Поли-N-винилпирролидон с боковыми аминокислотными группами. Синтез и применение в медико-биологических областях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

004608026

На правах рукописи

АРТЫКОВА ЗУЛЬФИЯ БАЙМИРЗАЕВНА

ПОЛИ-М-ВИНИЛПИРРОЛИДОН С БОКОВЫМИ АМИНОКИСЛОТНЫМИ ГРУППАМИ. СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЛАСТЯХ

Специальность: 02.00.06 - Высокомолекулярные соединения 03.01.06 - Биотехнология (в том числе нанобиотехнологии)

Автореферат

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

- 9 СЕН 2010

/ У > }

Москва-2010 / /*"

п,

■ . ,у

004608026

Работа выполнена в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В, Ломоносова, на кафедре «Химии и технологии высокомолекулярных соединений им. С.С. Медведева» и на фирме «Фармед» (Ташкент, Республика Узбекистан)

Научные руководители

Официальные оппоненты

Ведущая организация

А 09

доктор химических наук, профессор Грицкова Инесса Александровна

доктор химических наук

Ташмухамедов Равшан Иркинович

Академик РАМН, доктор химических наук, профессор Швец Виталий Иванович

доктор химических наук профессор Коршак Юрий Васильевич

ГНЦ РФ Физико-химический институт им. Л.А.Карпова

2010 г. в 15.00 час. на заседании

Защита состоится _____

Диссертационного совета Д 212.120.04 при Московской академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова (МИТХТ) (119571 Москва, пр.Вернадского, д.86) в ауд. Т-410.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.ВЛомоносова

Автореферат размещен на сайте www.mitht.ru Автореферат разослан « ^ у, && 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного советаД212.120.04, доктор химических наук, профессор л И.А.Грицкова

Актуальность проблемы. Поли-1М-виншпшрролидон нашел широкое применение в различных областях, в первую очередь в медицине, где он используется в качестве компонентов различных лекарственных систем, в частности, в качестве компонента кровезаменителей, носителя различных лекарственных веществ, компонента лекарственных форм, средства, способствующего криосохранности органов и тканей и т.д.

Это определяется комплексом специфических свойств этого полимера, в частности, растворимостью в воде и широком круге органических растворителей, способностью к комплексованию с веществами различного химического строения, высоким уровнем биосовместимости.

В то же время актуальной проблемой является расширение возможности применения иоли-Ы-винштирролидона за счет его модификации путем введения дополнительных функциональных групп. Одним из путей модификации является введение в него боковых аминокислотных фрагментов.

В данной работе поставлена задача оптимизации процесса синтеза такого полимера и поиска новых путей его использования.

Цель работы. Оптимизация процесса синтеза аминокислотного производного поли-М-винилпирролидона и его использование в качестве компонента кровезаменителей, диагностических тест-систем, и термоустойчивых гидрогелевых капсул.

Научная новизна.

• Оптимизирован процесс синтеза поли-М-винилпирролидона, содержащего боковую группу Р-аланина, и определены условия получения полимера с высоким выходом;

• Показано, что использование производного поли-Ы-винилпирролидона с боковой группой р-аланина в составе кровезаменителей существенно повысило уровень их дезинтоксикационного действия;

• Показано, что применение поли-М-винилпирролидона с боковой группой Р-аланина в процессе создания диагностической тест-системы на плазминоген в крови, позволяет существенно понизить уровень неспецифической адсорбции белков плазмы крови, что повышает чувствительность и специфичность тест-системы;

• Сформулированы научные принципы формирования структур термоустойчивых капсул на основе термотропных (желатины) и ионотропных (производных полисахарида) гелей и модифицированного р-аланином поливинилпирролидона, позволяющие повысить (в 3-12 раз) устойчивость витамина Е при длительном хранении и к действию окислителей.

Практическая значимость.

Проведено сравнительное исследование в опытах на животных дезинтоксикационного действия стандартного кровезаменнтеля-дезинтоксикатора препарата Красгемодез и поли-М-винилпирролидона, содержащего боковую группу Р-аланина, на фоне контрольного исследования в отсутствие дезинтоксикатора. Показано, что новый кровезаменитель - высокоэффективное дезинтоксикационное средство, что и определяет несомненное преимущество этого препарата, и он может бьгть рекомендован для использования в медицинской практике.

Создана и опробована в НИИ ФХМ ФМБА тест-система для определения плазминогена в крови с низким уровнем неспецифической адсорбции белков плазмы крови.

Предложена технологическая схема создания термоустойчивых капсул, содержащих витамин Е, обеспечивающая устойчивость биологически-активного компонента.

Личный вклад автора. Автор лично выполнял все этапы работы, включая постановку задач, проведение эксперимента, анализ и интерпретацию результатов.

Автор защищает

- Способ оптимизации процесса синтеза аминокислотного производного поли-Ы-винилпирролидона;

- Данные сравнительного исследования дезинтоксикационной активности в опытах на животных препарата Красгемодез и поли-Ы-винилпирролидона, содержащего боковую группу Р-аланина;

- Условия создания тест-системы дая определения плазминогена в крови, характеризующейся высокой чувствительностью и специфичностью;

- Принцип создания термоустойчивых капсул, содержащих витамин Е.

Апробация работы. Основные результаты работы были изложены в 7

тезисах докладов на всесоюзных и международных конференциях.

Публикации. Основные положения и результаты работы изложены в 10-ти печатных работах, в том числе, 3-х журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 161 странице, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы; содержит 39 таблиц, 47 рисунках, 101 библиографическую ссылку.

Во введении дано обоснование актуальности работы и сформулирована ее

цель.

Глава 1. Литературный обзор. Приведены данные о современном состоянии проблем синтеза функциональных поли-№винилпирролидонов и путей их

использования, создания диагностических тсст-систем и термоустойчивых капсул для биокомпонентов.

Глава 2. Экспериментальная часть. Описаны исходные вещества и методы исследования (ИК-снектроскопия, ПМР, злекгронная микроскопия, оптическая спектроскопия и фотон-корреляционнная спектроскопия, дифференциальная сканирующая калориметрия, жидкостная хроматография, гель электрофорез, ротациошт вискозиметрия, метод ультрафильтрации и др.)

Глава 3. «Результаты н обсуждение»

3.1. Синтез функционального поли-И-винилпирролидона, содержащего боковые аминокислотные группы

Ранее было показано, что поли-М-вишшпирролидоны, содержащие в боковой цепи фрагменты низших а, ш - аминокислот, обладают различными типами биологической активности, в частности иммуноадыовантной и антивирусной. Их синтезировали с использованием модифицированной реакции Дарзана с дальнейшими превращениями получаемых соединений. Вначале был получен эпоксисодержащий поли-Ы-вишиширролидон, часть боковых циклических аминогрупп которого была замещена эпоксисодержащими фрагментами, которые затем вступали во взаимодействие с аминокислотами в щелочной среде с образованием поли-Ы-виншншрролидона с боковыми остатками а, м -аминокислот.

