Карбоксилсодержащие полимерные микросферы для изучения трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных

Левшенко, Елена Николаевна

Карбоксилсодержащие полимерные микросферы для изучения трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Левшенко, Елена Николаевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.06 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Карбоксилсодержащие полимерные микросферы для изучения трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных»

Автореферат диссертации на тему "Карбоксилсодержащие полимерные микросферы для изучения трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных"

005054325

На правах рукописи

ЛЕВШЕНКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

КАРБОКСИЛСОДЕРЖАЩИЕ ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОСФЕРЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ТРЕХМЕРНОГО СТРОЕНИЯ СОСУДИСТОГО РУСЛА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Специальности: 02.00.06 — высокомолекулярные соединения

03.01.06 — биотехнология (в т.ч. бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

- 8 НОЯ 2012

МОСКВА 2012

005054325

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова на кафедре «Химия и технология высокомолекулярных соединений им. С.С. Медведева» и в ФГБУН Научно-исследовательском институте физико-химической медицины ФМБА России в лаборатории морфологии.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

заслуженный деятель науки РФ ГРИЦКОВА Инесса Александровна

доктор медицинских наук, профессор ГУСЕВ Сергей Андреевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

ПАПИСОВ Иван Михайлович профессор кафедры химии Московского автомобильно-дорожного государственного технического университета

доктор химических наук, профессор ВАСИЛЕНКО Иван Александрович

директор испытательной лаборатории ООО «ОЛФАРМ»

Ведущая организация: Государственный научный центр РФ Федеральное государственное унитарное предприятие «Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский физико-химический институт имени Л.Я.Карпова» (ФГУП «НИФХИ им.Л.Я.Карпова»)

Защита состоится «29» ноября 2012 г. в 1500 на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.04 в ФГБОУ ВПО Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, пр. Вернадского, д. 86, корп. Т, ауд. Т-410.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Московского государственного университета тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 2012 года.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 212.120.04 Доктор химических наук, профессор

/^¡кШ-Ч Грицкова И. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Одной из актуальных проблемных областей применения полимерных микросфер в биотехнологии может быть их использование для исследования васкуляризации тканей (степени развития в них сосудистого русла), что необходимо для понимания патогенеза опухолевого роста.

Существующие методы исследования сосудистого русла, основанные на заполнении их смесью тушь-желатин и азотнокислым серебром или быстрополимеризующимся мономером с последующим изучением препаратов с помощью светового или растрового электронного микроскопа, не позволяют последовательно изучать закономерности ветвления сосудов, что необходимо для понимания их функционального состояния.

В этом плане могут быть перспективными полимерные микросферы, окрашенные люминесцентным красителем, с использованием флуоресцентной конфокальной микроскопии для построения трехмерной модели сосудов. Полимерные микросферы должны обладать высокой интенсивностью флуоресценции, низкой адгезивной активностью к внутренней поверхности сосуда, что исключит их прилипание к стенкам сосуда, и не образовывать коньюгатов друг с другом и с биологическими молекулами.

Для построения модели сосудистого русла с высоким разрешением (менее 0,1 мкм) и изучения характера контуров просвета необходимо плотное заполнение сосудов полимерными микросферами. Размер микросфер выбирают, исходя из среднего размера сосудов экспериментальных животных, который колеблется в интервале 4-100 мкм. Минимальный размер частиц для заполнения всего русла должен быть меньше или соизмерим с длиной волны фиолетовой границы видимого излучения (0,4-0,76мкм или 25000-13158см ).

Цель работы. Синтез карбоксилсодержащих полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам, содержащих флуоресцентные метки, для создания метода визуализации трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных для изучения ангиогенеза.

Научная новизна

1. Определены условия синтеза карбоксилсодержащих полимерных микросфер разной природы с узким распределением по диаметрам, что позволило выбрать тип и природу полимерных микросфер, позволяющих плотно заполнять сосудистое русло экспериментальных животных для изучения его строения.

2. На основании данных по изучению кинетических закономерностей полимеризации стирола и метилметакрилата и сополимеризации стирола с метакриловой кислотой в присутствии нерастворимых в воде ПАВ разработаны рецептуры синтеза полимерных микросфер разного диаметра с

узким распределением по размерам, устойчивых в физиологических растворах.

3. Впервые для синтеза карбоксилсодержащих полистирольных и полиметилметакрилатных суспензий использовано кремнийорганическое гемини-ПАВ - а, ю-бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан, и показано, что оно проявляет высокие поверхностно-активные свойства на границе мономер/вода (о1,2 = 28,1 мДж/м2) и образует прочные межфазные слои на поверхности ПМЧ/вода.

4. Разработана методика визуализации трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных с помощью набора флуоресцентно меченных полимерных микросфер. Этот метод позволяет избирательно блокировать заполнение сосудов заданного внутреннего диаметра и последовательно анализировать их ветвление.

5. Показано, что разработанный метод визуализации трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных с помощью набора флуоресцентно меченных полимерных микросфер позволяет получить информацию о характере контура просвета сосуда для анализа наличия или отсутствия препятствий току крови и степени извитости стенки сосуда.

6. Разработанная методика визуализации трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных с помощью набора флуоресцентно меченных полимерных микросфер опробована и рекомендована для использования медицинским учреждениям.

7. Показаны перспективы использования полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер для создания иммунодиагностических тест-систем.

Практическая значимость работы. Разработанная методика опробована в

ФГБУН Научно-исследовательский институт физико-химической медицины

ФМБА России, выдана рекомендация по ее использованию медицинским

учреждениям.

Автор защищает:

• Кинетические закономерности полимеризации стирола и метилметакрилата, а также сополимеризации стирола с метакриловой кислотой в отсутствие ПАВ и в присутствии нерастворимых в воде ПАВ различной природы.

• Рецептуры синтеза полимерных микросфер с узким распределением по размерам и средними диаметрами в интервале 0,37 - 1,6 мкм.

• Новое карбоксилсодержащее ПАВ с двумя полярными группами (гемини-ПАВ) а,ю - бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан в качестве стабилизатора полимерных суспензий при гетерофазной полимеризации мономеров.

• Методологию, позволяющую с помощью набора флуоресцентно меченных полимерных микросфер разного размера изучать строение сосудистого русла экспериментальных животных.

• Перспективы использования полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер для создания иммунодиагностических тест-систем.

Личное участие автора являлось основополагающим на всех этапах работы и состояло в постановке цели исследования, разработке экспериментальных и теоретических подходов при выполнении эксперимента и обобщении полученных результатов.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2010» (Москва, 2010), Научной секции ПАВ Научного совета по коллоидной химии и физико-химической механике РАН «Поверхностно-активные вещества в технологических процессах» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 статей по теме диссертационной работы, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 107 страницах машинописного текста, включая 14 таблиц, 39 рисунков. Список литературы содержит 98 наименований.

Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована ее цель.

Глава 1. В Литературном обзоре рассмотрены основные области применения полимерных микросфер в биотехнологии и медицине, обсуждены материалы по способам синтеза полимерных микросфер, методам окрашивания полимерных микросфер флуоресцентными красителями, а также проведен обзор имеющихся в литературе сведений о существующих способах изучения строения сосудов.

Глава 2. В Экспериментальной части представлен перечень использованных веществ и их индивидуальных характеристик, методов синтеза полимерных микросфер и исследования их свойств (дилатометрический метод, метод сталогометрии, вискозиметрический метод, электронная сканирующая микроскопия, конфокальная сканирующая микроскопия).

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1. Синтез полистиролметакриловых суспензий

Наиболее часто в качестве носителей биолигандов используют полимерные микросферы с карбоксильными группами на поверхности. Это объясняется тем, что способы их синтеза относительно просты и хорошо изучены. Их получают сополимеризацией гидрофобных мономеров (чаще всего стирола) с ненасыщенными кислотами - акриловой, метакриловой, итаконовой и т.д. в присутствии или в отсутствие эмульгатора; затравочной сополимеризацией стирола и ненасыщенных кислот на полистирольных затравочных частицах; полимеризацией стирола с поверхностно-активными сомономерами или инициаторами, содержащими в своей структуре карбоксильные группы; а также полимеризацией стирола в присутствии нерастворимых в воде карбоксилсодержащих ПАВ. Однако сложность процесса состоит не только в том, что необходимо исключить полимеризацию полярного сомономера в водной фазе (для получения суспензий с узким распределением частиц по размерам), но и в концентрировании карбоксильных групп на поверхности частиц.

