Полимерные микросферы для реакции латекс-агглютивации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

московский ордена трудового красного гйамш институт тонкой хишчешой техко.тоши имени м.в.лошшсова

Специализированный Сове; Д 063.41.05

На лраьах рукописи

' ДОВОХОа^МЕМ'.А^ШКСАВДРОВНА ; ' . УДК 676.061.05:515.4

П(ЙИМЗРШй- жкросоеры для ршши.

Специальность 02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений

авгоризерат дассэртавдл на-соискание ученой степеяа кандидата хшнчоских наук

(I

Москва 1991

Работа вшголнела а Мооковоксм ордайа ^удоворо Красного Знамаки' пнот.чтчтз тонкой химической технологии ш. Ы.В.Яомонооова я а да-учно-лсоздогательоком звстит^те ^йзйко-хймйчеокоа медицины .

1.53 КЗФСР.

Научные руководителя: доктор хй5щческцх,ьаук, цро$еосор '

ь.Л.Гркцкоза .>.* ' V - \/

■ . доктор медицинских наук

, . С .А.Гусев "• ' ■ -V.'..•■•'

Официальные ошовеняы: доктор хккячасхих наук, профеооср .,

В.Н.ИзмеДдова : ' • - кандидат химических наук, доцонт

»•¡.Д.Ходкаева >'-;'■

Ведущая органязаце*: Нзучно-Есоледоьатедьокяй фазйко-хгалдчзский лнеадтут им. Я.Я.Кардога .

Защита состоится

1МОК% 1991 года в часов в аудито-

рии Б'ЭВяа заседании Специализированного СоЕЦта Д 063.41.05 при МИТХТ им. 1/..В.Ломоносова по'адресу::Ц9831, ГСП, Москва, Г-435, «.Пироговская ул. д. I.

Отзывы направлять да адресу: 117571, Москва , др. Вернадского, Д. 05.

С диссертацией можно ознакомиться 2 библиотеке МИТХТ им. В.Ломоносова. Азторефрат разослан П2Н" 1891 г.

УченьгД секретарь . ■ ' .

Специализированного Совета /) ' • I

д С63Л1.05, Д.х.и., дроф. ^ДрО.у _-И,.Гркцксва

"- '■". огцля ла15д:с:^'ЬСтккА рабс'й

' ■ /.цтуальность'- работц оцредсдена необходимостью зогдааия отечества ниос даагкоотячеокях тест-систем щ осноае полдморних ыккро-с Т-аз. ■ " ' . •' .

.'•.Пета работы состояла в созданач ослшлеиьых суспьяз!:.; и иоу-Чййзп их йязпко-ха'дячсоких овоЗсте, обеоцочяьагумт высокую' длаг-всстйческуд здооктагность хест-еястем ю основе реакщл латеко-пг-глвмнацаи/

Научная ;та^,:ша рпйотк:

- ныяплож веибояев судустсинкдо перяме'фн; опросе ляк'дкс пик-годиооть 'я.ол!С1врй!К 'НкросГ/>Р ллп ссадавшх дчтсглнн:: длагг.с^тт.;/-

глоп;

- установлена неоднородное п. стр^итуоц тдкст^рольшл'. и иохж-рилеиаопкх (/лг.росу.ер, ойуоловлэнда» эообоняост;г..я протеин.". •": лояя-уср-зна г родвсЛ сро;:с ;

- гс:г.::2КЛ дредмущес-п,: аадюзыздвт! в оепимгс дзт.ка-аг-гягдодлстдроягвыгт^госс ер, с?:^и,.::з!:рог;знлых рчстБорч-шм в углегодорсцно.! Гязе Ш.Н-дс-я--тод!>д~о-гл^1аги;о::с;'7«ЯЕлп'4г.бг.-нолсм (дТл);

- уотазоял-аш заяпслмостн количества альбумина, удсообировач--нох'о да полгс л:ролыУх чссткслх, ог ковдоятрадва бох.-а и поход-ног.: растворе при »шздяэдсс з!к«че>аппх рН среди;

- определены г:»«енв& ковдовтрад*:Л вдьСушво, й.:.:уаоглобул«!-на & ■••злозока а рН среди, йвсбхочшд-'в для достягавш ьакошальвсЛ яуЕст2!:тольнсота латскс-тестс^;-

- язучона конкурентная адсорбция белков сивортгп: ; человека л показано, что напГюльи;;;.! сродством к л-Едмтлрольнол пС-рзрхнсотп обладают # -лшгопротеидн.

Практическая ценность работы. На сонате полиотиродьшхсус-аеязиЯ созданы антятельяне латекс-тесты для ядентафикациа'дифте-pjtîiiHcro и отсдйвячно.о аиатоксгиа,- оакхеркк рода оалмонелл, 'которые лрошли испытания в лаборатории иммунопатологии -'НИИ. ФХМ о яо-ликатечьнш результатом. "-'. ' ' " ..'••-'■. л : ' ■г.. v ■ '".

Автор заткнет .. ; - '

- " груктуру иодшерных оусайьзий, доиучэйннх D различных условиях , диаметр частиц и распределение чаотиц до размерам для >, проведения реакщШ лзтекс-агглютадащш;.. ; . ; •"/''.-.'■[

- уоловия проведения адоорбдаи' белков - альбумина и клмуно-' глобулина 6 человека m полимерных микроойерах для .обеспечения сит.ададьного претензии« реакция латекс-агтлвтинаад. я шеокоа бе . чувствительности; ' , . •"''.■'''.

- последовательность связывания белков сыворотки крови с,до-верхпоотью солистьрольшх частпц; ■ •. .*-: ;

- антятзльше- латекс-тесты на основе, полимерных оусяенздй ' для идентификации дифтеритного и отолбнячного анатоксина. :

Апробация работа

Основные результаты работы быяд дологаны и обсукденына-1 Всесоюзной конференция "Радикальная полимеризация";. Горький, 1969 г.; на У1 Всесоюзной конференции молодых ученых а специалистов до фи-' зичеоко.3 химии "Физическая хяшя-УО", Москва,. 1990 г...