Однако в результате протекания реакции в этих условиях может быть получен полимер с выходом не более 50%, содержащий до 25% мол. звеньев с эпоксидными грушами. Было высказано предположение о том, что выход полимера в существенной мере зависит от строения спирта. И действительно, при увеличении длины алкильного радикала в молекуле спирта наблюдается уменьшение количества эпоксидных групп в полимере, видимо, из-за различной растворимости образующихся продуктов в реакционной среде. Максимальный выход полимера (~80%) был получен при проведении реакции в 1-бутиловом спирте (Табл. 3.1.1.)

В качестве вещества, связывающего хлористый водород, был использован не металлический натрий, растворение которого в 1-бутаноле протекает медленно и осложняет проведение процесса, а порошкообразный этилат натрия. Реакцию проводили при постепенном добавлении раствора этилата натрия в спиртовой раствор смеси ПВП и хлорацетамида, ХАА, поддерживая определенную температуру реакции.

Было изучено влияние температуры, времени реакции, концентрации и соотношения реагентов на выход полимера, результаты приведены на рис. 3.1.1.

Таблица 3.1.1. Влияние типа растворителя на количество эпоксидных групп и выход полимера (соотношение ПВП : ХАА - 1:1 осново-моль/моль, концентрация полимера 12,5 масс.%, температура 10°С, время реакции - 4 часа)

Спирт Количество эпоксидных групп, % Выход полимера, %

Молекулярная масса ПВП 9 * 103

Метиловый 25,8 42,5

Этиловый 23,8 63,5

Изопропиловый 12,4 67,3

1-бутиловый 9,8 75,1

Молекулярная масса ПВП 25 х 103

Метиловый 21,2 50,6

Этиловый 19,1 70,4

Изопропиловый 9,5 74,8

1-бутиловый 8,6 80,3

Полученные данные показали, что увеличение температуры приводит к снижению количества эпоксидных групп в полимере, (рис. 3.1.1.А) что, по всей видимости, связано с протеканием побочных реакций. Выход полимера составлял 76,4% и практически не изменялся при увеличении температура от 0°С до 10°С, содержание эпоксидных групп составляет 12%. Процесс протекает в течение 4 часов, (рис. 3.1.1.Б-3.1.1.Д). Оптимальная концентрация полимера в исходной смеси составляет 12,5%, оптимальное мольное соотношение ПВП: хлорацетамид : этилат натрия равно 1:1:1 осново-моль : моль : моль.(Рис. 3.1.1.Г, 3.1.1.Д).

Полимер очищали от примесей хлористого натрия и других низкомолекулярных веществ и выделяли лиофильной сушкой с последующим досушиванием в вакууме до постоянного веса. Строение полученного эпоксидсодержащего полимера подтверждали функциональным анализом и ИК-спектроскопией.

Полученный эпоксидированный поли-Ы-винилпирролидон представляет собой порошок белого цвета, растворимый в воде и в растворителях П и Ш групп, со средней и высокой способностью к образованию водородных связей, имеющих параметр растворимости соответственно >24,8 (мДж/м3)'Л (диметилформамид, диметилсульфоксид, формамид) и 21,3; 48,1 (мДж/м3)и (уксусная кислота, вода), а в растворителях 1 группы (с низкой способностью к образованию водородных связей) был нерастворим (углеводороды).

А

Б

Д

Ыа:ПВП, моль/осново-моль

Рис.3.1.1. Зависимость выхода эпоксидсодержащего ПВП от температуры (А), времени реакции (Б), концентрации ПВП (В), соотношения ХАА:ПВП (Г), и соотношения Ка: ПВП (Д). Молекулярная масса ПВП: - 9х 103. Растворитель -бутанол-1.

Синтезированный полимер был использован для получения модифицированного поли-М-винилпирролидона (ПВПм).

Предварительные исследования показали, что он характеризуется более высокой биологической активностью по сравнению с другими аминокислотными проиводпыми ПВП.

При получении ПВПм была использована описанная ранее реакция эпоксидирования поли-М-винилпирролидона аминокислотой.

Реакцию проводили в щелочной среде, когда в цвитер-ионе кислоты наблюдается переход к аминокарбоксилатной форме.

Было установлено, что степень замещения эпоксидных групп достигала высоких значений — 92-99% при мольных соотношениях аминокислоты и эпоксидных групп полимера от 10:1 до 20:1 (рН=9,0, Т=323К).

Строение полимеров, содержащих аминокислотные группировки, было подтверждено исследованием их ИК спектров (ИК-Фурье спектрометр "Paragon 1000РС") и ПМР - спектров.

3.2. Использование поли-М-винилпирролидона с боковыми аминокислотными группами р-аланипа в качестве компонентов кровезаменителей дезинтоксикационного действия.

Существующие до сегодняшнего дня дезинтоксикационные растворы на основе низкомолекулярного поливинилпирролидона, обладая активным дезинтоксикационным эффектом, имеют ряд побочных действий, что затрудняет их применение в медицинской практике. В связи с этим, представлялось интересным использовать в составе кровезаменителей модифицированный аминокислотный ПВПм, обладающий хорошим дезинтоксикационным эффектом и иммуностимулирующей активностью. Он нетоксичен, быстро и полностью, в течение 6 часов, выводится из организма. На основании этого, были созданы два кровезаменителя с различными концентрациями полимера - 30 г/л (кровезаменитель №1) и 60 г/л (кровезаменитель №2) в буферном изотоническом растворе, содержащем соли натрия, калия, магния, кальция, по составу, приближенному к плазме крови. В качестве систем сравнения были использованы опыты по введению широко применяемого в медицине препарата Красгемодеза (раствор №3), и опыты без введения кровезаменителей.

Опыты проводили на 100 белых крысах самцах весом 100-140 грамм на моделях интоксикации (четырёххлористым углеродом - I серия и алкоголем - II серия).

В динамике для оценки действия новых кровезаменителей использовали ряд показателей: выживаемость животных, биохимические показатели (активности AJIT (аланиновой трансаминазы) и ACT (аспарапшовой трансаминазы) в

сыворотке крови общего и прямого билирубина); показатели эндогенной интоксикации (сорбционная ёмкость эритроцитов (СЁЭ), уровень в плазме крови веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) и олигопептидов), индекс токсемии (ИТ) и индекс интоксикации (ИИ)); содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (малоновый диальдегид (МДА), диеновые кетоны (ДК), кетодисны (КД)); изучение аптиоксидантной системы (АОС) (уровень активности антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР) и каталазы); определение детоксицирующей функции печени гексеналовым тестом.

