Формирование поверхностной структуры монодисперсных микросфер на основе полистирола и сополимеров стирола с акролеином тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

СКУРКИС Юлия Олеговна

ФОРМИРОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНОЙ СТРУКТУРЫ МОНОДИСПЕРСНЫХ МИКРОСФЕР НА ОСНОВЕ ПОЛИСТИРОЛА И СОПОЛИМЕРОВ СТИРОЛА С АКРОЛЕИНОМ

02.00.06 - высокомолекулярные соединения н 02.00.11 - коллоидная химия и физико-химическая механика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

I

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте высокомолекулярных соединений Российской академии наук

Научные руководители:

доктор химических наук, старший научный сотрудник Теннгосова Татьяна Борисовна

кандидат химических наук, доцент Меньшикова Анастасия Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Лавров Николай Алексеевич

доктор химических наук, старший научный сотрудник Ермакова Людмила Эдуардовна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится « 17 » ноября 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.229.01 при Институте высокомолекулярных соединений РАН по адресу: 199004, Санкт-Петербург, В.О. Большой пр., 31, Конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высокомолекулярных соединений РАН

Автореферат разослан « № » октября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного /~врвета кандидат физ.-мат. наук (/]

Н.А. Долотова

П8Ъ5~

и I &

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуалыгость работы. В последние годы монодисперсные полимерные микросферы эффективно применяют в качестве носителей иммунореагентов, среди которых главную роль играют белки. Молекулы биологически активных веществ (БАВ) содержат в своем составе разнообразные ионогенные группы, поэтому они не только м01ут вступать в специфические взаимодействия в поверхностном слое, но и влиять на распределение в нем поверхностного заряда, который определяет коллоидно-химическое поведение полимерных дисперсий. Разнообразие биологического материала требует разработки носителей с заданными характеристиками поверхности, защищающими биолиганды от неспецифических взаимодействий и обеспечивающими оптимальные условия их экспонирования для участия в иммунохимических реакциях. В частности, такие носители могут быть созданы на основе полимерных микросфер, способствующих визуализации иммунохимических реакций. Образование комплекса антиген-антитело проявляется в этом случае как агрегация частиц латекса, несущих на поверхности один из взаимодействующих компонентов. На специфичность и чувствительность такой реакции существенное влияние оказывает конформация макромолекул белка, она меняется в зависимости от гидрофобности полимерной поверхности и наличия реакционно-способных групп, что также определяет структуру поверхности и электроповерхностные свойства микросфер. Монодисперсные частицы являются хорошей моделью для изучения механизма связывания биолигандов с поверхностью носителя. Таким образом, актуальна разработка методов получения полимерных частиц-носителей, позволяющих регулировать концентрацию функциональных групп в их поверхностном слое, а также его структуру и степень гидрофобности за счет варьирования рН реакционной смеси, концентрации мономеров, буферных солей и полимерного стабилизатора, а также полярности дисперсионной среды. Одним из подходов к решению этой задачи является безэмульгаторная эмульсионная сополимеризация (БЭП), например, стирола с акролеином, что позволяет гидрофилизовать поверхностный слой микросфер поли(стирол/акролеин)а (ПСАК) и ввести в него альдегидные группы. Другим подходом является использование дисперсионной полимеризации (ДП) стирола в спиртовых растворах стерического стабилизатора поливинилпирролидона (ТТВГТ), что позволяет получить частицы полистирола (ПС) с усложненной структурой поверхностного слоя, содержащего как привитые сополимеры ПС/ПВП дифильной природы, так и карбоксильные группы инициатора 4,4'-азо-бнс-4-(цианизовалериановой кислоты) (ЦВК). Сравнительное изучение химического состава поверхностного слоя и электроповерхностных свойств микросфер, полученных в разных условиях синтеза, обеспечивает информацию о поверхностной структуре и ее изменении при встраивании биолигандов. В этой связи, актуальной задачей является исследование адсорбции иными частицами

модельного белка, бычьего сывороточного альбумина (БСА), что позволяет проследить взаимосвязь условий синтеза со структурой поверхности носителя, его способностью к связыванию биолш андов и эффективностью их экспонирования на границе раздела фаз. Распространение этого подхода на низкомолекулярные биолиганды, в частности, синтетические пептиды вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), и сравнительное исследование чувствительности тест-систем, полученных на их основе, актуально для разработки латексных диагностикумов, применимых как для индивидуального экспресс-анализа, так и для маецнабно1 о скрининга.

Цель работы состояла в разработке методов направленного формирования в процессе синтеза поверхностной структуры монодисперсных полимерных микросфер с альдегидными и карбоксильными группами, выяснении механизмов образования смешанных структур при встраивании БАВ в поверхностные слои таких частиц, а также в изучении влияния поверхности полимерного носителя на эффективность специфического взаимодействия биолигандов в латексной тест-системе. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• исследовать безэмульгаторную эмульсионную сополимеризацию стирола и акролеина, инициированную персульфатом калия;

• исследовать дисперсионную полимеризацию стирола в спиртовых средах, инициированную карбоксилсодержащим азоинициатором в присутствии стерического стабилизатора ПВП;

• выявить факторы, влияющие на дисперсность и поверхностную структуру полимерных частиц в процессе их формирования;

• исследовать адсорбционное и ковалентное связывание биолигандов (БСА и синтетических пептидов) с полученными микросферами ПС и ПСАК;

• провести сравнительное изучение электрофоретической подвижности полимерных частиц, полученных в разных условиях синтеза, до и после их модификации биолигандами;

• определить эффективность протекания иммунохимических реакций на поверхности образцов микросфер ПС и ПСАК, модифицированных биолигандами.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование полимерных частиц - носителей иммунореагентов на основе полистирола и сополимеров стирола с акролеином. В результате установлена взаимосвязь между условиями синтеза полимерных частиц, их дисперсными характеристиками и поверхностными свойствами (^-потенциал, положение изоэлектрической точки, адсорбционная емкость), а также способностью эффективно экспонировать диагностически значимые биолиганды для их участия в реакциях молекулярного узнавания. В ходе исследования разработаны новые методы направленного регулирования в процессе БЭП и ДП характеристик частиц-носителей на основе ПСАК и ПС; впервые проведено углубленное изучение их поверхностной структуры и ее влияния на

адсорбционное и ковалентное связывание, а также реакционную способность биолигандов. В частности, получены частицы ПСАК с повышенной концентрацией альдегидных групп и показано влияние соотношения альдегидных и карбоксильных групп в их поверхностном слое, а также рН раствора белка на величину его хемосорбции. Впервые получены частицы ПС с усложненной структурой поверхности, содержащей как карбоксильные группы для ковалентного связывания биолигандов, так и привитые сополимеры ПС/ПВП. Определено строение данных сополимеров и их влияние на стабильность поверхности и эффективность экспонирования на ней БСА и синтетических антигенных детерминант ВИЧ. Практическая значимость. Получен широкий спектр монодисперсных микросфер на основе ПС в диапазоне размеров 1-5 мкм и сополимеров стирола с акролеином - 0,4-0,7 мкм. Выявлены факторы, позволяющие регулировать в процессе синтеза диаметр частиц, поверхностную концентрацию функциональных групп и структуру поверхностного слоя. Проведена серия экспериментов, направленных на оптимизацию процессов связывания БАВ частицами ПС и ПСАК. Выявлены условия получения полимерных носителей и связывания с ними биолигандов, обеспечивающие их экспонирование на границе раздела фаз, сохранение биологически активной конформации иммунореагента и, следовательно, высокую чувствительность тест-систем. Показана эффективность применения полученных частиц в качестве носителей синтетических антигенных детерминант поверхностных белков и белков ядра ВИЧ в тест-системах, предназначенных для выявления ВИЧ-инфицированных. Положения, выдвигаемые на защиту:

• Способы регулирования в процессах БЭП стирола с акролеином и ДП стирола в спиртовых средах дисперсности формируемых полимерных микросфер, поверхностной концентрации карбоксильных и альдегидных групп или структуры привитых сополимеров ПС/ПВП.

• Подходы к оптимизации условий связывания биолигандов путем адсорбции и хемосорбции БСА на частицах ПС и ПСАК в зависимости от структуры их поверхностного слоя.

• Метод оценки эффективности экспонирования биолигандов, основанный на комплексном изучении величин ^-потенциалов и положения изоэлектрических точек поверхности частиц-носителей ПСАК и ПС.

• Методы повышения чувствительности модельных латексных тест-систем для определения антител к ВИЧ на основе антигенных детерминант ВИЧ и монодисперсных частиц ПСАК и ПС.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международных симпозиумах «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems» (C-Петербург, 1999, 2002), международных конференциях XII «Surface Forces» (Звенигород, 2002), XVI и XVII European Chemistry at Interface (Владимир, 2003; Loughborough UK, 2005), «Химия высокоорганизованных веществ и

научные основы нанотехнологии» (С-Петербург, 2001, 2004), "Spectroscopy of Partially Ordered Macromolecular Systems" (Прага, Чехия 2003), "Polymers in Dispersed Media" (Лион, Франция 2004), на VIII, IX и X Всероссийских конференциях «Структура и динамика молекулярных систем», (Яльчик 2001, 2002, 2005). По теме диссертации опубликованы 28 работ, из них 10 статей. Вклад автора состоял в синтезе монодисперсных микросфер ПС и ПСАК, исследовании их олектроповерхностных свойств, адсорбции и ковалентного связывания ими БСА и синтетических пептидов, а также в изучении эффективности полученных иммунореагентов для экспресс-диагностики. Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты и их обсуждение), выводов, списка цитируемой литературы (178 наименований). < Работа изложена на 149 страницах, содержит 28 рисунков и 23 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение. Обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи работы.

Глава I. Обзор лтературы. Проведен анализ современных представлений о механизмах дисперсионной полимеризации как метода получения латексных частиц, а также основных требований, предъявляемых к латексам для биотехнологии. Рассмотрена поверхностная морфология полимерных частиц с различной степенью гидрофобности. Представлены методы получения монодисперсных полимерных микросфер с карбоксильными и альдегидными группами на поверхности для связывания биолигандов. Рассмотрены преимущества и перспективы использования в латексных тест-системах синтетических пептидов и применения их для диагностики заболеваний методом реакции агглютинации латекса (РАЛ).

Глава П. Объекты и методы исследования. Методами БЭП и ДП синтезированы 12 образцов монодисперсных микросфер ПСАК и 25 - ПС соответственно. Кинетика процесса (со)полимеризации изучена с помощью газовой хроматографии. Методами кондуктометрического и потенциометри-ческого титрования, тонкослойной хроматографии и ИК-спектроскопии иссле- < дован состав поверхностного слоя полученных частиц. Изучение электроповерхностных свойств микросфер проведено методом микроэлектрофореза. С применением метода высокоэффективной моиолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ) исследована адсорбция и хемосорбция биолигандов. В качестве модельного белка использован БСА. Чувствительность и специфичность модельных тест-систем на основе полученных полимерных микросфер и синтетических антигенных детерминант ВИЧ изучена методом РАЛ с гипериммунными кроличьими сыворотками. Глава III. Результаты и их обсуждение.