Публикации. По р^.даьтатам диссертационно.) работы, опубликовано 4 работы.

Структура и объем диссертации, диссертация изложена на IOS отраницах машинописного текста и состоит из. следуюиих разделов: »'ведение, литературный обзор, иоходиые ве-дества и кетодц исследования, результаты л ах обсуждение, выводы, включает Ï3 таблиц, Ï8 рисунков . Библиография содержит 129 наименований.

Исходные вещества. Стдрол я ахрслеяя мяркя "ч" очящалк от стабилизатора по известной методике. Сывороточный альбумин человека очищали методом' гэл^-хрематографаи на нооятеле Sepharose CI-6B. Ишуноглобуляя 9 человека и моноспецифячёские сыворотки против альбумина и иммуноглобулина в чело- зка применяли баз дополнительной очяоткя.. Дягитоняя, поливиниловый опарт, оксаэтиля-рованнне цетяловый ояярт и лоляпролялеяглякодь, элкилсул>фонет йатр.чя, дя-й-толял-о-каобалкоксиФеиялкарбинол, дягидромсофат натрия, гадрофоофат натрия , ацетон я другие реагенты марки "хч" и "ч" использовали бег дополнительной очистки. Дисперсионная среда -года диотилл'бт.

Методы исследования. Конверсию мой ом бра оценивала методом гравиметрия. Размеры частиц полимерных дисперсий определяли методом сканирующей .электронной t.-д крое копии на прибора " s_57ü" ("Kitaolli, Япония). Структуру частиц полимер ни; суспензий яссле-' девали методом ;;окного тртленяя на установке хЕ'-З ( ^iko Er^tne-eriiic, Лиояяя). Количество белка, адсорбированного на по лис тиро Овцах чротидах, олределли; г.о .методу , основанному нт иг;.:ирекйл убыли кок4ентраг;ш белка лз раствора в результате адсорбция. Концентрацию растнсров ЧСа определяли на спектрофотометре uv - vis " Seeoord Ы 40" (ГДР) при длине волны 279 шл. Реакцию латекс-агглютинация ваблвдаля зязуальчым ояисобом на стЬклгнпоЛ или поя;!-

т

стпрольной пластинке черного цяета.

РЬЗУХЬТАТЫ ;; ОБСВДЕЖ1

I. Последов анае свойств оусяеизяЯ различно;; нош.-еояой природ;

'из литера турш:: доныне "зиестао, что для приготовления летекс-усотол обк»яо ясшльэугт чгствда ;'.олш.;ерно;1 суспензии с диаг.яиро.'*, г.еиао I ■*!•■'.{.

' G

Препараты ьа основе таких суспензия выпускают гаогие зарубе ясные фирмы, однако, отечественного производства полимерных суспензий подобного типа нот г. в настоящее время реакция латеко-аггдо-тинации обычно доводят с попользованном зарубежных дяагностикумов. ■Это делает потребность в создании отечественных диагностических ■ тест-систем на основе подимершх ыикросфер чрезвычайно актуальней-.

В нас- ящеЯ работе сделана попытка, используя модельные.системы антигенного и сн тигельного диагноооикумоа, отработать оптимальные условия г*риготовления тест-систем .на ооново полимерных суспензий и постановки реакции латекс-агглютинации для выявления ьсзможнссти пооледушеН. апробации этого метода на экспериментальном к клиническом материале с точки зрения оценки его диагноста-, ческой эффективности. . .

Создание лзтекишх тест-систем для диагностики различных за-солеьашп",, работающие,по методу. латекс-агглютинация, включает в себя нисколько этапов:.

[-Й этап состоит s EMiîopa природа полимера суспензии , диаметра частиц, распределения частиц до диаметрам;.

2-й этап - ь Еыборе полимерных суспензий, устойчивых в растворах солей низкой концентрации и при хранении;

3—il этап - исследование адоорбции белка на поверхности частиц полимерной суспензии с целью нахождения условия проведения адсорбции и выбора концентрации белка, необходимой дат обеспечения оптимального протекания реакции ла токе-агглютинации и высокой ее чувствительности.

доследования были начаты с оинтеэа и предварительного мслыта-нкя двух типов по>;«ершх суспенкиа, полкогчрсльноЛ а цолиакрод&н-iiCBoli, с разным размером частиц. ^ыбор;природы подшгра оаре'дйлял-

; ' ' " 7

оя целесообразности) испытания частиц, способных физически сорбировать белок (полистирольные) и ковале ни о его связывать (по-ляакролеиноввд).

йолкстиролыше суспензии получали методами эмульсионной и суо-пснзг.онноа полимеризации. Эмульсионную по.-имеризацвю проводили в присутствии ионогенных (алкилоульфонат натрия, Е-30) и веночных (оксиэтяллронанныз цетилсвый спирт я полипропиле нгляколь, дягито--нян) элульгатороз, а также в отсутствие эмульгатора. Условия проведения .полимеризации (концентрации инициатора и эмульгатора, температура) выбирали "''акш.; образоч, чтобы полученный латоко содержал частицы о узки».! распределением по размерам. Выбор объемного соотношения мономер/водная ?аза, концентрации инициатора и ПЛИ определялись условиям получения стабильных в процесс« синтеза суспензий.

Суспензионную полимеризацию стирола проводила в присутствии стабилизаторов - поливинилового спирта и ди-п-толдл-о-карбалког;-си^еяллгдрбйиола (Д"К). В зтом случае такге выбирали условия проведения аолйлеризацы!. обеспечивающие получение суспензии с ускшл распределением инфосфер по размерам.