Острое отравление четыреххлористым углеродом (I серия) проводили путем ежедневного подкожного введения 1 мл/кг СО4, растворенного в равном объеме оливкового масла в течение 6 дней, лечение проводили в течение 5 дней в дозе 5 мл/кг массы тела животного. Животные были разделены на шесть групп: первая группа - лечение новым кровезаменителем № 1 (3%); вторая группа - лечение новым кровезаменителем № 2 (6%); третья группа - лечение кровезаменителем Красгемодезом; четвёртая группа - интоксикация; пятая группа -интоксикация без лечения; шестая группа - интактные животные.

Животных опытных и контрольной группы эфтаназировали попарно, одновременно, под гексеналовым наркозом (введением им барбитурата натрия -Гексанала (Нехепа1ит) - 1,5-диметил-5- (циклогексен-1-ил)а, на 5 день лечения.

Результаты показали, что в I серии экспериментов интоксикация четыреххлористым углеродом вызывает глубокие поражения печени, синдром цитолиза (увеличение АЛТ и АСТ в 13 и 12,7 раз), холестаза (увеличение общего билирубина в 2,5 и прямого в 4,1 раз), достоверное повышение уровня ВНСММ в плазме и эритроцитах крови (примерно в 3 раза), СЕЭ (увеличение в 3 раза), свидетельствующие о развитии эндогенной интоксикации, активизации ПОЛ (МДА увеличивался в 2,7 раза, диеновые кетоны в 3, кетодисны в 2,4 раза) и истощении факторов антиокеидантной защиты.

Лечение проводили введением дезинтоксикационных препаратов, содержащих полимерные компоненты, в течение 5 дней в дозе 5 мл/кг массы тела (примерно такая доза вводится больным в клинике).

Введение крысам тетрахлорметана вызывало тяжелое нарушение функции печени и привело к гибели 50% животных, состояние животных было тяжёлым. Применение препаратов, содержащих ПВПм, привело к ее снижению. В первой группе - до 6%, во второй группе - до 10%, в третьей группе-до 16%.

Для всех животных был проведен гексеналовый сон, характеризующий эффективность действия новых кровезаменителей. Так, после введения тетрахлорметана гексеналовый сон увеличивался в 4 раза, по сравнению с

интактными животными, а после инфузии новых кровезаменителей в 1,9, 2 раза короче, а в случае красгемодеза -1,5 раза по сравнению с интоксикацией.

Анализируя полученные данные, можно констатировать, что дезинтоксикационная терапия интоксикации, вызванной тетрахлорметаном, препаратами, содержащими ПВПм, по сравнению с Красгемодезом более выраженно влияла на структурно-функциональные параметры печени, что проявлялось замедлением процесса цитолиза, холестаза. Применение новых кровезаменителей, существенно снижало эндогенную интоксикацию и отмечалось снижение выраженности гиперлипопероксидации и некоторой активации ферментов АО С.

Алкогольную интоксикацию (II серия) получали путём внутрижелудочного введения сублетальной дозы (6,2 г/кг этанола) в течение четырёх дней. Через 4 часа после последнего введения этанола проводили инъекцию кровезаменителей (5 мл/кг) в течение пяти дней.

Проведённые эксперименты свидетельствуют о том, что алкоголь вызывает в организме комплекс метаболических расстройств, свойственных токсикозу, в патогенезе которого ведущее место принадлежит усилению процессов ПОЛ, снижению активности ферментов АОС, структурно-функциональным изменениям печени и изменениям биохимических показателей.

На 5-е сутки после лечения препаратом № 1 показатель ACT был в пределах исходных величин, активность АЛТ снизилась в 2,5 раза, ВНСММ в плазме снижалась в 1,5 раз, олигопептиды возвращались к норме, ИТ - в 2,6, ИИ - в 3,2 раза, СЕЭ нормализовывалась. Показатели ПОЛ снижались МДА в плазме и эритроцитах в 1,7 раз, активность ферментов антиоксидантной защиты восстанавливалась. Примерно такие же результаты получены при применении кровезаменителя № 2.

При сравнении полученных данных с лечебной эффективностью Красгемодеза отмечалось, что терапевтический эффект после исследуемых кровезаменителей наступает быстрее по сравнению с Красгемодезом. В группах животных, получавших новые кровезаменители, уже после первой инъекции наступает более выраженное снижение показателей эндогенной интоксикации. О положительном влиянии новых кровезаменителей указывают данные гексенапового сна, который при алкогольной интоксикации увеличивался в 2 раза, после инфузии новых кровезаменителей снижался в 1,7, 1,8 раз, после инфузии Красгемодеза в 1,5 раза.

Таким образом, результаты проведённого исследования позволяют считать, что исследованные кровезаменители, содержащие ПВПм высокоэффективные, дезинтоксикационные средства, при применении которых дезинтоксикация

наступает значительно быстрее, чем при использовании Красгемодеза, и действие их более выраженное, что и определяет несомненные преимущества препаратов.

Использование новых кровезаменителей способствовало снижению уровня эндогенной интоксикации, восстановлению структурно-функциональных параметров печени, что проявлялось замедлением процессов цитолиза, холестаза, снижению гиперлипопероксидации и повышению активности ферментов АОС. Следовательно, применение кровезаменителей, содержащих ПВПм, при интоксикациях является целесообразным в плане снижения эндогенной интоксикации и диктует необходимость использования их в медицине.

3.3. Использование поли-1\г-винилпирролидона, содержащего в боковой цепи р-алании, для получения диагностических тест-систем.

Одна из основных проблем, которая возникает при создании диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер в качестве носителей биолиганда состоит в том, что, кроме целевого, то есть специфически связанного с биолигандом, на поверхность полимерных частиц сорбируются неспецифические к данному лиганду белки, что снижает чувствительность и специфичность биохимических анализов.

Из литературы известно, что уменьшить содержание неспецифических белков на поверхности полимерных микросфер можно путем адсорбции на их поверхность поливинилпирролидона. Поливинилпирролидон характеризуется невысокой поверхностной активностью, и при появлении в системе более сильных поверхностно-активных белков десорбируетя с поверхности полимерных микросфер. Было высказано предположение о том, что более эффективно блокировать неспецифическую сорбцию белков плазмы крови будет модифицированный аминокислотами ПВП.

Исследования были начаты с синтеза полимерных микросфер. Согласно требованиям, предъявленным к полимерным микросферам, используемым в мультиплексном анализе, они должны иметь диаметр ~ 5-6 мкм, а для ковалентной иммобилизации биолиганда - содержать в поверхностном слое функциональные группы.

Для получения таких полимерных микросфер была выбрана затравочная полимеризация стирола в присутствии растворимого в мономерной фазе кремнийрганического карбоксилсодержащего ПАВ, а,ш-бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксана. Коллоидно-химические свойства полимерной суспензии приведены в таблице 3.3.1.

Полученные полимерные суспензии имели средний диаметр 6 мкм и узкое распределение частиц по размерам, о чем свидетельствуют данные электронно-микроскопического исследования частиц, приведенные на рис. 3.3.1.

Таблица 3.3.1. Коллоидно-химические свойства полимерной суспензии,

полученной в присутствии кремнийорганического ПАВ.

