Создание диагностических тест-систем на основе полимерных суспензий и факторы, определяющие их чувствительность и специфичность тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АВДЕШЯ . ТОНКОЙ тмжШ ТЕХНОЛОГИИ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ла правах рукописи

"" ""БАСЫРЕВА. ЛИДИЯ ЮРЬЕВНА

СОЗДАНИЕ ДИАГНОСТМЕСКИХ ТЕСТ-СИСТШ

НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ СУСПЕНЗИЙ И ФАКТОРЫ, ОШДЕШВДЕ ИХ " '

ЧУВСТШТЕШГОСТЬ И СПЕЦШЧЮСТЬ

02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений.

АВТОРЕФЕРАТ-, диссертации на соискание ученой степени » ' • кандидата химических наук

МОСКВА - 1994

Работа выполнена в Московской Государственной Академии тонкой химической технологии им.М.В.Ломоносова и в научно-исследовате институте физико-химической медицины

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор Грицкова И.А. доктор медицинских наук, профессор 1усев С.А. ''

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Измайлова В.Н. доктор химических наук, профессор Штйльшн М.й.

Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л.Я.Карпова

Защита состоится ОРЛАиЬ^1^ года в часов в аудитории на заседай™ специализированного Совета Д 063.' при ШТХТ им. М.В.Ломоносова по адресу:

Н9831, Москва, ул. М.Пироговская, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в бибдиотеке ШТХТ им. 1

}

моносова.

Автореферат разослан

V иоЛь

1994г.

Ученый секретарь специализированного Совета д.х.н., проф.

■Грицкова И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность •работы определяется необходимостью создания отечественных диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции латексной агглютинации, предназначенных для проведения массовых вкспресс-анализов, с использованием полимерных микросфар в качестве носителей белка.

Цель работы состояла в изучении влияния природы полимера и функциональных групп на поверхности частиц полимерных суспензий на иммунохимическую активность белка.

Научная новизна работы: ^ ^

- установлено, 'что определяющими факторами при создании высокоэффективных диагностических препаратов, является природа полимера и функциональных групп на поверхности частиц',

- установлено, что высокая диагностическая эффективность тест-систем достигается при использовании полимерных суспензий, частицы которых характеризуются невысоким поверхностным зарядом, близким к нейтральному;

- разработаны антигенные тест-системы, работающие на основе реакции латекс-агглютинации, предназначенные для выявления в сыворотка крови человека нр-фактора и антител к тиреоглорулину, и использующиеся для диагностики ревматоидных заболеваний и заболеваний щитовидной железы;

- разработаны антитэльные тест-системы, работающие на основе реакции латекс-агглютинации, предназначенные для выявления в сыворотка крови человека альфа-фетопротеина, альфа-микроглобулина фертильности и трофобластического бета-глобулина, и использующиеся для диагностики раковых заболеваний и • ранней стадии беременности.

Практическая значимость работы.

На основе полистиролметакриловой суспензии созд тест-системы для диагностики ревматоидных заболева заболеваний щитовидной железы, ранней стадии беременна прашедше клинические испытания с положительным результатом.

Автор защищает:

- функциональные полимерные суспензии, пригодные иммунохимических исследований;

- методы иммобилизации белка на поверхность частиц суспе различной полимерной природа;

факторы, определящие создание высокоеффекти диагностических препаратов;

- методики создания антигенных и антительных тест-сис работающих на основа реакции латекс-агглютинации, для диагнос некоторых ревматоидных заболеваний (ревматоидный артр

. заболеваний щитовидной железы (тиреоидит Хасимото, базе болезнь) и ранней стадии беременности.

Публикации. По результатам диссертационной рн .опубликовано 4 работы.

Структура и объем диссертации.Диссертация изложена на страницвх машинописного текста и состоит из следующих разде введение, литературный обзор, исходные вещества и ме исследования, результаты и их обсуждение, выводы, включав1 таблиц, II рисунков. Библиография содержит/оО наименований.

ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА. Стирол и метакриловую кислоту марки очищали от стабилизатора по известной методике. Персульфат ке ди-п-толил-о-кврбалкоксифенилкарбинол, е -(карбоксиэтил)-ш-( метилсилокси)полидиметилсилоксан, е-аминокапроновую кислоту,