Распределение карбоксильных групп между поверхностью частиц и их объемом, обычно наблюдаемое при этом синтезе, является причиной постоянного изменения их свойств при хранении вследствие лиофилизации поверхности из-за миграции карбоксилсодержащих фрагментов полимерных цепей к границе раздела фаз.

Все эти процессы являются причиной того, что хорошо изученная и описанная в литературе сополимеризация стирола с метакриловой кислотой при обычно используемой ее концентрации 5-10% в расчете на стирол не позволяет синтезировать полимерные микросферы с узким РЧД.

Было высказано предположение о том, что снижение концентрации МАК в эмульсии и добавление ее не в водную, а в мономерную фазу, позволит свести к минимуму побочные процессы, приводящие к расширению распределения частиц по размерам, увеличению их числа и снижению устойчивости реакционной системы.

Сополимеризацию стирола с МАК проводили в отсутствие ПАВ при объемном соотношении стирол/вода, равном 1:9, температуре 70С, концентрации инициатора персульфата калия (ПК) 1%масс. в расчете на смесь мономеров. Концентрацию МАК изменяли в интервале от 0,05 до 2%масс. в расчете на стирол.

Было показано, что с уменьшением концентрации метакриловой кислоты существенно уменьшается скорость сополимеризации из-за снижения числа частиц, образующихся при полимеризации полярного мономера в водной фазе. Полная конверсия мономеров достигается за 7 - 12ч. Средний размер частиц уменьшается от 0,5 до 0,3 мкм с увеличением концентрации МАК от 0,05 до 2%масс. в расчете на стирол. Однако полимерные суспензии были неустойчивы в физиологических растворах, т.е. не соответствовали предъявляемым требованиям.

Устойчивость полистиролметакриловых суспензий удалось увеличить при

сополимеризации стирола с метакриловой кислотой в тех же условиях, но в присутствии нерастворимого в воде ПАВ ди-п-толил-о-карбалкоксифенилкарбинола (ДТК). В этом случае образование ПМЧ происходило преимущественно из микрокапель мономера, а формирование их по одному механизму и образование прочного межфазного слоя из молекул ДТК и полимера позволило получить полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам.

Присутствие в эмульсии мономеров стабилизатора ДТК (1%масс. в расчете на мономер) практически не меняет скорость сополимеризации, но увеличивает устойчивость суспензии в процессе синтеза. Распределение частиц по размерам приведено на рисунке 1. Видно, что средний размер частиц составляет 0,6 мкм при концентрации МАК в эмульсии, равной 0,05%масс. в расчете на стирол, и 0,3 мкм при концентрации МАК, равной 2%масс. в расчете на стирол.

Сополимеризация стирола с метакриловой кислотой в присутствии ДТК протекает до полной конверсии мономеров за 10-12 часов (в зависимости от содержания МАК в эмульсии).

Рисунок 1. Микрофотографии и распределение по размерам частиц, полученных при

полимеризации стирола с различным содержанием МАК в присутствии ДТК: 1 - 0,05%, 2 - 2%.

Устойчивыми в физиологическом растворе оказались полимерные суспензии со средним диаметром частиц 0,3мкм, т.е. только они соответствовали требованиям, предъявляемым к полимерным суспензиям для использования при решении поставленной задачи.

3.2. Синтез карбоксилсодержащих полистирольных суспензий

Синтез полистирольных карбоксилсодержащих полимерных суспензий проводили в присутствии моноэфиров ароматических дикарбоновых кислот, МАФ, с разным содержанием гидрофобных групп в молекуле, и кремнийорганического ПАВ - а-(карбоксиэтил)ю-

(триметилсилокси)полидиметилсилоксана, ПДС*. Эти ПАВ представляли собой лабораторные образцы, синтезированные специально для данных исследований. Было изучено влияние объемного соотношения фаз, концентрации стабилизатора и концентрации инициатора на средний диаметр частиц, распределение их по размерам и устойчивость в электролитах. Полученные результаты представлены на рис. 2 и в таблице 1.

*Эти исследования выполнены совместно с Крашенинниковой И.Г.

Рисунок 2. Микрофотографии полимерных суспензий и распределения частиц по размерам: 1 - МАФ1; 2 - МАФ2; 3 — ПДС при соотношении фаз 1:9; 4 — ПДС при соотношении фаз 1:2

Таблица 1. Рецептуры синтеза полимерных суспензий (1=80°С)

Тип полимерной суспензии Объемное Концентра- Концентра- Средний Устойчи- Полиди-

соотноше- ция ция диаметр вость в сперс-

ние фаз стабилизат инициатора частиц, ЫаС1, М ность,

стирол/ opa, %масс. ,ПК, мкм Dw/D„

вода на мономер %масс. на

мономер

Полистирольная суспензия, 1:9 0,1 1 0,4 0,15 1,08

стабилизированная ПДС 0,25 0,41 0,15 1,04

0,5 0,43 0,15 1,02

1,0 0,44 0,20 1,01

2,0 0,46 0,20 1,01

3,0 0,48 0,20 1,01

4,0 0,51 0,20 1,01

Полистирольная суспензия, 1:9 1 0,1 0,4 0,15 1,02

стабилизированная ПДС 0,5 0,41 0,15 1,01

1,0 0,43 0,20 1,01

2,0 0,43 0,20 1,01

4,0 0,44 0,20 1,01

Полистирольная суспензия, 1:9 1 1 0,43 0,20 1,01

стабилизированная ПДС 1:6 1 1 0,55 0,20 1,02

1:4 1 1 0,60 0,15 1,05

1:2 1 1 0,70 0,15 1,10

Полистирольная суспензия, 1:9 1 1 0,3 0,20 1,10

стабилизированная МАФ1

Полистирольная суспензия, 1:9 1 1 0,6 0,20 1,11

стабилизированная МАФ2

Полистирольная суспензия, 1:9 1 1 0,9 0,20 1,08

стабилизированная МАФЗ

Видно, что в присутствии МАФ и ПДС можно получить устойчивые карбоксилсодержащие полимерные суспензии с узким распределением

частиц по размерам и диаметрами 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; и 0,9 мкм. Синтезированные полимерные микросферы соответствовали необходимым требованиям и их предполагали использовать в биотехнологии.

Новые перспективы получения полимерных микросфер в заданном интервале диаметров получили свое развитие после появления в качестве коммерческих продуктов широкого спектра новых кремнийорганических ПАВ.

С начала 90-х годов прошлого столетия в зарубежной литературе стали появляться публикации по синтезу и изучению свойств димерных, гемини, ПАВ, представляющих собой амфифильные молекулы с двумя гидрофобными «хвостами» и двумя полярными группами, связанными между собой спейсорной группой. В иностранной литературе отмечалась их высокая поверхностная активность, многообразие морфологии структур, образующихся в межфазных слоях частиц, и низкие адгезивные свойства.

Эти данные позволили предполагать, что изучение таких веществ в качестве ПАВ при гетерофазной полимеризации откроет перспективы синтеза полимерных суспензий с заданными свойствами и размерами частиц и расширит границы применимости полученных результатов.

Карбоксилсодержащие гемини-ПАВ были синтезированы в ГНИИХТЭОС и предоставлены для изучения их в качестве стабилизаторов при синтезе полимерных суспензий для биотехнологии. Общая формула этого ПАВ, а,со— бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксана, представлена ниже: НООС—(СН2)ю—(Me2SiO)30—SiMe2(CH2)io—СООН Это ПАВ принципиально отличается по строению от а-(карбоксиэтил)ю-(триметилсилокси)полидиметилсилоксана, ПДС: ПДС состоит из олигосилоксановой цепи и одной карбоксильной группы, а КС — двух силоксановых цепей и двух карбоксильных групп.

Так как в литературе свойства этого типа ПАВ не описаны, оно впервые использовалось в качестве стабилизаторов полимерных микросфер, исследования были начаты с изучения его коллоидно-химических свойств.

а,ю-бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан (КС) практически нерастворим в воде и хорошо растворим в стироле, коэффициент распределения, характеризующий отношение растворимости КС в воде к растворимости в стироле составляет 9*104 . Стабилизатор обладает поверхностно-активными свойствами и снижает межфазное натяжение, Oii2 на границе толуольный раствор КС — вода до 28 мДж/м2 (рис.3). Максимальная адсорбция КС Гмах составляет 3,3*10"6 моль/м2, площадь поверхности, занимаемая молекулой стабилизатора, равна 75 Ä2, а поверхностная активность G=5,6 мН*м2/моль.