Полиш'.ролеиновиз суспензии с узиич распределением частиц по

у}

размером получали методом анионной осадительной полимеризации ' п б присутствии полимерного стабилизатора-сополшдеоа виимацеиа-та, Ехрилово/! кчелоты и игпилвикилэтшшлгидролероксид* (иАГ).

Все синтезированные полимерные суспензии очищали от примесей -незаполииоризовашегося мономера, остатков инициатора и эмульга-

;;) Эти исследования выполнены совместно с оотрудняком кй«1». СЦ ¿ДТП' ь:и !1.3Ломоносова, м.н.з. Е.Бэхаревым.

тора путем ультрафильтрации .'< - ' ' ■ . .'

Известно, что полякерные частицы-нссятел^ биологлчеоких Молекул, долуш отвечать комплексу требоеаниЛ/.а именно:.,-': ••■'

- размер полимерных инфосфер менее Г шел .-(для 'слайдовых:. • аггяютянацяолных тестов); . ' ^ " . \ .'. ч ■"•;".

- узкое распределение частиц по размерам; • •.

- огр"'-атявиая.уогойчавсоть частиц в'0,1-0,;15 М ссдевнх раот-• ; ворах;-- ' - • " :- " :,'Ч< - ... -■-:;'•'".' V-; ':■

- устойчивость полимерных кйкрос(1к.>пк; процедуре очистки'мето-:., дом центрифугировано я иди удьтрафьчьтрацаа;• -. / • ... С" . \

- устойчивос ть чаотш; при . Хранении;—.-' ■ ; '-'- ■ :■'

- обеспечение необратимой иммобилизации- белков\с шксшаль-'' ., кым сохранением лх активности. ■'.'. .у., . . . ''; '.'';-..'

Размеры пояг,отйро;:ькых гшросфои,...полученных, методами экуль-у с ионной и суспензионной пояимери.защи', изменялись в' «проком диапазоне значений от 0,12 до 0,9 ш<м.\4аатйцы полимерных оуопевзяЯ • с диаметрами менее 0,2 мкм.в согдашг латекс-тестов не применяли из-за сдошюсти их очистки. . V , ,'■ ",.-

Частицы до диакроле «новых суспензий имели диаметры 0,2; 0,6; 0,7 и 1,5 мкм. . • '' ■•-•.. 1 '

Дня слайдовых тестов рекомендуется использование частиц о диаметрами, не превышающими 0,8-и,Э мкм, так как крупные частицы быстро седягдаитируют на олаЛдолоЛ пластанко, затрудняя учет результатов реакции латекс-агглютинации, поэтому испытывали частицы с диаметрами 0,2; 0,6 и 0.7 мкм.

Тан как реакция антиген-антитело, которая является основой рйаьадн латекс-агглютинации, протекает только в присутствии селей, тс прежде всего необходимо было изучить агрзгативную усто*5чк-еость суспензи:1. в солевых растворах.

В результате проведенных доследований оказалось, что шллстн-родькке частиш, пэлучовР!» в присутствий эмульгаторов - 2-3U, ÍI-2C, ДГТ, в отсутствие эмульгатора и з ^рисутстнни стабилизатора - ЛЕС, а тагасе лолиакролеяновые частицы обладают недостаточной агрзгативной устойчивостью'в электролитах (0,01 .'.'-и,05 Ы) для использования'их в кшуиохямячеоках исследованиях, где применяются буферные растяоры с концентрацией, ü,I-ü, 15 М. Цолиоткроль-яые buücpooíepu, стабилизированные ДТК, были устойчивы в солевых растворах (U, 15-0,2 U). Уото.тюст]. полимерных суспензий, как указывалось выше, должка сохраняться и при хранений в течение не менее 3-х месяцев.

Стабильность полимерных мчкросфер определяется многими >гакто-рами, в первую очередь, реологическими свойствавд межфазных адсорбционных слоев, ПАВ, ь которые существенный вкяад вносит природа полимера, из которого состоит частица. Англиз данных по устойчивости частиц полимерных суспензий в процессе хранена! показал, что их стабильность ьо временя не одинакова, ¿ели поляотирольнке суспензии сохраняют своя свойства в течение '¿-г. месяцев,, то по-ляакролеиаоЕыг теряют их. через 2 суток.

Было высказано предпоаокбназ» что отлячие овоЛстп полимерных оуопензяй определяется ррзшга $оловяяйя их формирования. Ведя частяпу далястярольноГ) оуспзязяя, образумяяеея-яря суспензконнсл я эмульсионной полимеризация стирола, формируются из капель мономера разного размера, то частицы поляакролеиновой суспензии ,..ор-мяруются яз ассоциатоз яля клубков олягомеров акролеина, выпавших в водную ■.--азу, в результате протекания полимеризации. Потеря уото^чивостя таких частиц может быть вызвана постепенным растворением в воде олягомеров акролеина* из которых "построены" частицы.

Высказанную гипотезу подтверждали результатам анализа отрук-

; :

туры чаотщ методом травления образцов ионизированным воздухом. Били исследованы дол- ¡шрольные част гад, полученные методами эмульсионной и суспензионной полимеризация стирола, якяцйированяоЛ персульфатом кадия, в присутствии поверхностно-активных веществ различной фяроды: неионнкх - дигитонина, диаметр частиц 0,12 ыкм; оксиэтилированного подишоаи?;ьнглаколя, шшронкка, F-C8, диаметр час тип ',25 мкм; ди-п-толил-о-карбалкоксифенилкарбйкояа, ДТК, диаметр частиц 0,5 и 0,9 мкм; я ионогеиного - аЛкилоульфоната нат-ргн, 3-30, диаметр чаотиц 0,5 и 0,Х5 мыл,, а такхе полистирольные частицы, синтезированные в отсутствие ЕАВ, диаметр которых Сил равен 0,5 мкм. Били исследованы и долиакролеановые ¿астицц с диаметрами 0,2; 0,6; 0,7 и 1,5 мкм, полученные анионной полимеризацией акролеина, как в отсутствие стабилизатора, так и в присутствии полимерного стабилизатора - сополимера хшнялацетата, акриловой кислоты к метилвинилзишилгадроперокгсида (ЗАГ).