..'Л

свмэтилвндиамин и другие реагенты марки "хч", "ч" и "чда" использовали без дополнительной очистки. Дэкстран и карбодиимид - импортные продукты - использовали без дополнительной очистки. Иммуноглобулин в и тирвоглобулин о человека, бычий сывороточный альбумин, плацентарный альбумин человека, моноспецифическне сыворотки против иммуноглобулина о и тиреоглобулина О человека применяли без дополнительной очистки. Дисперсионная среда - вода дистиллат.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Конверсию мономера оценивали методом хроматографии. Размеры частиц полимерных суспензий опред^лрли методом сканирующей электронной микроскопии на приборе "3-570" (НЛ-taohi", Япония). Количество бвлкв, иммобилизованного на полимерных частицах, определяли методом Кумасси на спектрофотометре "Бреоогй М 40". Чувствительность и специфичность тест-систем оценивали в реакции латекс-агглютинации. Реакцию латексной агглютинации наблюдали визуальным способом на стеклянной или полистирольной пластине черного цвета.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ I.ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ СУСПЕНЗИЙ РАЗЛИЧНОЙ ПОЛИМЕРНОЙ ПРИРОДЫ.

Создание тест-систем для диагностики различных рэболеваний, работающих по методу латекс-агглютинации, включает два этапа. Первый этап - вто синтез функциональных полимерных суспензий, с узким распределением частиц по размерам, устойчивых в растворах солей низкой концентрации, при хранении, в процессах многократных модификаций поверхности частиц.

Были синтезированы полистирольные суспензии, стабилизированные поверхностно-активными веществами различной природа: гидрофобными, нерастворимыми в воде

ди-п-толид-карОалкоксифенижарбинолом.ДТК, и е-(карбоксиэтил) -(триметилсилокси)полидиметилсшгаксаном,ДДС, а также водорастЕ римым полисахаридом, декстраном, который использовали в качест полимерного стабилизатора частиц. В каждом отдельном случае поверхности частиц находились молекулы соответствующего стабил затора, содержащие функциональные группы, способные ковалент связываться с белком. Кроме того, методом базвмульгаторной пол меризации были синтезированы полистиролметакриловые суспензии с различным содержанием звеньев метакриловой кислоты, МАК, поЛЬлерной цепи.

Рецепты синтеза полимерных микросфер приведены в таблице При получении диагностических тест-систем важным вопросом является диаметр частиц полимерной суспензии. Практически не ис пользуют частицы о диаметрами менее 0,1 мкм, так как процесс и очистки сложен и многостадиен. Мало перспективны для слайдовы тестов микросферы о диаметрами выше 0,8 мкм, так как крупны частицы быстро седиментируют на слайдовой пластинке, затрудня тем самым "прочтение1* результатов реакции латекс-агглютинации.

Для исследований были выбраны полимерные суспензии, части которых имели диаметры от 0,3 до 0,7 микрон и узкое распределен по размерам (рис.1). Они были устойчивы в растворе электролита концентрацией не менее 0,15 М. (табл.г), сохраняли устойчивость в течение 3-х месяцев.

Второй этап создания тест-систем заключается в нахохдеы условий проведения ковалентного связывания белков с поверхност: частиц полимерной суспензии, обеспечивающих высок;

чувствительность и специфичность диагностических препаратов.

Таблица 1 . Рецепты синтеза полимерных суспензий.-

тип Iсоотнош^-полимерноиГнйе' *" • суспензии I стирол: I вода

_!_

1тип- 1конц. 1тип 1конц.,г !темпера-1 Iстабили-!стабили-!инициа-!иницйа-'Р ту$Ь- !I I затора !затора 1тора !тора I ?Г

1 !моль/л 1 1моль/л 1 "С I

I |мономера| |мономера] < |

полисти-рольная суспензия,I стабилизи-1 рованная I

дек 1

I док

!

I

1172' 10' ! '

полистирол1 метакрило-1 вая сус- 11:9 пензия 1

I

1 !

! -I

полисти- I рольная I суспензия,1 I стабилизи-1

Ш ванная 1 ' О I

I I

ЦЦО 11,08-10'

1 I

- полисти- I рольная I суспензия,! I : 10 стабилизированная ! декстраном!

I I

1 1 -5

!декстран! 1-10

II. КОВАЛЕНТНАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ НА ПОЛИМЕРНЫЕ НОСИТЕЛИ

И ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРИРОДЫ ПОВЕРХНОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ ЧАСТИЦ

НА ИММУНОХИМИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗУЕМОГО БЕЛКА .-'"-

I 1

и.1 Ковалентная иммобилизация иммуноглобулина■о 1

на поверхность полимерных микросфер

Наиболее распространенной и широко описанной в литературе моделью диагностических препаратов является система, включающая в качестве белка, иммобилизованного на полимерный носитель, альбумин, в качестве тестируемого образца - антисыворотку к альбумину.

Однако прямого применения в клинических исследованиях данная тест-система не находит. В связи с этим для создания модельной тест-системы был использован иммуноглобулин а человека (1^).