Полимеризация стирола в присутствии КС, как и в присутствии ПДС, протекает в прямой эмульсии, образование ПМЧ происходит из микрокапель мономера, размер которых определяется а[2, концентрацией инициатора, эффективностью инициирования и объемным соотношением мономер/водная фаза.

Образующийся полимер несовместим с КС, и с ранних конверсий мономера он принудительно вытесняет КС на границу раздела фаз, формируя оболочку ПМЧ.

Образование оболочки частиц из кремнийорганического ПАВ придает им специфические свойства, присущие кремнийорганическим полимерам, например, гидрофобность, низкую адгезию, эластичность, устойчивость к агрессивным средам.

Частицы сохраняют сферическую форму и узкое распределение по размерам (рис. 3) с ранних конверсий мономера (10%) до полного превращения мономера в полимер.

0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0,6

Рисунок 3. Микрофотографии полистирольных частиц и гистограммы распределения полистирольных частиц по размерам, полученных в присутствии 1% КС и 1% ПК при разных конверсиях мономера: 1 - 10%; 2 - 99%.

Известно, что при гетерофазной полимеризации виниловых мономеров диаметр частиц и распределение их по размерам зависят от нескольких факторов: температуры полимеризации, скорости перемешивания, концентрации инициатора и стабилизатора, объемного соотношения мономер/водная фаза.

Влияние температуры на скорость полимеризации стирола и размер частиц полимерных суспензий изучали при объемном соотношении стирол/вода, равном 1:9, концентрациях инициатора ПК и стабилизатора КС, равных 1%масс. в расчете на стирол.

Рисунок 4. Кривые конверсия-время, полученные при полимеризации стирола при различных температурах: ♦ - 60°С, ■ - 70°С, ▲ - 80°С.

Время, ч

Увеличение температуры от 60°С до 80°С приводило к повышению скорости полимеризации и уменьшению размеров частиц (от 0,65 мкм при 60°С до 0,55 мкм при 80°С) (рис.4). Снижение температуры ниже 60°С приводило к потере устойчивости реакционной системы. Энергия активации Еа составила 25,59 ккал/моль. Дальнейшие исследования проводили при температуре 80°С.

Диаметры полимерных микросфер и их распределение по размерам в значительной степени зависят от природы инициатора и его концентрации. Обычно в качестве инициатора применяют водорастворимый инициатор персульфат калия. Его выбор обусловлен высокой эффективностью инициирования, вхождением в состав полимера ионогенных фрагментов молекулы (804"), участвующих в формировании электростатического фактора устойчивости в межфазных слоях частиц.

Скорость полимеризации стирола в эмульсии, инициированной персульфатом калия, намного выше инициированной любым маслорастворимым инициатором.

Для исследования влияния природы инициатора и его концентрации на кинетические закономерности полимеризации, были выбраны динитрил азоизомасляной кислоты, ДАК, и персульфат калия. Полимеризацию стирола проводили в одинаковых условиях при температуре 60°С. Были сравнены значения диаметров частиц, распределение их по размерам и устойчивости реакционной системы.

Результаты приведены на рисунке 5 и в таблице 2. Видно, что замена водорастворимого инициатора на растворимый в мономерной фазе не повлияла на устойчивость реакционной системы и распределение частиц по размерам.

Рисунок 5. Микрофотографии полистирольных частиц и гистограммы распределения частиц по размерам, полученных в присутствии: 1- ПК; 2- ДАК.

Таблица 2. Характеристики полистирольных суспензий, стабилизированных

КС с водорастворимым (ПК) и маслорастворимым (ДАК) инициаторами

Инициатор Средний диаметр частиц, мкм Полидисперсность 0\у/0п Коагулюм

КгЗзОв 0,65 1,045 -

ДАК 0,67 1,028 -

Таблица 3. Влияние концентрации ПК на характеристики полистирольных суспензий._______

Концентрация ПК Средний диаметр частиц, мкм Полидисперсность Б\у/Оп Скорость полимеризации У„*103, моль/л*с Молекулярная масса М„*10"5 Коагулюм Устойчивость в №С1, М

102 моль/л %

1,68 0,5 0,43 1,036 1,82 4,1 - 0,20

3,36 1 0,55 1,014 2,73 1,7 - 0,20

6,70 2 0,55 1,019 3,95 0,87 - 0,20

Таким образом, для обеспечения устойчивости полимерным микросферам на всех стадиях процесса их синтеза оказалось достаточным структурно-механического фактора стабильности, образуемого ПАВ.

Зависимость скорости полимеризации и молекулярной массы полимеров от концентрации инициатора соответствовала закону радикальной полимеризации.

Видно, что изменяя концентрацию инициатора можно синтезировать полимерные микросферы с заданными свойствами и средними диаметрами 0,43 и 0,55 мкм, устойчивые в физиологических растворах и при хранении.

Известно, что увеличение концентрации водорастворимого ПАВ приводит к повышению скорости полимеризации и уменьшению диаметра частиц. Это обусловлено увеличением числа частиц и их устойчивости. Иная зависимость наблюдается при увеличении концентрации нерастворимого в воде ПАВ: с увеличением концентрации ПАВ скорость полимеризации уменьшается, а диаметр частиц увеличивается (рис.6). При этом было показано, что устойчивость реакционной системы высокая, распределение частиц по размерам узкое.

Снижение скорости полимеризации можно объяснить уменьшением числа ПМЧ, а это, в свою очередь, связано с падением интенсивности диспергирования капель мономера в присутствии олигомерного кремнийорганического ПАВ.

Полученные результаты приведены в таблице 4. Видно, что изменяя концентрацию КС, можно синтезировать полимерные микросферы с диаметрами 0,55, 0,58 и 0,65 мкм и узким распределением по размерам. Все полимерные микросферы соответствовали требованиям, предъявляемым для использования в биотехнологии.

0.5 0.55 0.6 0 65 07 0.75

Рисунок 6. Микрофотографии частиц и гистограммы распределения полистирольных частиц по размерам, полученные в присутствии различных концентраций КС, моль/л* 103: 1 - 6,64

(2%); 2- 16,6(5%).

Таблица 4. Характеристики полистирольных суспензий при различной

Концентрация Средний Полидис- Скорость Молекуляр- Коагу- Устойчи-

КС диаметр персность полимериза- ная масса люм вость в

103 моль/л % частиц, о„/о„ ции У„*103, М„*10"5 ЫаС1, М

мкм моль/л*с

3,32 1 0,55 1,036 2,73 0,31 - 0,20

6,64 2 0,58 1,014 2,1 0,41 - 0,20

16,6 5 0,65 1,114 1,7 0,56 - 0,20

Все приведенные выше исследования проводили при объемном соотношении мономер/водная фаза, равном 1:9.

Увеличение объемного содержания мономера при сохранении постоянным концентрации инициатора и КС приводит к увеличению диаметра частиц.

Чтобы оценить влияние концентрации мономера на диаметр частиц и их распределение по размерам в присутствии КС, полимеризацию стирола проводили в тех же условиях (1% ПАВ и 1% ПК в расчете на мономер, Т=80°С) в интервале объемных соотношений мономер/водная фаза - от 1:2 до 1:9.

Видно (рис.7), что характер кинетических кривых конверсия-время не изменился. С увеличением объемного содержания мономера в эмульсии (от 1:9 до 1:6) при сохранении постоянными концентрации инициатора и стабилизатора устойчивость реакционной системы сохраняется высокой, о чем свидетельствуют данные об отсутствии коагулюма (таблица 5), а образующиеся полимерные суспензии характеризуются узким распределением частиц по размерам. Полимерная суспензия, полученная при объемном соотношении фаз 1:2, оказалась неустойчивой.

Рисунок 7. Кривые конверсия -время, полученные при

полимеризации стирола в присутствии КС при объемном соотношении фаз мономер:вода 1:9 (♦)> 1:6 (■), 1:4 (А).

