Создание полимерных микросфер для биотехнологии с функционально-модифицированной поверхностью в широком интервале диаметров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

ЛУКАШЕВИЧ АНДРЕЙ ДМИТРИЕВИЧ

СОЗДАНИЕ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ С ФУНКЦИОНАЛЬНО-МОДИФИЦИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ В ШИРОКОМ ИНТЕРВАЛЕ ДИАМЕТРОВ

Специальность: 02.00.06 — высокомолекулярные соединения 02.00.11 - коллоидная химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

МОСКВА 2015

005562167

Работа выполнена в ФГБОУ НПО «Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» на кафедре «Химия и технология высокомолекулярных соединений имени С.С. Медведева».

Научный руководители:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор ГРИЦКОВА Инесса Александровна доктор химических наук ЛЕВАЧЕВ Сергей Михайлович

доктор химических наук, профессор Коршак Юрий Васильевич

ФГБОУ ВПО «Российский химико-технологический университет (РХТУ) имени Д.И. Менделеева»

доктор химических наук, профессор Деркач Светлана Ростиславовна

зав. кафедрой химии, ФГБОУ ВПО «Мурманский государственный технический университет»

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова Российской академии наук»

Защита состоится «8»октября 2015г. в 1800 на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.04 в ФГБОУ ВПО «Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119571, г Москва, пр. Вернадского, д.86, корп. Т, ауд. Т-410.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 119571, г. Москва, пр. Вернадского, д.86, МИТХТ имени М.В. Ломономова.

С диссертацией можно ознакомиться на сайте уухууу.гш^.пщ в библиотеке МИТХТ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » 2015г.

Учёный секретарь заседания Диссертационного Совета Д 212.120.04 Доктор химических наук, профессор

Грицкова И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Полимерные суспензии с большими размерами частиц (от 5 мкм и выше) получают методами дисперсионной и затравочной полимеризации. Несмотря на то, что эти методы синтеза известны давно и широко применяются для производства полимерных суспензий различного назначения, до сих пор актуальным остается вопрос регулирования диаметра полимерных микросфер, распределения их по размерам и свойств приповерхностного слоя. Существование этой острой проблемы обусловлено тем, что при гетерофазной полимеризации мономеров одновременно протекают несколько процессов. Это инициирование полимеризации, формирование полимер-мономерных частиц и образование межфазного адсорбционного слоя, которые определяют агрегативную устойчивость реакционной системы, диаметр полимер-мономерных частиц и их распределение по размерам.

При затравочной полимеризации мономеров необходимо предварительно получить полимерные суспензии малого диаметра с узким РЧР, что также является непростой задачей, а затем использовать их как затравочные для набухания мономером и проведения в них полимеризации. В этом случае необходимо тщательно соблюдать режим полимеризации для того, чтобы в водной фазе не оказался мономер и не образовались ПМЧ по другому механизму.

Одним из путей решения этой проблемы является полимеризация мономеров в присутствии нерастворимых в воде ПАВ. В этом случае образование полимер-мономерных частиц происходит по одному механизму из микрокапель мономера, а прочный межфазный адсорбционный слой формируется на поверхности ПМЧ на ранних стадиях полимеризации и определяет узкое распределение по размерам.

Получить полимерные микросферы, удовлетворяющие высоким требованиям, предъявляемым к носителям биолигандов, возможно и путем модификации предварительно полученных полимерных дисперсий. Это позволяет в широких пределах варьировать свойства поверхности ПМС, что невозможно обеспечить прямыми методами.

Цель работы: создание полимерных микросфер с функционально — модифицированной поверхностью в широком интервале диаметров и узким распределением по размерам различными методами гетерофазной полимеризации.

Научная новизна

1. Впервые проведены систематические исследования по изучению влияния изменения температуры реакционной смеси на начальную стадию дисперсионной полимеризации. Показано его определяющее влияние на число частиц, скорость их роста и конечный диаметр дисперсий.

2. Установлено влияние природы растворителя на дисперсный состав полимерных микросфер (в ряду метанол - трет-бутанол) при проведении дисперсионной полимеризации.

3. Методом микросуспензионной полимеризации стирола и метилметакрилата в присутствии нерастворимых в воде ПАВ синтезированы полимерные суспензии с узким РЧР и диаметрами 0,4-0,9 мкм, содержащие на поверхности карбоксильные и эпоксидные группы.

4. Впервые методом затравочной полимеризации стирола, содержащего нерастворимые в воде кремнийорганические ПАВ, на сшитых полистирольных частицах с диаметром ~5мкм, синтезированы полимерные микросферы со структурой ядро-оболочка, содержащие в межфазном адсорбционном слое функциональные карбокси и эпокси группы.

5. Предложены различные химические и коллоидно-химические способы модификации, позволяющие широко варьировать концентрацию функциональных групп на поверхности полимерных микросфер.

6. Впервые найдены условия синтеза устойчивых полистирольных микросфер с узким РЧР, содержащих на поверхности высокую концентрацию функциональных групп, путём последовательной модификации частиц процессами хлорметилирования и аминирования.

7. Разработана методология получения полимерных дисперсий, частицы которых представляют собой композит из флуоресцентной функциональной оболочки и полимерного ядра.

Практическая значимость работы.

Создана диагностическая тест-система с использованием полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов для определения уровня антител к столбнячному анатоксину в сыворотках крови человека методом реакции пассивной латексной агглютинации, чувствительность которой сопоставима с чувствительностью существующего гемагглютинационного иммунного диагностикума.

Получены новые композиционные полимерные частицы с высокой удельной поверхностью, применение которых в качестве носителей биолигандов позволяет на порядок повысить чувствительность диагностических тест-систем, по сравнению с наблюдаемой при использовании эритроцитов или индивидуальных полимерных микросфер.

Полученные результаты могут стать основой при разработке тест системы для диагностики различных заболеваний методом реакции пассивной латексной агглютинации.