После ионного травления образш напыляли золотом и поверхность полимерных часадц изучали о помощью электронного микроскопа s-570 (" Hitaohi ", Япония).

Анализ результатов электронномнкроокопического исследования показал, что в качеотЕенном отношении травление всех чаотиц про- • исходит одинаково. Вое иссшдоьаннке поликерные микросферы неоднородны и состоят вн;, ри из набора субьединиц, которые проявляются после разрушения внешней оболочки частиц в течение первых икнут ионного травления. U увеличением времени травления наблюдается возникновение значительных пустот н пошшенди рихлэоти упаковки субьод.чниц, которое завершается потере*! сферическое Гори: чаотиц. Сль:;ует, однако, отымать, что полпакредоиковче части«:

имеют болов рыхлую структуру и поэтому разрушаются за боле о короткое время ионизирующего излучения.

. Дополнительные эксперименты (разрушение частиц механически и самопроизвольное разрушение полиакролеиновых чаотиц при хранении) подтвэрздают достоверность получанных картин травления.

Таким образом, анализ полученных картин травления показал, что все исследованные микросферы характеризуются неоднородной .структурой, независимо от механизма их образования. Можно пред-полонить, что неоднородность структуры частиц обусловлена особенностями протекания полимеризации в водной среде и вызвана захватом воды полимеризующимися.частицами. Естественно ожидать, что способ проведения полимеризации, определяющий размер частиц (суспензионный илч эмульсионный), должен влиять на количество воды, которое захватывается полимеризующимися частицами, и соответственно на их внутреннюю структуру. Зги,.! можно, по-видимому, объяснить более рыхлую, чэм в иоллетирольных частицах, упаковку субъ-еданиц в полиакролеиновых частицах, образование которых происходит в воде по механизму гомогенной куклеацаИг

Приведенные выше факты представляются интересными и полезными как для уточнения механизма формирования частая, так к для стратегии выбора лолимзршдг микросфер. для иммунологических исследований в зависимости от условий раооты с ними:, в Еиде полимерной суспензии или в виде лиофилизованнкх микросфер, использование которых продполагает их родиспергирование в водной среде.

На основании полученных данных по структуре частиц полимерных суспензий и их устойчивости в солевых растворах и при хранении для решения задач, поставленных в работе, были выбраны полистироль ные микросфоры, стабилизованные ДТК.

П. Адсорбция белков на полиотирольяых микросферах и постановка реакции латекс-агглютинация

В данной работе начади адсорбцию альбумина я кммуногдобуля-на 8 человека только на полимерных микроспорах, пригодных для иммунологических исследований. ' .

Учитывая, что основная идея проводимого исследования заключается в разработке принципов создания латексиых дяагнестякумов, необходимо было сопоставить количсстьенные закономерности адсорбции бедкув на поверхности частиц о параметрами, .характзризушимя работу диагностических тест-систем. Анализ литературных данных показал, что подобные сравнительные исследования отсутствуют.

Исследование адсорбция белка но поверхности част."ц лодямериой суспензии с целью находцеяля условий, необходимых для обеспечения оптимального протгкания реакции латекс-агглютинации, проводили на полистнрольяых чаотицах, синтезированных в присутствии стабилизатора ди-п-толид-о-карбалкохсй(5енялкарбякола и имеющих средний диаметр 0,55 мкм. Суспензия содержала частицы с узким распределением по размерам.

Такая однородность чаотиц по размерам дает определенное преимущество для использования их в диагностических реакциях, так как позволяет достаточно точно определить площадь поверхности носителя белковых молекул я установить степень се покрытия антигеном иди антителом.Кроме то^о, однородность частиц обуславливает сход- ' ный характер их поведения во время агглютинации, что облегчает "'прочтение" результатов реакции латекс-агглютинации.

[1а основании литературных данных выбраия концентрация ауслен-зли лслшершх частиц, равняя 2-2,G %. Адсорбцию оелков кп иалч-открольвих »инфосферах изучал! , используя че лозе чео кий сыьс.роточ-

вый альбумин (ЧСА). Бкбор в качество исследуемого иелгл - ЧСА определяется его доступностью й наибольшей охарактеризованное«.«).

Болок подвергали очистка от димера и ннзкомолекулярных веществ и использовали препарат ЧСА практически не содержащий примесей.

Адсорбцию ЧСА на полистирольных частицах исследовали как Функции рН среди. Для этого применяли 0,1 буферные растворы со следующими значениями рК: 7,7 ; 6,8; 5,8; 5,0; 4,0. После сме.»ивания и инкубирования равных объемов суспензии полимерных частиц и растворов белков различной концентрации в течение 15-18 часов яесвязавшипся с частицами белок удаляли ультрафлль-трацией или центрифугированием с последующей промывкой суспензии полимерных микросфер соответствующим буфером.

Изотермы адсорбции ЧСА на полистирольных частицах, приведенные на рис. I, были получены при значениях рН среда, соответствующих области выше изоздоктрической точки ЧСА (рН 5,8; 6,8; 7,7), вблизи ее (рН 5,0) и ниже изоэлектрической точки ЧСА (рН 4,0). Получить изотерму адсорбции человеческого сывороточного альбумина на полистирольных микросферах при рН среды 5,0 не удалось, так как через-16 часов после смешивания суспензии полимерных микросфер с растворами ЧСА наблюдали осавдение полимерных ча'стиц', покрытых белком. Это объясняется, по-видимому, тем, что в изоэлектрической области молекула ЧСА практически электрокейт-рэчып и имеет компактную структуру. Б этзх условиях макромолекулы склонны к агрегации, что, возможно. и плаводит к нарушению устой-чиностп по аииерпо.; с!успэ::зии.