Время, ч

Таблица 5. Характеристики полистирольных суспензий, стабилизированных

Соотношение фаз мономер/ вода Средний диаметр частиц, мкм Полидисперсность Dw/Dn Коагулюм Устойчивость в NaCl, М

1:9 0,55 1,014 - 0,20

1:6 0,73 1,020 - 0,20

1:4 0,80 1,041 - 0,15

1:2 0,92 1,471 + 0,10

Устойчивую полимерную суспензию при объемном соотношении фаз 1:2 не удалось получить при увеличении концентрации стабилизатора более 10%масс. в расчете на мономер.

И только в присутствии смеси КС и полиоксиалкиленорганосилоксанового блоксополимера (ПООСБ) удалось провести полимеризацию стирола при высокой концентрации мономера в эмульсии (объемное соотношение стирольный раствор КС+ПООСБ/вода составляло 1:2). Повышение устойчивости полимерных микросфер объясняется участием полиоксиалкиленорганосилоксанового блоксополимера в формировании межфазного слоя. Более высокомолекулярный ПООСБ (ММ 4375), обладая меньшей совместимостью с образующимся полистиролом с большей скоростью

вытесняется на межфазную границу. При этом из него формируется каркас тонкой пленки. Затем в этот каркас происходит подстройка КС, имеющего меньшую несовместимость с полистиролом. Таким образом преодолеваются кинетические несогласования между процессом формирования новой границы раздела фаз при объемном соотношении мономер/вода, равном 1:2, и скоростью формирования стабилизирующей пленки. Особое значение рассматриваемый факт имеет на начальной стадии полимеризации в момент образования ПМЧ.

Полимеризацию проводили при объемном соотношении фаз 1:2, концентрации инициатора ПК, равной 1%, концентрации КС, равной 1%масс. на мономер, ПООСБ, равной 0,5%масс. на мономер, Т=80°С. Кривая конверсия - время приведена на рисунке 8.

Рисунок 8. Кривые конверсия-время, полученные при полимеризации стирола при объемном соотношении фаз мономер:вода 1:2 при

соотношении ПАВ/соПАВ ♦ -1/0,5, ■- 2/0,1.

Время, ч

Таблица 6. Характеристики полистирольных суспензий при различной

Концентрация Средний диаметр Полидисперсность Коагулюм

КС, % частиц, мкм 0\у/0п

1 0,92 1,471 коагулюм

3,5 1,05 1,453 коагулюм

10 1,48 1,070 коагулюм

1+0,5% ПООСБ 1,59 1,023 -

1+0,1% ПООСБ 1,6 1,016 коагулюм

2+0,1% ПООСБ 1,66 1,021 -

Рисунок 9. Микрофотографии полистирольных частиц и гистограммы распределения частиц по размерам при объемном соотношении фаз мономер/вода 1:2, полученные при использовании: 1) 1% КС и 0,5% ПООСБ; 2) 2% КС и 0,1% ПООСБ.

Полученная полимерная суспензия отличалась устойчивостью (отсутствие коагулюма) и узким распределением частиц по размерам. Концентрацию ПООСБ удалось снизить до 0,1% в расчете на мономер, сохранив необходимые

свойства полимерной суспензии, варьируя масс, соотношения ПАВ (таблица 6). Микрофотографии и гистограммы распределения частиц по размерам приведены на рисунке 9.

Таким образом, в результате проведенных исследований были определены оптимальные условия синтеза полистирольных суспензий, отвечающих предъявляемым требованиям, с размерами частиц в интервале от 0,5 до 1,6мкм. Полимеризация протекает до полной конверсии мономера за 9-12 часов (в зависимости от объемного соотношения стирол/вода).

3.3. Синтез карбоксилсодержащих полиметилметакрилатных суспензий

Гетерофазную полимеризацию полярного мономера - метилметакрилата (ММА) проводили в тех же условиях: объемное соотношение фаз мономер/вода -от 1:2 до 1:9; концентрация персульфата калия - 1% масс, в расчете на мономер; концентрация КС - 1% масс, в расчете на мономер; температура полимеризации - 80°С.

На рисунке 10 приведены кривые конверсия-время. Видно, что кинетические кривые имеют характерный для гетерофазной полимеризации вид.

Отличительной особенностью наблюдаемых зависимостей является наличие гель-эффекта при конверсии ММА выше 30%. До 80 - 90%-ной конверсии полимеризация протекает с постоянной скоростью, обусловленной конкуренцией между увеличивающейся скоростью процесса из-за гель-эффекта и ее снижением в результате уменьшения концентрации мономера.

Зависимости скорости полимеризации, диаметра и распределения частиц по размерам от концентрации мономера аналогичны наблюдаемым при полимеризации стирола (таблица 7).

Полимерные суспензии, полученные при полимеризации ММА в присутствии КС, также как и полистирольные суспензии, отличаются устойчивостью с самых ранних конверсий мономера, о чем свидетельствуют данные об отсутствии коагулюма в суспензиях. Частицы имеют сферическую форму и узкое распределение по размерам (рис.11).

40 60

Время, мин

Рисунок 10. Кривые конверсия — время, полученные при

полимеризации ММА в присутствии КС при различном соотношении фаз мономер/вода: ♦1:9; 1:6; А- 1:4; х- 1:2.

Проведенные исследования позволили разработать рецептуры синтеза полиметилметакрилатных частиц с узким распределением по размерам в интервале диаметров от 0,37 до 0,65 мкм.

Рисунок 11. Микрофотографии полиметилметакрилатных частиц и гистограммы распределения их по размерам при разном соотношении фаз мономер/вода: 1 - 1:9; 2- 1:6; 3- 1:4; 4- 1:2.

Таблица 7. Характеристики полиметилметакрилатных суспензий, стабилизированных КС при различном соотношении фаз.__

Соотношение фаз мономер/вода Среднечисловой диаметр частиц, мкм Полидисперсность Б\у/Оп Коагулюм

1:9 0,37 1,016 -

1:6 0,47 1,027 -

1:4 0,51 1,019 -

1:2 0,65 1,009 -

3.4. Синтез карбоксилсодержащих иолистирольных суспензий методом затравочной полимеризации

Полистирольные суспензии с большим размером частиц получали последовательной затравочной полимеризацией стирола. В качестве исходных затравочных частиц использовали полистирол-дивинилбензольные микросферы с диаметром 2 мкм. Вначале проводили набухание полимерной суспензии затравочных частиц мономером с растворенным в нем инициатором (ДАК) и кремнийорганическим ПАВ (а,со-бис[10-

карбоксидецил]полидиметилсилоксаном) при комнатной температуре в течение

Таблица 8. Рецептура проведения затравочной полимеризации.

Наименование компонента Массовые части

Полимерная фаза (затравочные полистирольные частицы) 500

Мономерная фаза (стирол) 100

Дисперсионная среда (вода) 4500

Инициатор (ДАК) 1

ПАВ (КС) 1

24 часов. Затем проводили затравочную полимеризацию мономера в течение 20 часов при 70°С. Рецептура получения полистирольной суспензии с диаметром частиц 5,9 мкм и с функциональными (карбоксильными) группами на

поверхности представлена в таблице 8. Видно, что полученные полимерные микросферы имеют узкое РЧР (рис.12).

Рисунок 12.

Микрофотография и

гистограмма распределения частиц по размерам полистирольной суспензии, полученной затравочной полимеризацией

3.5. Разработка метода анализа 3-х мерной организации сосудистого русла с помощью полимерных микросфер

Основным методом исследования сосудистого русла предполагается использовать флуоресцентную конфокальную микроскопию, что требует заполнения сосудов окрашенными флуоресцентным красителем полимерными микросферами.

Окрашивание полимерных микросфер флуоресцентным красителем проводили по описанной в патентах методике. В качестве красителя был выбран магдаловый красный. Полимерные микросферы набухали в ацетоне, в котором растворен краситель требуемой концентрации.

Вначале были определены пороговые концентрации красителя с достаточным откликом флуоресценции. Для полистирольных и полиметилметакрилатных суспензий пороговая концентрация красителя составляет 0,1 - 0,2%об.

После окрашивания изучали агрегативную устойчивость полимерных суспензий в физиологических средах для того, чтобы исключить агрегацию микросфер и, как следствие, закупорку сосудов агрегатами при перфузии. Для применения были пригодны полимерные микросферы, устойчивые в растворе электролита (ЫаС1) с концентрацией не менее 0,15 М. Все полимерные суспензии характеризовались устойчивостью в физиологических растворах.

Таблица 9. Агрегативная устойчивость микросфер в различных средах.