Наименование полимерной суспензии Средний диаметр, мкм КлоЛИДИСП-И ^-потенциал Аггрегативная устойчивость, Молярность (М) раствора №С!

6 мкм Э^орг 6,0 1,014 +31,6 0,20

В качестве лиганда к плазминогену был выбран а-лизин, который специфически взаимодействует с плазминогеном.

Активацию карбоксильных групп на поверхности микросфер в присутствии водорастворимого карбодиимида (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид) (далее - КДИ) проводили по стандартной схеме при рН=6,8 и температуре 0 - 4 °С с последующим взаимодействием полученных реакционноспособных групп с лизином.

Рис. 3.3.1. Распределение частиц полимерной суспензии с диаметром 6 мкм по размерам и микрофотография частиц полимерной суспензии.

Распределение частиц по размеру

Концентрацию КДИ и Ь-лизина выбирали, исходя из количества на поверхности полимерных микросфер карбоксильных групп. Избыток КДИ в системе может привести к агрегации полимерных частиц из-за снижения их устойчивости в результате перенасыщения поверхности полимерных микросфер гидрофильными реакционноспособными группами. Недостаток же КДИ приводит к снижению эффективности тест-системы, что связано с недостаточным количеством реакционноспособных групп на поверхности частиц и, следовательно, меньшим количеством лизина, ковалентно связанного с этими группами.

Оптимальное количество КДИ оказалось равным I мл 4%-ой полистирольной суспензии.

Для того, чтобы убедиться в том, что ковалентное связывание функциональных групп Ь-лизина и карбоксильных групп, расположенных на поверхности полимерных микросфер, произошло, был проведен качественный анализ иммобилизованного лизина на поверхности полистирольных микросфер. Специфическим реагентом на а-аминокислоту является нингидрин, который реагирует со всеми аминокислотами , исключая пролин и оксипролин. При этом образуется бесцветный гидриндантин, альдегид, диоксид углерода и аммиак.

В слабокислом растворе (рН 3-4) избыток нингидрина взаимодействует с гидршщантином и аммиаком, образуя продукт пурпурного цвета.

В диссертации представлены фотографии результатов проведенного анализа, из которых видно, что ковалентное связывание функциональных групп лизина и кремнийорганического ПАВ произошло.

Кроме плазминогена, который специфически связывается с лизином, на полимерную поверхность могут сорбироваться различные неспецифические белки благодаря электростатическим и гидрофобным взаимодействиям.

Определение белкового состава элюата, удаленного с поверхности микрочастиц, методом электрофореза на полиакриламидном геле показало, что он состоит из сыворотчного альбумина, тяжёлых цепей иммуноглобулинов и плазминогена. Уровень неспецифического связывания был высокий.

В литературе имеются сведения о том, что адсорбция белков на поверхность полимерных микросфер, содержащих иммобилизованный полининилпирролидон, существенно снижается.

ПВП добавляли в полистирольную суспензию, частицы которой содержали иммобилизованный лизин в количествах в 10 раз больших и в 10 раз меньших, чем необходимое для образования монослоя на их поверхности частиц. Оказалось, что адсорбированный на поверхности частиц ПВП не уменьшает неспецифическую сорбцию белков.

Был проверен уровень неспецифической адсорбции белков плазмы крови на полистирольные микросферы, содержащие и не содержащие на поверхности лизин. Полученные результаты приведены в таблице 3.3.2.

Видно, что количество белков, элюированных с поверхности микросфер, на которой нет иммобилизованного лизина, в 10 раз меньше количества элюированных белков с поверхности полимерных микросфер, содержащих лизин, ПМС-Л. Другими словами, иммобилизация лизина на поверхность полимерных микросфер приводит к изменению свойств поверхностных слоев полимерных микросфер. Количество белков, физически адсорбированных на поверхность полистирольных частиц, значительно увеличивается.

Таблица 3.3.2. Количество элюированных белков в мкг по фракциям в расчёте на 100 мкл 10%-ой суспензии ПМС, диаметром 6 мш. Х(т)

Количество белка, элюировапного 0,ЗМ раствором фосфатного буфером, мкг Количество белка, элюированпого 0,2М раствором е-амипокапроновой кислоты, мкг Количество белка, элюированного 8,6% раствором додецилсульфата натрия, мкг

Полистирольные микросферы 15(2) 0 30(2)

Полистирольные микросферы с лизином 172 (10) 12(7) 115 (Р)

Следовательно, дальнейшие эксперименты по анализу влияния различных веществ на уровень адсорбции неспецифических белков плазмы необходимо проводить только на полимерных микросферах с иммобилизованным на их поверхности лизином.

Было высказано предположение о том, что модифицированный р-аланнном ГГОП (ПВПм), ковалентно связанный с карбоксильными группами, расположенными на поверхности полимерных микросфер, позволит создать стерические затруднения для физической адсорбции неспецифических белков.

Таблица 3.3.3. Количество элюированных белков по фракциям в мкг в расчёте на 100 мкл 10%-ой суспензии ПМС при изменении концентрации ПВПм, ковалентно иммобилизованного на поверхность полистирольных микросфер.

Концентрация ПВПм в мг/мл 10% суспензии Количество белка, элюированного 0,ЗМ раствором фосфатного буфером, мкг Количество белка, элюированного 8.6% раствором додецилсульфата натрия, мкг

0 + лизин 172 ПО) 115(9)

1,5 без лизина 108 (7) 70(8)

5 без лизина 101 (7) 98(7)

15 без лизина 25(2) 34(2)

25 без лизина 32(3) 43(3)

50 без лизина 33(3) 38(3)

Результаты, приведенные в таблице 3.3.3, показывают, что количество эшоированного белка уменьшается с увеличением концентрации модифицированного ПВПм.

и

А

Б

Рис. 3.3.2. Качественный анализ определения на поверхности полистиролышх микросфер поли-Ы-винилпиррслидона, содержащего звенья в-аланина. (А) -исходная суспензия микросфер диаметром 6 мкм с карбоксильными группами на поверхности; (Б) - суспензия микросфер с ковалентно иммобилизованным модифицированным поливинилпнрролидоном.

Очевидно, что количество элюированных с поверхности частиц белков, на которой иммобилизован ПВПм, ниже количества элюированных белков с поверхности, на которой иммобилизован лизин. Концентрация ПВПм, при которой количество элюированных белков минимальное, составляет 15 мг/мл 10%-ной полимерной суспензии.

При иммобилизации лизина и последующей иммобилизации ПВПм, удалось понизить уровень неспецифической адсорбции белков.(Табл. 3.3.4.)