Проведено исследование различных методов формирования флуоресцентных микросфер, спектрально кодированных квантовыми точками, что позволило научно обоснованно сформулировать требования к конструкции флуоресцентных микросфер, применяемых в качестве диагностикумов.

Автор защищает:

1. Влияние изменения температуры на начальной стадии дисперсионной полимеризации стирола на диаметр частиц и их распределение по размерам.

2. Влияние природы растворителя и концентрации мономера на дисперсный состав полимерных дисперсий.

3. Кинетические закономерности полимеризации стирола и метилметакрилата в присутствии функциональных нерастворимых в воде ПАВ и рецептуры синтеза полимерных дисперсий с диаметрами 0,4-1,1мкм.

4. Синтез и свойства функциональных полимерных дисперсий с диаметром порядка 5мкм, полученных методом затравочной полимеризации.

5. Химическую и коллоидно-химическую модификацию поверхности полимерных частиц.

6. Методологию получения полимерных микросфер с иммобилизованными на поверхности флуоресцентными нанокристаллами.

Личное участие автора являлось основополагающим на всех стадиях работы и состояло в постановке задач и целей исследования, разработке экспериментальных и теоретических подходов при выполнении эксперимента, обобщении полученных результатов и подготовке публикаций.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались и обсуждались на международной конференции "Коллоиды и нанотехнологии в индустрии", Алматы, 2014г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы в изданиях, рекомендованных ВАК, подана 1 заявка на авторское свидетельство.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 147 страницах машинописного текста, включая 22 таблицы, 62 рисунка. Список литературы содержит 123 наименования.

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована её цель.

Глава 1. В Литературном обзоре основные методы получения полимерых микросфер, а также композиционных материалов, получаемых на их основе. Обсуждены способы функционализации поверхности полимерных частиц различными химическими и физико-химическими методами.

Глава 2. В Экспериментальной частипредставлен перечень использованных веществ, методов синтеза полимерных суспензий с различными значениями диаметров и узким РЧР. Использованы такие современные методы исследования, как ИК-спектрометрия, фотометрия, малоугловое рассеяние света, электронно-сканирующая (SEM) микроскопия, конфокальная микроскопия и ряд других.

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Полимеризация стирола в присутствии функциональных КО ПАВ*

В данном исследовании были использованы кремнийорганические олигомеры, содержащие функциональные группы в органическом заместителе у атома кремния на обоих концах полимерной цепи: карбоксидецильные и глицидоксипропильные. На рис. 3.1.1. приведены изотермы межфазного натяжения, полученные для кремнийорганических ПАВ, рассчитанные коллоидно-химические характеристики ПАВ приведены в таблице 3.1.1.

"" Рис. 3.1.1. Изотермы межфазного

40

натяжения, полученные на границах:

1 - толуольный раствор КС(СНОСН2) п=30 / вода.

2 - толуольный раствор КС(СООН) п=30 / вода;

о

0 1 2 * 4 ? 6

С'.*.

Видно, что параметры изотермы межфазного натяжения зависят от природы функциональных групп.

"Данная работа была проведена совместно со Злыдневой Л.А. Волкова Е.В. Разработка полистирольных микросфер для имунофлуоресцентного анализа/Е.В. Волкова, И.А. Грицкова, CA. Гусев, А.Д. Лукашевич, A.A. Гусев, Е.НЛевшенко, Л.А. Злыднева, К.О. Сочилина // Биотехнология. - 2012,- №4,- С.74-77.

Таблица 3.1.1.

Коллоидно-химические характеристики поверхностно-активных веществ.

ПАВ 01.1» мДж/м2 Гмакс'Ю , моль/м2 С, мН-м2/моль 5<ь А2 5-Ю9, м

КС(СООН) п=30 28,1 2,79 4,60 593 7,96

КС(СНОСН2) п=30 18,9 2,08 16,7 79,9 5,49

Основным выводом проведенных исследований является то, что все кремнийорганические вещества являются поверхностно-активными, а, следовательно, могут быть использованы в качестве стабилизаторов при синтезе полимерных суспензий методом гетерофазной полимеризации.

Исследования были начаты с изучения кинетических закономерностей полимеризации стирола в присутствии синтезированных кремнийорганических ПАВ. Полимеризацию проводили в условиях, обычно используемых для синтеза полимерных суспензий, применяемых в биотехнологии: объемное соотношение фаз 1:9, концентрация персульфата калия (ПСК) 1 мае. % в расчете на мономер, концентрация ПАВ 1 мае. % в расчете на мономер, Т=80±0,5°С. На рис. 3.1.2. приведены кривые конверсия-время, полученные в присутствии всех исследуемых ПАВ. Видно, что вид кинетической кривой соответствует обычно наблюдаемой при гетерофазной полимеризации. Скорости полимеризации для кривых 1 -3 практически не отличаются и намного превышают скорость полимеризации в массе. Полная конверсия мономера достигается за 5 часов.

Все синтезированные полимерные суспензии устойчивы в процессе синтеза, но существенно отличаются по значениям диаметров и молекулярных масс: в присутствии карбокси- и эпоксидсодержащего ПАВ образуются полистирольные микросферы с диаметрами 0,55 и 0,70 мкм соответственно, с узким распределением частиц по размерам. Средние размеры частиц не зависят от конверсии мономера. Микрофотографии и гистограммы распределения по размерам микросфер, полученных при полимеризации стирола в присутствии карбоксилсодержащего ПАВ, показаны на рис. 3.1.3. При увеличении концентрации мономера до объёмного соотношения мономер/вода, равного 1:4 диаметр частиц увеличивается. При этом сохраняется узкое распределение частиц по размерам. При дальнейшем увеличении концентрации мономера выше 25% реакционная система неустойчива.