ИаО 0,15 М Поливидон Стабизол Фруктоза (10%р-р) Сахароза (2,6%р-р)

ПС + + - + +

ПММА + + - + +

Наряду с изучением агрегативной устойчивости полимерных микросфер в растворах электролитов было проведено изучение агрегативной устойчивости микросфер в различных растворах, применяющихся в медицине для замещения кровопотери при внутривенном переливании крови. Оказалось, что полистирольные и полиметилметакрилатные микросферы устойчивы в растворах поливидона, 10%-ном растворе фруктозы и 2,6%-ном растворе сахарозы (таблица 9). Данные растворы могут служить вариантом выбора при проведении экспериментов по заполнению сосудистого русла экспериментальных животных полимерными микросферами.

Диаметр частиц, мкм

Окрашенные полимерные микросферы использовали для заполнения сосудистого русла крыс. Для анализа были выбраны фрагменты брыжейки тонкого кишечника.

Перед анализом в световом микроскопе препараты просветлялись путем плавного перевода через серию водных растворов фруктозы с восходящей концентрацией. Эта методика была выбрана, поскольку краситель, магдаловый красный, практически не растворим в воде. Препараты пропитывали фруктозой (показатель преломления 80%-ного раствора фруктозы п=1,49, который близок к показателю преломления неокрашенных тканей экспериментальных животных).

Фотографии были выполнены с помощью светового микроскопа. Результаты просветления показаны на рисунке 13.

На микрофотографии 13 А представлен фрагмент микрососудистого русла, заполненного микросферами диаметром 6 мкм, окрашенными магдаловым красным. Четко видны микросферы и хорошо видно, что микрососуд (1) имеет несколько ветвей (2,3,4), 2 из которых (2 и 4) находятся не в фокусе и выглядят размытыми. Внутри просвета ветви (3) микросферы расположены в один ряд, ветвь заполнена на расстояние 24 мкм. Вероятно, дальнейшее продвижение микросфер по этой ветви было остановлено наличием сужения. Размытые линии (5) на микрофотографии являются границами жировых клеток.

Рисунок 13. Кровеносные сосуды брыжейки крысы, заполненные микросферами диаметром 6 мкм (А) и микросферами диаметром 0,4 мкм (Б).

Видно, что полимерные микросферы плотно заполнили сосудистое русло и останавливаются в том месте, где внутренний диаметр сосуда становится меньше диаметра микросфер. Следовательно, данный подход позволяет анализировать артериальную часть сосудистого русла. В сосудистом русле существуют «шунты», позволяющие крови, минуя капилляры попадать в венозное русло, и диаметр которых сопоставим с диаметром артерий. Поэтому не исключается возможность попадания микросфер диаметром 6 мкм в венозное русло. Однако, в тех участках, где мы проводили исследования, вен, заполненных микросферами, обнаружено не было. Но это необходимо принимать во внимание при дальнейших исследованиях.

На микрофотографии 13 Б представлен фрагмент микрососудистого русла, заполненного микросферами диаметром 0,4 мкм, окрашенными магдаловым

расным. Четко виден сосуд (1), имеющий 2 ответвления (2 и 3). Хорошо видно, :то сосуд заполнен окрашенными микросферами.

Просветленные препараты, заполненные полиметилметакрилатными тикросферами с диаметром частиц 0,4мкм и полистирольными микросферами с иаметром частиц бмкм, окрашенными флуоресцентным красителем, магдаловым расным, исследовались на конфокальном микроскопе Nikon Eclipse CI plus.

На микрофотографии 14 Б представлен фрагмент микрососудистого русла, ^полненного микросферами диаметром 0,4 мкм, окрашенными магдаловым расным. Виден раздваивающийся сосуд (1), плотно заполненный икросферами, и вена (2).

'исунок 14. Микрососуды брыжейки крысы. А - капилляр (заполнен суспензией с размером частиц 6 мкм); Б - артериола (1) и венула (2) (заполнены суспензией с размером частиц 0,4 мкм); В - артериола (заполнена суспензией с размером частиц 0,4 мкм).

На микрофотографии 14 В видна артериола (1), от которой вправо и влево гходят 4 ветви. Ветви (2) и (3) делятся на капилляры со средним диаметром 4 мкм. [нтенсивность флуоресценции артериолы (1) в левом верхнем углу фотографии еньше, чем по всей длине артериолы, что говорит о том, что эта часть артериолы _аходится выше плоскости оптического среза (4).

Для селективного анализа сосудов разного диаметра необходимо использовать абор полимерных микросфер разного размера. В качестве примера, на икрофотографии 14 А показано заполнение капилляра микросферами с размером : мкм. Это позволит анализировать полную картину 3-х мерного ветвления сосудов процессе ангиогенеза в условиях нормы и патологии.

Была выполнена серия оптических срезов (ОС) препарата (рис.15), шолненного полиметилметакрилатными микросферами с диаметром 0,4 мкм. Оптические срезы были сделаны через каждые 25 мкм по глубине препарата от поверхности до основания. Исследуемый препарат имел толщину 275 мкм.

Полученные данные дают возможность определить плотность (количество) эсудов в объеме препарата с помощью программы 1тгцте1. В этой программе ль возможность сделать проекцию всех ОС на основание препарата по схеме, приведенной на рисунке 16. Из полученного изображения (рис.17) возможно пределить площадь сосудов в препарате и, зная толщину препарата, редставляется возможным рассчитать количество сосудов в его объеме.

7.QC на глубине 150 мкм 8. ОС на глубине 175 мкм 9. ОС на глубине 200 мкм

Рисунок 15. Серия оптических срезов (ОС), сделанных на расстоянии 25 мкм друг от друга

по глубине препарата.

Таким образом, была разработана методика анализа сосудов, основным преимуществом которой является возможность построения трехмерной модели, позволяющей проанализировать плотность (количество) сосудов в объеме препарата, а так же определить их пространственное положение.

}

РАССТОЯНИЕ МЕЖДУ ОС 5 МКМ

ТОЛЩИНА ПРЕПАРАТА 275 МКМ

Рисунок 16. Схема получения проекции всех оптических срезов препарата.

ОСНОВАНИЕ

-V —

ПРОЕКЦИЯ

■ Рисунок 17. Проекция оптических срезов препарата, на плоскость параллельную основанию препарата.

Полученные полимерные микросферы характеризуются высокой табильностью во времени, наличием карбоксильных групп на поверхности, грегативной устойчивостью в растворах электролитов. Эти свойства юзволяют использовать при создании иммунодиагностических тест-систем.

Синтезированные полимерные микросферы были переданы для испытаний в институт физико-химической медицины, где на их основе были разработаны модельные тест-системы, которые показали высокую пецифичность и чувствительность. Полученные результаты позволяют рекомендовать данные полимерные микросферы для создания различных тест-истем медицинского назначения.

1ЫВОДЫ:

1. Синтезированы карбоксилсодержащие полимерные микросферы различной природы с диаметрами частиц в интервале 0,3 -1,6 мкм и 6,2 мкм с узким распределением по размерам, и на их основе создана методика анализа архитектуры сосудистого русла.

Все полимерные суспензии имели узкое распределение по диаметрам, не содержали ассоциатов, были устойчивы в буферных растворах и при хранении.

3. Впервые в качестве ПАВ для синтеза полистирольных и полиметилметакрилатных суспензий использован новый тип кремнийорганического функционального ПАВ - а,ю-бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан. Изучены его коллоидно-химические свойства.

4. Предложен новый подход к созданию методики анализа сосудов, позволяющий с помощью конфокальной микроскопии построить трехмерную модель сосудистого русла.

5. На примере полистирольных микросфер с диаметром 6 мкм, окрашенными люминесцентным красителем, показана возможность с помощью конфокальной микроскопии увидеть архитектуру артериального русла.

6. Полученные полимерные микросферы были рекомендованы для создания диагностических тест-систем медицинского назначения.

Список печатных работ:

Статьи, опубликованные в журналах ВАК:

1. Грицкова И.А. Полимеризация стирола в присутствии кремнийорганических ПАВ различной природы / И.А. Грицкова, E.H. Левшенко. Е.Р. Мансурова, И.В. Хачатурян, Н.И. Прокопов, Г.А. Симакова, В.М. Копылов // Вестник МИТХТ. - 2008. - Т. 3. - №5. - С. 111-114.