III. 1. Безэмулъгаторная эмульсионная сополимеризацш стирола с акролеином Для получения субмикронных монодисперсных частиц ПСАК с альдегидными группами в поверхностном слое проведена БЭП стирола и

гидрофильного сомономера акролеина, инициированная персульфатом калия. Обнаружено, что наиболее полно этот процесс протекает при эквимолярном соотношении мономеров. С целью увеличения размеров микросфер температуру синтеза снижали с 60 до 55°С, но при этом наряду с основной фракцией, в латексе наблюдались и более мелкие частицы. Уменьшение концентрации К28208 не позволило получить более крупные микросферы из-за заметного снижения конверсии мономеров. Напротив, при повышении содержания мономеров в реакционной смеси их конверсия достигала 90%, при этом формировались более крупные частицы диаметром 0.61 мкм. Введение 2 10"2 моль/л ЫаС! несколько увеличивало диаметр частиц, но при больших концентрациях №С1 формировался полидисперсный латекс. Применение буферной соли КН2РО4 (1-2 10"2 моль/л) позволило поддерживать рН реакционной смеси в слабо кислой области, что способствовало сохранению альдегидной группы акролеина. Это также обеспечивало повышение агрегативной устойчивости полимер-мономерных частиц (ПМЧ) за счет поддержания более высокого значения рН реакционной смеси. В результате в присутствии КН2Р04 были получены монодисперсные частицы диаметром до 0.67 мкм. Методом газовой хроматографии исследована кинетика сополимеризации стирола с акролеином (рис. 1). Показано, что перед началом синтеза 70% акролеина находилось в водной фазе. На протяжении синтеза акролеин расходуется с постоянной скоростью 9.1 Ш"2 моль/л с. На конверсионной кривой стирола индукционный период практически не заметен, что указывает на быстрое формирование ПМЧ дифиль-ными олшомерами И олигорадикалами, Рис. 1. Зависимость конверсии содержащими звенья, как гидрофобного мономеров ог времени синтеза при стирола, так и гидрофильного акролеина, сополимеризации акролеина (7) и В области средних конверсий мономеров, стиР°ла(2) в мол' С00Т"01пении 1:1 когда основной зоной сополимеризации являются ПМЧ, скорость расхода стирола (8.6 10"2 моль/л с) очень близка к скорости расхода акролеина. Снижение растворимости акролеина в водной фазе и смещение основной зоны реакции в ПМЧ обусловлено присутствием в реакционной смеси КН2Р04, что позволило уже при эквимолярном соотношении мономеров получить микросферы ПСАК с содержанием звеньев акролеина до 53 мол.%. Исследование гель-фракций в частицах ПСАК показало, что часть звеньев акролеина расходуется на меж- и внутримолекулярное сшивание полимерных цепей. В результате, золь-фракция составляет всего 30%. Таким образом, методом радикальной сополимеризации акролеина со стиролом были

Время, мин

получены монодисиерсные латексы с частицами диаметром в диапазоне 01 0.37 до 0.67 мкм с гидрофилизированной поверхностью и высоким содержанием на ней альдегидных групп, позволяющих осуществить ковалентное связывание БАВ. III. 2. Дисперсионная полимеризация стирола

С целью получения монодисперсных частиц ПС размером более 1 мкм с карбоксилированной поверхностью осуществлена ДП стирола, инициированная ЦБК, в присутствии стерического стабилизатора ПВП. Обнаружено, что при концентрациях 1.43 10'2 моль/л ЦБК и 20 г/л ПВП с уменьшением полярности среды в ряду (этанол/вода) - этанол - (этанол/толуол) происходит заметное укрупнение размеров частиц и некоторое уширенис их распределения по размерам (табл. 1). Ухудшение сольватации ПВП-блоков и улучшение ее для ПС-блоков привитых сополимеров ПС/ПВП, образующихся в ходе синтеза, закономерно приводит к уменьшению их дифильности и стабилизирующей способности. Образование привитых сополимеров в этих условиях идет не столь эффективно, поскольку в слабо полярной среде цепи ПВП более свернуты и менее доступны для радикальной атаки.

Таблица 1. Влияние полярности реакционной среды на характеристики

микросфер ПС

Опыт, № Состав среды, об.% Стирол, моль/л Ць мкм от/о„ о,* % ММ х10'3

ДМФА толуол

15 16 Этанол:вода 93:7 1.44 1.92 1.25 1.88 1.002 1.004 4.4 6.2 55.0 57.0 76.0 120.0

17 Этанол 100 1.92 2.75 1.019 13.5 54.0 68.9

18 Этанол:толуол 93:7 1.92 4.84 1.022 15.0 32.4 32.4

с — среднеквадратичная дисперсия

СООН, мкг-экв/м2 О, мкм 5 4

1,5 2,0 стирал, моль/л

10

СООН, мкг-экв/м2 8

20 30 ПВП, Г1п

Рис 2. Влияние исходной концентрации стирола (а) и ПВП (б) на диаметр микросфср ПС, полученных под действием ЦБК в растворе ПВП (20 г/л) в смеси этанол/вода (93:7 об %) (1), и на концентрацию карбоксильных групп на их поверхности (2).

100

SO

- x,%

В процессе ДП в этаноле с 7 об.% воды при достаточно высоком содержании ПВП (20 г/л) наибольшая концентрация СООН групп на поверхности частиц достигается в области низких концентраций стирола (рис. 2 а, кривая 2), что обусловлено низкими ММ образующихся цепей ПС (24 1 03 - 49 1 03). При повышении содержания стирола постоянство поверхностной концентрации групп СООН свидетельствует о неизменности числа привитых цепей с концевыми карбоксильными группами на одну макромолекулу ПВП (рис. 2 а, б, кривые 2). Минимальный диаметр частиц достигается при концентрации стирола 1.15 моль/л (рис. 2 а, кривая 7), соответствующей условиям наилучшей стабилизации частит! ПС. С дальнейшим повышением содержания стирола полярность среды снижается, и диаметр частиц возрастает, что указывает на снижение стабилизирующей способности привитых сополимеров в результате улучшения их сольватации. Такая экстремальная зависимость позволяет, варьируя концентрацию стирола, получать монодисперсные частицы ПС одного диаметра, которые будут различаться структурой привитых сополимеров в поверхностном слое и, следовательно, поверхностной концентрацией СООН групп. При сохранении высокой концентрации стирола (1.92 моль/л) и низком содержании ПВП формируются полидисперсные частицы вследствие недостаточной стабилизующей способности привитых сополимеров (рис. 2 б). С повышением содержания ПВП в реакционной смеси образуются монодисперсные частицы ПС меньшего диаметра. При этом симбатно снижается и поверхностная концентрация концевых СООН групп привитых цепей ПС, что подтверждает уменьшение числа точек прививки на цепь ПВП. Повышение концентрации ПВП от 15 до 30 г/л при полимеризации стирола в этаноле с 7 об.% воды, приводит к увеличению продолжительности полимеризации в растворе с 30 до 60 минут (рис. 3), формированию более мелких частиц: Dn, соответственно, 1.90 и 1.64 мкм, и к возрастанию скорости полимеризации в ПМЧ с 1.28.10-4 до 1.61.10-4 моль/л.с. Увеличение скорости полимеризации после достижения степени конверсии 50% (рис. 3 б, кривая 1), указывает на проявление гель-эффекта. В качестве фактора, позволяющего контролировать структуру привитых сополимеров и дисперсность образующихся частиц, рассмотрена также температура введения инициатора. Диаметр монодисперсных частиц ПС возрастал (стабилизация ухудшалась) при

о*

100

IX, %

100

200

300

Время, мин.

Рис. 3. Зависимости конверсии стирола от времени с начала синтеза в смеси этанол/вода (93:7 об.%) при исходных 1.92 моль/л стирола и 15 (а) и 30 г/л (б) ПВП: 1 и 2 -воспроизведение опыта.

повышении температуры введения ЦВК: 2.75 мкм (25"С), 3.20 мкм (65°С). 3.80 мкм (72°С). При введении ЦВК в уже нагретую до температуры полимеризации (78°С) реакционную смесь образовывался полидисперсный латекс. Это указывает на слабую стабилизирующую способность привитых сополимеров с большим оличеством коротких цепей ПС и малой длиной се! ментов ПВП между точками прививки. Такая структура сополимеров подтверждается понижением ММ полистирола и разности ее значений, определенных в ДМФА (47 101) и в толуоле, который является осадителем ПВП (66103), Проведенный методом ТСХ анализ полимерных фракций, экстрагированных с поверхности ряда образцов микросфер ПС, продемонстрировал присутствие в полученном экстракте только привитых сополимеров и отсутствие ПВП. Методом ИК-спектроскопии оценено массовое содержание в них блоков ПС и ПВП. Исходя из содержания СООН групп в выделенных сополимерах и полагая, что на каждую привитую цепь ПС приходится одна концевая СООН группа, для трех образцов, полученных в различных условиях, были рассчитаны среднее число (и) цепей ПС, привитых на одну цепь ПВП, и среднее число мономерных звеньев в них (т) (чабл. 2).

Таблица 2. Анализ привитых сополимеров ПС/ПВП, выделенных

экстракцией

Опыт, № Содержание сополимеров ПС/ПВП в спиртовой вытяжке 1пвп/1ст* Содержание блоков ПВП, мас.% Параметры структуры сополимеров ПС/ПВП

Число точек прививки на цепь ПВП, п Число звеньев в цепях ПС, т

% к массе микросфер мг/м2

19 1.69 4.0 1.22 53.1 - -

20 1.47 3.7 0.89 49.5 9.9 35

21 1.07 2.8 1.19 52.5 - -

22 0.55 2.4 1.07 49.5 - -

23 1.01 3.4 1.56 58.9 6.8 34

24 1.61 4.9 1.64 60.1 2.3 96

Отношение интенсивностей полос в области 1674 см" (лактамная С=0 группа ПВП) и 700 см"1 (деформационные колебания С-Н ароматических колец ПС)

III4.1 Электроповерхностные свойства микросфер ПСАК до модификации белком

Исследование двух латексов ПСАК (рис. 4) с Оп 520 нм, различающихся поверхностной концентрацией функциональных 1рупп (1абл. 3) методом микроэлектрофореза показало, чю в случае латекса 3, с большей концентрацией СООН групп, при увеличении ионной силы возрастас! электрофоретическая подвижность частиц (11). Данное явление обусловлено

смещением границы скольжения фаз вглубь дисперсионной среды при изменении ориентации полимерных цепей в результате электростатического отталкивания их ионизированных карбоксильных групп. С увеличением ионной силы раствора диффузная часть ДЭС сжимается, и их заряд оказывается вынесенным ближе к границе скольжения фаз. Для латекса 4 с меньшей поверхностной концентрацией СООН групп эффекты концентрационного сжатия ДЭС и разрыхления поверхностного

и 1СГ, м /Вс

4-

а

2

рН 0

4 6 8 10

-2

\ ■-ч^ 1

•4-

\2

-6-

/В с

Рис. 4. Электрофоретическая подвижность частиц ла1ексов 3 (а) и 4 (б) (З-б) в растворах ЫаС1 10"4 (/, 3, 5) и 10"2 моль/л (2, 4, 6) в зависимости от рН и хранения латсксов - год (/, 2, 5,6) и 3 месяца (3,4).

Таблица 3. Характеристики образцов латексов ПСАК

Латекс №3 №4

Срок хранения 1 год 3 месяца 1 год

Концентрация групп мкг-экв/м2 % мкг-экв/м2 % мкг-экв/м2 %

-ОБОз 1.4 9 1.1 11 1.1 29

-СООН 9.1 60 2.6 26 0.7 18

-СОН 4.8 31 6.3 63 2.0 53

Всего 15.3 100 10.0 100 3.8 100

слоя практически компенсируют друг друга (кривые 5, 4).Однако через год при увеличении концентрации №0 с 10"4 до 10'2 моль/л величины и частиц снижались (кривые 5, 6), поскольку в процессе хранения количество ионогенных поверхностных групп уменьшалось (табл. 3). Для обоих образцов латексов значения изоэлектрических точек (ИЭТ) были равны 2.0. Ото указывает на определяющее влияние на рНИэ! концевых сульфогрупп, которые могут [акже легко выдвигаться на концах гидрофилизованных полимерных цепей к самой границе скольжения фаз.

III.4.2. Связывание бепка частицами ПСАК

Наличие альдегидных групп на поверхности частиц ПСАК позволило осуществлять химическое взаимодействие с аминогруппами белка с образованием оснований Шиффа. 11ри определении остаточной концентрации

БСА методом ВЭМДХ было установлено, что в процесс хемосорбции в щелочной среде с поверхности частиц ПСАК вымываются олигомерные цепи, которые связываются с БСА в растворе, на что указывало появление на хроматограммах широких пиков коньюгатов с большим временем удерживания, чем для исходного БСА (рис. 5 а, б). Предварительная экстракция олигомеров выдерживанием микросфср перед хемосорбцией в боратном буфере с рН 10.0 позволила избежать потерь белка на реакцию в растворе (рис. 5 в). С ростом рП отрицательный заряд, как поверхности, так и глобул белка возрастает. Вследствие электростатического отталкивания и уменьшения гидрофобного взаимодействия сорбция БСА частицами латекса 3 снижается (рис. 6). Напротив, снижение вместе с рН степени диссоциации СООН групп белковой макромолекулы должно приводить к более плотной укладке в поверхностном слое, то есть большей адсорбции. Однако снижение рН до 8.25 выводит систему оптимальной для образования азометиновых связей в

Время, мин

Рис. 5. Кривые ВЭМДХ растворов БСА 1.5 мг/мл (а, б, в) в буфере с рН 7 5 (а) и 9 2 (б, в) до (1) и после их взаимодействия с частицами ПСАК 9 (2) без предварительного удаления олигомеров (а, б) и после их отмывания (в).