Рис. 3.1.2. Кривые конверсия-время, полученные при полимеризации стирола в присутствии 1 мае. % ПАВ:

1 - КС(СНОСН2),

2 - КС(СООН),

3 - полимеризация в массе.

Рис.3.1.3. Микрофотографии и гистограммы распределения по размерам частиц полистирольных суспензий, полученные в присутствии КС(СООН).

1.9

Влияние природы инициатора на скорость полимеризации, средние размеры частиц и распределение их по диаметрам было предсказуемым: в присутствии (ПСК) скорость полимеризации выше, чем в присутствии динитрилаазоизомасляной кислоты (ДАК) и перекиси бензоила (ПБ). Частицы полистирольных суспензий характеризуются узким распределением по размерам, их диаметр составляет 0,65, 0,67 и 0,70 мкм, соответственно. Зависимости скорости полимеризации и молекулярной массы полимеров от концентрации маслорастворимых инициаторов соответствуют наблюдаемым для радикальной полимеризации.

Влияние концентрации ПАВ на кинетические закономерности полимеризации изучали, изменяя его концентрацию от 0,1 до 5,0 мае. %. С увеличением концентрации ПАВ до 5 мае. % диаметр частиц практически не изменяется, скорость полимеризации снижается, а молекулярная масса полимера увеличивается. Такой характер влияния ПАВ на кинетические закономерности полимеризации стирола, по-видимому, связан с увеличением вязкости межфазного слоя. При всех концентрациях ПАВ сохраняется узкое распределение частиц по размерам.

Полученные результаты отличаются от наблюдаемых в присутствии всех типов водорастворимых ПАВ, где увеличение концентрации ПАВ приводит к повышению скорости полимеризации и уменьшению диаметра частиц. Следует особо отметить, что полученные полимерные суспензии, характеризуются

устойчивостью в процессе синтеза, уже при концентрации кремнийорганического ПАВ равной 0,1 мае. %, в то время как присутствии ионогенных ПАВ, требуется концентрация не менее 5-6 мае. %.

Снижение температуры в интервале 80-60°С приводит к увеличению диаметров полистирольных микросфер от 0,5 мкм (при 80°С) до 0,65 мкм (при 60°С). Энергия активации Еа составила 25,6 ккал/моль.

Полученные результаты позволили предложить следующий механизм протекания полимеризации. В начальный момент исходная система состоит из раствора кремнийорганического ПАВ в мономере и водной фазы, содержащей растворенный в ней инициатор. Образование эмульсии происходит при диспергировании углеводородной фазы в водной при одновременном инициировании полимеризации. При этом образуется высокодисперсная эмульсия, микрокапли которой становятся основным источником ПМЧ. Образование полимера приводит к вытеснению молекул кремнийорганического ПАВ из объема к поверхности раздела ПМЧ/водная фаза из-за их несовместимости и образованию ПМЧ со структурой ядро-оболочка.

На межфазной границе кремнийорганический ПАВ формирует жидкокристаллическую пленку, лиофилизирующую границу раздела фаз и обладающую реологическими свойствами, необходимыми для реализации структурно-механического барьера по Ребиндеру. Полученные результаты позволили разработать рецептуры синтеза функциональных полимерных микросфер с диаметрами в интервале от 0,4 до 1,1 мкм.

3.2. Дисперсионная полимеризация мономеров.

3.2.1. Дисперсионная полимеризация стирола.

Дисперсионную полимеризацию стирола и глицидилметакрилата (ГМА) проводили в спиртовой среде с использованием ДАК в качестве инициатора, диоктилсульфосукцината натрия (АОТ) и поли-М-винилпирролидона (ПВП) (40 КДа) в качестве стабилизаторов.

3.2.1.1. Влияние объёмного соотношения мономер/растворитель на конечный диаметр полистирольных частиц.

Для получения полимерных суспензий с диаметрами частиц в интервале размеров от 2 до 6 мк с узким распределением по размерам, было изучено влияние объёмного соотношения мономер/растворитель на эти характеристики полимерной суспензии. Полученные результаты приведены в таблице 3.2.1.1.1.

Таблица 3.2.1.1.1.

Эффективный диапазон проведения дисперсионной полимеризации стирола в спиртовых средах. ___

Метанол Этанол Изопропанол Трет-бутанол

Концентрация мономера, %об. а, мкм Р (1, мкм Р (1, мкм р <1, мкм Р

20 1,10 1,017 1,70 1,013 2,20 1,017 2,60 1,018

25 1,30 1,017 1,90 1,015 2,50 1,018 3,43 1,016

35 1,60 1,018 2,60 1,020 3,0 1,011 4,00 1,013

40 2,31 1,018 3,20 1,013 3,60 1,014 5,20 1,010

5 2.50

| 2.40

I

ь 2,20

А'«

20 21 22 21 2425 2627 28 29 30 31 »233 34 35361713 13 4041 424344 4546

20 21 22 23 24 25 26 27 28 25 30 31 32 33 34 35 36 37 38 3940 41 ¿2 43 44 45 С, Ч0Б

IX

1П V

о-»»;""

20 21 22 21 24 25 26 27 28 29 30 3132 33 34 35 36 3? 35 3! И 4142 45 4415 № С.%06

2 4,25 | 4.СЮ О' 3,75

20 2122 23 24 25 26 27 28 29 30 3132 33 34 35 36 37 38 3940 4142 13141516 С,Ч0Б

Рис.3.2.1.1.1. Зависимость среднего диаметра микросфер от объёмной концентрации мономера при проведении полимеризации в среде метанола (а), этанола (б), изопропанола (в), трет-бутанола (г).

Было показано, что эффективным диапазоном концентраций мономера является интервал от 20 до 40% объёмных. В этом интервале концентраций мономера были получены полимерные суспензии с диаметрами частиц от 1 до 5 мкм, использованные в дальнейшем в качестве затравочных при синтезе частиц большего размера. Анализ данных, представленных на рисунке 3.2.1.1.1., позволяет с высокой степенью точности прогнозировать диаметр

частиц конечной суспензии при выборе любого растворителя в ряду (метанол-трет-бутанол) при концентрации мономера в интервале 20-40%об.