I!? даиша, прлЕсдонных на р;-.о. I, 2йд;;о, что при увеличении коп.!':;", рации чздойечсскою сывороточного а л ь о v глина до ..,£> ".т/мл

няолкд: ТО У о н. ¡.о;'

стоя аозрас"?аз'!о геля ч:: ив адсорбции, а при дальнейшем роо-янтрацдо ЧСА - выход-се на плато, увеличения долячнш рН сродл количество адсорбированного асесрхност:: частиц падает, ¿то упвяьаювие, по-вцдимоыу.

Рис. X. ft30Tcpt.su адсорбщш ЧСА да лолкстирольиэс и.'крос.рорах 2 при различиях значениях рН средь;: -2,0 (I); 5,6 (2); -И 8,6 (о); 7,7 (4).

О 2 г с,«

обусловлено воз; :с шелл:' кол'орпационЕШЯ изменениями молекулы бел-перехода',: се в более развернутое состояние вследствие оттал-кгвтдня. одной::.опшх зар;^0Е. Гвелпче:и'.е размера молекулы -;елове-' ческогс сывороточного альбумина с возрастанием рН среди приводят к у :лен уценив числа молекул, аяссрбируешх на поверхности частиц.

и увеличение;,! рН среды у;.:еяьпается и кзплон начального .участ-;:а изотера, который позволяет судить о степени сродства мезду белком я лоля:.:ерно« поверхностью. Уиинтеш.о на члена начального участка изотерш «окно объяснять те:.;, «то с перехс„ом в более щелочную область значений рН увеличивается отрицательней заряд молекулы белка, что связано с возрастанием диссоциации карбоксильных групп ЧСА, которые ориентируется по направлению к поверхности сорбента, затрудняя процесо адсорбции белка.

.Макромолекула альбумине представляет собой жесткую глобулу в форме, эллипсоада вращения с осями 40x40x140 А, и если предположить, что при адсорбции большая ссь макромолекулы белка располагается

параллельно поверхности сорбента, то площадь проекции молекулы со-

ог,

ставит 4400 А . Расчеты определенных экспериментально значений площадей полимерной поверхности частиц, приходящихся на одну адсорбированную молекулу ЧСА, при различных значениях рК среды показали, что значениям предельной адсорбции (плато изотера) соответствует заполнение белком поверхности шжэ л'снослойкого, за исключением величины предельной адсорбция, полученной при рН среды 4,0, В это;.: случае экспериментальное значение плоззди доля,'.юрно>1 поверхности чаотяц, приходящейся на одну адсорбароганную г.-.олеку-лу ЧСА, почти совпадает с теоретически.! значением площади проекции молекулы ЧСА, предполагая тем оамым образование монослоя белка с упаковкой, плотность которой маг-сиг/альна.

Итак, в результате проведенных экспериментов было установлено, что связывание человеческого сыворо-гсчного альбумина о полисти-рольнымп микрос,¿¡ерами максимально при рН среды 4,0 и минимально -при рН 7,7. Для образования моносдоя белка с максимальной плотно-отью упаковка на поверхности полимерных частиц необходимо проводить адсорбцию белка при значениях рН среда, леяапшх вблизи язо-электрической точки человеческого сывороточного альбумина.Ло мере удаления от язоэло^тричеокоИ точки ЧСА (при смещении рН среды в щелочную область) количество адсорбированного на частицах белка уменьшается. Адсорбция человеческого сывороточного альбумина на полис тирольных частицах при рЬ среды 5,0 приводят к потере устой-чивизти системы. Со смещением рН среды е щелочную область уменьшается ¡: сродство меяду молекулами бодка к полимерной поверхность >о частиц.

иязяиае услойкЗ «.мобилизации белка на шлистирольных иккро-сЛерах ш чувствительность получаемого латекс-тесте оценивала методом РЛЛ. Сусповзиго полимерных частиц, покрытых ЧСЛ, виотупатаим

в данном случае х. роли антигена, агглютинировали шнослецяйячес-кой сывороткой, действующим начало/л которой являются антитола к иммобилизованному белку (ЧОА), специфически овязываэдяеоя толкло с гтим белком. Чувствительность метода РЙА оценивали пс максимальному рчэЕедонию антг.сцворотки, я-ря котором реакция латекс-агглюте-ноции еще учитывается;. Па рис. 2 представлены зависимости чувствительности ?ЯА (максимального разведения антисиворотки) при различных значениях рН среды от концентрации человеческого сывороточного альбумина в раствоое.

Цчщ

Чш 4256

-Чем, %

. ?лс. ¿. Зависимость чувстви-^ то;лл-:сстп РЛА от концентрация 2 болгя I." растворе яр:: различных рН ере,л: 5,8 (I), 6,8 (.?); 7,? ('?); ■»,& (4).

I

С кс

МА

..з дянкых, 1М рис. '¿, ..не, т:о г.>: зяччтылх

рП ерздн о,С; :: 7,7 о ;л ^личег.г.е;.' «»трг.чу.г. ;ея:,г'>П"с::сгс сигороточйох'о а-л.г':..ч:нч г ¡ас-люре до 3 пг/лл ли::о;;а,л:? ототкяе чугстгл-л'зльноотп лЛА. .¡з ,;ыл;:г:-: тллл с;:о:ует, что

;/2в.-::ченяе средл, т.е. сиг;ек::о р:! в оч-.чv-•• область, лес-дя? л сяк-жя::» чуястчг с с ль нос г: .-ЗА, что, еллл.дно, с.-:г.гаяо с вог-ростанп^л «чргла ¡,ег.гд. ир.: <лщлл ч^гсгсг.годь!:«??.