из области результате

протонирования аминогрупп белка, вследствие чего хемосорбция снижается. С увеличением доли альдегидных групп в поверхностном слое частиц ПСАК 3

■ Г, мг/м

Г, мг/м1

0,4 О.а 1,2 1,в 0,0 С , мг/мл

0,4 0,8 1,2 1, С , мг/м

Рис. 6. Хемосорбция ЬСА частицами Рис. 7. Влияние структуры поверхноои частиц

латекса 3 при рН. 8.25 (1), 9.25 (2), латексов 3-(/) и 4 (срок хранении I юд)-(2)

9 60 (3), 10 20 (4) и латекса 9 (5) при на величину хемосорбции ВСА при рН 9.25 (а)

рН 7.5 и 10 2(6)

и 4 (табл. 3) наблюдался рост хемосорбции БСА (рис. 7, кривые 2). При меньшей поверхностной концентрации СООН групп (латекс 4) электростатическое отталкивание БСЛ от поверхности при данном рН снижалось. В результате предельные значения хемосорбции были близки в случае модификации белком при рН 9.25 и 10.2, однако восходящий участок изотермы располагался выше при большем значении рН. Для латекса 9 с самой низкой долей карбоксильных групп в поверхностном слое ([СНО] 3.2, [СООН] 0.9 мкг-экв/м2) связывание белка происходило наиболее эффективно (рис. 6 , кривая 5). Восходящий участок изотермы указывает на то, что БСА интенсивно v поглощается даже при низкой его концентрации в буферном растворе и слабо щелочном рН 7.5. Снижение электростатического отталкивания глобул белка от поверхности частиц латекса 9 благодаря малой поверхностной конценч рации СООН групп и низкому рН обусловливает исчезновение S-образного участка на изотерме хемосорбции, которая характеризуется ярко выраженным плато при Г = 1.6 мг/м2. Таким образом, значение рН в процессе сорбции на частицах ПСАК, не только определяет степень диссоциации ионогенных групп поверхности микросфер и белка, и следовательно, возможность их электростатического отталкивания, но оказывает существенное влияние и на кинетику химической реакции.

Ill 4.3 Электроповерхностные свойства микросфер ПСАК после модификации белком

При изучении электрофоретической подвижности частиц латекса ПСАК № 4, модифицированных БСА, обнаружено, что зависимости рНиэт от равновесной концентрации белка проходят через минимум (рис. 8). ИЭТ БСА достигалась только в случае самой низкой и самой высокой величин хемосорбции при рН 10.2, когда белок полностью экранировал поверхность, несмотря на то, что количество глобул белка, приходящееся • на 1 мкм2 отличалось для этих образцов в ч среднем в 4 раза. При низких заполнениях поверхности эти глобулы могут образовывать с ней многочисленные связи, частично теряя исходную струюуру, при этом их посадочная площадка возрастает. При промежуточных величинах хемосорбции, как было показано Сломковским методом атомно-силовой микроскопии, образуются кластеры из глобул белка, сосуществующие со свободной поверхностью, доля которой уменьшается с увеличением степени заполнения. При уменьшении рН степень диссоциации карбоксигрупп белка снижается, его глобулы иереходяг в более компактную изоморфную форму с меньшей посадочной площадкой. Доля

Рис. 8. рНиэт латекса 4 (срок хранения 1 год), модифицированного БСА при рН 9.25 (1) и 10.2 (2), в зависимости от равновесной концентрации БСА при хемосорбции.

незаполненной белком поверхности возрастает, чю влияет на значение ИЭТ. Таким образом, результаты исследования электроповерхностных свойств микросфер ИСАК после модификации белком в различных условиях могут быть интерпретированы на основе представлений о различных способах укладки белковых молекул на поверхности полимерной подложки и об изменении их конформаций в процессе хемосорбции и после ее завершения под действием состава дисперсионной среды.

III. 4.4. Электроповерхностные свойства микросфер ПС до и после модифжаиии белком

При исследовании электроповерхностных свойств частиц ПС до и после экстракции привитых сополимеров ПС/ПВП показано, что полного их удаления из поверхностного слоя не происходит. Об этом свидетельствует инверсия знака (^-потенциала в интервале рН 2.0-2.3 (рис. 9), обусловленная координацией ионов Н+ лактамными группами ПВП. Однако при больших рН электрофоретическая подвижность частиц резко возрастала после частичной экстракции привитых сополимеров. Это свидетельствует об уменьшении экранирования поверхностного заряда частиц, поскольку к границе скольжения фаз выносится большее число ионизированных карбоксильных групп на концах полимерных цепей в результате возрастания их конформационной подвижности.

С целью выявления роли привитых сополимеров поверхностного слоя в процессе сорбции были сопоставлены изотермы хемосорбции и адсорбции БСА, а также положение ИЭТ для двух образцов, различающихся структурой привитых сополимеров ПС/ПВП в поверхностном слое (табл. 4). Образец 19 был получен в условиях, когда структура этих сополимеров может характеризоваться большим количеством коротких привитых ПС цепей, для образца 23 было характерно меньшее количеством более длинных привитых цепей ПС. Присутствие на поверхности образцов карбоксильных групп дает возможность проводить ковале1 иное связывание биолигандов с применением метода активированных эфиров, который предусматривает раздельное проведение стадий активации поверхностных СООН групп носителя водорастворимым карбодиимидом (КДИ) в присутствии Ы-гидроксибензотриазола с последующим удалением избьпка реагентов и затем ковалешного присоединения биолиганда по его аминогруппам при рН 5.5.

^ 4 8 рН

_я1

32

\ 3

и ю", м2/В с 4

-8

Рве. 9. и частиц ПС, (опыт 22), в растворах ЫаС1 10*2 (1,3) и 10 3 моль/л (2,4) в зависимости от рН до (1,2) и после (3,4) спирто-щелочной экстракции.

Таблица 4. Условия синтеза и характеристики микросфер ПС

№ Стирол моль/л ПВП, г/л ЦВК, мас% к стиролу ЦВК, мас% к ПВП о„, мкм м5/ Г [СООН] мкг-экв/м2 рНиэт ММ хЮ"3 Дисперсность

ога/о„ о,%

19 23 1.53 1,92 20 15 2.50 2.00 20 27 1.36 1.90 4.2 3.0 1.60 2.72 2.3 2.5 55.0 74.2 1.0011 1.0035 3.40 5.90

*ММ, измеренная методом вискозиметрии в ДМФА

Такой подход позволяет избежать активации СООН групп биолигандов и вовлечения их в химическое взаимодействие, ведущее к образованию внутренних сшивок и нарушению их биологически активной конформации. Обнаружено, что изотермы адсорбции для образцов 19 и 23 выходят на плато при Г 1.6 и 2.7 мг/м2, соответственно (рис. 9). Напротив, значения хемосорбции для образца 19 продолжают возрастать во всем исследованном диапазоне концентраций БСА. Обнаруженное для данного образца превышение значений хемосорбции над адсорбцией (рис. 10 а, кривые 1, 2), может быть обусловлено

разрыхлением поверхности частиц в процессе активации ее СООН групп и дальнейшего взаимодействия с БСА. Такому разрыхлению способствует отмывка частиц горячим щелочным спиртом с целью извлечения слабо закрепленных привитых сополимеров с короткими цепями ПС. Для образца 23 эти цепи имеют большую длину и лучше закреплены на поверхности частиц, что является причиной ее более стабильной структуры. В результате, различие в значениях хемосорбции и адсорбции практически отсутствует-. Вместе с тем, для образца 23 обнаружен изгиб начального участка изотерм, свидетельствующий о наличии препятствий для сорбции при малой концентрации белка (рис. 10 б, кривые 1, 2). Встраивание небольших количеств БСА в поверхностный слой может оказаться невыгодным, поскольку приводит к уменьшению энтропийной составляющей энергии системы за счет

Г, мг/м2 рНиэт

Ср, мг/мл

Рис. 10. Изотермы хемосорбции (1) и физической адсорбции (2) Г (мг/м2), а также рНиэт частиц латексов 19 (а) и 23 (б) после хемосорбции (3) и физической адсорбции (4) ЬСА в зависимости от его равновесной концентрации Ср (ш/мл) в процессе адсорбции.

ограничения подвижности гидрофильных сегментов ГТВГТ привитых сополимеров. Однако с увеличением концентрации БСА в растворе количество связанного белка быстро нарастает и при наибольших значениях адсорбции -2.7 мг/м2 (образец 23) на 1 мкм2 поверхности частиц находятся 2.3x104 глобул БСА. Эта величина практически достигает предельного уровня адсорбции на поверхности гидрофобных частиц ПС, не содержащих привитых сополимеров в поверхностном слое (2.5х104 глобул БСА на 1 мкм2). Таким образом, гидрофилизация поверхности частиц за счет блоков ПВП привитых сополимеров не препятствует эффективному связыванию ими белка Следует также учесть, что адсорбция, то есть концентрирование белка в поверхностном слое, является первым этапом взаимодействия и при его ковалентном связывании. Адсорбция БСА может осуществляться за счет водородных связей его аминогрупп с поверхностными СООН группами и координационного взаимодействия с цепями ПВП на поверхности частиц. Близкие значения хемосорбции и адсорбции свидетельствуют о сохранении конформации белка при его связывании стандартным карбодиимидным методом, поскольку при этом сохраняется площадь, занимаемая одной глобулой БСА в поверхностном слое и соответствующая гидродинамическому радиусу глобулы БСА 3.6 нм. Уже при минимальных значениях хемосорбции ИЭТ образца 19 (рис. 10 а, кривые 3, 4), равная 4.7-4.8, попадает в интервал ИЭТ нативного БСА, что указывает на полное экранирование поверхности белком. Однако с увеличением поверхностной концентрации БСА до 3.2 м1/м2, когда на 1 мкм2 поверхности приходится уже 2.8x104 молекул белка, значения ИЭТ неожиданно уменьшаются до 4.0. Это подтверждает увеличение эффективной удельной поверхности данного образца вследствие ее разрыхления, причем падение значений ИЭТ указывает на формирование рыхлой мозаичной структуры, которая допускает выдвижение на границу скольжения фаз как сополимеров ПС/ПВП, так и глобул белка. Однако для образца 19 снижение ИЭТ происходит не только в случае хемосорбции, но также и при адсорбции, что указывает на заметное влияние на значение ИЭТ конформационно

подвижных сополимеров

ПС/ПВП, которые не позволяют белку полностью экранировать поверхность

Цепь ПС

Рис. 11. Структура поверхности образцов ПС после связывания ЬСА. Латексы: 19 (а) с большим количеством коротких цепей ПС привитых на цепь ПВП и 23 (б) с малым количеством длинных привитых цепей ПС.

частиц. Только в случае образца 23, постоянство высоких значений ИЭТ при всех степенях заполнения поверхности белком и любом типе связывания указывает на эффективное экспонирование БСА на фапице скольжения фаз (рис. 10 б, кривые 3,4) и, следовательно, его доступность для дальнейших иммунохимических взаимодействий. Модели поверхностного слоя исследованных образцов представлены на рис. 11. Таким образом, строение привитых сополимеров ПС/ПВП оказывает существенное влияние на стабильность поверхностной структуры частиц и, соответственно, на характер изотерм адсорбции и хемосорбции.