Таблица 3.3.4. Количество элюированных белков по фракциям в мкг в расчёте на 100 мкл 10%-ой суспензии ПМС-Л, с иммобилизованным на поверхность частиц ПВПм последовательно после лизина, Х(т)_

Количество белка, Количество белка,

элюированного 0,ЗМ элюированного 8.6%

раствором фосфатного раствором додецилсульфата

буфером, мкг натрия, мкг

Лизин+ ПВПм 0 172(10) 115(9)

Лизин + ПВПм 1,5 116(6) 120 (7)

Лизин + ПВПм 5 101 (6) 99 (6)

Лизин + ПВПм 15 81(4) 98(6)

Лизин + ПВПм 25 87(4) 98(6)

Лизин + ПВПм 50 83(4) 98(6)

При одновременной иммобилизации лизина и ПВПм, концентрация лизина составляла 1 мкг/мл 4%-ой полимерной суспензии, концентрация ПВПм составила 15 мг/мл 10%-ной полимерной суспензии, количество элюированных с поверхности частиц неспецифических белков уменьшилось.

В таблице 3.3.5. приведены сводные результаты всех 3-х вариантов комбинированной иммобилизации лизина и ПВПм на поверхность полимерных

микросфер. Каждый вариант представлен условием, при котором количество эллюированных белков минимальное.

Таблица 3.3.5. Сводные результаты 3-х вариантов комбинированной

иммобилизации лизина и ПВПм на поверхность полимерных микросфер.

Количество белка, элюированного 0,ЗМ раствором фосфатного буфером, мкг Количество белка, элюированного 8.6% раствором додецилсульфата натрия, мкг

Лизин+ПВПмО 172 (10) 115(9)

1 вариант: ПВПм 15+лизин 142 (6) 121 (9)

2 вариант: Лизин + ПВПм 15 81(4) 98(6)

3 вариант: Лизин и ПВПм 119(7) 94(6)

Из данных таблицы 3.3.5. видно, что способ создания диагностической системы, предназначенной для обнаружения в плазме крови плазминогена, заключается в иммобилизации на поверхность частиц лизина с последующей иммобилизацией ПВПм в количестве, составляющем 15 мг/мл 10%-ой суспензии.

3.4. Использование ПВПм для создания термоустойчивых капсул, содержащих витамин Е.

Создание термоустойчивых капсул проводили из многокомпонентной системы, состоящей из водорастворимых полимеров и масляного раствора БАД по следующей схеме:

- в объем гидрогеля, сформированного из желатина в смеси с альгинатом натрия, включали мелкодиспергированную масляную фазу, стабилизированную ПВПм;

- В полученной дисперсной системе формировали сферические капсулы, покрытые термоустойчивой мембраной из кальциевой соли альганата.

Вначале было исследовано взаимовлияние полимеров на коллоидно-химические свойства их растворов, оптимизирован состав смеси полифункциональных полимеров и изучены физико-химические, реологические и механические свойства термоустойчивых капсул. На основе анализа экспериментальных закономерностей поведения смесей полифункциональных полимеров были предложены научно-обоснованные принципы биотехнологического процесса получения капсул, обеспечивающих длительный срок хранения БАД.

Вначале было изучено взаимовлияние полимеров на образование интергголимерных комплексов. При увеличении концентрации полимера в водном растворе может происходить агрегация макромолекул, как за счет минимизации свободной энергии системы при возрастания энтропии, так и возможности образования водородных связей, ионных и гидрофобных взаимодействий между полимерными цепями.

В качестве характеристик взаимодействия макромолекул в растворе могут служить закономерности изменения размера аесоциатов макромолекул и температуры конформационных переходов макромолекул. Измерение радиусов и коэффициентов диффузии коллоидных частиц, было выполнено методом фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС).

Показано, что при увеличении концентрации ПВПм происходит ассоциация макромолекул, причем, при изменении концентрации полимера от 0,005 до 0,1%, размер рассеивающих частиц возрастает с 6,5 до 780 нм. Переход к смеси трех полимеров (ПВПм, альгината натрия и желатина) приводит, также к увеличению размера частиц в растворе. Так, для систем с концентрацией ПВПм 0,005% он возрастает до 100 нм.

Метод дифференциальной сканирующей калориметрии, ДСК, позволяет высокой точностью определить температуру изменения информационного состояния макромолекулы желатина (температура фазового перехода полипептидной цепи), область перехода коллагеноподобная спираль -статистический клубок.

Все экспериментальные кривые ДСК имеют экстремальный вид. Температура, соответствующая точки минимума на зависимости величины теплового потока от температуры системы, соответствует tj. Для желатина в области этой температуры происходит фазовый переход полипептидной цепи, при котором коллагеноподобная спираль превращается в менее организованную структуру, близкую к конформации статистического клубка гибкоцешюго полимера.

Для макромолекул альгината натрия полученная кривая имеет экстремальный вид. Минимум на кривой ДСК при температуре 39,2°С соответствует изменению коиформации макроцепи полисахарида.

При рассмотрении смесей желатина с полисахаридом (альгинатом натрия) тепловые эффекты, связанные с изменением конформации полипептидной цепочки желатина, преобладают над тепловыми эффектами, связанными с изменением состояния полисахаридных молекул. Экспериментально наблюдаемый суммарный эффект может рассматриваться, как процесс, в котором преобладает вклад фазового перехода полипептидных макромолекул.

Введение в систему полисахарида и ПВПм приводит к увеличению значений 1ф (табл. 3.4.1.) Величина изменения термостабильности зависит от химического состава добавляемого полимера.

Таблица 3.4.1. Температура (°С) фазового перехода полипептидной цепи желатин В в присутствии альгинатов натрия и кальция при различных значениях рН среды, ш(желатина)=3%, исходная ш(альгината натрия)=1%. Ошибка измерения температуры 0,1°С.

Температура фазового перехода

рН 3,0 4,0 4,5 5,0 5,5 6,5 7,0 8,0 9,0 10,0

Желатин 26,7 29,4 30,8 31,2 30,5 28,1 26,6 25,3 25,1 24,6

Желатин + алгинат натрия 26,3 34,2 33,9 32,6 32,9 33,2 29,4 24,9 25,2 25,1

Желатин + алгинат кальция 27,1 29,1 29,9 30,8 31,7 32,1 31,8 25,3 26,3 24,8

Желатин+ алгинат натрия + ПВПм 27,0 31,5 32,4 31,7 31,9 29,0 26,8 26,7 26,6 25,3

Наибольшее увеличение значений ^ наблюдается в системе желатин-алъгинат-ПВПм (табл. З.4.1.). Это связано с образованием трехмерной сетки макромолекул желатины, стабилизированной полисахаридом, и ПВПм. Возникшая структура стабилизирована за счет электростатических взаимодействий между ионогенными группами полимеров и гидрофобными взаимодействиями между желатином и ПВПм,

Проведенные исследования свидетельствуют об образовании интерполимерных комплексов в водных растворах смеси желатин-альгинат-ПВПм. Комплексообразоаание исследованных полифункциональных

высокомолекулярных соединений открывает возможность формирования на их основе термоустойчивых капсул, характеризующихся высокой стабилизирующей способностью относительно биологически-активных веществ.