3.2.1.2. Влияние температурного профиля на процесс полимеризации и свойства конечной дисперсии.

Было подробно исследовано, влияние интенсивности, и длительности нагрева реакционной смеси до температуры полимеризации на начальной стадии на свойства получаемой дисперсии. При этом весь процесс полимеризации делили на определённое количество стадий, отличающихся температурой проведения процесса. Было обнаружено, что изменяя количество стадий, температурные параметры проведения процесса, можно в значительной степени влиять на диаметр полимерных микросфер и их распределение по размерам. Совокупность данных факторов можно объединить в т.н. «температурный профиль полимеризации».

Влияние температурного профиля исследовали на примере модельной дисперсионной полимеризации стирола в трет-бутиловом и этиловом спирте при объёмной концентрации мономерной фазы, лежащей в нижнем и верхнем пределе эффективного диапазона концентраций (20 и 40% соответственно).

За начало отсчёта времени полимеризации берётся момент введения мономерной фазы в дисперсионную среду, содержащую стабилизатор. Этому моменту соответствует достижение температуры в реакторе, равной 50°С. Данное действие продиктовано целью максимально использовать эффективный распад инициатора и избежать преждевременного инициирования на стадии, предшествующей моменту нуклеации. Это позволяет максимально нивелировать возмущения, вносимые инициирующими радикалами в протекание стадии образования полимерной цепи и её роста с момента инициирования до потери ею растворимости и выпадения в дисперсионную среду.

Представляло интерес оценить влияние интенсивности и времени нагрева реакционной системы на кинетику изменения диаметров частиц и их распределения по размерам в течение стадии формирования дисперсной системы. Считая, что начальная стадия полимеризации оказывает определяющее влияние на дисперсный состав конечной полимерной суспензии, было принято решение провести полимеризацию при двух различных температурных профилях. Профиль№1, рис.3.2.1.2.1,отличается от профиля №2, рис. 3.2.1.2.3. количеством ступеней, характеризующих изменения температуры процесса полимеризации, длительностью и характером роста температуры на начальной стадии процесса.

Влияние каждого профиля на кинетику процесса, размеры частиц и распределение их по размерам показано ниже на примере дисперсионной полимеризации стирола в трет-бутаноле. Рис. 3.2.1.2.1. — 3.2.1.2.5.

-о Рис.3.2.1.2.1..Температурный профиль дисперсионной полимеризации

стирола в среде

этанола и трет-бутанола при прочих равных условиях. ( №1).

Рис.3.2.1.2.2.Кинетика

дисперсионной полимеризации стирола в среде трет-бутанола при различной концентрации мономера, профиль 1. а- 40%, б-20%.

Рис. 3.2.1.2.3.Температурный профиль дисперсионной полимеризации стирола в среде трет-бутанола при прочих равных условиях. (№2).

Рис 3.2.1.2.4.Кинетика

дисперсионной полимеризации стирола в среде трет-бутанола, профиль 2

Рис.3.2.1.2.5. Микрофотографии полимерной дисперсии, полученных при полимеризации стирола в трет-бутаноле.

Совокупность полученных результатов показала, что природа растворителя практически не влияет на кинетические закономерности протекания процесса при выбранном температурном профиле. Кинетические кривые имеют общий вид для всего ряда растворителей (метанол-трет-бутанол). Меняется только конечный диаметр частиц и их распределение по размерам.

3.2.2. Дисперсионная полимеризация глицидилметакрилата

Дисперсионную полимеризацию глицидилметакрилата проводили в среде этанола с использованием ДАК в качестве инициатора, (АОТ) и ПВП в качестве стабилизаторов, и воды как регулятора дисперсности образующейся полимерной суспензии. На протяжении всей серии опытов концентрация мономера, установленная экспериментальным путём, оставалась постоянной; равно как и общий объем реакционной смеси. Рецептура проведения полимеризации приведена в таблице 3.2.2.1.

Последовательность этапов проведения процесса была следующей

1. В круглодонном реакторе в спирте одновременно растворяются ПВП, АОТ, ДАК и вода до гомогенного раствора. Температура процесса 40 С. Нагрев применяется для ускорения растворения компонентов.

2. После полного растворения компонентов системы, температура поднимается до 50°С. При этой температуре в реакционную среду вводится мономер. Это делается с целью предотвращения преждевременной нуклеации.

3. После полного растворения мономера температура поднимается до 67 С согласно температурному профилю со скоростью 0,5 С/мин и удерживается при этом значении 1 час. При этом необходимо тщательно следить за моментом и температурой нуклеации. При нуклеации прозрачная гомогенная реакционная смесь начинает опалесцировать и со временем становится молочно-белой вследствие образования полимерной фазы.

ТаблнцаЗ.2.2.1.

Рецептура дисперсионной полимеризации глицидилметакрилата

Вещество Навеска

1. ГМА 20 мл

2. ПВП К-30 2,8 г

3. Диоктилсульфосукцинат натрия (АОТ) 2,6 г

4. Спирт 75 мл

5. Вода от 0 до 5 об.%

6. Динитрил азо-бис изомасляной кислоты (ДАК) от 0,1 до 0,3 г

С момента нуклеации течение полимеризации зависит от температурного профиля проведения процесса. Варьируя количество стационарных температурных точек, можно в значительной степени влиять на дисперсный состав конечной дисперсии. По истечении второго часа полимеризации температура поднимается до 72°С и удерживается на этом уровне в течение всего оставшегося времени полимеризации. Общее время полимеризации — 3 часа с момента нуклеации. Температура нуклеации является важным параметром процесса и позволяет приближенно оценить конечный диаметр полученных микросфер.

