученных в присутствии глицирама объемное соотношение стирол: раствор буфера =1:10: Т=60° С; [К23208 ]=0,5% мае. и [Гл]=0,5% мае. в расчете на стирол.

рН среды конверсия % обще время синтеза ч. скорость полиме риз. %/мин коа-гу- люм % [NaCl], не вызывающая агрегации дисперсии М среднее значение М„ -Ю'5 dz мкм к'

5,5 75 8.5 0,09 20 0.3 3.6 0, 373 0. 39

7.0 97 22.5 0,035 15 0,3 4.5 0.706 1.00

8,0 93 18,5 0,04 15 0,3 4,2 0,912 0.53

Таблица 5.

Характеристика процесса полимеризации и свойства полистирольных дисперсий, полученных в присутствии глицирама объемное соотношение фаз стирол: раствор буфера=1:10: рН=7.0; [К2Зг08]=0,5% мае. в расчете на стирол; Т=60°С.

:онцен рация Гл. 1 мае. конверсия % общее время синтеза ч. скорость поли-мериз %/жн коа гу- люм % [NaCl]. не вызывающая агрегации дисперсии М м„ ■ 10"5 мкм ¡C мкм к'

0.5 97 22,5 0,035 15 0,3 4.5 1.200 1,15 0.706 1,000

1.0 87 10,0 0,08 10 0.3 9,0 0.291 1,03 0. 287 0, 097

2.0 76 4.5 0.25 10 0.3 12,0 0. 194 1. 03 0. 197 0. 056

Таблица 6.

Характеристика процесса полимеризации и свойства полистирольных дисперсий, полученных в присутствии глицирама К23г08]=0,5%мас. и [Гл] = 1%мас. в расчете на стирол;Т=60°С; рН=7, 0.

Съемное кон- общее ско- коа- [NaCl], не среднее

юотно- вер- время рость гу- вызывающая значение а. к

|ение сия син- поли люм агрегации mv-io-5

фаз теза мериз % дисперсии

% ч. %/мин М мкм

1:2 78 6.0 0,17 2.5 0.2 10.0 0.301 1.00

1:5 77 7,5 0,10 9,0 0.3 9.4 0.306 1,03

1:10 87 10,0 0,08 10,0 0.3 9.0 0.291 1.03

Средний размер частиц дисперсии определяли методами: электронной сканирующей микроскопии (йп;к=й„/с1п). фотон-корреляционной спектроскопии (с12; к' =(12 /<3П ).

При таком способе получения эмульсии стирола образуются обра-щенномицеллярные агрегаты глицирама в стироле. При добавлении дисперсионной среды и нагревании реакционной системы одновременно протекали процессы инициирования полимеризации стирола и массопере-нос глицирама из момономерной фазы в водную, приводящие к турбулиза-ции границы раздела фаз и дроблению мономера. Изменение внешних условий приводит к конформационным перестройкам глицирама. в результате которых полярные группы экспонируются на границу фаз стирол/вода. При этом снижается межфазное натяжение и происходит дробление капель мономера. Экспериментальные результаты (таблица 4) подтверждают, что рН среды значительно влияет, как на процесс полимеризации, так и на свойства полистирольной дисперсии. Наблюдаемые отличия, проявляемые в уменьшении скорости полимеризации и увеличении диаметра синтезируемых частиц, может быть объяснено влиянием строения ассоциатов глициризинатов на снижение межфазного натяжения на границе раздела фаз. Однако, при всех значениях рН наблюдается образование коагулюма в большом количестве. Очищенные от коагулюма дисперсии были устойчивы к действию электролита -КаС1 в широком диапозоне концентраций от 0,05 до 0.3 моль/л.

Увеличение содержания глицирама в эмульсии стирола с 0,5 дс 2,0% мае. в расчете на мономер, практически не повлияло на устойчивость реакционной системы. Изменился лишь средний диаметр части: дисперсии: при 0.5%-ной концентрации глицирама он составлял величин! -0.7 мкм, а при 2,0% -0,2 мкм. Полученные результаты приведены е таблице 5. По-видимому, образование коагулюма происходит на начальной стадии полимеризации вследствие недостаточной устойчивое™ частиц из-за медленной переориентации молекул глицирама на межфазноР границе, что приводит к увеличению времени формирования межфазногс адсорбционного слоя.