:::; лучоегг-'х г? теко-лосл'сл оч.лл. .г:;;:', а л/. л '. !:

глитглло, л:-гклх Я,5-и,о лл/л:!, :л':лл':л т/лгк.л. не

Сл-л'г.0то'; .'.-ос бг.е. , 0:0л ллл сл :ллг- " та , члт ;; 1 :: ст',лл-1лл г Л А ;лсчЛ;о лло, ч'ллл ллл лл.; тот?, о л г".е:'.у;'.и " лл!"-—

глобулина 5 прореагировала о двумя молекулами ЧСА, пркнаяле^аци-ми разным полимерным частицам. При поЕЫиеняа величины адсорбция-возрастает вероятность реакции молекулы иммуноглобулина & с молекулами ЧСА, прикадлекащими одно.) частице, что не сопровождается реакцией латекс-агглютинации. . ■ -

Итак, в'результате проведенного исследования биле установлено, что существует, еааисвмость чувствительности получаемых латекс-тестон' от -количества белка, 'адсорбированного на полимерных микро--■ сферах, которое ц;овою очередь, определяется условиями проведения адсорбции. Наяосйызую чувствительность РЯА удастся получить яри . величинах адсорбодк;не достигших, своего предельного значения я /соотавляюсдах 0,3-0,5 от Гыа1С04 Это соответствует концентрациям белка в раствора' менее' Гмг/мд. Выбор рН среды для проведения . ..'адсорбции "бе лка и постановка'реакция латекс-агглютинация тэкхе определяется максимальной чувствительностью латекс-тестов, которая достигается-при рН среда 5,8. В. этом случае молекулы белка .имеют небольшой.отрицательный заряд, который достаточен для стабилизации частиц и на препятствует проведению РЛА.

Таким образом, максимальная чувствительность датехс-те'ста на

к

альбумин-била получена-чри концентрациях белка в растворе менее I мг/мл, рН среды 5,8 а ионной силе 0,1 М.' "• Для проверки специфичности данной РДд случае ее максимальной чувствительности) была проведена реакция латекс-тестов, полученные при рН среды 5,8, с нормальной кроличьей сывороткой (ИКС). Полученные результаты показали, что при концентрациях человеческого с'Еороточнсго «льбумина в растворе .чиж О,В мг/мл наблюдается неслецифсчеокая реакция с нормальной кроличьей сывороткой (разнодзвие НЖ 1/1024), А начиная с концентрации ЧСА в рзст-

хе

воре 0,8-1,0 мг/<.;л веспециЛическая агглютинация прекращается полностью. Степень насыарния поверхности полимерных частиц белком, соответствующая кош;ентрации ЧСА в растворе 0,8 мг/мл при рК среды 5,8, равна 48,7 %, то есть специфичность РИА, по-видимому., определяется, степенью покрытия'частиц белком.

Для создания модельной антительной тест-системы необходимо было1 изучить адсорбцию человеческого иммуноглобулина, 6 (1^ 6) на полмтнполышх частицах. При ЕЫборе концентрации было обна-рукепо, что при смешивании растворов белка, в которых его концентрация составляла 3 мг/мл а шике, с 2°5-ной суспензией полимерных частиц насаждается потеря стабильности полиыерко.1 суспензии. По-• торя устойчивости полимерной суспензии или явление "спонтанной агглютинаций", проявляемое в появлении видимых глазом агрегатов, ' везмокпо, обгоняется недостаточной насыщенностью ао1'врхнсстя «ас-г:.ц белком, приводящей к агрогации «аотпп при их столкновении. Тс кос объяснение подтверждается те«, что при увеличении концеи-тращ.л белка .то 6 мгА;л и ягяго ил;: угеньшенга концентрация суспензия полжерних частой до I % (т.е. уменьшит: количества полимер-сих частиц) интенсивность спонтанной агглютинация существенно снижается, ецпоть до ее ИСЧСЗКОВв'ШШ. Кроге этого били »и.¡девы и другие возмогшие способы устранения споятаьвой •■итльтикадав, которые заключаются к смоления рН среды в щелочную область, приводящим к значительному возрастанию заряда молекулы иммуноглобулина в (изо-элсктричсская точча молекулы 6 , рН 7,8) и, вследствие этого, -заряда псли..;ернык частиц с белком на поверхности, что уменьшает вероятность их столкновения; и арьпенсния лол»'>орных шжрос.оер, предвпритслько некрытых бопкш А, специ-лческг. реогаруглцкд с ш-куиогяобудиввии человека.

Итак, nitíop ¿'.rvjz я ::.ra ^.y""vx-î, г.оп^льг;/?:

api; получензп патетльво.-: röcr-c:.crorur, 014. а'.:г.чог. e.io«JïunnoJ ;¡r-ivi::t;:íku::ku. аы о..-о,!ча,я?дьяо7о s-tfop.? ,.:¡ нроледекпя ид— еорблд« 1Ел;..5К0Рй0бугглп У tfmo г.зуч"'íio :'л:*.::•:г.'1 р " ере;:: по чупог-гагоадаоок. получае;:;.;: лл'"е:.с-?ес?о;:. Дг; ¡-того üJ7ío;.'!' етотаоров içér (<" ;tA:z к l-,« -г/::*:) о g, '-до.. с-ус^азазгш.*

яолжорь::х час™'.Д 12 ■Л'ОГ.ИЛН Ii 'i'O-

чонйс часа при, 2ô°C. Нсол; 0':';'чп:::; o-javnnsv. i но улк «-¡отащ •

от !ieci!:-:0a.va(!i?ci:.. í'r го г'осг:;:ме;:л y;nv: "...' i лз'.' о :c~?,±,vrjyz:~

нагих с ГО: <со:;о ичс очен: СГ;.,;Д'IIiV ö че-

дозока. ¿-'йзуяьтас: э::спер:. Т.'.'ОГ- I.