'о

10

го

т 60 1,0 30 20 {О

А

%

90 80 ГО 60 50

ко го го ю

В

/л»* - £> 09/г/о*г

0$5 ОМ ОМУ 0,50

//у^г - 0,09 "лу

0,60 0,Ь5 0,Ю 0,?5 сЬ,Н<П

ч

¿0

£0 Щ-

20 70 {О

X.

■90 2040 ЬО 50 Ш го в {о

- 0,0$*лау

_г

0,60 0,65 0,40 О,

(«гм-О.

0,15- 0,30 0,Ь5 О,

Рес.1 Распределение частиц полимерных суспензий по размв] А - полистирольная суспензия, стабилизированная ДТ1 Б - полистиролметакриловая суспензия; В - полис тирольная суспензия, стабилизированная ЦДС Г — полистирольная суспензия, стабилизированная де!

На основе каждой из 4-х типов синтезированных полимерн суспензий были приготовлены модельные антигенные диагностич! системы, на поверхность частиц которых был иммобили иммуноглобулин в человека. В качестве тестируемого об ; использовали кроличью антисыворотку к человека (Ав 166)1

Таблица г

Диаметр, электрофоратическая шдвижность и аггрегативная устойчивость в растворах электролита частиц полимерных суспензий

тип

полимерной суспензии

j диаметр мкм

полистирольная !

суспензия, отабилизи-1 рованная ДТК I

0,45

z - потенциал мВ

-72,46

аггрегативная устойчивость молярность (Ы) раствора NaOl

!

0,15

полиотиролметакрило-вая суспензия 1

0,70

-10,55

0,15

I

-1

0,20 1

_1±_! 1

0,20 ! _!

полистирольная суспензия, стабилизи-1 рованная ЦЦО !

0,70

-10,90

полистирольная суспензия, стабилизированная двкстрансм

0,30

-2,50

1

Рабочими параметрами, характеризующими диагностическую эффективность модельной иммуноглобулиновой системы, являются чувствительность теста по отношению к Аа igo, специфичность теста по отношению к сывороткам крови здоровых доноров и время хранения тест-системы.

Чувствительность теста по отношению к Ab igO определяли в РЛА. Контролем PJIA. являлся диагностикум, смешанный с буфером, служившим средой реакции. Положительной реакция счит^л^сь в том случае, когда происходило образование видимых невооруженным глазом аггрегатов. В контроле . такие агграгаты должны отсутствовать.

В РЛА количество антител в сыворотке оценивается титром. Под титром реакции понимают то наибольшее разведение антисыворотки, при котором реакция антиген-антитело еще наблюдается (порядковый номер разведения Аз IgG = log^ лир РЛА)).

Для определения специфичности тест-систем по отношению к

сывороткам крови здоровых доноров готовые диагностик

раститровывали о прогретыми цельными сыворотками крови здорс

доноров. Величину специфичности расчитывали по формуле:

количество сывороток.непрореагировавших с тестом общее количество сывороток, взятых для анализа 100 ж

Для того, чтобы оценить преимущества тестов, созданных основе полимерных частиц с ковалентно иммобилизованным на поверхности белком, перед тестами, приготовленными использованием микросфер, содержащих на поверхности физиче едборбированный белок, на основе каждого типа полимер суспензии были приготовлены две модельные системы.

Концентрация суспензии полимерных частиц была выбрана основании литературных данных и составила 2-2,5 % .

II.1.1. Модельная. система на основе частиц полистироль суспензии, синтезированной в присутствии ДТК в качест стабилизатора

Частицы полистирольной суспензии, полученные в присутст ДТК, не содержали на своей поверхности реакционноспособных гру реагирующих с белком. Для их получения на поверхность чао 1 'физически адсорбировали бычий сывороточный альбумин (БОА), в личестве, обеспечивающем образование монослоя из молекул белка поверхности частиц. Концентрация БОА в этом случае должна сост лять 3 мг/мл суспензии. Затем модифицированную альбумином пове ность частиц обрабатывали дифувкциональным соединением, кврбо имидом (ИДИ) или глутвровым вльдегидом (ГА), что необходимо получения на поверхности частиц групп, ковалентно связыввдихс соответствующими функциональными группвми белка.

Для наховдения условий ковалентного связывания igG челов

с реакционноспособными грушами, полученными на поверхности полистирольных микросфер, покрытой молекулами БСА, после ее модификации дифункциональным соединением, было подобрано оптимальное соотношение концентраций КДИ (ГА) и белка.

Проведенное исследование показало, что оптимальная концентрация карбодиимида составляет I мг/мл, а концентрация глутарового альдегида - IQ мг/мл.