Экспериментальные результаты по влиянию объемного соотношени? фаз стирол: раствор буфера на размеры, дисперсность и свойства синтезируемых полимерных микросфер представлены в таблице 6. Постоянстве значений диаметров частиц полистирольных дисперсий, полученных пр1 увеличении содержания мономера в реакционной системе в 5 раз. связано с тем, что условия, приводящие к дроблению капель мономера (межфазное натяжение, эффективность инициирования), не претерпевают заметных изменений при варьировании концентрации инициатора и глицирама в выбранных пределах. Кроме того, образующиеся ПМЧ устойчивы \

коалесценции и при увеличении концентрации мономера в эмульсии воз-эастает лишь их число, о чем свидетельствует повышение скорости полимеризации.

В качестве носителей белка были выбраны полимерные микросферы, синтезированные в следующих условиях: объемное соотношение стирол: раствор буфера{рН=7,0)-1:10.температура полимеризации 60°С, концентрации глицирама и персульфата калия в расчете на мономер состав-ляют-1%мас. и 0.5% мае. соответственно.

4. КОВАЛЕНТНАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ БЕЛКА НА ПОЛИМЕРНЫЕ ЧАСТИЦЫ И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ .

Для экспериментов по иммобилизации белка на поверхности по-

листирольных частиц и проведению реакции латексной агглютинации (РЛА) были выбраны полимерные дисперсии, сохраняющие свои свойства при хранении в течение трех месяцев и выдерживающие многократную отмывку. Краткие сведения об условиях их получения и основные характеристики частиц дисперсии представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Рецепты синтеза частиц и их характеристики

Тип полимерных дисперсий УСЛОВИЯ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ [NaCl]. не вызывающая агрегации дисперсии м d„ мкм к

полистирольные, стабилизированные декст-раном Т-500 Тип-1 объемное соотношение фаз стирол: вода = 1:10 Т= 60°с [КоЭгОз]=0.5%мас.от стирола [Дек] =2. 5%мас.от стирола 0.3 0. 305 1.004

полистирольные, стабилизированные МАГ Тип-II стирол: вода = 1:5 Т= 70°С [Кг3,08]=1,0%мас.от стирола [МАГ] =1, 0%мас. от стирола 0,2 0. 520 1,040

полистирольные. стабилизированные глици-рамом Тип-1II стирол: фосфатный буфер=1:10 рН = 7.0 Т= 60°С [К2Б208]=0.5%мас.от стирола [Гл] =1.0%мас.от стирола 0,3 0.291 1,030

Активацию гликозидных групп проводили в мягких условиях: 30 минут без доступа света при комнатной температуре и концентрации

окислителя (периодата натрия) 0.1 моль/л. В результате реакции происходит расщепление а-гликольных группировок, при этом происходит разрыв связи С-С с образованием двух альдегидных групп. Полистироль-ные частицы, стабилизированные молекулами глицирама. на своей поверхности имеют еще карбоксильные группы, которые обычно могут взаимодействовать с амминогруппами белка в присутствии растворенного в воде карбодиимида (КДИ). Поэтому к объему полимерной дисперсии добавляли КДИ в таком количестве чтобы его концентрация в растворе составляла 1 мг/мл. Реакцию вели в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего проводили однократную отмывку от невступив-шего в реакцию КДИ. На подготовленные таким образом полимерные носители ковалентно иммобилизовали белок.

Для создания модельных тест-систем использовали иммуноглобулин С человека (1^). Выбор типа белка определялся способностью к специфическому "узнаванию" между полисахаридными фрагментами, так как согласно литературным данным ^ представляет собой гликопротеин, в молекуле которого присутствуют полисахаридные остатки. Время инкубации составляло 1час,конечная концентрация 1еС-1мг/мл. В качестве тестируемого образца использовали кроличью антисыворотку к человека (Аэ .

Таблица 8.