III 4.5 Конструирование латексиых тест-систем для определения возбудителей легионеллеза

Микросферы ИСАК (латекс 3) с диаметром частиц 0.52 мкм и поверхностной концентрацией альдегидных групп 4.8 мкг-экв/м2 были испытаны в Государственном научном центре прикладной микробиологии (Московская обл., п. Оболенск) как носители антител (иммуноглобулинов G, выработанных к специфическим антигенным эпитопам белков и липополисахаридному компоненту внешней мембраны бактерий легионеллы) с целью создания латексной тест-системы для экспресс-диагностики легионелеза. Параллельно испытания проводились на латексе ПСАК фирмы «Estampo» (Франция) с диаметром частиц 0.8 мкм и поверхностной концентрацией альдегидных групп 2.3 мкг-экв/м2. Оптимальная сенсибилизирующая концентрация иммуноглобулинов для обоих латексов была 40 мкг/мл. Для исследованных образцов уровень чувствительности полученных тест-систем был достаточно высок и сопоставим: определяемая концентрация легионелл составляла 103 КОЕ/мл для латекса 3 и 5x10"2 КОЕ/мл для латекса «Estampo». III. 4.5 Конструирование латексных тест-систем для определения антител к ВИЧ

Таблица 5. Характеристики антигенных детерминант ВИЧ

Антигенные MM (q>)% Количество Соотношение рНиэт

детерминанты ацетонитрила амино- амино- и

ВИЧ в элюенте при кислотных карбоксигрупп

ВЭЖХ остатков

"gpl20" 2559 9 22 9/3 12.0

"HIV-II-16" (gp 41) 1851 20 16 3/1 10.1

"Leu" (gp 41) 1275 29 12 2/0 10.1

"sp35" (gp 41) 4300 29 35 3/3 10.1

"p24-15" 1544 34 15 1/3 3.1

При связывании синтетических пептидов, являющихся антигенными детерминантами поверхностных белков (§р120, др 41) и белка ядра (р24) ВИЧ (табл. 5) частицами ПСАК латекса 9 было выявлено снижение активности латекс-тестов во времени, обусловленное лабильностью поверхностного слоя носителя и низкими молекулярными массами пептидов. В связи с этим, была применена модификация поверхности носителя белком-блокером (хемосорбция

3-х кратного избытка БСА при рН 10, затем активация СООН групп пептидов КДИ и связывание их по остаточным аминогруппам белка).

Пептид Со, Латекс, Объем,

мкг/мл ' мг мл

иа>120" 42 6 29 3.51

"Н1У-П-16" 47.3 25 3.17

"зр35" 48.6 40 3.66

"р24-15" 42.6 29 3.52

Связанные пептиды

мкг/м мкмоль/м2

0.63 0.25

0.74 0.40

0.55 0.13

0.60 0.42

I 1в растворе У////Л на частицах ПСАК

др120

$р35

р24

При этом были использованы как отдельные пептиды (табл. 6), так и их композиция (рис. 12).Обнаружено, что способность пептидов к связыванию зависела от молекулярной массы и соотношения карбоксильных и аминогрупп. Примечательно, что самый гидрофильный пептид '^р120" (наименьший % ацетонитрила в элюенте при ВЭМДХ - табл. 5) связывался с поверхностью частиц практически нацело, благодаря высокому содержанию аминогрупп, которые при протони-ровании обеспечивали его притяжение к отрицательно заряженной поверхности. Напротив, более гидрофобный пептид "р24-15" связывался с поверхностью лишь на 39%, поскольку содержал наибольшее количество СООН групп, при ионизации которых отрицательно заряженная цепь пептида отталкивалась от поверхности носителя. Пептид "р24-15" связывался частицами латекса полностью лишь в случае использования пептидной

Рис. 12. Соотношение пептидов в композиции при связывании с частицами ПСАК.

Таблица 7. Испытания в РАЛ латекс-тестов с сывороткой Анти"зр35''

композиции, ко1 да он мог образовав в растворе комплексы с другими пептидами, например, с 1^р120". Полученные модельные латекс-тесты были испытаны в РАЛ с гипериммунной кроличьей антисывороткой к пептиду "зр35" и сыворотками инфицированных ВИЧ (табл. 7, 8). Латекс-гесты, полученные с использованием белка-блокера (БСА), сохраняли специфичность и

чувствительность при хранении в течение полугода. Таким образом, связывание антигенных детерминант ВИЧ с поверхностью част иц-носителей через глобулы БСА оказалось наиболее перспективным подходом для латекса

Разведение Латекс-тесты на основе

сыворотки "НПММб" "р24-

Анти"8р35 * 15'"

1 10 Зf 4+ 2+

1 20 3+ 4+ 2+

I 40 2+ 2+ 2+

1 80 + + +

Кошроль - - -

ПСАК. Для частиц ПС было Таблица 8. Испытания в РЛЛ латекс-прослежено влияние структуры теста на основе композиции пептидов поверхности на связывание диагностически значимых пептидов ВИЧ и их чувствительность в РАЛ.

По мере заполнения пептидами "sp-35" и "Leu" поверхности частиц ее ИЭТ смещалась от 2.0 в щелочную область pH, но только для образца 23 достшала рНИэт пептида 10.1 (рис. 13 б, табл. 5). Таким образом, частицы 23 обладают поверхностной структурой, способной эффективно экспонировать пептид "sp-35" на границе раздела фаз для дальнейших иммунохимических реакций. Для образца 19 при предельных величинах хемосорбции данного пептида значение ИЭТ достигало 8.3 (рис. 13 в). Тогда как для образца 23, модифицированного пептидам "Leu", рНИэт достигал лишь 6.6 (рис. 13 а). Таким образом, структура поверхности частиц образца 19, а также меньший

Сыворотки Разведение

ВИЧ- 1 20 1 40 1 80

инфицированных

1 2+ ± -

2 2+ + +

3 2+ 2+ ±

4 3+ 2+ ±

5 2+ 2+ +

6 3+ 2+ ±

7 3+ 2+ ±

8 3+ + ±

Контрольные

1 2 + - -

3 + - -

РАЛ в 0 05 моль/л NaCl, pH 7 2

0 иг/и1 0 4 М г/и ' О 7 м г/м' 2 5 м г/м!

Рис. 13. Влияние pH на ^-потенциал частиц латексов 23 (а, б) и 19 (в) до (/) и после модификации их поверхности пептидами "Leu" (а) и "sp35'" (б. в) (2, 3, 4, 5, 6). размер цепи пептида "Leu" способствуют проникновению пептидов внутрь слоя привитых сополимеров. В результате привитые сополимеры влияют на значение ИЭТ наряду с пептидом. Несмотря на различную структуру поверхности, оба образца, модифицированные "sp-35" и "Leu", были активны в РАЛ с гипериммунными кроличьими сыворотками к данным пептидам (табл. 9, 10).

Наибольшую активность показал образец 23 при средних заполнениях поверхности. При его модификации пептидом большей молекулярной массы,

РАЛ проявлялась на 10 мин раньше по сравнению с другими модельными тестами. Таким образом, привитые сополимеры в поверхностном слое частиц образца 23 лучше способны выполнять спейсерную функцию. При изучении специфической активности модельного латекс-теста на основе пептида "Leu" с гипериммунными кроличьими сыворотками к данному пептиду наибольшую чувствительность проявил образец с величиной хемосорбции 2.0 мг/м2. Было показано, что для этого образца РАЛ проявляется уже на ранних стадиях после иммунизации и становится всеболее отчетливой с ростом активности антисыворотки за счет выработки специфических антител класса IgG (табл. 10). Это свидетельствует о сохранении биологической активности даже сравнительно небольшого пептида при его связывании с поверхностью носителя через спейсерные цепи привитых сополимеров.

Таблица 10. РАЛ тест-системы на основе микросфер ПС, модифицированных нешидом ''Leu"

Таблица 9. РАЛ тест-системы на основе микро сфер ПС, модифицированных пептидом "'sp-35"

Латекс

Разведение сывороток

0 1 0 4 0 7 1 3 2 1 0

1/100

1/200

1/400

1/800

Контроль

РАЛ, мин

№19

№23 |_

Величина адсорбции, мг/м

2+ 2+ 2+ 2+ 2+

2+ 3+ 3+ 3+ 2+

21 3+3+ 3+ 2+

2+ 2+ 3+ 2+ 2+

10 5 5 5 10

04 07 1 3 20

2+ 2+ 2+ 2+ 2+

2+ 2+ 3+ 2+ 2+

2+ 2+ 3+ 2+ 2+

2+ 2+ 3+ 2+ 2+

20 20 15 20 20

Разведение Время с момента

сывороток иммунизации

7дн 12 да 21дн

1/10Ö 2+ 2+ 2+

1/200 2+ 3+ 3+

1/400 2+ 3+ 4+

1/800 2+ 3+ 4+

1/1600 2+ 2+ 3+

Контроль - - -

РАЛ, мин 15-20 15-20 15-20

Таким образом, исследование влияния структуры поверхности полимерно! о носителя на адсорбцию и хемосорбцию белков и пептидов позволило выявить поверхностные характеристики, необходимые для повышения эффективности как химического связывания биолигандов, так и реакций молекулярного узнавания в полимерных системах с развитой межфазной поверхностью. Показано, что экспонирование антигенных детерминант на поверхности полимерных микросфер путем их ковалентного связывания через гидрофильный спейсерный слой способствует повышению чувствительности латексных тестов, поскольку увеличивает конформационную подвижность биолигандов и их доступность для биоспецифических реакций, протекающих на поверхности частиц-носителей.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведено комплексное исследование монодисперсных полимерных частиц - носителей иммунореагентов на основе полистирола и сополимера стирола с акролеином, включающее их синтез, изучение дисперсных характеристик, поверхностных свойств и влияния этих свойств на эффективность связывания и участия биолигандов в реакциях молекулярного узиавания.

2. Оптимизированы условия проведения безэмульгаторной эмульсионной сополимеризации стирола и акролеина, инициированной персульфатом калия, на основе чего получены монодисперсные микросферы сополимера стирола с акролеином субмикронного размера с высокой поверхностной концентрацией альдегидных групп (до 6.3 моль/м2). Дисперсионной полимеризацией стирола, инициированной 4,4'-азо-бис-(4-цианизовалериа-новой кислотой) в спиртовых растворах поливинилпирролидона, получены частицы полистирола диаметром в диапазоне 1-5 мкм с карбоксильными поверхностными группами (до 4 моль/м2).

3. Разработаны методы направленного формирования в процессе синтеза поверхностной структуры полимерных микросфер и изучено образование смешанных белково-полимерных структур при встраивании БАВ в их поверхностные слои. Обнаружено, что наиболее стабильной поверхностной структурой обладают частицы поли(стирол/акролеин)а с наименьшей степенью карбоксилирования поверхности и микросферы полистирола, которые содержат в поверхностном слое привитые сополимеры ПС/ПВП с длинными боковыми цепями ПС (в среднем, 100 мономерных звеньев).

4. Установлено, что величины хемосорбции белка на частицах сополимера стирола с акролеином в щелочной среде возрастают в случае преобладания в поверхностном слое альдегидных групп над карбоксильными. Показано, что частицы полистирола с усложненной структурой гидрофильного поверхностного слоя, содержащие привитые сополимеры ПС/ПВП и карбоксильные группы, также демонстрируют высокие предельные величины хемосорбции белка, проведенной методом активированных эфиров в слабо кислой среде, достигающие 3.2 мг/м2.

5. Показано, что полученные микросферы поли(стирол/акролеин)а и полистирола способны эффективно экспонировать на поверхности диагностически значимые биолиганды: антитела, выработанные к бактериям легионеллы, или синтетические антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека, причем связывание антигенных детерминант с участием гидрофильных спейсерных слоев привитых сополимеров или белка - блокера (БСА) повышает их реакционную способность в латексных тест-системах.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Меньшикова А.Ю., Дмитриева И.Б., Кучук В.И., Скуркис Ю.О., Евсеева Т.Г., Шабсельс Б.М. Электроповерхностные свойства латексов соиолимеров стирола и акролеина с поверхностью, модифицированной белком // Коллоидн. журн. 1999. Т. 61. № 6. С. 799 808.

2. Меньшикова А.Ю., Скуркис Ю.О., Дмитриева И.Б., Кучук В.И., Евсеева Т.Г., Шабсельс Б.М. Влияние структуры поверхности поли(стирол/-акролеин)овых микросфер и модификации ее белком на электроповерхностные свойства// Коллоидн. журн. 2001. Т. 63. № 5. С. 678-686.

3. Меньшикова А.Ю., Евсеева Т.Г., Чекина Н.А., Скуркис Ю.О., Иванчев С.С. Монодисперсные микросферы на основе сополимеров акролеина // Ж. приклад, химии 2001. Т. 74. № 10. С. 1677-1683.

4. Меньшикова А.Ю., Чекина Н.А., Дорош М.Ю., Шкарубская З.П., Скуркис Ю.О., Шабсельс Б.М., Тенникова Т.Б. Модификация белком нолимерных частиц с функциональными группами // В сб.: "Структура и динамика молекулярных систем" Йошкар-Ола. 2001. Ч. 1. С. 220-224.

5. Меньшикова А.Ю., Евсеева Т.Г., Скуркис 10. О., Шабсельс Б.М., Литвинова J1.C. Структура поверхности полистирольных частиц, формируемых методом дисперсионной полимеризации // В сб.: "Структура и динамика молекулярных систем" Уфа 2002. Т. 2. С. 18-21.