Таблица 3.2.2.2.

Дисперсионная полимеризация ГМА

№ спытэ Этэнзл мл Беда мл ПБПгК-30) г АОТ. г ДАК гПСОмпГМА ГМА мп Т. мин Рз-м?э МКМ РЧР мкм

АОЗ'Ш 75 0 23 26 1 5 23 4 5 0 85

АР VI 75 10 28 26 1 5 20 3 0 61

АР 1/3 75 13 28 26 15 20 2 7 0 59

А51П04 75 0 28 26 1 I 20 30 25 029

АЭ1'10Э 75 0 28 26 05 20 30 1 2 0 22

Аэкт 75 0 23 26 0 5 ¡ПБ1 20 30 1 5 021

А51'117 75 0 28 26 1 (1иг?гох| 20 10 1 3 0 22

А31/121 ао 80 4 27 2 20 30 25 0 47

В таблице 3.2.2.2. представлена серия опытов по проведению дисперсионной полимеризации глицедилметакрилата. Начало исследованиям положил первый по приведённой рецептуре. Полученные частицы не соответствовали требованиям к размеру и полидисперсности. Были предприняты попытки скорректировать размер использованием некоторых количеств воды, однако это приводило к уширению РЧР. Решить эту проблему удалось путём уменьшения концентрации инициатора ДАК (1% вместо 1,5% к мономерной фазе), что помогло снизить размер частиц до 2,5 мкм.

Одновременно с этим было зафиксировано время нагрева реакционной смеси до температуры, соответствующей температуре полураспада инициатора за 6 часов (для ДАК это 67°С), что позволило добиться воспроизводимости

опытов (ранее имело место отсутствие корреляции между опытами). Опыты с количествами инициаторов менее 1% масс.для ДАК и соответствующими по молям количествами других инициаторов (перекись бензоила и Ьирегох) позволили нам получить частицы меньшего размера (1-1,5 мкм) с узким РЧР. Наконец, альтернативным способом получения 2,5-мкм частиц пГМА была последняя рецептура с несколько иным подходом к регулированию размера частиц: использовалось повышенное количество воды (1:1 к этанолу), большее количество стабилизатора ПВП и инициатора ДАК. Однако РЧР данных частиц оказалось шире, и для дальнейших модификаций использовалась рецептура, приведённая в таблице 3.2.2.1.

В таблице 3.2.2.3 показаны результаты опытов по проведению дисперсионной полимеризации ГМА в среде трет-бутанола и изо-пропанола. Из них следует некая зависимость размера полимерных микросфер и их полидисперсности от применяемого температурного профиля. Также серия данных опытов доказывает важность регулирования температуры именно на стадии нуклеации; на завершающих стадиях полимеризации изменения в температурном профиле не вносят существенных изменений в конечные параметры частиц. Эти данные соответствовали результатам, приведённым ранее при обсуждении результатов по полимеризации стирола.

Таким образом, увеличение времени нагрева от момента загрузки до начала нуклеации, равно как и понижение температуры загрузки мономера, приводит к уменьшению среднего диаметра частиц и их полидисперсности. Идея использования программируемого температурного профиля состоит в том, чтобы контролировать протекание множества зависимых от температуры процессов, имеющих место в ходе дисперсионной полимеризации: скорость образования первичных частиц, скорость полимеризации в ПМЧ, скорость образования олигомерных цепей в непрерывной фазе, интенсивность поглощения первичными частицами олигомерных цепей, осаждённых из непрерывной фазы. Ранее процесс проводился с максимальной скоростью нагрева реакционной смеси, что приводит к положительным результатам лишь тогда, когда состав рецептуры тому не препятствует. Таким образом, если температура повышается слишком интенсивно, первичные частицы образуются слишком рано, соответственно, их начальный размер слишком мал; процесс полимеризации в ПМЧ идёт очень интенсивно, а система склонна к образованию агрегатов частиц, т.н. «вторичных частиц» (высокодисперсных частиц). Результат их образования можно наблюдать на фото (рисЗ.2.2.2.)

Наоборот, при плавном регулировании температуры во время нуклеации процесс дисперсионной полимеризации протекает без образования «вторичных частиц», процесс становится полностью воспроизводимым от опыта к опыту.

Удовлетворительный результат проведенной дисперсионной полимеризации показан на фото ниже. Частицы монодисперсны, распределение по размерам унимодальное.

Таким образом, был зафиксирован важнейший параметр при проведении дисперсионной полимеризации - температура, а сам процесс проводился с применением программируемого температурного профиля. Была найдена оптимальная рецептура синтеза, отвечающая следующим характеристикам микросфер: размер - 2,5 мкм (см. подробнее п.3.2), РЧР - наиболее узкое (ширина пика не более 15% от ср. диаметра частиц).

Рис.3.2.2.1. Микрофотография ГТГМА микросфер при вторичной нуклеации.

Рис.3.2.2.2. Микрофотография монодисперсных ПГМА микросфер

Таблица 3.2.2.3.

Дисперсионная полимеризация стирола и используемые температурные профили

Номер опыта (Т-Ьи1апо1+ГМ\+Н20,мл) Диаметр, мкм РЧР, мкм Профиль температур Выход Комментарии