Результаты определения специфичности и чувствительности тест-систем

Тип дисперсии Реакционно способная группа Чувствитель ность диаг-ностикума Специфичность диаг-ностикума Чувсивит. после обработки лаурил сульфатом натрия Контроль РЛА

I - СОН 1/512 1/2 1/512 отриц

II - СОН 1/512 — — отриц

III - СООН 1/2084 1/8 1/64 отриц

- СОН 1/1024 1/4 1/64 отриц

При проведении РЛА использовали пробы, содержащие антисыворотки

разного разведения [1/2, 1/4. 1/8____]. Контролем РЛА являлся диаг-

ностикум, смешанный в равном количестве с буфером, который служил средой реакции. Результаты РЛА регистрировали через десять минут. Количество антител в сыворотке оценивали титром реакции. Под титром реакции понимали то наибольшее разведение антисыворотки, при котором реакция антиген-антитело наблюдается. Результаты РЛА по всем типам

:тиц представлены в таблице 8.

Из данных таблицы 8 видно, что максимальной чувствительностью отношению к Аэ^ обладал тест, полученный с использованием ;тиц полистирольной дисперсии, стабилизированных глицирамом. На ювании полученных данных установлено , что при высокой чувстви-_ 1ЬНости диагностикумов их специфичность чуть ниже 100% из-за. юльзования при проведении РЛА непрогретых сывороток здоровых до-зов. Прочность связывания молекул белка с поверхностью полимерных жителей продемонстрирована данными по чувствительности тестов, по-ненных после обработки системы детергентом - лаурилсульфатом нат-1. Результаты показывают, что полученные диагностические ;т-системы сохраняют достаточное количество белка для обеспечения эбходимой чувствительности и специфичности.

Из полученных данных можно сделать вывод о перспективности раз-5отки метода иммобилизации ^ на полимерных носителях всех типов, к как они продемонстрировали высокую чувствительность и специфич-сть.

ВЫВОДЫ

1. синтезированы полимерные дисперсии с гликозидными группами поверхности частиц и узким распределением частиц по разме-

м. средние диаметры которых лежат в интервале от 0.1 до 1,0 мкм.

2. Выявлена роль декстрана и глицирама при гетерофазной полиме-зации стирола в качестве стабилизаторов полимерной дисперсии и ли-ндов для ковалентного связывания с белками.

3. Установлено, что одним из важнейших факторов, контролирующих змер микросфер полистирола при гетерофазной полимеризации стирола присутствии глицирама является рН дисперсионной среды.

4. Впервые радикальной сополимеризацией стирола и метакрилиро-.нной глюкозы получены дисперсии с узким распределением частиц по ;аметрам.

5. Приготовлены диагностические тест-системы на основе синтези-гемых частиц, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью, юдемон стрирована возможность ковалентной иммобилизации белка на )верхности микросфер, стабилизированные глицирамом, по двум функци-[альным группам.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Басырева Л.В., Чирикова О.В., Бакеева И.В.. Повалий Т.М. Получение латексных агглютинационных систем в условиях физической адсорбции и ковалентной иммобилизации антигенов на полимерные микросферы //Тезисы VIII Всесоюзной научно-технической конференции "Синтетические латексы, их применение и модифицирование". Воронеж. 1991. с. 94.

2. Бакеева И.В.. Грицкова И. А.. Басырева Л.Ю.. Повалий Т.М. Синтез полистирольных латексов в присутствии углеводов в качестве ПАВ //Тезисы VIII Всесоюзной научно-технической конференции "Синтетические латексы. их применение и модифицирование". Воронеж. 1991.с.115.

3. Басырева Л.Ю.. Бакеева И. В.. Шуманский В.М.,Повалий Т.М., Телешов Э.Н. Иммобилизация иммуноглобулина G на полимерных микросферах с различными функциональными группами на поверхности // Тезисы IX Всесоюзного научного симпозиума "Синтетические полимеры медицинского назначения".Звенигород. 1991. с.137.

4. Gritskova I.A. .Bakeeva I. V.,Grzywa-Niksinska L.LegocklM. Basyreva L.. Grzywa E. Synthesis of polystyrene suspension with a narrow particle size distribution In the presence of dextran as a particle stabilizer for the use in immunochemical investigation// Polimery. 1996.41.nr9.p.503-507.

5. Бакеева И. В.. Бородина И. А.. Грицкова И.А. Синтез полимерных суспензий в присутствии декстранов разной молекулярной массы// Высокомолекулярные соединения.Сер. Б. 1997. тЗ9. N5. с. 868-871.

6. Патент Республики Польша N 171687 от 30 июня 1997 г.

7. Положительное решение по заявке на изобретение Республики Польша "Способ синтеза полимерных дисперсий с узким распределением частиц по размерам" от 14.01.97 г.