При выбора концентрации IgG в исходном растворе, необходимой для обеспечения максимальной чувствительности тестов, было установлено, что при смешивании растворов белка и полимерных частиц наблюдается явление спонтанной агглютинации при концентрациях IgG ниже 0,1 мг/мл, которое мохет быть объяснено недостаточной насыщенностью поверхности полимерных частиц молекулами белка, приводящей к аггрегации микросфер при их столкновении. Поэтому в работе концентрации IgG человека ниже 0,1 мг/мл не рассматривали. Было выявлено, что максимальная чувствительность дивгностихума достигается при концентрации IgG, равной I мг/мл.

На основе частиц той ке полимерной суспензии были приготовлены тесты, в которых IgG был физически адсорбирован на поверхность полимерных мшфосфер. Диагностическая эффективность полученных тест-систем представлена на рисунках 2 и 3.

Чувствительность и специфичность диагностикумов, полученных как о использованием частиц, содержащих ' ковалентно иммобилизованный IgG на поверхности, так и чвстиц с физически адсорбированным белком, практически одинаковы . Однако, для всех рассматриваемых в работе полимерных суспензий было характерно то, что тесты, приготовленные с использованием полимерных

носителей, на поверхности которых белок был коваленп иммобилизован, по истечению трех месяцев сохраняли, исходщ чувствительность по отношении к Ав 1{*<з. Чувствительность а тестов, полученных на основе полимерных носителей, содержав физически адсорбированный белок, снижалась уже через 1,5 месяцс а через 3 месяца РЛА не наблюдалась вообще, что, по-видимому связано с десорбцией белка с поверхности частиц полимерш суспензий.

1 < Высказанное ' предположение было подтверждено опытам: вклшчапцими в себя обработку диагностикумов лаурилсульфат* натрия (ЛСН) и пятикратную отмывку тестов от ЛСН десорбированного бежа. После каждой отмывки методом Кума'с' определяли количество 1§а в промывных водах и чувствительное тест-систем по отношению к Ав Было продемонстрировано, ч

чувствительность тестов по отношению к Ав з:^ снижается по ме уменьшения количества иммобилизованного на поверхнос

частиц.

После полной очистки тест-систем от лаурилсульфата натрия ^десорбированного белка было показано, что имеет место практичес полная десорбция адсорбированного белка с поверхности части Десорбция же физически сорбированного белка с поверхнос микросфер, содержащей ковалентно иммобилизованный практически не сказывается на специфичности и чувствительное диагностикумов (рис.2 и 3).

Предложенный способ ковалентного связывания 1§а поверхностью частиц, модифицированной альбумином путем е физической адсорбции на микросферы, не дает возможности созде диагностику« с необходимой чувствительностью для выявлен

белков, находящихся в сыворотке крови человека в концентрации ниже 0,1 мг/мл. Поэтому, двнная система может быть применима в условиях, когда целью диагностики является лишь обнаружение того или иного белка в организме человека, который присутствует в крови в высоких концентрациях.

11.1.2 Модельная система на основе полимерных частиц полистиролметакриловой суспензии

Полистиролметакриловые суспензии получали при разном

содержании МАК в эмульсии мономеров (2 и 0,2 % масс в расчете на

стирол). $

Полимерныв суспензии характеризовались разной устойчивостью

при хранении: полученные при высокой концентрации МАК в эмульсии

были устойчивы всего 1,5 месяца, то есть оказались непригодными

для иммунохимических исследований. Устойчивость

полистиролметакриловой суспензии, полученной при содержании МАК в

исходной эмульсии, равном 0,2% масс в расчете на стирол,

сохранялась при ее хранении в течение полугода.

Для нахождения условий ковалентного связывания человека

с реанционноспосоОными группами на поверхности микросфер, было

подобрано оптимальное соотношение концентраций кар^одиимида и

обеспечивающее максимальную чувствительность и специфичность

теста. Было показано, что концентрация карбодиимида,

обеспечивющая необходимое количество реакционноспособных груш,

равна I мг/мл.

При выборе концентрации в исходном растворе, необходимой для обеспечения максимальной чувствительности тестов, было выявлено, что она равна I мг/мл. Было показано, что при концентрации КДИ, равной I мг/мл, с рвакционноспособными группами на поверхности частиц суспензии может ковалентно связаться и 5

мг/мл 1бО. Но увеличение концентрации бежа приводит к снижению чувствительности теста, что скорее всего вызвано слишком большой плотностью посадки молекул бежа на поверхности полимерного носителя. Следовательно, при иммобилизации З^ человека в количестве, равном I мг/мл, на поверхности микросфвр суспензии остаются незанятые молекулами бежв реакционноспособные группы, которые необходимо блокировать. Для втого применяли плацентарный альбууин человека. Было показано, что необходимая концентрация альбумина равна I мг/мл суспензии.