6. Меньшикова А.Ю., Евсеева Т.Г., Скуркис Ю.О., Шабсельс Б.М., Власова E.IL, Иванчев С.С. Синтез монодисперсных частиц полистирола с кон фолируемой структурой привитых сополимеров в поверхностном слое //Высокомолек. соед. А. 2004. V. 46. № 9. С. 1479-1487.

7. Меньшикова А.Ю., Скуркис Ю.О., Евсеева Т.Г., Шкарубская З.П., Тенникова Т.Б., Иванчев С.С. Связывание белка микросферами полистирола с поливинилпирролидоном в поверхностном слое // Ж. приклад, химии. 2004. Т. 77. № 12. С. 2036-2041.

8. Меньшикова А.Ю., Шабсельс Б.М., Скуркис Ю.О., Дорош М.Ю., Тенникова Т.Б., Буров С.В. Синтетические антигенные детерминанты ВИЧ на поверхности полимерных частиц: методы сенсибилизации и иммунореактивность // В сб.: "Структура и динамика молекулярных систем" Казань. 2004. Вып. 11. Т. 1. С. 296-299.

9. Menshikova A.Yu., Evseeva T.G., Skurkis Yu. О., Tennikova T.B., Ivanchev S.S. Monodisperse carboxylated polystyrene particles - synthesis, electrokinetics and adsorptive properties // Polymer. 2005. V. 46. № 4. P. 1417 1425.

10. Menshikova A.Yu., Dmitrieva I.B., Kuchuk V.I., Skurkis Yu.O., Shabsels B.M., Evseeva T.G.. Modification of poly(styrene/acrolein) microspheres by bovine serum albumin // Abstr. 3-rd Intern, symp. "Molecular order and mobility in polymer systems" Saint Petersburg 1999. P. 131.

11. Menshikova A.Yu., Shabsels B.M., Skurkis Yu.O., Martirosova N.S., Evseeva T.G. Protein absorption on polystyrene microspheres synthesized in

presence of polyvinylpyrrolidon // Abstr. 3-rd Intern, symp. "Molecular order and mobility in polymer systems" St. Petersburg 1999. P. 128.

12. Меньшикова А.Ю., Скуркис Ю.О. Шабсельс Б.М., Дорош М.Ю., Буров С.В. Поверхностная модификация полимерных микросфер синтетическими пептидами // Автореф. докл. 3-ая между нар. конф. «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» С-Петербург. 2001. С. 361-362.

13. Skurkis Yu. О., Menshikova A.Yu., Evseeva T.G., Shabsels B.M., Litvinova L.S. Mixed protein/polyvinylpyrrolidon layers on the surface of polystyrene particles. // Abstr. 4-th Intern. Symp. "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems"- St.Petersburg. 2002. Russia. P. 134.

14. Skurkis Yu. O., Menshikova A.Yu., Chekina N.A., Evseeva T.G., Ivanchev S.S. Electrokinetic and adsorption properties of polymer particles // Abstracts of XII Intern. Conf. "Surface Forces" Zvenigorod. 2002. Russia. P. 107.

15. Menshikova A.Yu., Skurkis Yu.O., Shabsels B.M., Vlasova E.N., Evseeva T.G. Graft copolymers formed in the process of styrene dispersion polymerisation as stabilizers of monodisperse polymer particles //Abstr. XVI European Chemistry at Interface Conf. Vladimir. 2003. P. 120.

16. Menshikova A.Yu., Shabsels B.M., Vlasova E.N., Skurkis Yu.O., Evseeva T.G., Analysis of graft copolymers formed in the process of styrene dispersion polymerisation by FTIR spectroscopy //Abstr. 22-nd Discussion Conference "Spectroscopy of Partially Ordered Macromolecular Systems" Prague. 2003. Czech Republic. P-01.

17. Menshikova A.Yu., Evseeva T.G., Skurkis Yu. O., Tennikova T.B., Ivanchev S.S. Monodisperse carboxylated polystyrene particles - synthesis, electrokinetics and adsorptive properties // Abstracts of Intern. Symp. "Polymers in Dispersed Media" Lyon, France. 2004. P. 413-416.

18. Скуркис Ю.О., Меньшикова А.Ю., Евсеева Т.Г., Шабсельс Б.М., Тенникова Т.Б. Микросферы на основе полистирола с функциональными группами как носители иммунореагентов // 4-ая междунар. конф. «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» Автореф. докл., С.-Петербург. 2004. С. 326.

19. Скуркис Ю.О., Меньшикова А.Ю., Евсеева Т.Г., Дорош М.Ю., Буров С.В, Тенникова Т.Б. Синтетические антигенные детерминанты ВИЧ на поверхности полимерных микросфер // Тезисы XII Всеросс. конф. «Структура и динамика молекулярных систем» Яльчик. 2005. С. 195.

20. Skurkis Y.O., Menshikova A. Yu., Shabsels В.М., Evseeva Т. G., Burov S. V. Peptide immunoreagents on latex particles: structure effects on binding, surface properties, and immunoreactivity // Abstracts of XVII European Chemistry at Interface Conf. Loughborough, UK. 2005. P. 89.

Бесплатно

Ц9480

РНБ Русский фонд

2006-4 17835

Автореферат отпечатан в ИВС РАН. Ризография. Тираж 100 экземпляров

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Эмульсионная и дисперсионная полимеризация как методы получения полимерных микросфер

1.1.1. Механизм процесса эмульсионной полимеризации

1.1.2. .Монодисперсные латексы

1.1.3. Особенности безэмульгаторной эмульсионной полимеризации

1.1.4. Функциональные группы на поверхности частиц

1.1.5. Поверхностная морфология частиц, полученных методом эмульсионной сополимеризации

1.1.6. Полимерные частицы размером более 1 мкм

1.1.7. Механизм процесса дисперсионной полимеризации в полярных средах

1.1.8. Влияние условий дисперсионной полимеризации на характеристики частиц

1.1.9. Поверхностная морфология частиц, полученных методом дисперсионной полимеризации

1.2. Взаимодействие биолигандов с поверхностью полимерных микросфер

1.2.1. Адсорбция

1.2.2. Ковалентное присоединение биолигандов

1.2.2.1. по карбоксильным поверхностным группам

1.2.2.2. по альдегидным поверхностным группам

1.2.3. Адсорбция и хемосорбция синтетических пептидов

1.3. Преимущества и перспективы метода реакции агглютинации латекса

Глава II. Объекты и методы исследования

II.1. Исходные реагенты

II. 1.1. Мономеры

И. 1.2. Прочие реагенты

II.2. Методы синтеза

11.2.1. Получение микросфер полистирола методом дисперсионной полимеризации в полярных средах

11.2.2. Получение микросфер поли(стирол/акролеин)а методом безэмульгаторной эмульсионной полимеризации

И.З. Методы изучения процесса полимеризации и характеристик образуемых полимерных частиц

11.3.1. Изучение кинетики (со)полимеризации методом газовой хроматографии

11.3.2. Определение молекулярной массы полимеров

11.3.3. Определение содержания гель - фракций в сополимерах поли(стирол/акролеин)а

11.3.4. Определение размеров микросфер методом электронной микроскопии

11.3.5. Определение содержания сухого вещества в латексе

11.3.6. Определение поверхностной концентрации функциональных групп латексов

11.3.6.1. Кондуктометрическое титрование карбоксильных групп

11.3.6.2. Кондуктометрическое титрование альдегидных групп

11.3.7. Определение адсорбционных характеристик латекса методом непрерывного потенциометрического титрования

11.3.8. Анализ полученных полимеров

11.3.8.1. Анализ сополимерной структуры микросфер ПСАК

11.3.8.2. Анализ полимерного состава привитых сополимеров

11.3.9. Анализ полимеров методом ИК-спектроскопии

11.3.10. Изучение электрофоретической подвижности микросфер методом микроэлектрофореза

II.4. Метод связывания белка

11.4.1. на поверхности карбоксилированных латексов ПС

11.4.2. на поверхности частиц ПСАК с альдегидными группами

II.5. Определение концентрации белка на поверхности частиц латексов

11.5.1. методом Лоури-Фолина

11.5.2. методом высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ)

Глава III Результаты и их обсуждение

III. 1. Безэмульгаторная эмульсионная сополимеризация стирола с акролеином

111.2. Дисперсионная полимеризация стирола

111.3. Связывание биолигандов с частицами ПСАК и ПС, влияние на их электроповерхностные свойства

111.3.1. Электроповерхностные свойства микросфер поли(стирол/акролеин)а до модификации белком

111.3.2. Связывание белка с частицами ПСАК

111.3.3. Электроповерхностные свойства микросфер поли(стирол/акролеин)а после модификации белком

111.3.4. Электроповерхностные свойства микросфер полистирола до и после модификации белком

111.3.5. Конструирование латексных тест-систем для определения возбудителей легионелеза

111.3.6. Конструирование латексных тест-систем для определения антител к ВИЧ

Выводы

Монодисперсные полимерные микросферы применяются в различных областях науки и техники. Их правильная сферическая форма и монодисперсность позволяют широко использовать полимерные микросферы в качестве модельных коллоидов при изучении реологического поведения, стабильности, седиментации, электрокинетики и агрегации коллоидов. Достаточно крупные монодисперсные полимерные частицы с диаметром более 1 мкм могут быть использованы в качестве сорбентов для анализа и разделения биологически активных веществ (БАВ) методами жидкостной хроматографии. В последние годы монодисперсные полимерные микросферы эффективно применяются в иммуноанализе в качестве носителей иммунореагентов, среди которых главную роль играют белки. Молекулы БАВ содержат в своем составе разнообразные ионогенные группы, поэтому они не только могут вступать в специфические взаимодействия с поверхностью полимерного носителя, но и влиять на распределение поверхностного заряда. Поверхностный заряд полимерных частиц определяет коллоидно-химическое поведение дисперсий, весь комплекс их электроповерхностных свойств. При этом, наряду с величиной заряда, немаловажное значение имеет и химическая природа полимерной поверхности - степень ее гидрофобности, наличие тех или иных функциональных групп, их кислотно-основные свойства и т. д. Микросферы служат для визуализации иммунохимических реакций, в которых образование комплекса антиген-антитело проявляется как агрегация частиц латекса, несущих на поверхности один из взаимодействующих компонентов. На специфичность и чувствительность такой реакции определяющее влияние оказывает конформация макромолекул белка, она меняется в зависимости от структуры поверхности микросфер и их электроповерхностных свойств. Монодисперсные частицы являются хорошей моделью для изучения механизма специфической адсорбции биолигандов на поверхности носителя. В связи с этим проведение комплексного исследования, позволяющего установить взаимосвязь между условиями синтеза полимерных частиц и их поверхностной структурой, а также разработка методов, позволяющих получать частицы с заданными свойствами, с целью эффективного экспонирования на их поверхности биоспецифических лигандов является актуальной задачей.