AS1/104 (1100+425+100) 3,43 3

AS1/12 (1100+400+20) 4,5 00,55 1 Вторичная нуклеация

AS1/113 (1100+400+35) 3,9 0,51 2 80

AS1/38 (1100+400+50) 3,8 0,51 1

AS1/123 (1100+400+50) 2,92 0,41 5

AS1/43 (1100+400+70) 3,3 0,4 1

AS1/13 (1100+400+80) 3,24 0,41 1

AS1/14 (1100+400+100) 3,16 0,4 1 84 Вторичн. нуклеация

AS1/99 (1100+400+100) 2,47 0,28 5 50

AS1/101 (1100+400+100) 2,85 0,2 5 32 А1ВГЧ 4,5%,Втор. нуклеация

AS1/109 (1100+400+100) 2,1 0,26 6

AS1/112 (1100+400+100) 1,85 0,24 7 60

AS1/121 (1100+400+100) 1,78 0,28 8

AS1/126 (1100+400+115) - 8 Полиднсперсность

AS1/15 (1100+400+130) - 1 Коагуляция

AS1/34 (1100+375+40) 3,38 1

AS 1/36 (2200+750+80) 3,33 0,4 1 Ав1/34 повторение

AS1/65 (1050+350+10) 3,82 0,48 2

AS1/49 (1100+350+0) 3,5 0,4 2 714

AS1/44 (1100+350+0) 3,4 0,41 1

AS1/86 (550+175+8) 3,18 0,48 3 А1В\ 4,5%, 2л реактор

AS1/78 (1100+350+25) 2,47 0.31 3

AS1/82 (1100+350+25) 2,46 0,31 3 70 Пол-я при 72 С 2 часа

AS1/93 (1100+350+25) 2,51 3 А1ВМПикаЗ%

AS1/83 (1100+350+25) 2,93 0,43 3 85 А1В\ 4,5%

AS1/87 (1100+350+25) 3,56 0,57 3 72 А1В\ 6%

AS1/33 (1100+350+40) 3,25 0,38 1

AS1/81 (1100+350+50) 2,43 0,3 3

AS 1/32 (1100+350+60) 3,11 0,41 1

ASI/67 (1100+350+60) 3,06 0,4 2

ASI/17 (1100+350+80) 2,93 0,42 1

ASI/18 (1100+350+80) 2,99 0,36 1

ASI/19 (1100+350+80) 2,99 0,43 1

AS 1/69 (1100+350+80) 2,97 0,42 2

ASI/74 (1100+350+80) 2,83 0,37 2 Окончание при 73 С

ASI/88 (1100+350+80) 2,68 0,39 4

ASI/46 (750+239+10) - 1 Вторичная нуклеация

ASI/47 (750+239+7) - 1 Вторичная нуклеация

ASI/16 (1100+300+80) 2,42 0,3 1

Номер опыта (и-пропанол+ГМА+Н20, мл) Диаметр мкм РЧР мкм Профиль температур Выход, % Комментарии

ASI/128 (500+150+200) 1,48 0,11 2 78

AS 1/135 (2000+720+800) 1,51 0,12 2

ASI/132 (500+180+200) 1,82 0,22 2

Таблица 3.2.2.4.

Перечень температурных профилей, использованных в работе.

1 2 3 4 5 6 7 8

50-67°С ЗОмин 50-67°С 30 мин 50-6ГС 60 мин 50-70°С 20 мин 40-67°С 60 мин 40-67°С 30 мин зо-бгс 30 мин 21-67°С 60 мин

67°С 60 мин 67°С 60 мин 67°С 60 мин 70"С 60 мин 6 ГС 60 мин 67°С 60 мин 67°С 60 мнн 67°С 60 мнн

67-70°С 7 мин 67-70°С 7 мин 67-70°С 7 мин 70-72"С 7 мин 67-70°С 7 мин 67-70°С 7 мни 67-70°С 7 мнн 67-70°С 7 мнн

70°С 60 мин 70"С 60 мии 70°С 60 мин 72°С 60 мни 70° С 60 мин 70°С 60 мин 70"С 60 мин 70°С 60 мин

70-72°С 7 мин 70-72°С 7 мин 70-72°С 7 мин 72-74°С 7 мин 70-72°С 7 мин 70-72°С 7 мин 70-72°С 7 мин 70-72"С 7 мин

72°С 60 мин 72°С 60 мин 72°С 300 мин 74°С 300 мин 72°С 240 мин 72°С 60 мин 72°С 60 мин 72°С 60 мин

72-74"С 7 мин 72-74°С 7 мин 72-74°С 7 мин 72-74°С 7 мин 72-74°С 7 мин

74 "С 60 мин 74 °С 240 мин 74°С 240 мин 74'С 240 мин 74 "С 240 мин

74-76'С 7 мин

76°С 120 мин

33. Затравочная полимеризация.

33.1. Затравочная полимеризация глицидилметакрилата.

Затравочную сополимеризацию глицидилметакрилата и

этиленгликольдиметакрилата проводили в присутствии 111 МА затравочных частиц со средним диаметром 2,5 мкм, в присутствии пероксидабензоила в качестве инициатора с соотношением мономерной фазы к полимерной 1:8.

Стоит отметить, что целевой диаметр полимерных микросфер по требованиям их использования в качестве носителей биолигандов вместо эритроцитов составляет 5мкм.

Была проведена серия опытов по определению оптимального соотношения мономер/полимер. Дело в том, что без использования специальных добавок, набухаемость полимера в растворителях весьма ограничена, а при слишком низких соотношениях мономер/полимер степень сшивки будет недостаточной, и стадия затравочной полимеризации не приведёт к желаемому эффекту.

Таблица 3.3.1.1.

Определение соотношения мономер/полимер для затравочной полимеризации ГМА_

Соотношение М:П Результат

1:1 Растворение в ДХМ

1:3 Растворение в ДХМ

1:5 Положительный

1:8 Положительный

1:10 Начало коалесценции

1:12 Сильная коалесценция

Согласно литературным данным, было выбрано массовое соотношение мономерной фазы и полимерной соответствующее полному набуханию полимера в мономере, равное 7:1. Такое соотношение фаз приводит к увеличению диаметра ПМ в ходе затравочной полимеризации в 2 раза, т.е. при использовании затравочных частиц с диаметром 2,5мкм, образуются полимерные частицы с диаметром 5мкм. Полимеризацию ведут 2 часа при температуре 80 "С. По истечении указанного времени процесс прекращают

3.3.2. Анализ наличия функциональных групп

Наличие функциональных групп на поверхности полимерных микросфер было подтверждено элементным анализом и данными ИК-спектроскопии.