Закономерности процесса смешения водных растворов высокомолекулярных соединений, а затем и процесса технологии формирования капсул во многом определяются реологическими параметрами. В тоже время, механические свойства полученных термоустойчивых капсул определяются реологическими параметрами

18

гелей, образующихся в исследуемой полимерной системе. Эти факторы определили необходимость изучения реологического поведения полимерной системы при различных температурах. При температуре выше 30°С система является расплавом полимеров в водной фазе, характеризующимся вязко-упругим поведением. При температурах ниже 20°С система представляет собой гидрогель, обладающий пределом текучести.

При температуре 10°С происходит увеличение значения порога пластичности от 108 Па, для 1%-ного раствора желатина, до 2620 Па, для 5%-ного раствора желатины. Такое значительное увеличение напряжения, при котором происходит образование плоскостей скольжения в объеме геля, связано с одной стороны с увеличением количества узлов трехмерной сетки геля, представляющими наноразмерные фрагменты коллагеноподобных спиралей, так и образованием центров взаимного переплетения полимерных цепочек макромолекул желатина. После разрушения геля его вязкость падает от 1520 Па.с до 5 Па.с для 1%-ного геля и от 209 ООО Па.с до 224 Па.с для 5%-ного геля. Такое поведение системы подтверждает наше предположение о роли механического взаимодействия полимерных цепочек.

Повышение температуры до 40°С приводит к плавлению геля, связанного с разрушением коллагеноподобных спиралей и ослаблением механического взаимодействия полимерных цепей, вследствие возрастания энтропии системы. Исследуемый объект приобретает свойства упруго-вязкой жидкости. При этом до скоростей деформации порядка 1 с'1 система характеризуется аномальной зависимостью вязкости от скорости деформации. Такое поведение системы объясняется процессом ориентации макромолекул в потоке. В этой области реологических кривых вязкость системы практически не зависит от концентрации желатина. При более высоких скоростях деформации система ведет как ньютоновская жидкость. На этом участке кривых прослеживается традиционная зависимость вязкости от объемной доли диспергированного вещества, описываемой уравнением Эйнштейна

Для нахождения оптимальных условий формирования термоустойчивых капсул были проведены реологические испытания расплавов гелей смесей желатина с ПВПм и альгинатом натрия. Показано, что при температурах от 10 до 30°С система представляет собой структурированное твердое тело, имеющее предел пластичности (т0,) порядка от 15 до 0,0026 Па в зависимости от состава смеси и температуры. Пластическая вязкость (т8) уменьшается с увеличением температуры, в 108 раз. Предельное динамическое напряжение (-с^) зависит от содержания полимеров в геле и температуры и изменяется от 1714 до 0,0182 Па. Скорость деформации (у), при которой наступает Tj, возрастает с увеличением

температуры. Зависимость напряжения сдвига от скорости деформации может быть аппроксимирована линейной зависимостью.

При температурах 40+50 °С изменяется характер кривых течения. При этом значение т<) зависит от концентрации полимеров, что свидетельствует о взаимном влиянии макромолекул, подвергающихся действию сдвиговых напряжений.

Полученные реологические характеристики смесей желатины с различными производными полисахаридов позволили выбрать оптимальный состав капсул, обеспечивающий требуемые органолептические свойства. Кроме этого, численные значения реологических параметров смесей биополимеров, полученных при различных температурах, позволили сформулировать требования к оборудованию, используемому в технологической линии по производству термоустойчивых капсул.

В работе предложен путь получения микрогелей, покрытых пленкой нерастворимой соли полисахарида, удовлетворяющих технологическим требованиям массового производства, основанный на «капельной технологии». При этом капля исходного раствора гелеобразующего вещества, например, смеси желатина и альгината, биологически-активных добавок, красителей, ароматизаторов и др. формируется на конце капилляра. После отрыва капли от капилляра она попадает в раствор, содержащий ионы, например, кальция. В этом растворе происходит формирование нерастворимой пленки альгината кальция. В процессе выделения новой фазы кальциевой соли производного полисахарида и происходит формирование мембраны, сохраняющей устойчивость до 120°С. Формирование такой мембраны обеспечивает изоляцию и целостность внутреннего объема капсулы в независимости от его агрегатного состояния.

Методами оптической микроскопии, ИК-спектроскопии полученны кинетические характеристики формирования защитной мембраны на поверхности термоустойчивой капсулы, что позволило теоретически обосновать параметры такого важного технологического этапа, как обработка поверхности капсул раствором хлорида кальция.

Для введения в состав термоустойчивой капсулы масляного раствора витамина Б была установлена область устойчивости эмульсий типа масло/вода в диапазоне концентрации полимера от 0,25 до 1.5 %. Полученные результаты показывают, что устойчивость эмульсий становится достаточной для дальнейшего их использования при концентрациях ПВПм выше 0,5%

Исследование эмульгирующей способности раствора ПВПм, показало, что эта величина зависит от химического состава масляной фазы. Эмульгирующая способность раствора ПВПм возрастает при переходе от коммерческого образца масляного раствора витамина Е к системе, полученной при добавлении к нему 30%

(по массе) стеариновой фракции пальмового масла. Это связано, вероятно, с высокой адсорбционной активностью ПВПм на твердых поверхностях. Увеличение адсорбции полимера на межфазной границе в этих условиях приводит к повышению устойчивости получаемой эмульсии, а, следовательно, и росту эмульгирующей способности раствора полимера.

Устойчивость биологически активных добавок к действиям окислителей исследовали на примере витамина Е (табл.3.4.2.).

Таблица 3.4.2. Зависимость относительного содержания, % витамина Е от времени хранения для образцов 1-4.

Окислитель, водный раствор 1, час 1 2 3 4

0 100 100 100 100

2 53,9 99,4 100 100

5,%03 6 26,6 99,4 100 100

24,2 13,5 99,7 99,7 99,3

48 7,4 95,6 91,6 99,7

72 4,7 88,9 79,1 99,7

0 100 100 100 100

2 12,7 100 100 100

5,%Н202 6 2 100 100 100

25 0 100 98,3 99,3

48,4 0 100 72,4 100

72 0 91,2 52,2 99

0 100 100 100 100

2 62 99,4 93,6 100

8% КС Юз 6 5,7 99 85,9 100

24,2 0 95 63,6 100

48 0 86,2 47,5 99

72 0 70,4 40,4 90,9

В качестве окислителей были выбраны: растворы озона, перекиси водорода и перхлората калия. Первый из них представляет собой молекулярный раствор газов, второй - в водном растворе может образовывать радикалы, а третий -диссоциирует в воде с образованием аниона С103", характеризующимся высохим окислительным потенциалом.