2. Грицкова И.А. Полимеризация стирола в присутствии поверхностно-активных кремнийорганических веществ различной природы / И.А. Грицкова, В.М. Копылов, Г.А. Симакова, С.А. Гусев, И.Ю. Маркузе, E.H. Левшенко // Высокомолекулярные соединения. - 2010. - серия А. - Т. 52. -№7. - С.1-7.

3. Волкова Е.В. Полимеризация метилметакрилата в присутствии кремнийорганических ПАВ / Е.В. Волкова, И.А. Грицкова, Л.А. Злыднева, E.H. Левшенко. Н.В. Рассоха, П.Н. Чадаев, Д.И. Шрагин // Известия ВУЗов. — Химия и химическая технология. - 2011. - Т.54. - №9. - С.70-73.

4. Солодухина Н.М. Полистирольные микросферы как носители биолиганда при определении Д-9-тетрагидроканнабинола в моче человека / Н.М. Солодухина, Л.А. Злыднева, E.H. Левшенко. М.А. Мягкова, И.А. Грицкова // Биотехнология. — 2012. - №1. — С. 90-96.

5. Волкова Е.В. Разработка полимерных микросфер для иммунофлуоресцентного анализа / Е.В. Волкова, И.А. Грицкова, С.А. Гусев, А.Д. Лукашевич, A.A. Гусев, E.H. Левшенко. Л.А. Злыднева, К.О. Сочилина // Биотехнология. - 2012. - №4. - С.74-77.

Тезисы докладов в других изданиях:

6. Грицкова И.А. Полимеризация стирола в присутствии кремнийорганических ПАВ различной природы / И.А. Грицкова, E.H. Левшенко, И.В. Хачатурян, Н.И. Прокопов, В.М. Копылов // Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии: тез. докл. Междунар. научно-практич. конф. 22-25 сентября 2008г. - Москва,

2008. - С. 35.

7. Мансурова Е.Р. Полимеризация стирола в присутствии кремнийорганических ПАВ различной природы / Е.Р. Мансурова, E.H. Левшенко // Ломоносов-2009: тез. докл. XVI Международн. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. 13-18 апреля 2009 г. - Москва,

2009. - С.67.

8. Злыднева Л.А. Полимеризация стирола в присутствии поверхностно-активных кремнийорганических веществ / Л.А. Злыднева, E.H. Левшенко // Ломоносов-2010: тез. докл. Международ, молодежи, науч. форума. 12-15 апреля 2010 г. - Москва, 2010. - С. 81.

9. Злыднева Л.А. Полимеризация стирола в присутствии кремнийорганических поверхностно-активных веществ для создания полимерных носителей биолигандов / Л.А. Злыднева, Е.В. Волкова, E.H. Левшенко. Н.В. Рассоха, И.А. Грицкова, С.А. Гусев // Поверхностно-активные вещества в технологических процессах: тез. докл. Науч. секции ПАВ Науч. совета по коллоид, химии и физико-химич. механике РАН. 21-22 сентября 2010г. -Москва, 2010.-С.12.

Подписано в печать 26.10.12 Заказ № 66 Тираж 100 экз. Типография ООО "Генезис" 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86 www.copycentr.su 8 (495) 434-83-55

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Левшенко, Елена Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Использование полимерных микросфер в биотехнологии.

1.2 Методы изучения строения сосудов.

1.3. Методы окрашивание полимерных микросфер флуоресцентными красителями.

ГЛАВА 2. ЭКСШРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Исходные вещества.

Методы исследования.

2.1. Дилатометрический метод исследования кинетики полимеризации.

2.2 Проведение затравочной полимеризации.

2.3. Измерение межфазного натяжения на границе раздела фаз.

2.4. Определение молекулярных масс полимеров.

2.5. Определение размера частиц в суспензии.

2.6. Определение сухого остатка суспензии.

2.7. Подбор концентрации красителя.

2.8. Определение агрегативной устойчивости микросфер.

2.9. Окрашивание ПММА и ПС микросфер.

2.10. Перфузия.

2.11. Просветление препаратов.

2.12. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Синтез полистиролметакриловых суспензий.

3.2. Синтез карбоксилсодержащих полистирольных суспензий.

3.3. Синтез карбоксилсодержащих полиметилметакрилатных суспензий.

3.4. Синтез карбоксилсодержащих полистирольных суспензий методом затравочной полимеризации.

3.5. Разработка метода анализа трехмерной организации сосудистого русла с помощью полимерных микросфер.

ВЫВОДЫ:.

Введение диссертация по химии, на тему "Карбоксилсодержащие полимерные микросферы для изучения трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных"

Полимерные микросферы с узким распределением по размерам нашли широкое применение в различных областях биологии и медицины. К полимерным суспензиям, применяемым в этой области, предъявляются следующие требования: они должны иметь заданный диаметр и узкое распределение частиц по размерам, определенную природу поверхности и быть устойчивыми при хранении и в растворах электролитов. Области применения полимерных микросфер постоянно расширяются. В частности, их предложено использовать для изучения ангиогенеза, что необходимо для ранней диагностики опухолевого роста, так как известно, что по мере развития раковая опухоль прорастает новыми кровеносными сосудами.

Для исследования развития сосудистого русла используют метод флуоресцентной конфокальной микроскопии. Его применение требует заполнения сосудов флуоресцентными метками, в качестве которых перспективно использовать полимерные микросферы, окрашенные люминесцентным красителем. К ним предъявляется ряд специфических требований: они должны обладать высокой интенсивностью флуоресценции, низкой адгезивной активностью к внутренней поверхности сосуда, что исключит их прилипание к стенкам сосуда, и не образовывать коньюгатов друг с другом и с биологическими молекулами.

Полученные результаты можно использовать для построения трехмерной модели сосудов и капилляров. Эта модель позволит последовательно изучать закономерности ветвления сосудов, что необходимо для понимания их функционального состояния.

Целью данной работы являлся синтез карбоксилсодержащих полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам, содержащих флуоресцентные метки, для создания метода визуализации трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных для изучения ангиогенеза.

Научная новизна:

3. Впервые для синтеза карбоксилсодержащих полистирольных и полиметилметакрилатных суспензий использовано кремнийорганическое гемини-ПАВ - а, со-бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан, и показано, что оно проявляет высокие поверхностно-активные свойства на границе мономер/вода (с1,2 = 28,1 мДж/м2) и образует прочные межфазные слои на поверхности ПМЧ/вода.

Практическая значимость работы. Разработанная методика опробована в

ФГЪУН Научно-исследовательский институт физико-химической медицины

ФМБА России, выдана рекомендация по ее, использованию медицинским учреждениям.

Автор защищает:

• Новое карбоксилсодержащее ПАВ с двумя полярными группами (гемини-ПАВ) а,со - бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан в качестве стабилизатора полимерных суспензий при гетерофазной полимеризации мономеров.

Заключение диссертации по теме "Высокомолекулярные соединения"

ВЫВОДЫ:

1. Синтезированы карбоксилсодержащие полимерные микросферы различной природы с диаметрами частиц в интервале 0,3 - 1,6 мкм и 6,2 мкм с узким распределением по размерам, и на их основе создана методика анализа архитектуры сосудистого русла.

2. Для создания метода анализа структуры сосудистого русла с различным диаметром синтезированы полимерные суспензии трех типов: полистиролметакриловые, полистирольные и полиметилметакрилатные. Все полимерные суспензии имели узкое распределение по диаметрам, не содержали ассоциатов, были устойчивы в буферных растворах и при хранении.

3. Впервые в качестве ПАВ для синтеза полистирольных и полиметилметакрилатных суспензий использован новый тип кремнийорганического функционального ПАВ - а,оо-бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан. Изучены его коллоидно-химические свойства.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Левшенко, Елена Николаевна, Москва

1. Bangs L.B. New developments in particle-based immunoassays // Pure and Appl. Chem.-1996.-v.68.-N 10.-p.l873-1879.

2. Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы // Алма-Ата: Наука, 1982.

3. Каральник Б.В., Царевский Ю.П., Шамардин В.А. Эритроцитарные белковые диагностикумы // Алма-Ата: Наука, 1982.

4. Сюрин В.Н., Самойленко А .Я., Соловьев В.Б. и др. Вирусные болезни животных // Москва, ВНИТИБП, 1998.

5. Красота А.Ю. Технология тест-системы для серодиагностики парагриппа-3 крупного рогатого скота методом РНГА // Автореф. канд. веет, наук: М., 2003.