Целью настоящей работы является: разработка методов направленного формирования в процессе синтеза поверхностной структуры монодисперсных полимерных микросфер с альдегидными и карбоксильными группами, выяснении механизмов образования смешанных структур при встраивании БАВ в поверхностные слои таких частиц, а также в изучении влияния поверхности полимерного носителя на эффективность специфического взаимодействия биолигандов в латексной тест-системе. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• исследовать безэмульгаторную эмульсионную сополимеризацию (БЭП) стирола и акролеина, инициированную персульфатом калия;

• исследовать дисперсионную полимеризацию (ДП) стирола в спиртовых средах, инициированную карбоксилсодержащим азоинициатором в присутствии стерического стабилизатора поливинилпирролидона (ПВП);

• выявить факторы, влияющие на дисперсность и поверхностную структуру полимерных частиц в процессе их формирования;

• исследовать адсорбционное и ковалентное связывание биолигандов (бычьего сывороточного альбумина (БСА) и синтетических пептидов) с полученными микросферами полистирола (ПС) и поли(стирол/акролеин)а (ПСАК);

• провести сравнительное изучение электрофоретической подвижности полимерных частиц, полученных в разных условиях синтеза, до и после их модификации биолигандами;

• определить эффективность протекания иммунохимических реакций на поверхности образцов микросфер ПС и ПСАК, модифицированных биолигандами.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование полимерных частиц - носителей иммунореагентов на основе полистирола и сополимеров стирола с акролеином. В результате установлена взаимосвязь между условиями их синтеза, дисперсными характеристиками и поверхностными свойствами (^-потенциал, положение изоэлектрической точки, адсорбционная емкость), а также способностью эффективно экспонировать диагностически значимые биолиганды для их участия в реакциях молекулярного узнавания. В ходе исследования разработаны новые методы направленного регулирования в процессе БЭП и ДП характеристик частиц-носителей на основе ПСАК и ПС; впервые проведено углубленное изучение их поверхностной структуры и ее влияния на адсорбционное и ковалентное связывание биолигандов и их реакционную способность. В частности, получены частицы ПСАК с повышенной концентрацией альдегидных групп и показано влияние соотношения альдегидных и карбоксильных групп в их поверхностном слое, а также рН раствора белка на величину его хемосорбции. Впервые получены частицы ПС с усложненной структурой поверхности, содержащей как карбоксильные группы для ковалентного связывания биолигандов, так и привитые сополимеры полистиро/поливи-нилпирролидон (ПС/ПВП). Определено строение данных сополимеров и их влияние на стабильность поверхности и эффективность экспонирования на ней БСА и синтетических антигенных детерминант вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Практическая значимость:

Получен широкий спектр монодисперсных микросфер на основе ПС в диапазоне размеров 1-5 мкм и сополимеров стирола с акролеином - 0.4-0.7 мкм. Выявлены факторы, позволяющие регулировать в процессе синтеза диаметр частиц, поверхностную концентрацию функциональных групп и структуру поверхностного слоя. Проведена серия экспериментов, направленных на оптимизацию процессов связывания БАВ частицами ПС и ПСАК. Выявлены условия получения полимерных носителей и связывания с ними биолигандов, обеспечивающие их экспонирование на границе раздела фаз, сохранение биологически активной конформации иммунореагента и, следовательно, высокую чувствительность тест-систем. Показана эффективность применения полученных частиц в качестве носителей синтетических антигенных детерминант поверхностных белков и белков ядра ВИЧ в тест-системах, предназначенных для выявления ВИЧ-инфицированных.

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

• Способы регулирования в процессах БЭП стирола с акролеином и ДП стирола в спиртовых средах дисперсности формируемых полимерных микросфер, поверхностной концентрации карбоксильных и альдегидных групп или структуры привитых сополимеров ПС/ПВП.

• Подходы к оптимизации условий связывания биолигандов путем адсорбции и хемосорбции БСА на частицах ПС и ПСАК в зависимости от структуры их поверхностного слоя.

• Метод оценки эффективности экспонирования биолигандов, основанный на комплексном изучении величин ^-потенциалов и положения изоэлекгрических точек поверхности частиц-носителей ПСАК и ПС.

• Методы повышения чувствительности модельных латексных тест-систем для определения антител к ВИЧ на основе антигенных детерминант ВИЧ и монодисперсных частиц ПСАК и ПС.

Структура диссертации:

Выводы

1. Впервые проведено комплексное исследование монодисперсных полимерных частиц - носителей иммунореагентов на основе полистирола и сополимера стирола с акролеином, включающее их синтез, изучение дисперсных характеристик, поверхностных свойств и влияния этих свойств на эффективность связывания и участия биолигандов в реакциях молекулярного узнавания.

2. Оптимизированы условия проведения безэмульгаторной эмульсионной сополимеризации стирола и акролеина, инициированной персульфатом калия, на основе чего получены монодисперсные микросферы сополимера стирола с акролеином субмикронного размера с высокой поверхностной концентрацией альдегидных групп (до 6.3 моль/м ). Дисперсионной полимеризацией стирола, инициированной 4,4'-азо-бис-(4-цианизовалериановой кислотой) в спиртовых растворах поливинилпирролидона, получены монодисперсные микросферы полистирола диаметром в диапазоне 1-5 мкм с карбоксильными поверхностными группами (до 4 моль/м2).

3. Разработаны методы направленного формирования в процессе синтеза поверхностной структуры полимерных микросфер и изучено образование смешанных белково-полимерных структур при встраивании БАВ в их поверхностные слои. Обнаружено, что наиболее стабильной поверхностной структурой обладают частицы поли(стирол/акролеин)а с наименьшей степенью карбоксилирования поверхности и микросферы полистирола, которые содержат в поверхностном слое привитые сополимеры ПС/ПВП с длинными боковыми цепями ПС (в среднем, 100 мономерных звеньев).

4. Установлено, что величины хемосорбции белка на частицах сополимера стирола с акролеином в щелочной среде возрастают в случае преобладания в поверхностном слое альдегидных групп над карбоксильными. Показано, что частицы полистирола с усложненной структурой гидрофильного поверхностного слоя, содержащие привитые сополимеры и карбоксильные группы, также демонстрируют высокие предельные величины хемосорбции белка, проведенной методом активированных эфиров в слабо кислой среде (до 3.2 мг/м2).

Показано, что полученные микросферы поли(стирол/акролеин)а и полистирола способны эффективно экспонировать на поверхности диагностически значимые б иолиганды: антитела, выработанные к бактериям легионеллы, или синтетические антигенные детерминанты вируса иммунодефицита человека, причем связывание антигенных детерминант с участием гидрофильных спейсерных слоев привитых сополимеров или белка - блокера (БСА) повышает их реакционную способность в латексных тест-системах.

1. Мономеры // Под ред. Блаут, Е., Хохенштейн, В., Марк, Г.- М.: Иностранная литература, 1951. 239 с.

2. Сивергин Ю.М., Киреева С.М., Гришина И.Н. Перекиси и гидроперекиси как инициаторы полимеризации мономеров // Пластич. массы.- 2002. № 5. С. 27-32.

3. Елисеева В.И. Полимерные дисперсии М.: Химия, 1980.- 296 с.

4. Arshady R. Suspension, emulsion, and dispersion polymerization: A methodological survey // Coll. Polym. Sci. 1992. V. 270. № 8. P. 717 732.

5. Goodwin J.W., Hearn J., Но C.C., Ottewill R.H. The preparation and characterization of polymer latices formed in the absence of active agents // Brit. Polym. J. 1973. № 5. P. 347-362.

6. Оудиан Д. Основы химии полимеров. Перевод с англ. Выгодского Я.С., Фрунзе Т.М. М.: Мир, 1974. 616 с.

7. Smith W., Ewart R. Kinetics of emulsion polymerization // J. Chem. Phys.- 1948. V. 16. №6. P. 592-601.

8. Павлюченко B.H., Иванчев C.C. Эмульсионная полимеризация неполярных мономеров (развитие представлений о кинетике и топохимии) // Успехи химии. 1981. Т. 50. №4. С. 715-745.

9. Friis N., Hamielec А.Е. Kinetics of styrene emulsion polymerization // J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 1973. V. 11. № 12. P. 3321-3325.

10. Ivancev S.S., Pavljucenko V.N. Emulsions Polymerisation von Styren bei Lokalisierung der Radikalbildung im Bereich der Adsorptionsschichten des Emulgators // Acta Polymerica. 1981. V. 32. N 7. P. 407-412.

11. Павлюченко B.H., Иванчев C.C., Бырдина H.A., Алексеева З.М., Лесникова Н.Н. Особенности эмульсионной полимеризации стирола при локализации актов радикалообразования в адсорбционных слоях эмульгатора // ДАН СССР. 1981. Т. 259. №3. С. 641-645.

12. Иванчев С.С. Радикальная полимеризация М.: Химия, 1985. 280 с.

13. Иванчев С.С. Реакции в полимерных системах Л.: Химия, 1987. 304 с.

14. Ryan C.F., Grochowsky R.J. U.S.Patent 3426101. Acrylic modifiers which impart impact resistance and transparency to vinyl chloride polymers. 1969.

15. Deguchi S., Handa R. U.S.Patent 3502604. Impact resistant resin compositions and method of production thereof. 1970.

16. Dickie R., Newman S. U.S.Patent 3787522. Acrylate polymer particles comprising a core,an outer shell,and an intermediate layer in my patents list. 1974.

17. Grancio M.R., Wiliams D.J. The morphology of monomer-polymer particles in styrene emulsion polymerisation // J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 1970. V. 8. P. 26172629.

18. Okubo M., Katsuta Y., Matsumoto T. Rupture of anomalous composite particles prepared by seeded emulsion polymerisation in aging period. // J. Polym. Sci., Polym. Lett. Ed. 1980. V. 18. № 7. P. 481-486.

19. Елисеева В.И. Роль полярности и физического состояния композиционного полимера при эмульсионной полимеризации // ДАН СССР. 1983. Т. 270. № 3. С. 625-628.

20. Chainay М., Hearn J., Wilkinson М.С. Preparation of overcoated polymer latexes by "shot growth" technique // Brit. Polym. J.l 981. V. 13. № 9. P. 132-136.

21. Елисеева В.И., Герасимова A.C., Француз 3.C., Титова Н.В., Афанасьева Н.В., Борисова Т.И. Регулирование структуры и морфологии полимера при латексной полимеризации мономерных композиций // Высокомолек. соед. 1984. Т. А26. № 7. С. 1382-1389.

22. Елисеева В.И., Асламазова Т.Р. Эмульсионная полимеризация в отсутствие эмульгатора и латексы на ее основе // Успехи химии. 1991. Т. 60. № 2. С. 398-429.

23. Прокопов Н.И., Грицкова И.А., Черкасов В.Р., Чалых А.Е. Синтез монодисперсных функциональных полимерных микросфер для иммунодиагно-стических исследований // Успехи химии. 1996. Т. 65. № 2. С. 178 192.

24. Bangs L.B. In The Latex Course. Bangs Laboratories Inc.: Carmel. Indianapolis. USA, 1996. Vol.4,p 1-15.

25. Kawaguchi H. Functional polymer microspheres // Prog. Polym. Sci. 2000. V. 25. P. 1171 1210.

26. Fitch R.M. The homogeneous nucleation of polymer colloids // Brit. Polym. J. 1973. V. 5. № 6. P. 467-483.

27. Асламазова T.P., Борейко Jl.B., Елисеева В.И. К механизму безэмульгаторной латексной полимеризации // Высокомол. соед. 1987. Т. 29 Б. № 6. С. 434-437.

28. Лишанский И.С., Меньшикова А.Ю., Евсеева Т.Г., Комаровская Э.Э., Шубин В.Е., Сахарова Н.А. Особенности синтеза безэмульгаторных латексов полистирола в присутствии карбоксилсодержащего инициатора // Высокомол. соед. 1991. Т. 33 Б. №6. С. 413-416.

29. Arai M., Arai K., Sailo S. Polymer particle formation in soapless emulsion polymerization//J. Polym. Sci.: Polym. Chem. Ed. 1976. V. 17. № 11. P. 3655-3665.

30. Goodwin J.W., Ottewill R.H., Pelton R. Studies on the preparation and characterization of monodisperse polystyrene latices // Coll. Polym. Sci. 1979. V. 257. P. 61-69.

31. Goodwin J.W., Ottewill R.H., Pelton R., Vuanello G., Yates D.E. Control of particle size in the formation of polymer latices // Brit. Polym. J. 1978. V. 10. № 9. P. 173-180.

32. Goodwin J.W., Hearn J., Но C.C., Ottewill R.H. Studies on the preparation and characterization of monodisperse polystyrene latices // Coll. Polym. Sci. 1974. V. 252. № 6. P. 464-471.

33. Елисеева В.И., Иванчев C.C., Кучанов С.И., Лебедев А.В. Эмульсионная полимеризация и ее применение в промышленности М.: Химия, 1976. 240 с.

34. Меньшикова А.Ю., Дмитриева И.Б., Кучук В.И., Скуркие Ю.О., Евсеева Т.Г., Шабсельс Б.М. Электроповерхностные свойства латексов сополимеров стирола и акролеина с поверхностью, модифицированной белком // Коллоидн. журн. 1999. Т. 61. № 6. С. 799-808.

35. Kondo A., Kawano Т., Itoh F., Higashtani K. Immunological agglutination kinetics of latex particles with physically adsorbed antigen // J. Immunol. Methods. 1990. V. 135.P. 111-119.

36. Margel S., Wiesel Е. Acrolein polymerization: monodisperse, mono, and hybrido microspheres, synthesis, mechanism, and reactions // J. Polym. Sci.: Polym. Chem. Ed. 1984. V. 22. P. 145-156.

37. Rembaum A., Chang M., Richrads M. Structure and immunological properties of polyacrolein formed by means of ionizing radiation and base catalysis // J. Polym. Sci.: Polym. Chem. Ed. 1984. V. 22. № 3. P. 609-621.