I.

Б.1л:.1Ь!е среди ш ЬЙОО^Ь л:) тоне -7С:0?3

Концентрация ig. & чел., ГЯ'/иЛ ; ! pH Cpe.'u i {гпяьодакио чел. ! Г' ! ! ! .'ль^роль (li öytTopr; )

6 ' U ,6 7,2 1:8 „ :С4 +

G 0,3 0.2 1:2 £:5i2

г* 0 3,3 Í,G нет розтс-:.:'Л ■ i:IG '

из цьиЕоцо-чннх ранних следует, что oroyvorzße РЯД плд ее низкая чуяссвлтбльиозза ¡2 елучао';-'.o;iU-ii:Tpai';:i: Ig 6 - S и?/мл) ;.ю-Rf¡£ ÛlTh OÔyOSORÎIJÏia ДЛЛТЦОЛ уПОКСШ.Ой t.x-.нкуг. ig G на шшзр&во-отя час л: д. lip:; коьиачтрашш Ig 5, иэиаой (¿,5 (лг/чл, чу.чотвятэль-коегь Ш судестшшо узоличавазотл •/. яс-огягаог каябожгеего гла- •

чокпл цра 'рН В,2. ::онтрода реакции датекскоЗ аггдютпвапаа, аостаз-. денные па наличие спонтанной агглютинации (латекс-тест с буфером), ; Cuan не ва-де достаточно четкими и отрицательными. Улучшение кон- , т-ролл Г ЯЛ происходит при сместила prl среды (7,2 —» 9,6) в шелоч- ■ ' нуп сблглть. Uto свкгапо, по-видшto.v.y, с тем, что вблизи азоэлект-рической течки иммуноглобулина G - молекулы белка слектронейтраль- ¡ ны и, следовательно, агрегативно неустойчивы,- что приводит к не- ; i стабильности полимерной суспензии . При смещения рН среды в щелочную область происходит увеличение заряда молекулы белка и, вследствие зтого, повышение агрегатигной устойчивости частиц, по-; | кр;;тых молекулами иммуноглобулина 6. j

Thí'j:m образом, для. получения стабильных и высокочувствительных антптельнах латекс-тостов адсорбцию человеческого идкуногло- - • кулика S следу зт проводить в щелочной области значений рН и при концентрации белка, выбранной таким образом, чтобы стабильность латекс-.зста сочеталась с ;/-оокой чувствительностью.

Рассмотрев адсорбцию альбумина и иммуноглобулина fe человека '.¡а полястпрольных частицах с целью создания модельных диагностических гест-опстем, из;?но заключить, что в каждом отдельном случае имеются свои особенности, определяемые, в оснсньсм, природой белка. Но существуют я общие закономерности, присуме процессу адсорбции белков на полимерных частицах. Во-лэрБНх, ьри увеличена концентрации белка, испс.изуемой при адсорбц!"", чувствительность РДА падает ; во-вторы::, при проведении адсорбции при значениях рН среды, близких к кзоэлектрпческой точке белка, аолжврная суспензия теряет стабильность; в третьих, специфичность латекс-теста ■ определяется степенью нгенву.ния Поликарпов поверхности белком.

' • . 21

Презде чем от адсорбция индивидуальных белков в коделъшх системах яереЯтя к реальным теотгоистемам, необходимо рассмотреть адсорбцию смеси белков. Это связано с тем, что обычно получить достаточно чистке белки не удается я всегда приходится иметь дело оо смесью белков. Ь момент сорбция возникает конкуренция белков ' за места связывания. Для изучения конкурентно;! адсорбция в качестве. смаоя белков моает бнть использована сыворотка крови человека. Конкурентная адсорбция белков была изучена на полистлрольиых частицах со средним диаметром 0,6 мкм иоэффяцяантом подядиспзро-ности К = 1*С)05} с использованием мояоспощзфяческих антисиворо-ток к индивидуальным белкам сывороткл крова человека. Для разве- . дзняя антисывороток к индивидуальным бедкам я приготовлении да-тека-тестсв Ьряменяля йоссатно-ф']зйодогяческя.1 раствор (PBS ), рВ 7,4.. • . ■

Но:: язучанм адсорбция'белков т полистародышх мнкрос.оерох из смэоя (цельная сыворотка) оказалось, что удается зарегистрировать связывание с яоверхвоогь» частиц только J> -дялопротеядов (Jj -ЛП)..Зтог <Ьект молсет свидетельствовать о том, что прочность я скорость связывания о поверхностью микрсслер у Ji-Hi значительнее выше, чем у всех Стальных белков. Кроле того, поскольку раз-мери молекулы J> - лияопротеадоя знэчлтэльяо больше, чем у других белков, есть основания предположить, что J, -Ш могут пи со экранировать. другие адоор&кювэниые оелкя я яредогвращать их язаьмо-дыктвде с аитясизороткоа, дкбо суцеотяепио увеличивать рвсстог-нае, ян которое способны сбдябя'/ься яоЕорхяостя кяярос.\ор, я теп 'лила.: яредстератясь их сценлеяяэ а пож&ю аятятед. После яя-дубяц::;: г.'якроо.лер с сннероткоЛ, Ko-"opoJ чродваргтельно угдлгля jb--«uciipoTf.i^Li, р'.ччиуя апжжадзцвя азбящоотоя с аг>тпо*иоро-:-.