3.4.1. Затравочная полимеризация стирола.

Методом затравочной полимеризации были проведён синтез монодисперсных сшитых полимерных микросфер с диаметром порядка 5мкм.

Процесс проводили путём набухания линейных полистирольных микросфер смесью стирола и дивинилбензола по рецептуре, представленной в таблице 3.4.1.1. Для выбора массового соотношения полимер/мономерная фаза, как и ранее, использовали литературные данные по набуханию стирола в собственном мономере. И в этом случае в качестве затравочных использовали частицы с размером 2,5мкм. В этом случае массовое соотношение полимер:мономерная фаза составило 1:8 соответственно. Полноту набухания затравочных частиц мономером контролировали с помощью светового микроскопа с нанесённой градуировочной шкалой.

На рисунке 3.4.1.1. представлены микрофотографии полученных полистирольных микросфер со степенью сшивки 4%.

Рис.3.4.1.1. Микрофотография сшитых полистирольных микросфер с d = 5 мкм, полученных методом затравочной полимеризации.

Табл. 3.4.1.1.

Рецептура проведения затравочной полимеризации стирола.

Вещество Навеска

1. Затравочные ПСт микросферы 5 г

2. 2% раствор ПВС в воде 500 мл

3. Стирол 38 г

4. Перекись бензоила (75%) 0,4 г

5. Дивинилбензол 80% (DVB) 2 г

6. Бихромат калия 0,5 г

3.5. Модификация поверхности полимерных микросфер флуоресцентными нанокристаллами (КТ).

В работе разработан новый способ иммобилизации КТ на поверхность полимерных микросфер и подана заявка на авторское свидетельство.

Методология этого процесса состояла в том, что готовят раствор квантовых точек в органическом растворителе, содержащем катионактивный ПАВ, представляющий собой соль четвертичного аммониевого основания. Концентрацию квантовых точек в растворе выбирают равной 0,1-1,0 г/л, соответственно концентрация катионного ПАВ была равной 1-2 % масс на сухой полимер. К этому раствору добавляют полимерные микросферы при соотношении полимер :раствор квантовых точек, равном 1:1. Полученную смесь подвергают ультразвуковой обработке, затем выдерживают в течение 2-6 часов при комнатной температуре и диспергируют в С2-С4-алифатическом спирте, содержащем катионактивный ПАВ, выдерживают в течение 5-15 минут, затем центрифугируют для выделения образовавшегося осадка, состоящего из полимерных микросфер, содержащих квантовые точки.

При осаждении на полимерную поверхность квантовые точки ведут себя одинаково вне зависимости от того, в каком растворителе они диспергированы: в толуоле, хлороформе или их смеси. Их устойчивость и способность к самоагрегации определяется исключительно степенью стабилизации и отсутствием резкого перехода от неполярной среды к полярной.

Разработанный способ позволяет получать полимерные микросферы требуемого размера, содержащие на поверхности прочно иммобилизованные флуоресцентные нанокристаллы. Полученные результаты демонстрируются фотографиями, представленными на рисунках 3.5.1.

Рис.3.5.1. Полимерные микросферы с (1 = 5 мкм, содержащие на поверхности слой флуоресцентных нанокристаллов.

3.6. Выбор иолистирольиых микросфер для разработки диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации.

Для создания диагностических тест-систем были использованы полистирольные суспензии, синтезированные методом затравочной полимеризации в присутствии функциональных кремнийорганических ПАВ, что позволило получить полистирольные микросферы, содержащие в поверхностном слое аминогруппы, карбоксигруппы и эпоксигруппы.

Применяли полимерные частицы двух размеров. Первые — со средним диаметром 5 мкм - были получены методом затравочной полимеризации стирола в присутствии функциональных кремнийорганических ПАВ, а вторые,-со средним диаметром 0,4 - 0,7 мкм, синтезированые методом гетерофазной полимеризации стирола в присутствии тех же функциональных кремнийорганических ПАВ. Так как поверхность микросфер была гидрофобной, то возникла необходимость в гидрофилизации. Гидрофилизацию поверхности (до угла смачивания 52°) проводили разными способами: путем введения в систему поливинилового спирта, увеличением концентрации аминогрупп на поверхности частиц при хлорметилировании и последующим аминировании полимерных микросфер.

Наибольшей агрегативной устойчивостью в буферных растворах характеризовались полистирольные микросферы со средним диаметром 5 мкм, модифицированные хлорметилированием с последующим аминированием. Данная полимерная суспензия была использована при создании диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации для определения уровня антител к столбнячному анатоксину в сыворотке крови человека.

Вторые - были использованы при получении диагностических тест-систем для постановки реакции латексной агглютинации «на стекле». В качестве специфических биолигандов были использованы сывороточный альбумин человека, гамма-иммуноглобулин человека и столбнячный анатоксины.

Полистирольные частицы сохраняли агрегативную устойчивость на всех этапах получения диагностических тест-систем. Наблюдаемая высокая чувствительность реакции латексной агглютинации на стекле подтверждала наличие на поверхности полимерных частиц функциональных групп и химических связанных с ними биолигандов в достаточных количествах.

3.7. Разработка нового типа частиц - носителей с развитой поверхностью.

Был предложен принципиально новый подход к созданию частиц полимерного носителя, позволяющий увеличить как удельную поверхность, так и скорость их седиментации. Суть данного подхода заключалась в получении композиционных полимерных частиц путем формирования на поверхности полимерных микросфер большего диаметра оболочку из полимерных частиц малого диаметра за счет ковалентного связывания функциональных групп, содержащихся в их поверхностном слое.