38. Жоров O.B., Прейгерзон B.A., Лукин В. 1995. V. 21. № 4. P. 261-263.

39. Лукин Ю.В., Бахарев В.И., Заиченко А.С., Воронов С.А., Зубов В.П., Грицкова И.А., Праведников А.Н. Полиакролеиновые латексы: синтез, введение наполнителей и механизм формирования // ДАН СССР. 1985. Т. 285. С. 159-161.

40. Лукин Ю.В., Трифонов В.Д., Туркин С.И., Зубов В.П. Полиакролеиновые латексы в качестве иммунореагентов // Труды МХТИ. 1985. Т. 135. С. 137-141.

41. LeDissez С., Wong P.C., Mitchell A.R., Brooks D.E. Analysis of Surface Aldehyde Functions on Surfactant-Free Polystyrene/Polyacrolein Latex // Macromolecules. 1996. V. 29. № 3. P. 953-959.

42. Kowalczyk D., Marsault J.P., Slomkowski S. Atomic force microscopy of human serum albumin (HSA) on poly(styrene/acrolein) microspheres // Colloid and Polymer Science. 1996. V. 274. № 6. P. 513-519.

43. Yan C., Zanhg X., Sun Z. Poly(styrene-co-Acrolein) latex particles: copolymerization and characteristics // J. Appl. Polym. Sci. 1990. V. 40. P. 89-98.

44. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии. Поверхностные явления , и дисперсные системы. М.: Химия, 1982. 400 с.

45. Неймана Р.Э. Практикум по коллоидной химии. Коллоидная химия латексов и поверхностно-активных веществ. М.: Высшая школа, 1972. 175 с.

46. Григоров О.Н., Карпова И.Ф., Козьмина З.П., Тихомолова К.П., Фридрихсберг Д.А., Чернобережский Ю.М. Руководство к практическим работам по коллоидной химии, изд. 2-е М.: Химия, 1964. 332 с.

47. Фролова Ю.Г., Горского А.С. Лабораторные работы и задачи по коллоидной химии М.: Химия, 1986. 216 с.

48. Hidalgo-Alvarez R., Martin-Rodriguez A., Fernandez A., Bastos D., Martinez F., de las Nieves F J. Electrokinetic properties, colloidal stability and agregation kinetics of polymer colloids // Adv. Colloid Interface Sci. 1996. V. 67. P. 1-118.

49. Нейман Р.Э. Очерки коллоидной химии синтетических латексов В.: Издательство Воронежского университета, 1980. 335 с.

50. Bastos D., de las Nieves F.J. Effect of electrolyte type on the electrokinetic behavior of sulfonated polysterene model colloids // Coll. Polym. Sci. 1993. V. 271. P. 860-867.

51. Gallardo V., Salecedo J., Vera P., Delgado A.V. Electric and adsorption properties of pharmaceutical polymers. Part I: Electrokinetics of aquacoat // Coll. Polym. Sci. 1993. V. 271. P. 967-973.

52. Dittgen M., Zozel B. Influence of valence and concentration of electrolytes on the dzeta potential of polyacrylic lattices // Coll. Polym. Sci. 1991. V. 269. P. 259-263.

53. Peula-Garcia J.M., Hidalgo-Alvarez R., de las Nieves F.J. Colloid stability and electrokinetic characterization of polymer colloids prepared by different methods //

54. Colloid and Surface. A: Physicochem. and Engineer. Aspects. 1997. V. 127. P. 19-24.

55. Kondo A., Kawano Т., Itoh F., Higashitani K. // J. Immunol. Methods. 1990. V. 135.P. 111.

56. Husband J.S., Adams J.M. // Coll. Polym. Sci. 1992. V. 270. № 3. P. 1194.

57. Serra J., Puig J., Martin A., Galisteo-Gonzalez F., Galvez M.J., Hidalgo-Alvarez R. On the adsorption of IgG onto polystyrene particles: electrophoretic mobility and critical coagulation concentration // Coll. Polym. Sci. 1992. V. 270. P. 574-583.

58. Galisteo-Gonzalez F., Martin-Rodriguez A., Hidalgo-Alvarez R. Adsorption of monoclonal IgG on polystyrene microspheres // Coll. Polym. Sci. 1994. V. 272. P. 352358.

59. Prescott J.H., Shiau S., Rowell R.L. Characterization of Polystyrene Latexes by Hydrodynamic and Electrophoretic Fingerprinting // Langmuir. 1993. V. 9. P. 20712076.

60. Marra A., Peuvrel-Disdier E., Wittemann A., Guo X., Ballauff M. Reology of dilute and semidilute suspensions of spherical polyelectrolyte brushes // Coll.Polym. Sci. 2003. V. 281. P. 491-496.

61. Basinska Т., Slomkowski S., Dworak A., Panchev I., Chehimi M.M. Synthesis and characterization of poly(styrene/alpha-t-butoxy- omega-vinylbenzyl-polyglycidol) microspheres // Colloid and Polymer Science. 2001. V. 279. № 9. P. 916-924.

62. Gagnon D.R., McCarthy T.J. Polymer surface reconstruction by diffusion of organic functional groups from and to the surface // J. of Applied Polymer Science. 1984. V. 29. № 12. P. 4335-4340.

63. Ugelstad J., Mork P.C., Kaggerud K.H., Ellingsen Т., Berge A. Swelling of oligomer-polymer particles. New methods of preparation of emulsions and polymer dispersions //Adv. in Colloid and Interface Sci. 1980. V. 13. P. 101 140.

64. Ugelstad J., Mfutakamba H.R., Mork P.C., Ellingsen Т., Berge A., Schmid R., Holm L., Jorgedal A., Hansen F.K., Nustad K. Preparation and application of monodisperse polymer particles // J. Polym. Sci. Polym. Symp. 1985. V. 72. P. 225-240.

65. Dispersion polymerization in organic media; Barrett K.E.J.,Ed.; Wiley: London, New York, 1974. 322 p.

66. Paine A.J. Dispersion polymerization of styrene in polar solvents. 7. A simple mechanistic model to predict particle size // Macromolecules. 1990. V. 23. P. 3109-3117.

67. Kawaguchi S., Winnik M.A., Ito K. Dispersion Copolymerization of N-Butyl Methacrylate with Poly(Ethylene Oxide) Macromonomers in Methanol-Water -Comparison of Experiment with Theory // Macromolecules. 1995. V. 28. № 4. P. 11591166.

68. Deslandes Y., Mitchell D.F., Paine A.J. X-Ray Photoelectron-Spectroscopy And Static Time-Of-Flight Secondary-Ion Mass-Spectrometry Study of Dispersion , Polymerized Polystyrene Latexes // Langmuir. 1993. V. 9. № 6. P. 1468-1472.

69. Shen S., Sudol E.D., El-Aasser M.S. Dispersion Polymerization of Methyl-Methacrylate Mechanism of Particle Formation // J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 1994. V. 32. № 6. P. 1087-1100.

70. Lacroix-Desmazes P., Guillot J. Dispersion polymerization of styrene in ethanol-water media: Monomer partitioning behavior and locus of polymerization // J. Polym. Sci., Part B: Polym. Phys. 1998. V. 36. P. 325-335.

71. Lok K.P., Ober C.K. Particle size control in dispersion polymerisation of polystyrene // Can.J.Chem. 1985. V. 63. P. 209-216.

72. Tseng C.M., Lu Y.Y., El Aasser M.S., Vanderhoff J.W. Uniform Polymer Particles by Dispersion Polymerization in Alcohol // J. Polym. Sci.: Part A: Polymer Chem. 1986. V. 24. P. 2995 3007.

73. Saenz J.M., Asua J.M. Dispersion Polymerization in Polar-Solvents // Journal of Polymer Science Part a-Polymer Chemistry. 1995. V. 33. № 9. P. 1511-1521.

74. Lu Y.Y., El Aasser M.S., Vanderhoff J.W. Dispersion Polymerization of Styrene in Ethanol: Monomer Partitioning Behavior and Locus of Polymerization // J. Polym. Sci.: Part B: Polym. Physics. 1988. V. 26. P. 1187- 1203.

75. Liu J., Chew C.H., Wang S.Y. Dispersion polymerization of styrene in aqueous ethanol media using poly(ethylene oxide) macromonomer as a polymerizable stabilizer // Polymer. 1998. V. 39. № 2. P. 283-289.

76. Shen S., Sudol E.D., Elaasser M.S. Control of particle size in dispersion polymerization of methyl methacrylate // J. Polym.Sci., Polym. Chem. 1993. V. 31. № 6. P. 1393-1402.

77. Tuncel A., Kahraman R., Piskin E. Monosize polystyrene microbeads by dispersion polymerization // J.Appl. Polym. Sci. 1993. V. 50. № 2. P. 303-319.

78. Chen Y., Yang H.W. Hydroxypropyl cellulose (HPC)-stabilized dispersion polymerization of styrene in polar solvents: Effect of reaction parameters // J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 1992. V. 30. № 13. P. 2765-2772.

79. Ober C.K., Lok K.P. Formation of large monodisperse copolymer particles by dispersion polymerization // Macromolecules. 1987. V. 20. P. 268-273.

80. Tuncel A., Kahraman R., Piskin E. Monosize polystyrene latices carrying functional groups on their surfaces // Journal of Applied Polymer Science. 1994. V. 51. P. 1485-1498.

81. Baines F.L., Dionisio S., Billingam N.C., Armes S.P. Use of Block Copolymer Stabilizers for the Dispersion Polymerization of Styrene in Alcoholic Media // Macromolecules. 1996. V. 29. № 9. P. 3096-3102.

82. Kobayashi S., Uyama H., Choi J.H., Matsumoto Y. Preparation of Micron-Size Monodisperse Poly(Methyl Methacrylate) Particles Using Poly(2-Oxazoline) Macromonomer // Polymer International. 1993. V. 30. № 2. P. 265-270.

83. Dawkins J.V., Neep D.J., Shaw P.L. Non-aqueous polystyrene dispersions: steric stabilization by partially hydrolysed poly(vinyl alcohol) in methanolic media // Polymer. 1994. V. 35. № 24. P. 5366-5368.

84. Lacroix-Desmazes P., Guyot A. Reactive surfactants in heterophase polymerization. Part XXI kinetics of styrene dispersion polymerization stabilized withpoly(ethylene oxide) macromonomers // Polym. Adv. Technol. 1997. V. 8. № 10. P. 601607.

85. Bourgeat-Lami E., Guyot A. Thiol-ended polyethylene oxide as reactive stabilizer for dispersion polymerization of styrene // Colloid Polym. Sci. 1997. V. 275. № 8. P. 716 -729.

86. Laus M., Dinnella L., Lanzarini G. Core-shell functional microspheres by dispersion polymerization: 2. Synthesis and characterization // Polymer. 1996. V. 37. № 2. P. 343-347.

87. Ober C.K., Hair M.L. The effect of temperature and initiator levels on the dispersion polymerization of polystyrene // J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 1987. V. 25. №5. P. 1395-1407.

88. Thomson В., Rudin A., Lajoie G. Dispersion copolymerization of styrene and divinylbenzene: Synthesis of monodisperse, uniformly crosslinked particles // J. of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 1995. V. 33. № 3. P. 345-357.

89. Saenz J., Asua J.M. Dispersion copolymerization of styrene and butyl acrylate in polar solvents // J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 1996. V. 34. № Ю. P. 1977-1992.

90. Balmus V., Tuncel A., Piskin E. Production of polymethylmethacrylate particles by dispersion polymerization in aqueous media with eerie ammonium nitrate // J. Appl. Polym. Sci. 1996. V. 60. № 5. P. 697-704.

91. Saenz J., Asua J.M. Kinetics of the Dispersion Copolymerization of Styrene and Butyl Acrylate // Macromolecules. 1998. V. 31. № 16. P. 5215-5222.

92. Shen S., Sudol E.D., Elaasser M.S. // J. Polym.Sci., Polym. Chem. 1993. V. 31. № 6. P. 1393.

93. Ocubo M., Ikegami K., Yamamoto Y. // Colloid. Polym. Sci. 1989. V. 267. P. 193.

94. Takattashi K., Miyamori S., Uyama H., Kobayashi S. Preparation of micron-size monodisperse poly(2-hydroxyethyl methacrylate) particles by dispersion polymerization // J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 1996. V. 34. № 2. P. 175-182.