: 22 .:'••. камя к пммуноглобуляну S я альбумину.-Это означает, чт; после

удаления -^-Ш из сыворотки крови на поверхности кикросфер адсорбируются альбумин и иммуноглобулин 6. -

При создании актятелывых латзкс-теотов 'на у.-.® конкрегше забо-леваши, например, дейтерию, учитывая влияние J¡-липопротеядои не. процесс адсорбции, на по лис ти рольных частицах была иммобилизована не цельная сыворотка, а выделенная из сыворотки ¡¡t- 1До- . бу липовая фракция с пред вари те .гьным удалением из сыворотки попрстеидоЕ.

Антительше латекс-тесты ю дифтерию были получены на отечественных лолястиролььых частицах со сред г. им диаметром Ü.G мкм и ;ю;и;стлрол:,ных частицгрс с диаметром 0,8 мкм оири: "Рон-Пулеьк" (-Г'ракцяя). Частицы "ирмы "Рон-Нуленк" широко попользуются зарубе ш ;ли фирмами для приготовления диагностических препаратов. На частицах была иммооилигонана выделенная и? лошадиной п-дифтериЯ-üc;: пыворот-t!. -глсбул:п.овал ¿рдоияя, дпализованиая против PBS рК 7,8. Адоорбцчч ^ -гдобудииозгл ракцла к> частиках -.«рин "Рон-Пиюнк" выполняли согласно уз «дико, предттлвлэнво.! Фирмой, s ка. етечествсшшх чпеткцах согласно .летодиго, сшлакпо \ , J'-гло-будвковся фракция, получек«ая осчвдзпием сульфатом аммония, могет оочор.ать rpa-.е с&увогяобулияов к другие плазменные белки, которые м.;гут выступать в роля докэлн; тояьшх сю бил;: за тор он суслсь-з::и "олг.:.'.ерных частиц, покрытых JI -фракцией, что позволяет проводить -'цссрбцпю при рК 7.8 (вблизи нзоэлехтричес^эЗ точка молоку лы I д S).

Релг-цию латекс-аггдютижцин проводили с туря иным анатоксином. Хит-к иоставаеде следу шиз контроля РЛА: лг. ггко-тест с буферов (контроль на иаялчче одоьтзяиоЛ егглютввацпи), латекс-тест с

сывороткой здорового человек (контроль специфичности), Полученные результаты ;прэдс тавлзны н таблице 2.

I . -. : . Таблица 2

Чувствительность автительдах латеко-теотоа на дцТ>тарию. - полученных на основе отечественных частиц и частиц ^¡ирмы 'Тон-Пуле ну."

тг---------'—:—г-

, - ' ' " ; ¡Разведение Контроли РЛА Лайке . • ••.' ' |антигена.; -гагц0р0Т1ц, Левого

■.■'.'.• - ; . . ! • 1 . _¡человека

Отечественный • 1:8192

"Эстапор" ; ' • 1:8192

Из приведенных данных видно, что по'чувствительности дзтекс-тест, Полученный при использовании отечественных частиц, не уступает латекс-тисту на основе импортных, частиц производства -Тнрш "Рон-Пуленк", Франция. Отсутствие реакции с сывороткой здорового человека указывает на высокую елецппичкость полученных латекс-тестов.

виеоды

1

1. Установлено, что неоднородная структура полистирольнСх и полиакрелеиковых микросфер обусловлена особенностями протекания полимеризация в водной среде.

2. Показаны преимущества использования в реакциях лзгекс-аг-глютилацик йолистирольных микросфер, стабилизированных ди-д-то-лн л-о-карбалкопеи.оашюр бинолом.

Установлен;-:зависимости количества альбумина, адсорбированного на полис тиролькъгх частицах,от концентрации бедка г, поход, >

«ом растворе при разлкчшх зь.ичекагас. рН среды,определены условдя,

при которых наблюдается максимальная чувствительность латекс-тес-тсв.

Изучена конкурентная адсорбция балков сыворотки крови человека ч показано, что наибольшим сродством к полистиролькой поверхности ойяадаът J\-лияопротешщ.

5. Создан антатольный латекс-тост на основе полистдрольных жкросфер, полученное в присутствии ди-д-толил-о-карбалкокси;$ою1л-карбпнола, для идентификации дифтерийного анатоксина.

Ос-лошое содержание диссертации опубликовано в следущих ра~" ботах:

1. Кадаяцева A./I., Краизниннияова И.Г., Гусеа С.А., Поваляй Т.IJ., Дорохова H.A., Ьогачева А.Н., Кадкин В.Д. Роль природы стае пли затора ар;; синтезе монодисперсных паткстирольяых суспен-

'з:sll.// I Всэссюзиая конференция "Радикальная полимэризация": Тезисы./ Горький. - 1989. - С..'¿18.

2. Дорохова ¿.Л., Краше ьшяиоЕД И.Г., Бахауов В.Н. Исследо-гллпо структура полимэрн.^-: мыфосфар, используемых в иммунохимия. // Л Вс(.-ссх)зная конрер^лгля молодых ученых л специалистов по фи-зпчоской хилаш "физическая химия - SO": Тезисы./ IL: ИЖ'ГЗЖМ.-1990. - С.ЗЭ.

3. Gu3ev S.A., Povalii i1.!..., Dorocno^a K.A., xetininirx D.D., Griokova I.A., KreoerJ.nrd.kova 1.0. Adsorption of proteins et pclyotyrer.e mlcrospherren // PoIiiv.ery.-1990.-Fr>K OV.-IiR 5.-1S7-159-'"' •

4. Кардаш Г.И., Ахметьева ¿¡.И., Изамнакоя Л.Л., Грицкова II,А,, • . Гусев С.А., Дорохова ¿.А. Исследование реакции датексной airawca- ■ нации методом светорассеяния// Лабораторное дало.-19У0.~й 5.-0.55-58.

лак IT3 тират ТП<' _экз Ротапринтам i.^-ltXT"^!?-?? В Ломоносова