Даннные, приведенные на рис. 2 и 3, убедительно показывают, что диагностическая эффективность теста, полученного на основе частиц, содержащих на поверхности ковалентно иммобилизованный белок, значительно выше эффективности теста на основе микросфер с физически адсорбированным Хцр на их поверхности.

Таким образом показано, что для' иммунохимичвских

исследований целесообразно использовать частицы

.полистиролметакриловой суспензии, полученные при низкой

концентрации МАК в эмульсии, на основе которых возможно получить

диагностикум, обладающий высокой чувствительностью, 100%-ой

специфичностью, необходимым временем хранения.

11.1.3 Модельная система на основе полистирольной суспензии, синтезированной в присутствии ЦЦО в качестве ПАВ

ЦЦО является гидрофобным соединением, карбоксильные группы которого располагаются монослоем на поверхности микросфер. Такая полимернвя суспензия, будучи высокостабильной во времени, является идеальным вариантом полимерного . носителя с карбоксильными группами на поверхности частиц. Однако из-зе высокой стоимости ПАВ полимерные носители такого типа возможнс использовать пока только в лабораторных условиях в небольппс

количествах. Поэтому в работе была показана лишь принципиальная возможность создания тест-систем на основе данного полимерного носителя в условиях ковалентной иммобилизации человека на поверхность полимерных частиц.

Следует заметить, что чувствительность тестов, представленная на рис. 2, не уступает, а даже несколько превышает чувствительность тест-систем, полученных на основе частиц полистиролметакриловой суспензии.'

п.1.4 Модельная системе на основе частиц полистирольной суспензии,синтезированной в присутствии декстрана в качестве стабилизатора.

При использовании в качестве полимерных носителей частиц полистирольной суспензии, содержащих на поверхности молекулы декстрана, необходимо было предварительно проводить- окисление гликозидных груш молекул декстрана периодатом натрия для получения реакционноспособных альдегидных груш, непосредственно связывающихся с белком.

Получить диагностикум на основе данных частиц, содержащих на поверхности физически адсорбированный человека, не удалось. Концентрацию белка изменяли в широком диапозоне значений (от 0,01 до 50 мг/мл) и во всех случаях наблюдалась аггрегация микросфер.

Для нахождения условий ковалентного связывания 1{*о человека с . полученными после периодатного окисления альдегидными грушами на поверхности полимерных частиц было подобрано оптимальное соотношение концентраций окислителя и белка.

Было показано, что для получения необходимого количества альдегидных груш, концентрация окислителя составляет 2,1 мг/мл (0,01 М раствор гша^), а оптимальное время реакции окисления -30 минут.

!Г

Чувствительноеть тес-т-систем, уд выраженная в порядковом но— д маре разведения антисывороткп $

7 6 5 к ъ 2 1

--------МК---

Декстра

ДГК

Рис.2 Чувствительность тест-систем по отношению к А5 получ< на основа полимерных частиц, содержащих на поверхности ко] лентно иммобилизованный нативный. человека.

Чувствительность I тест-систем, ¿0 выраженная в порядковом но-мерэ разведения 0 антисыворопш о

Деке тр!

Рис-3 Чувствительность тест-систем по отношению к Ав , полу1 на основа полимерных частиц, содержащих на поверхности йи ки адсорбированный нативный. человека.

п

- чувствительность тест-систем до обработки их лаурилсульфатом натрия

- чувствительность тест-систем после обработки их лаурилсульфатом натрия

Максимальная же чувствительность тест-системы достигается при концентрации белка, равной I мг/мл. Показано, что, выбирая концентрацию не выше I мг/мл, при получении тест-системы целесообразно оставлять на поверхности частиц полимерного носителя свободные реакционноспособные альдегидные . ■ группы, которые затем необходимо блокировать. В работе был использован метод блокировки альдегидных групп 0,05 М водным раствором глицина, который обеспечивает полную блокировку адьдегидных групп, не влияя на чувствительность и специфичность даагностикума. V

Полученная тест-система оказалась неустойчивой во времени, что, возможно, обусловлено нестабильностью при низких значениях рН основания ШиЗфа, которое образуется в результате взаимодействия первичной аминной и альдегидной групп и содержит фрагмент >о=и-. Для его восстановления использовали боргидрид натрия. Результаты исследования показали, что необходимая концентрация боргидрида натрия—I мг/мл, а время реакции восстановления - 2 часа.

Параметра, характеризующие диагностическую эффективность теста, показали, что и на основе частиц полистирольной суспензии, стабилизированных декстраном, можно в модельных условиях получить высокочувствительную и специфичную тест-систему, обладапцую необходимым временем хранения.

Из данных рисунка 2 видно, что тесты, полученные на основе частиц суспензий различной полимерной природы, отличаются по максимальной чувствительности по отношению к Ав 1еО, что монет быть связано не только с природой полимерных носителей, на основе которых готовилась модельная тест-система, но и о различной

ориентацией в пространства белковых, молекул, иммобилизованных на полимерных носителях.