95. Ober C.K. Dispersion copolymerisation in non-aqueous media // Macromol. Chem. Macromol. Symp. 1990. V. 35/36. P. 87-104.

96. Paine A.J. Dispersion polymerization of styrene in polar solvents. A simple mechanistic model to predict particle size // Macromolecules. 1990. V. 23. P. 3109-3117.

97. Paine A.J. Dispersion polymerization of styrene in polar solvents. I. Grafting mechanism of stabilization by hydroxypropyl cellulose // J. Colloid Interface Sci. 1990. V. 138. № 1.Р. 157-169.

98. Winnik F.M., Paine A.J. Dispersion polymerization of styrene in polar solvents. Characterization of stabilizer in ordinary and precipitated particles by fluorescence quenching // Langmuir. 1989. V. 5. P. 903 910.

99. Kawaguchi S., Ito K., Winnik M.A., Ito K.H. NMR Study of Dispersion Copolymerization of n-Butyl Methacrylate with Poly(ethylene oxide) Macromonomer in Deuterated Methanol-Water // Macromolecules. 1996. V. 29. № 13. P. 4465-4472.

100. Paine A.J., Shivers R.R. Non-equilibrium particle morphology in dispersion-polymerized polystyrene particles // Can.J.Chem. 1995. V. 73. P. 1747-1756.

101. Ortega-Vinuesa J.L., Galvez Ruiz M.J., Hidalgo-Alvarez R. F(ab')2-Coated Polymer Carriers: Electrokinetic Behavior and Colloidal Stability // Langmuir. 1996. V. 12. № 13. P. 3211 -3220.

102. Norde W. Driving forces for protein adsorption at solid surfaces // Macromol. Symp. 1996. V. 103. P. 5-18.

103. Furusawa K., Arai T. Eiectrical double layer on a latex surface and protein adsorption // Surfactant Science Series. 1998. V. 76. P. 441-446.

104. Galisteo-Gonzalez F., Puig J., Martin-Rodriguez A., Serra-Domenech J., Hidalgo-Alvarez R. Influence of electrostatic forces on IgG adsorption onto polystyrene beads // Colloids Surface B. 1994. V. 2. P. 435-441.

105. Peula-Garcia J.M., Hidalgo-Alvarez R., de las Nieves F.J. Protein co-adsorption on different polysteren latexes: electrokinetic characterization of polymer colloid stability // Coll. Polym. Sci. 1997. V. 275. P. 198-202.

106. Arai Т., Norde W. The behavior of some model proteins at solid-liquid interfaces // Colloids and Surfaces. 1990. V. 51. P. 1-15.

107. Polymer latexes. Preparation, characterization, and applications; Daniela E.S., Sudol E.D., El-AasserM.S. Eds., Washington, DC. 1992. Vol. 492. 462 p.

108. Shirahama H., Suzawa T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Styrene/2-Hydroxyethyl Methacrylate copolymer latex // J. Coll. Interface Sci. 1985. V. 104. № 2. P. 416-421.

109. Walker H.W., Grant S.B. The coagulation and stabilization of colloidal particles by adsorbed DNA block copolymers: the role of polymer conformation // Langmuir. 1996. V. 12. N 13. P. 3151-3156.

110. Carter D.C., He X.M., Munson S.H., Twigg P.D., Gernert K.M., Broom M.B., Miller T.Y. Three-Dimensional Structure of Human Serum Albumin. // Science. 1989. V. 244. P. 1195-1198.

111. Carter D.C., He X.M. Structure of human serum albumin. // Science. 1990. V. 249. P. 302-303.

112. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине // Под ред. Грызунова, А., Добрецова, Г. Е. М.: Ириус, 1994.Т. 1, 2.

113. Buijs J., Lichtenbelt J.W.T., Norde W., Lyklema J. Adsorption of Monoclonal Iggs and Their F(ab')2 Fragments onto Polymeric Surfaces // Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 1995. V. 5. № 1-2. P. 11-23.

114. Suzawa Т., Shirahama H. Adsorption of plasma proteins onto polymer latices // Adv. Colloid Interface Sci. 1991. V. 35. P. 139-172.

115. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия M.: Просвещение, 1987. 450 с.

116. Basinska Т. Poly(styrene/acrolein) and poly(styrene/a-tetr-butoxy-w-vinilbenzyl-polyglycidol. Similarities and differences // E-Polymers. 2002. № 011. P. 1-13.

117. Horak D., Straka J., Schneider В., Lednicky F. Poly(ethylene dimethacrylate) particles with poly(glycidyl methacrylate) functionalities // Polymer. 1994. V. 35. № 6. P. 1195-1202.

118. Nustad K., Johansen L., Schmid R., Ugelstad J., Ellingsen Т., Berge A. Covalent Coupling of Proteins to Monodisperse Particles. Preparation of Solid Phase Second Antibody // Agent and Actions Suppl. 1982. V. 9. P. 207 212.

119. Microspheres: Medical and Biological Application; Rembaum A., Tokes Z.A. Eds.; CRC, Boca Raton, FL, 1988. 234 p.

120. Ganachaud F., Mouterde G., Delair Т., Elaissari A., Pichot C. Preparation and Characterization of Cationic Polystyrene Latex- Particles of Different Aminated Surface-Charges // Polymers for Advanced Technologies. 1995. V. 6. № 7. P. 480-488.

121. Yen S.P.S., Rembaum A., Molday R.W., Dreyer W. In Emulsion Polymerization: Am. Chem. Soc. Symp. Ser.; Am. Chem. Soc.: Washington, 1976. p 236 244.

122. Ugelstad J., Soderberg L., Berge A., Bergstrom J. Monodisperse polymer particles A step forward for chromatography. //Nature. 1983. V. 303. P. 95-96.

123. Margel S., Rembaum A. Synthesis and Characterization of Poly(glutaraldehyde). A Potential Reagent for Protein Immobilization and Cell Separation // Macromolecules. 1980. V. 13. № l.P. 19-24.

124. Formoso C., Olsen D.A. WO Patent № 90/07119 Synthetic HIV-Like Peptides, Their Compositions And Uses. 1990.

125. Wang C.Y. Patent EP-328403 .- Synthetic peptides related to the HIV-GP 120-env-protein, and their use. 1989.

126. Weiner D.B., Ugen K.E. Patent US 5556744 Methods and compositions for diagnosing and treating certain HIV infected patients. 1996.09.17.

127. Alizon M., Montagnier L. Patent US 5580739 Peptides of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) and in vitro diagnostic methods and kits employing the peptides for the detection of HIV-2. 1996.12.03.

128. Меньшикова А.Ю., Шабсельс Б.М., Евсеева Т.Г., Красникова Е.Н., Власов Г.П. Моделирование реакций молекулярного узнавания на поверхности полимерных микросфер // В сб. Структура и динамика молекулярных систем. 2003. Т. 3 С. 73-77.

129. Kondo A., Furukawa S., Taira М., Higashitani К. Effect of peptide antigenic determinant properties on adsorption equilibrium of anty-peptide antibodies // J. Ferment. Bioeng. 1991. V. 72. № 6. P. 409-412.

130. Molina-Bolivar J.A., Galisteo-Gonzalez F., Quesada-Perez M., Hidalgo-Alvarez R. Agglutination Kinetics of F(ab')2 coated polymer colloids // Coll. Polym. Sci. 1998. V. 276. P. 1117-1124.

131. Stramer S., Allain J.-P. Patent EP 0445650. Detection of anti-HIV antibodies. 1991.09.11.

132. Новые методы иммуноанализа // Под ред. Коллинза. М.: Мир, 1991. 240 с.

133. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций // Под ред. Перадзе, Т. В., Халонена, П. М.: «Медицина», 1985. 302 с.

134. Hadfield S.G., Lane A., Mclllmurray М.В. A novel coloured latex test for the detection and identification of more than one antigen // Journal of Immunological Methods. 1987. V. 97. № 2. P. 153-158.

135. Quinn Т., Riggin C., Kline R., Francis H., Mulanga K., Sension M., Fauci A. Rapid latex agglutination assay using recombinant envelope polypeptide for the detection of antibody to the HIV. // JAMA. 1988. V. 260. № 4. P. 510-513.

136. Аракелов C.A., др. и. Сравнительная характеристика тест-систем для определения антител к ВИЧ. В Кн. Фундаментальные и прикладные вопросы проблемы СПИД. М.: 1988.

137. Лещинская Н.П., Смольская Т.Т. Методы серодиагностики ВИЧ-инфекции М.: Изд-во"Пульс" НПО Союзмединформ, вып.4-12. 1992. 1-36 с.

138. Cavell E.A.S., Meeks А.С. Temperature dependence of rate of initiation of polymerization 4,4'-azo-bis-4-cyanopentanoic acid // Macromolek. Chem. 1967. V. 108. P. 304 306.

139. Brandrup J., Immergut E.H. In Polymer handbook; 3 rd ed.; John Wiley and Sons. 1989. p 397.

140. Goode N.P., Davison A.M., Gowland G., Shires M. Preparation, purification and analysis of BSA-coated latex particles for in vivo studies. Non-ionic adsorbance of unbound protein ligand // J. Immunol. Methods. 1986. V. 92. № 1. P. 31-35.

141. Столяров Б.В., Савинов И.М., Витенберг А.Г. Руководство к практическим работам по газовой хроматографии. Л.: Химия, 1978. 243 с.

142. Labib М.Е., Robertson A.A. The conductometric titration of latices // J. Colloid Interface Sci. 1980. V. 77. № 1. P. 151-161.

143. Staros J. V., Wright R.W., Swingle D.M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions // Anal. Biochem. 1986. V. 156. № 1. p. 220-222.

144. Tennikova Т., Freitag R. An introduction to monolithic disks as stationary phases for high performance biochromatography // J. High Res. Chromatogr. 2000. V. 23. № 1. P. 27-38.

145. Tennikova Т., Reusch J. Short monolithic beds: history and introduction to the field // J. of Chromatogr. A. 2005. V. 1065. P. 13-17.

146. Хэм Д. Сополимеризация. M.: Химия, 1971. 615 с.

147. Абрамзон А.А. Повехностно-активные вещества: свойства и применение. Д.: Химия, 2е изд. 1981. 304 с.

148. Ober С.К., Lok К.Р., Hair M.L. // J. Polym. Sci., Polym. Lett. Ed. 1985. V. 23. № 2. P. 103.

149. Jayachandran K.N., Chatterji P.R. Preparation of Linear and Crosslinked Polymer Microspheres by Dispersion Polymerization // J. Macromol. Sci. Polym. Rev. 2001. V. C41.№ 1-2. P. 79-94.

150. Сидельковская Ф.П. Химия N-винилпирролидона. M.: Наука, 1970. 249 с.

151. Беллами JI. Инфракрасные спектры молекул. М.: Изд-во инстр. лит., 1957. 444 с.

152. Меньшикова А.Ю., Евсеева Т.Г., Чекина Н.А., Иванчев С.С. Монодисперсные микросферы на основе сополимеров акролеина // Журн. прикл. химии. 2001. Т. 72. № 10. С. 1677-1683.

153. Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. № 1. P. 265-275.

154. Elgersma F. Competitive adsorption of albumin and monoclonal immuno g-globulin molecules on polystyrene surfaces, Agricultural Univercity, Netherlands, Wageningen, 1990.

155. Shubin V.E., Hunter R.J., О Brien R.W. Electroacoustic and dielectric study of surface conduction // J. Coll. Interface Sci. 1993. V. 159. P. 174-179.

156. Шубин В.Е., Исакова Н.В., Сидорова М.П., Меньшикова А.Ю., Евсеева Т.Г. Электроповерхностные свойства карбоксильного латекса и их анализ на основе моделей ионных пар // Коллоидн. журн. 1990. Т. 52. № 5. С. 535-541.

157. EsserP. Principles in Adsorption to Polystyrene //Nunc Bulletin. 1988. № 6. P. 1-5.

158. Кирш Ю.Э. Поли-Ы-винилпирролидон и другие поли-Ы-виниламиды. М.: Наука, 1998. 252 с.

159. Wu J.Y., Riggin С.Н., Seals J.R., Murphy C.I., Newman M.J. In vitro measurement of antigen-specific cell-mediated immune responses using recombinant HIV-1 proteins adsorbed to latex microspheres // J. Immunol, methods. 1991. V. 143. № l.P. 1-9.

160. Advances in Protein Chemistry; AnfinsenC.B., Edsall J.T., Richards F.M. Eds.; V. 37. 347 p.