В работе проведено сравнение четырех форм нахождения данных БАД в водной среде. Первая - солюбнлизнрованное БАД в водном растворе Т\уееп 80,

21

вторая - диспергированное БАД в стеариновой фракции пальмового масла в водном растворе Ттеееп 80, третья - диспергированное БАД в ядре капсулы и четвертая - диспергированная во стеариновой фракции пальмового масла с БАД в ядре капсулы. Во всех случаях максимальной устойчивостью характеризовалась четвертая система, где была реализована разработанная схема защиты БАД от действия химически активных веществ.

Проведенные исследования показывают неудовлетворительную устойчивость витамина Е в условиях применения традиционной технологии производства пищевых продуктов. Это связано с тем, что данные БАД, находящиеся в молекулярной или дисперсной форме, непосредственно контактируют со средой, в которой паходится окислитель. Содержание витамина Е падает до нуля за 24 часа при выдерживании в среде, содержащей Н202 и КС103, и до 4,7% за 72 часа выдерживания в среде, содержащей Оз.

Максимальная устойчивость БАД в среде; содержащей окислители, была достигнута при диспергировании стеариновой фракции пальмового масла, обогащенного БАД в ядре синтезированных термоустойчивых капсул.

В последнем случае удается создать максимально эффективный диффузионный барьер на пути проникновения окислителей из внешней среды в точку локализации молекул БАД.

Выводы.

1. Определены условия модификации М-винилпирролидопа (температура, растворитель, соотношение компонентов), позволяющие получить высокий выход конечного продукта и оптимизировать процесс синтеза аминокислотного производного поли-М-винилпирролидона.

2. Показано, что использование поли-М-винилпирролидона с боковой группой р-аланина в составе кровезаменителей обеспечивает повышение их дезинтоксикационного эффекта относительно известных препаратов.

3. Впервые получены тест-системы на плазминоген в плазме крови, представляющие собой функциональные полимерные микросферы с ковалентно иммобилизованным поли-1Ч-виншширролндоном с боковой группой р-аланина, отличающиеся низким уровнем адсорбции неспецифических белков.

4. Обнаружено, что термоустойчивые капсулы на основе гидрогелей желатина, производных полисахарида и поли-М-винилпирролидона с боковой группой р-алашша характеризуются длительным хранением витамина Е, иммобилизованного в их объем, и стойкостью к действию окислителей.

Литература

1. Артыкова З.Б., Горячая А.В., Ташмухамедов Р.И., Грицкова И.А., Штильман М.И. Взаимодействие поли-М-винилпирролидона и хлорацетамида в спиртовой среде. // Пластмассы, 2010, №7, с.

2. Артыкова З.Б., Грицкова Й.А., Гусев С.А., Штильман М.И., Кедик С.А., Прокопов Н.И. и др. Получение диагностических гест-систем на основе полимерных микросфер в присутствие поливинилпирролидона, модифицированного аминокислотой. И Вестник МИТХТ, 2010, том 5, №3, с. 82-88.

3. Горячая А.В., Артыкова З.Б., Кусков А.Н., Ташмухамедов Р.И., Штильман М.И. Определение характеристик амфифильных полимеров винилпирролидона (Тверь, 2008), ТГУ, С.27.

4. Горячая А.В., Артыкова З.Б., Кусков А.Н., Ташмухамедов Р.И., Штильман М.И. Наноразмерные системы на основе амфифильных полимеров винилпирролидона (Тверь, 2008), ТГУ, С.34.

5. Artykova Z.S., Tashmuhamedov R.I., Goryachaya A.V., Shaimurzin A.M., Shtilman M.I. Functional derivatives of polyvinylpyrrolidone as a base of novel bioactive and drug systems. // Euro-Eco - 2009, Hannover 2008, International Conference, p.9.

6. Artykova Z.B., Tashmuhamedov R.I., Tsatsakis A.M., Tzatzarakis E., Gritskova I.A., Kramfcovitis E., Goryachaya A.V., Shtilman M.I. // "Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances and Saffety - Toxicological Issue" (Iй Russian-Hellenic Symposium with International Participation and Young Scientist's School) [Iraklion, 3-9 May, 2010], P.63.

Подписано в печать:

23.08.2010

Заказ № 4008 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Поли-1Ч-винилпирролидон как компонент медицинских препаратов.

1.1.1. Основные свойства поли- N-винилпирролидона.

1.1.2. Отдельные направления использования ПВП.

1.1.3. Токсикологические особенности ПВП.

1.2.Полимерные микрочастицы в биоанализе.

1.2.1. Принципы использования микрочастиц в биоанализе.

1.2.2. Полимерные носители биолигандов.

1.2.3. Требования к полимерным микрочастицам.

1.2.4. Методы синтеза полимерных микросфер.

1.2.5. Функционализация микросфер.

1.4. Принципы формирования термоустойчивых гидрогелевых капсул для иммобилизации лекарственных препаратов.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Исходные вещества.

2.2.Методы исследования.

2.2.1.Получение поли-М-винилпирролидона, содержащего эпоксидные и аминокислотные группы.

2.2.2. Получение полистирольных микросфер диаметром 6 мкм с карбоксильными группами на поверхности.

2.2.3. Определение размера частиц полимерных суспензий.

2.2.4. Определение содержания полимера в суспензии.

2.2.5. Очистка полимерных суспензий.

2.2.6. Определение агрегативной устойчивости микросфер.

2.2.7. Иммобилизация лизина на поверхность полистирольных микросфер

2.2.8. Качественное определение иммобилизованного лизина на поверхности полимерных микросфер, ПМС-Л.

2.2.9. Адсорбция на поверхность полимерных частиц, содержащих ковалентно связанный лизин, ПМС-Л, поливинилпирролидона и модифицированного аминокислотой поли-1М-винилпирролидона (ПВПм)

2;2.10.Адсорбция белков плазмы крови на поверхность ПМС-Л.

2.2.11. Количественное определение адсорбированного белка.

2.2.12 Постановка одномерного электрофореза в полиакриламидном геле.

2.2.13. Определение активности супероксиддисмутазы с помощью фотосенсибилизированной хемилюминесценции.

2.2.14. Определение механических свойств капсул.

2.2.15. Исследование реологических свойств водных растворов. полимеров.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Синтез функционального поли-1М-винилпирролидона.

3.1.1. Синтез поли-М-винилпирролидона, содержащего боковые аминокислотные группы.

3.2. Использование поли-N- винилпирролидона с боковыми аминокислотными группами в составе кровезаменителей дезинтоксикационного действия.

3.3. Использорвание поли-Ы-винилпирролидона, содержащего в боковой цепи р-аланин. Для получения диагностических тест-систем.

3.3.1. Анализ уровня неспецифической адсорбции белков сыворотки крови ПМС-Л.

3.4. Использование ПВПм для создания термоустойчивых капсул, содержащих витамин Е.'.

ВЫВОДЫ.

Поли-1Ч-винилпирролидон нашел широкое применение в различных областях, в первую очередь в медицине, где он используется в качестве компонентов различных лекарственных систем, в частности, в качестве компонента кровезаменителей, носителя различных лекарственных веществ, компонента лекарственных форм, средства, способствующего криосохранности органов и тканей и т.д.