Опираясь на литературные данные было сделано предположение о том, что ориентацию в пространстве ' молекул белка, иммобилизованных на поверхность полимерных частиц,возможно изменить, создав на поверхности частиц спейсор.

В качестве спейсоров в работе были использованы е-аминокапроновая кислота (е-вкк) и гексаметилендиамин (ГМДА), в качестве полимерного носителя - частицы полистиролметакриловой суспензии.

Было показано, что введение молекулярных спейсоров на поверхность полимерного носителя не изменяет чувствительность теста по сравнению с наблюдаемой в тест-системах, полученных на основе тех же частиц, но не содержащих спейсорных молекул на поверхности.

Таким образом, есть все основания утверждать, что ориентация в пространстве белковых молекул не влияет на диагностическую эффективность тестов и, следовательно, не ■ является причиной различной чувствительности тестов, созданных на основе исследуемых полимерных суспензий различной природа. В первую очередь диагностическая еффективность тест-систем, под "чтг которой подразумевается иммунохимическая активность иммобилизованного белка, зависит от природы полимерного носителя и функциональных груш на его поверхности.

<■•-■•■• Из данных рисунка 2 видно, что наибольшей максимально« чувствительностью по отношению к Ав 1§а обладает тест, получении* на основе частиц палистирольнай суспензии, стабилизировать декстраном. Данные таблицы 2 показывают, что этому типу части!

полимерного носителя соответствует минимальный поверхностный заряд. Наименьшая же чувствительность соответствует тесту, созданному на основе частиц полистирольной суспензии, синтезированной в присутствии ДГК и персульфата калия в качестве иницивтора, поверхностный заряд которых максимален. Можно предположить, что поверхность с низким зарядом меньше . деформирует иммобилизованную молекулу белка, сохраняя большее количество натигных антигенных детерминант для связывания с антителами тестируемой антисыворотки 1§о при постановки РЛА.

На диагностическую эффективность тест-систем существенное влияние оказывает не только природа полимерного носителя, но и плотность посадки белковых молекул на полимерной поверхности, которая в свою очередь определяется числом реакционноспособных групп, способных связываться с белком.

В работе было определено количество белка, реально связывающееся с поверхностью частиц всех исследуемых суспензий, имеющих различный диаметр. Для этого методом Кумасси была оценена суммарная концентрация в промывных водах диагностикумов и рассчитано количество белка, связавшегося с полимерной поверхностью, в процентах от его количества в исходном растворе. Для частиц полистирольной суспензии, стабилизированной декстраном, это количество составило 85% (0,85 мг/мл), для частиц полистирольной суспензии, стабилизированной ДТК - 79% (0,79 мг/мл), для частиц полистиролметакриловой суспензии - 74% (0,74 мг/мл). Чем меньше диаметр частиц полимерной суспензии, тем большее количество белка иммобилизуется на их поверхность.

Используя полученные значения количества белка, реально связывающегося о поверхностью полимерных частиц, была рассчитана

величина площади полимерной поверхности в единице объема полимерной суспензии, приходящаяся на I иммобилизованную молекулу igO человека. Оказалось, что она обратно пропорциональна диаметру частиц полимерных носителей и для всех полимерных суспензий составляет приблизительно 10-20 недеформированных молекул igG человека.

Таким образом, максимальная диагностическая эффективность всех полученных тест-систем наблюдается в условиях, обеспечивающих неполное покрытие белком поверхности частиц. Можно думать, что только в этом случае обеспечивается максимальное сохранение структуры иммобилизованной молекулы иммуноглобулина G человека.

Анализ полученного экспериментального материала позволяет сделать вывод о том, что иммунохимическая активность иммобилизованного белка (а, следовательно, диагностическая эффективность тест-систем), главным образом, зависящая от природы полимера и функциональных групп на поверхности полимерного носителя, достигает высоких значений при связывании белковой молекулы с полимерной поверхностью в условиях, позволяющих минимально деформировать иммобилизованную молекулу белка, тем самым максимально сохраняя ее структуру.

III.2 Создание тест-систем для определения ревматоидного фактора ' и антител к тиреоглобулину в сыворотке крови человека.

На основе результатов проведенных исследований была предпринята попытка создать антигеннные тесты для диагностики ревматоидных заболеваний и заболеваний щитовидной железы. ' ' Иммуноглобулин о человека в данном случае выступал в качестве антигена, иммобилизуемого на поверхность микросфер

полимерной суспензии. ••.„ v

Для создания диагностических препаратов были взятн^ частицы ' полистиролмэтакриловой суспензии с диаметром 0,7 мкм,.устойчивые-, при многократной модификации поверхности частиц . и . i характеризущиеся небольшой величиной поверхностного , заряда'

микросфер.- .. ¡«й-аий» i!;

Из литературных данных известно, что для .;выявления

Г* > 1. ( > ¡У

RP-фактора используется унифицированный метод ,,определения '.'-■§..