6. Singer, J.M, С.М. Plotz. The Latex Fixation Test: Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis // Am J Med. 1956. - № 21 - P. 888

7. Макаров В.В. Реальная эпизоотология бешенства. // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2002.

8. Малеев В.В., Сологуб Т.В., Ершов Ф.И., Романцов М.Г. Современный взгляд на вирусные гепатиты. М.: Миклош, 2010. 168с.

9. Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я. Инфекционные болезни. М., 2003.

10. И. Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. Новые методыиммуноанализа. М.: Мир, 1991. - 116с.

11. Ugelstad J., Futakama H.R., Mork P.C., Ellingsen Т., Berge R., Holm L., ect. Preparation and characterization of monodisperse polymer particles // J. Polym. Sci., Polym. Symp. 1985. - v. 72. - p. 225-240.

12. Черкасов B.P. Полимерные суспензии, модифицированные серусодержащими аминокислотами, для иммунохимических исследований // Автореф.дис. .канд.хим.наук. М. - 1992. - с.138.

13. Richardson I.R. Latex 34 Legionella pneumoplua species inentification using a commercial latex agglutination kit a potential gross-reaction problem with serogroup-12 // Med.Lab.Sci. 1992. - v.49. - №2. - p. 144-146.

14. Крашенинникова И.Г. Полимерные суспензии медико-биологического назначения с узким распределением частиц по размерам // Автореф.дис.док.тех.наук.-М., 2007.

15. Прокопов Н.И. Синтез полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам методом гетерофазной полимеризации полимеризации // Автореф.дис. .докт.хим.наук. М., 1999.

16. Лобанов А.Н. Синтез полимерных суспензий медико-биологического назначения // Автореф.дис.канд.хим.наук. М., 2003.

17. Суспензионная полимеризация метилметакрилата // Сб. обзорной информации. М.: НИИТЭХИМ.-1975. -с.59.

18. Егоров В.В. Радикальная полимеризация поверхностно-активных мономеров // Автореф. дисс. в форме научного доклада на соискание уч. степ, д.х.н.- Москва. 1992.

19. Cochin, D. Emulsion polymerization of styrene using conventional, polymerizable, and polymeric surfactants. A comparative study /D. Cochin, A. Laschewsky // Macromolecules. -1997. Vol. 30. -P. 2278- 2287.

20. Напер Д. Стабилизация коллоидных дисперсий полимерами: Пер. с англ. // Привалко В.П., Липатов Ю.С. М.: Мир. - 1986. - с.448.

21. Чекина Н.А. Синтез носителей иммунореагентов на основе полиметилметакрилата и его сополимеров методами радикальной эмульсионной полимеризации // Автореф. дис.канд.хим.наук. СПб. -2003.

22. Скуркис Ю.О. Формирование поверхностной структуры монодисперсных микросфер на основе полистирола и сополимеров стирола с акролеином // Автореф.дис.канд.хим.наук. СПб. -2005.

23. Stubbs, J. The dynamics of morphology development in multiphase latex particles / J. Stubbs, D.C. Sundberg // Prog. Org. Coat. 2008. - Vol. 61, - P. 156-165.

24. Schulz, D.N. Polymers as rheology modifiers. / D.N. Schulz, J.E. Glass // Eds. ACS Symposium series 462. American Chemical Society. Washington. DC. 1991.

25. Shalaby, S.W. Water-soluble polymers. Synthesis, solution properties and applications /S. Shalaby, C.L. McCormick, G.B. Butler // Eds. ACS Symposium series 467. American Chemical Society. Washington. DC. -1991.

26. Абрамзон, A.A. Поверхностно-активные вещества: Свойства и применение / А.А. Абрамзон.- JL: Химия, 1981.- 58 с.

27. Грицкова, И. А. Полимеризация стирола в присутствии неионогенных эмульгаторов. Автореф.дис. канд. хим. наук/ Грицкова Инесса Александровна.- Москва. 1964.- 158 с.

28. Таубман, А. Б. Роль взаимодействия ПАВ с твердыми эмульгаторами в образовании и стабилизации эмульсий / А. Б. Таубман, А. Ф. Корецкий // Доклады АН СССР, 1961. Т. 144. № 5. С. 1128 - 1129.

29. Дудукин, В.В. Исследование эмульсионной полимеризации стирола и метилметакрилата в присутствии неионных эмульгаторов. Дис. канд. хим. наук/ Дудукин В.В.- Москва. 1967.- 153 с.

30. Симакова, Г.А. Микроэмульгирование в процессе эмульсионной полимеризации/ Г.А. Симакова, В.А. Каминский, И.А. Грицкова, А.Н. Праведников. Докл. АН СССР.- 1984.-Т. 276.-Вып.1. С. 151-153.

31. Симакова, Г.А. Микроэмульгирование и его роль в процессе эмульсионной полимеризации гидрофобных мономеров. Автореф. дис.докт. хим. наук / Симакова Галина Александровна,- Москва.- 1990.- 24 с.

32. Gan, L.M. Effects of surfactant concentration on polymerizations of methyl methacrylate and styrene in emulsions and microemulsions/ L.M. Gan, K.C. Lee, C.H. Chew// Langmuir.- 1995.- Vol. 11.- P.449.

33. Хаддаж, M. Эмульсионная полимеризация стирола при низком содержании мономера в системе/ М. Хаддаж, Г.И. Литвиненко, И.А. Грицкова, В.А. Каминский, А.Н. Праведников// Высокомолек. соед.- Сер. Б.-1983.- Т. 25.- № 2.- С. 139 -142.

34. Адебайо, Г.Б. Синтез полистирольных суспензий с узким распределением частиц по размерам для иммуннохимических исследований: Автореф. дис.канд. хим. наук/Адебайо Габриэль Балогун.- Москва, 1996, 24 с.

35. Roe, С.Р. Surface chemistry aspects of emulsion polymerization / C.P. Roe // Ind Eng Chem. -1968. Vol. 60. - P. 20 - 33.

36. Antonietti, M. 90 years of polymer latexes and heterophase polymerization: more vital than ever / M. Antonietti, K. Tauer // Macromol. Chem. Phys. 2003. - Vol. 204. - P. 207 - 219.

37. Чирикова, O.B. Синтез функциональных полимерных суспензий в присутствии кремнийорганических ПАВ: Автореф. дис. . .канд. хим. наук/ Чирикова Ольга Владимировна.- Москва, 1994. -24 с.

38. Hill, R.M. Silicone surfactants: Surfactant science series/ R.M. Hill// Marcel Dekker Inc. -1999. P. 112-117.

39. Грицкова, И.А.Физико-химические свойства оксиэтилированных неионных поверхностно-активных веществ/ И.А. Грицкова, P.M. Панич // Успехи химии.- 1965. -Т.34.-№ 11.- С.1989-2019.

40. Уклонский, Д.А. Синтез и свойства кремнийорганических ПАВ для ПГТУУ/Д.А. Уклонский, В.В. Северный, JI.C. Лысенко Л.С.//Свойства и применение вспененных пластмасс, Владимир.- 1974.- С. 9-14.

41. Kondo A., Kawano T., Itoh F., Higashtani К. Immunological agglutination kinetics of latex particles particles with physically adsorbed antigen // J. Immunol. Methods, -1990.-v.135. -p.111-119.

42. Шкарлат П.Е. Латексная тест-система для экспресс-диагностики лептоспирозной инфекции у собак // Автореф. дисс.канд.биол.наук: М., 2003.

43. Madhusudana S.N., Saraswati S. Development and evaluation of a latex agglutination test for rabies antibodies // Journal of Clinical Virology. 2003. -v.27. -pp.129-135.

44. Марков А.Г. Полимерные микросферы для получения биотест-систем на С-реактивный белок// Автореф. дисс.канд.биол.наук: М.: 2005.

45. Быков В.А., Грицкова И.А., Станишевский Я.М., Прокопов Н.И. Лабораторный практикум по курсу «Полимерные микросферы в диагностике» М., 2003.

46. Григорьевская И.И. Антительные тест-системы на основе полимерных суспензий для мониторинга биополлютантов и биологически важных соединений // Автореф. дисс. .канд.хим.наук М.: 2005.

47. Сапунова О.О. Тест-системы для индикации антител к брюшнотифозному ВИ-антигену на основе полимерных микросфер латексов //Автореф. дисс.канд.мед.наук. М., 2001.