Полистирольные частицы со средним диаметром 0,4 - 0,7 мкм были использованы при формировании оболочки на поверхности полистирольных микросфер со средним диаметром 5 мкм путем химического связывания их функциональных групп по известным методикам. Для исключения агрегации частиц большого диаметра активацию их функциональных групп и иммобилизацию полимерных частиц малого диаметра на их поверхность проводили в воде. Композиционные частицы характеризовались устойчивостью в буферных растворах высокой ионной силы и не меняли своих свойств во времени.

Согласно расчетным данным удельная поверхность полученных частиц в среднем в 3,5 раза больше удельной поверхности исходных полистирольных микросфер. На рисунке 3.7.4. представлены микрофотографии композиционных полимерных частиц, полученных на основе полистирольных микросфер, содержащих различные функциональные группы.

Рисунок 3.7.5. Полистирольные частицы с развитой удельной поверхностью, полученные путем фиксации: А - полистирольных частиц со средним диаметром 0,5 мкм, содержащих в поверхностном слое аминогруппы, на поверхность полистирольных микросфер со средним диаметром 5 мкм, содержащую аминогруппы; Б — полистирольных частиц со средним диаметром 0,7 мкм, содержащих в поверхностном слое эпоксигруппы, на поверхность полистирольных микросфер со средним диаметром 5 мкм, содержащую аминогруппы.

Выводы.

1. Определены условия синтеза полистирольных суспензий с диаметрами в интервале 0,4-1.1мкм в присутствии функциональных КО ПАВ

2. Систематические исследования влияния изменения температуры реакционной среды при проведении дисперсионной полимеризации стирола и глицидилметакрилата, позволили установить определяющую роль этого фактора в формировании полимерных частиц заданного размера.

3. Показано, что при проведении дисперсионной полимеризации стирола в спиртовом растворе (ряд: метанол, этанол, изопропанол, трет-бутанол) в широких пределах изменяется не только диаметр частиц, но и показатель полидисперсности полимерных суспензий.

4. Методом затравочной сополимеризации стирола с дивинилбензолом на затравочных полистирольных частицах с узким РЧР, предварительно полученных методом дисперсионной полимеризации, синтезированы сшитые полистирольные микросферы с ё = 4-5 мкм и узким РЧР. Полученные ПМС использованы в качестве затравочных при получении функционально-модифицированных полимерных микросфер ( хлорметилированные-аминированные, КТ- точки)

5. Химическими и физико-химическими методами модифицирована поверхность полистирольных и полиглицидилметакрилатных частиц с целью повышения эффективности иммобилизации биолигандов на поверхности при создании тест-систем.

6. Впервые сформулированы характерные особенности полимеризации мономеров в присутствии функциональных Ко ПАВ: независимость размеров частиц от конверсии мономера, высокая устойчивость в процессе синтеза при низких концентрациях ПАВ, узкое распределение по размерам, на порядок больший размер частиц по сравнению с образующимися в присутствии водорастворимых ПАВ, возможность регулирования размера частиц полимерной суспензии путём изменения концентрации ПАВ и природы функциональных групп на поверхности.

7. Разработана методика иммобилизации полупроводниковых нанокристаллов на поверхность полистирольных микросфер, отличающихся высокими устойчивостью и квантовым выходом.

8. Синтезированные в работе полимерные микросферы с размерами 0,4-0,9мкм были использованы при получении диагностических тест-систем для постановки РЛА на «стекле», а частицы с диаметрами 3-5мкм — для создания тест систем для определения уровня антител к столбнячному анатоксину в сыворотке крови человека. Стадия модификации полимерных микросфер КТ позволяет повысить чувствительность методов РЛА на 20%.

о

Список печатных работ:

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Волкова Е.В. Разработка полистирольных микросфер для имунофлуоресцентного анализа/Е.В. Волкова, И.А. Грицкова, С.А. Гусев, А.Д. Лукашевич, A.A. Гусев, E.H. Левшенко, Л.А. Злыднева, К.О. Сочилина // Биотехнология. -2012.- №4,- С.74-77.

2. Волкова Е.В. Выбор полимерных микросфер для проведения реакции латексной агглютинации в плашечном формате./ Е.В. Волкова, А.Д. Лукашевич А.Д., И.С. Левачева, С.М. Левачев, С.А. Гусев, И.А. Грицкова// Вестник МИТХТ.- 2013,- Т. 8. - №6. - С. 68-72

3. Серхачева Н.С.Полимеризация стирола в высокодисперсных эмульсиях в присутствии додецилсульфата натрия, цетилового спирта и их смеси, и изучение поведения ПАВ в монослоях на границе раздела вода/воздух /

H.С.Серхачёва, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, Ю.Н. Малахова, А.И. Бузин, С.Н. Чвалун, Г.М. Кузьмичёва, A.A. Чайнова, Ю.М. Ширякина, С.М. Левачёв, А.Д. Лукашевич // Пластмассы. - 2014, № 9-10, С 15-20.

Тезисы докладов:

I. Е.В. Волкова, A.B. Санджиева, A.B. Бахтина, А.Д. Лукашевич, С.Б. Айдарова, С.А. Гусев, И.А. Грицкова. Выбор полимерных микросфер при создании латекс-агглютинационных тест-систем.// Международная конференция "Коллоиды и нанотехнологии в индустрии", Алматы, 2014г.с.234-236.

2. Е.В. Волкова, А.Д. Лукашевич, С.Б. Айдарова, С.А.Гусев, И.А. Грицкова. Получение композиционных полимерных материалов с высокой удельной поверхностью в качестве носителя биолигандов.// Международная конференция "Коллоиды и нанотехнологии в индустрии", Алматы, 2014г.с.24-239.

Лукашевич Андрей Дмитриевич Создание полимерных микросфер для биотехнологии с функционалыю-моднфицированпои поверхностью в широком интервале диаметров

Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 05.08.2015г. заказ № 163 Типография ООО «Генезис» 8(495)434-8355 119571, г.Москва, пр-т Вернадского, 86