■ * ' ч;-

реакция гемагглптинации (реакция Wallery-Rose). V

Было сделано предположение о том, что прогревание1при 56*С в ^ течение 30 минут вызывает изменения Jo-фрагмента ,человека,;^ приводя к частичной денатурации его молекул. . ..

На поверхность частиц полистиролметакриловой.суспензии, были'.';.: иммобилизованы молекулы igo .человека, которыепредварительно модифицировали прогреванием. •

Иммобилизацию igG осуществляли по методике ранее'; разработанной на модельной системе. Параметры диагностической ,' эффективности полученной тест-системы указывают, на ; то, что-'; тест-системы обладают высокой чувствительностью по . отношению к сывороткам крови больных пациентов, высоко чувствительны по' отношению к As igG, обладают 100%-ой специфичностью,относительно . сывороток крови здоровых доноров и необходимым временем.хранения.'

Нв основании данных клинического испытания ■ КР-теста, рвботащего по принципу PJIÁ, проведенного нв 100 сыворотках крови V пациентов с ревматоидными заболеваниями и на 100 сыворотках крови здоровых доноров, был оделан вывод о его пригодности для диагностики ревматоидных заболеваний.

TgO-тест предназначен для определения антител к TgO в •

сыворотке крови пациентов, что представляет важный иммунологический критерий при диагностике заболеваний щитовидной железы.

Проведенное исследование показало, что наибольшая чувствительность теста по отношению к Ав Т^ достигается при концентрации КДИ, равной I мг/мл, концентрации равной 0,1 мг/мл. Для блокировки нелроревгировавших с белком реакционноспособных групп использовали- плацентарный альбумин человека, его концентрация составляет 5 мг/мл. ' '. " 'На основании . результатов клинического испытания '''" ' разработанной тирео-тест-системы, проведенного на 100 сыворотках .крови пациентов о заболеваниями щитовидной железы и на 100 сыворотках крови здоровых доноров, был сделан вывод о его пригодности для тестирования заболеваний щитовидной железы.

"'"" III.з"'" Создание антительных тест-систем' •.!■••:• •!• ■".•:,( ' .' ; 0 домощу® антительных твст-систем возможно обнаруживать ■" 1 антигены,' появляющиеся в жидкой среде организма при инфекционных л г тг-к«^ггн~ опухолэвых заболеваниях, воспвлении. Анализ литературных данных '••? 'показал, что в настоящее время антительные • диагностикумы, '•'"''"Т!'г'работащи9 по принципу РЛА,- еще нэ нвшли широкого применения в

"' ■"■••медицинской практике. 1 г " '

,-т л- •>> поскольку антитела - это бвлки, относящиеся к одному из пяти :-г"кла'ссов • иммуноглобулинов , то при разработке условий создания лг -р! антительных тест-систем были использованы полученные результвть к-д ' "по' изучению условий ковалентного связывания • человека с поверхностью полимерных частиц. ^ ' Выбор условий ковалентного связывания антител с поверхность!

полимерных частиц проводили, используя частицы полистиролметакри-

ловой суспензии и антитела к альфа-фетопротеину (АФП).

III.3.1 Тесты для определения альфа-фвтопратеина, альфа-микроглобулина фертильности ' и трофобластического р-глобулина в сыворотке крови пациентов

Белок АФП появляется в сыворотке крови больных ' первичным. раком печени.

Ат к АФП ковалентно иммобилизовали на поверхность частиц полистиролметакриловой суспензии в условиях, выбранных для

ковалентного связывания с частицами, содержащими

*

карбоксильные группы на поверхности. Оказалось, что диагностическая эффективность антительного теста, приготовленного в этих условиях, раЕна нулю.

Молекула антигена имеет 20-30 мест для связывания с антителами. При связывании антигена с полимерной поверхностью в условиях, деформирующих в какой-то степени молекулу антигена, потеря нескольких центров связывания с антителами не оказывает влияния на работу диагностического препарата. Молекула же антитела имеет всего лишь два антиген-связывающих центра. Следовательно, при связывании антител с полимерной суспензией частиц необходимо создать такие условия связывания белка с полимерной поверхностью, которые практически не деформируют иммобилизованную молекулу антитела и обеспечивают доступность для взаимодействия с антигеном.