48. Гаспарян В.К. Полистирольные латексы в реакции агглютинации, приготовление и сенсибилизация // Клиническая лабораторная диагностика. Москва. 2001. - №1. - с.43-45.

49. II-Hoon Cho, Eui-Hwan Paek, Haiwon Lee, Ji Yoon Kang, Tae Song Kim, Se-Hwan Paek. Site-directed biotinylation of antibodies for controlled immobilization on solid surfaces // Analytical Biochemistry. 2007. - v.365. -pp. 14-23.

50. Цинкернагель Рольф. Основы иммунологии. -М.: «Мир», 2008.-с.135.

51. Ковальчук JI.B., Ганковская JI.B., Мешкова Р.Я. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии. -М., «ГЭОТАР-Медиа», 2011. 640с.

52. Станишевский Я.М., Грицкова И.А., Прокопов Н.И. // Способ получения антительной тест-системы для постановки реакции латексной агглютинации. Пат.№2380708, РФ от 24.02.2010г.

53. Станишевский Я.М. Диагностические тест-системы на основе конъюгатов «полимерная микросфера-биолиганд» медико-биологического назначения // Автореф.дисс.докт.хим.наук. М., 2012.

54. Генералова А.Н. Получение биоаналитических реагентов на основе полимерных дисперсий // Автореф.дисс.канд.хим.наук. М., 2000.

55. Gunter Mistlberger, Ingo Klimant. Luminescent magnetic particles: structures, syntheses, multimodal imaging, and analytical application. Bioanal. Rev. - 2010.-p.101.

56. Феофанов А.В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях. Успехи биологической химии. - т.47. - 2007. - с.371-410.

57. Волкова Е.В. Разработка полимерных микросфер для иммунофлуоресцентного анализа / Е.В. Волкова, И.А. Грицкова, С.А. Гусев, А.Д. Лукашевич, А.А. Гусев, Е.Н. Левшенко, Л.А. Злыднева, К.О. Сочилина // Биотехнология. 2012. - №4. - С.74-77.

58. В. Прозоровский. Кровеносные сосуды и рак. // Наука и жизнь. -№ 9. 2006.

59. Ole Goertz et al. Burn model for in vivo investigations of microcirculatory changes.// Open access journal of plastic surgery.- 3.- 2009.

60. Shinya Higuchi et al. Gut hyperpermiability after ischemia and reperfusion: attenuation with adrenomedullin and its binding protein treatment. // International Journal of Clinica and Experimental Pathology. 2008. - №1(5) -p409^18.

61. Yonca A. Akova. Роль флуоресцентной ангиографии. // EuroTimes January 2008.

62. G. Zacharakis, H. Kambara, H. Shih, J. Ripoll, J. Grimm, Y. Saeki, R. Weissleder, V. Ntziachristos Volumetric tomography of fluorescent proteins through small animals in vivo // PNAS.- 2005.- V. 102.- N. 51.- P. 18252-18257.

63. W. Cai, A. R. Hsu, Z. Li, X. Chen Are quantum dots ready for in vivo imaging in human subjects? // Nanoscale Res Lett/ 2007/- №2. - p265-281.

64. Ballou В., Fisher G., Waggoner A., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies // Cancer Immunology. Immunother. 1995. -v/41 -№4 - p257-263.

65. S. Miltenyi, W. Muller, W. Weichel, A. Radbruch, Cytometry.- 1990. №11. - p231.

66. P. M. Lackie, Histochem. Cell Biol. 1996. - v. 106. p9.

67. С. В. Murray, D. J. Noms, M. G. Bawendi, ibid. 1993.-v.115. -p8706.

68. A. Waggoner, Methods Enzymol. -1995.-v.246.- p362.

69. X. G. Peng, J. Wickham, A. P. Alivisatos, ibid. -1998. -v.120.-p5343.

70. M.B. Ширманова, M.A. Сироткина, M.C. Клешнин, И.В. Балалаева, Е.В. Загайнова. Прижизненная флуоресцентная визуализация экспериментальных опухолей. // Нижегородская государственная медицинская академия, проект № 02.522.11.2002.

71. W.-B. Wu et al. Fluorescent polystyrene microspheres with large Stokes shift / Journal of Physics and Chemistry of Solids. 2008. - v.69. -pp76-82.

72. G.E. Johnson, Macromolecules.-1980. v.13. - ppl45-152.

73. M. Sivakumar, K.P. Rao, React. Funct. Polym.-2000.- v.46. p29-37.

74. D.T. Birnbaum, J.D. Kosmala, D.B. Henthorn, L. Brannon-Peppas, J. Controlled Release. -2000. -v.65. pp375-387.

75. A.J. Paine, J. Polym. Sei. Part A.-1990. v.28. -pp2485-2490.

76. A. Tuncel, R. Kahraman, J. Appl. Poly. Sei. 1993. - v.50. -ррЗОЗ-307.

77. J.T. Braunholtz, F.G. Mann, J. Chem. Soc. -1952.- p3046-3051.

78. P.I. Ittyeeah, F.G. Mann, J. Chem. Soc. -1956.- p3179-3183.

79. J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York.- 1999.- pp. 425-442.

80. A. Imhoff, M. Megens, J.J. Engelberts, D.T.N, de Lange, R. Sprik, W.L. Vos, J. Phys. Chem. B.-1999.- v.103.- ppl408-1415.

81. P.K.J. Kinnunen, A.-P. Tulkki, H. Lemmetyinen, J. Paakkola, J.A. Virtanen, Chem. Phys. Lett. 1987.-v.136. -pp539-545.

82. G.Z. Chen, Z.Q. Huang, Z.Z. Zheng, Fluoroimmunoassay, Science Press, Beijing.- 1990.- pp. 64-81.

83. J.J. Kelly, J.R. Ewen, S.L. Bernard, R.W. Glenny, C.H. Barlow, Rev. Sci. Instrum. -2000.-V.71 ,-pp228-234.

84. M.F.M. Van Oosterhout, H.M.M. Willigers, R.S. Reneman, F.W. Prinzen, Am. J. Physiol. -1995.-v.269.-ppH725-H733.

85. L. Wang, C.Y. Yang, W.H. Tan, Nano Lett. -2005. -v.5.-pp37^3.

86. U.S. Pat. No. 5,952,131 to Kumaceheva et.al.

87. U.S. Pat. No. 5,267,235 to Rembaum et.al.

88. U.S. Pat. No. 5,073,498 to Schwartz et.al.

89. Sukhorukov GB, Rogach AL, Garstka M et al.: Multifunctionalized polymer microcapsules: novel tools for biological and pharmacological applications. Small 3(6). - 2007. - p 944-955.

90. Nida DL, Nitin N, Yu WW, Colvin VL, Richards-Kortum R: Photostability of quantum dots with amphiphilic polymer-based passivation strategies. -Nanotechnology. №19. - 2008. - pl-6.

91. Patra MK, Manoth M, Singh VK et al.: Synthesis of stable dispersion of quantum dots in aqueous medium showing visible emission from bluish green to yellow. J. Luminescence. - 2008. - p320-324.

92. Li QA, Chen XJ, Xu Y et al.: Photoluminescence properties of the CdSe quantum dots accompanied with rotation of the defocused wide-field fluorescence images. J. Phys. Chem. C. - 2010. - pi 14.

93. Kettenbach, J.; -Stadler, A.; Katzler, I.; Schernthaner, R.; Blum, M.; Lammer, J.; Rand, T. Drug-loaded microspheres for the treatment of liver cancer: review of current results. Cardiovasc. Intervent. Radiol. - 2008. - v.31 - p468-476.

94. УТВЕРЖДАЮ» Директор ФГБУН Научно-исследовательский институт ¿теской медицины ФМБА России Сергиенко В. И.вбября 2012 г.

95. Полученные модельные диагностикумы показали высокую чувствительность и специфичность. Данные полимерные суспензии могут быть рекомендованы для создания диагностических тест-систем на различные заболевания.

96. Также на основе полимерных микросфер создана методика визуализации трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных.

97. Старший научный сотрудник лаборатории морфологии, кандидат медицинских наук

98. Подпись ст.н.с. Е.И. Гоуфмана

99. Ученый секретарь ФГБУН «НИИ ФХМ ФМБ, к.б.н.1. Е.И.Гоуфман/1. Васильева Л.Л.