Было высказано предположение о том, что этого можно достичь уменьшением концентрации антител в исходном растворе на порядок ниже концентрации используемого в качестве антигена. А также заменой глицина на моноэтаноламин и плацентарного альбумина человека, блокирующего незвнятне белком реакционноспособные

группы на поверхности частиц полимерного носителя, н полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой, равной 20000.

Полученный с учетом этих изменений антительный тест обладав высокой чувствительностью по отношению к препарату АФП, 100%-о специфичностью по отношению к сывороткам крови здоровых доноров необходимым временем хранения.

Была поставлена задача создать антительные диагностикумы последующей их апробацией не только на экспериментальном, но и н V клиническом материале на основе хотя бы еще двух кроличь

поликлональных антител.

Для работы были выбраны антитела к альфа-микроглобулин фертильности (АМГФ) и антитела к трофобластическом р-глобулину (ТБГ).

Одним из предназначений данных антительных тестов являете .;. ¡диагностика ранней стадии беременности. . .,..,;,.. Полученные антительные тест-системы на основе Ат к АМГФ и к „, к... ТБГ обладают высокой диагностической эффективность» ; ; .. . На основании данных клинических испытаний тестов, работают г,. :..-,.;|(.пр принципу РЛА, проведенных на 100 образцах крови беремвнш .-■ женщин, был сделан вывод об их пригодности для диагностики ранне •.стадии беременности и. о возможности разработки промышленно] ...варианта создания антительной тест-системы..

Найденные в данной работе условия ковалентно! .., • иммобилизации антител на поверхность частиц полимерных суспензм позволяющие максимально сохранять структуру молекулы антитела, ; реализованные в трех диагностических препаратах, по-видимом; . приемлимы для создания высокочувствительных и специфичн . антительных диагностикумов на основе любых кроличь:

поликлональных антител.

вывода

1. Синтезированы функциональные полимерные суспензии' с узким распределением частиц по размерам, диаметром в интервале от 0,30 до 0,70 мкм различной полимерной природы, пригодные для иммунохимических исследований.

2. Установлено, что природа полимера и функциональных групп на поверхности частиц являются определяющими факторами при создании высокоэффективных диагностических препаратов.

3. Показано, что высокая иммунохимическая 'активность иммобилизуемого белка, а, следовательно, высокая диагностическая эффективность тест-систем, достигается при связывании балка с полимерной поверхностью в условиях, позволяющих минимально' деформировать иммобилизованную молекулу белка, тем самым максимально сохраняя ее структуру.

4. Разработаны методики создания антигенных тест-систем, работающих на основа реакции латексной агглютинации,

использующиеся для обнаружения в сыворотке крови человека

: 1

КР-фактора и антител к тиреоглобулину.

5 Разработаны методики создания антительных ' тест-систем, работающих на основе реакции латексной агглютинации, использующиеся для обнаружения в сыворотке крови человека альфэ-фетопротвина, альфа-микроглобулина фертильности и трофобластического р-глобулина.

6. Созданные диагностические препараты прошли апробации на клиническом материале. На основании клинических испытаний, показавших высокую диагностическую эффективность тест-систем, был сделан вывод о пригодности тестов для диагностики ревматоидных

заболеваний, заболеваний щитовидной железы, ранней стадии беременности и о возможности разработки промышленного варианта создания тест-систем.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

Г.Басырева Л.Ю., Чирикова О.В., Бакаева И.В., Повалий Т.М. Получение латексных агглютинационннх систем в условиях физической адсорбции и ковалентной иммобилизации антигенов на полимерные микросферы.// YIII Всесоюзная научно-техническая конференция "Синтетические латексы, их применение и модифицирование": Тезисы./Воронеж,- 1991.-е.94.

2.Бакаева И.В., Грицкова И.А., Басырева Л.Ю., Повалий Т.М. Синтез полистирольных латексов в присутствии углеводов в качестве ПАВ.// VIII Всесоюзная научно-техническая конференция "Синтетические латексы, их применение и модифицирование": Тезисы./Воронеж.- I99I.-c.II5.

3.Басырева Л.Ю., Повалий Т.М., Грицкова И.А., Гусев С.А., Гжива Э. Латексные агглютинационные тест-системы для определения ревматоидного фактора и антител к тиреоглобулину в сыворотке

крови.// IX Всесоюзный научный симпозиум "Синтетические полимеры

• ........

медицинского назначения": Тезисы./Звенигород.-1991.-е.101.

4.Басырева Л.Ю., Бакаева И.В., Шуманский В.М., Повалий Т.М., Телешов Э.Н. Иммобилизация иммуноглобулина G на полимерных

• микросферах с различными функциональными грушами на поверхности.// IX Всесоюзный научный симпозиум "Синтетические полимеры медицинского назначения": Тезисы./Звенигород.-1991.-е.137.