Это определяется комплексом специфических свойств этого полимера, в частности, растворимостью в воде и широком круге органических растворителей, способностью к комплексованию с веществами различного химического строения, высоким уровнем биосовместимости.

В то же время, возможности использования поли-1Ч-винилпирролидона могут быть значительно расширены после введения в него дополнительных функциональных группировок. Это с одной стороны может значительно расширить способность этого полимера к взаимодействию с различными лигандами, в том числе биологического происхождения, а с другой стороны -придать этим производным поли-1\1-винилпирролидона дополнительные особенности биологической активности.

Среди подходов к получению функциональных производных поли-N-винилпирролидона можно отметить возможность получения его сополимеров с различными сомономерами и возможность введения в полимер дополнительных функциональных групп за счет химических превращений исходного полимера. Второй путь привлекает внимание в первую очередь получением продуктов с оптимальным молекулярно-массовым распределением, поскольку в этом случае в качестве исходного реагента может быть использован поли-Ы-винилпирролидон медицинского назначения, имеющий допуск для инъекционного введения в организм.

В данной работе был усовершенствован метод получения поли-N-винилпирролидона, содержащего дополнительные боковые группы Р-аланина, которые придают полимеру дополнительные свойства, и определены новые возможные пути его использования для получения различных медицинских препаратов и биоаналитических систем, обладающих повышенной эффективностью.

Одна из основных проблем, которая возникает при создании диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер в качестве носителей биолиганда состоит в том, что, кроме целевого, то есть специфически связанного с биолигандом, на поверхность полимерных частиц сорбируются неспецифические к данному лиганду белки, что снижает чувствительность и специфичность биохимических анализов.

Из литературы известно, что уменьшить содержание неспецифических белков на поверхности полимерных микросфер можно путем адсорбции на их поверхность поливинилпирролидона. Поливинилпирролидон характеризуется невысокой поверхностной активностью, и при появлении в системе более сильных поверхностно-активных веществ, например поверхностно активных белков, десорбируетя с поверхности полимерных микросфер. Было высказано предположение о том, что более эффективно блокировать неспецифическую сорбцию белков плазмы крови будет модифицированный аминокислотами ПВП.

Актуальной проблемой является создание термоустойчивых и устойчивых к действию окислителей капсул для биологически активных добавок. Было предположено, что такие капсулы можно получить из полифункциональных высокомолекулярных соединений, способных образовывать интерполимерные комплексы в водных растворах, например, смеси желатин - альгинат - поливинилпирролидон, содержащий в боковой цепи (3-аланин.

Цель работы. Оптимизация процесса синтеза аминокислотного производного поли-Ы-винилпирролидона и его использование в качестве компонента кровезаменителей, диагностических тест-систем, и термоустойчивых гидрогелевых капсул.

Научная новизна.

• Оптимизован процесс синтеза поли-М-винилпирролидона, содержащего боковую группу (З-аланина, и определены условия получения полимера с высоким выходом;

• Показано, что использование производного поли-М-винилпирролидона с боковой группой р-аланина в составе кровезаменителей существенно повысило уровень их дезинтоксикационного действия;

• Показано, что применение поли-М-винилпирролидона с боковой группой Р-аланина в процессе создания диагностической тест-системы на плазминоген в крови, позволяет существенно понизить уровень неспецифической адсорбции белков плазмы крови, что повышает чувствительность и специфичность тест-системы;

• Сформулированы научные принципы формирования структур термоустойчивых капсул на основе термотропных (желатины) и ионотропных (производных полисахарида) гелей, позволяющих повысить (в 3-12 раз) устойчивость витамина Е при длительном хранении и к действию окислителей.

Практическая значимость.

Проведено сравнительное исследование в опытах на животных дезинтоксикационного действия стандартного кровезаменителя-дезинтоксикатора препарата Красгемодез и поли-М-винилпирролидона, содержащего боковую группу р-аланина, на фоне контрольного исследования в отсутствие дезинтоксикатора. Показано, что новый кровезаменитель - высокоэффективное дезинтоксикационное средство, что и определяет несомненное преимущество этого препарата, и он может быть рекомендован для использования в медицинской практике.

Создана тест-система для определения плазминогена в крови с низким уровнем неспецифической адсорбции белков плазмы крови.

Предложена схема создания термоустойчивых капсул, содержащих витамин Е, обеспечивающая устойчивость биологически-активного компонента.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ВЫВОДЫ

1. Определены условия модификации N-винилпирролидона (температура, растворитель, соотношение компонентов), позволяющие получить высокий выход конечного продукта и оптимизировать процесс синтеза аминокислотного производного поли-М-винилпирролидона.

2. Показано, что использование поли-М-винилпирролидона с боковой группой р-аланина в составе кровезаменителей обеспечивает повышение их дезинтоксикационного эффекта относительно известных препаратов.

3. Впервые получены тест-системы на плазминоген в плазме крови, представляющие собой функциональные полимерные микросферы с ковалентно иммобилизованным пол и-М-винилпирролидоном с боковой группой р-аланина, отличающиеся низким уровнем адсорбции неспецифических белков.

4. Обнаружено, что термоустойчивые капсулы на основе гидрогелей желатина, производных полисахарида и поли-М-винилпирролидона с боковой группой Р-аланина характеризуются длительным хранением витамина Е, иммобилизованного в их объем, и стойкостью к действию окислителей.

1. Blecher L., Barnette L.W. Parenreral use о polyvinylpyrrolidone. // Bull.

2. Parenteral Drug, 1969, V.23, N.3, P.124-131.

3. Kabaivanov V. Physiologically active polymers. // Polym., Symp., 1971, V.3,1. P. 5-25.

4. Сидельковская Ф.П. Химия N-винилпирролидона и его полимеров. М.:1. Наука.-1970.

5. Кирш Ю.Э. Поли-М-винилпирролидон и другие поли-Ы-виниламиды:синтез и физико-химические свойства. М: Наука, 1998.- 252 С.

6. Buhler V. Polyvinylpyrrolidone. Excipients for Pharmaceuticals (Povidone,

7. Crosspovidone and Copovidone. Springer: Berlin Heidelberg New York, 2005.-263 p.

8. Robinson B.V., Sullivan F.M., Borzelleca J.F., Schwartz. PVP: A Critical

9. Review of the Kinetics and Toxicology of Polyvinylpyrrolidone (Povidone), Lewis Publisher, Inc.: Chelsea, Michigan, 1990. 209 P.

10. Барышев Б.А. Кровезаменители. Справочник для врачей. М.: Человек,2005.

11. Письмо Минздравсоцразвития № 01-6275/06 от 02.03.2006.

12. Folttmann Н., Quadir A. Polyvinylpyrrolidone (PVP) One of the Most

13. Widely Used Excipients in Pharmaceuticals: An Overview. // Drug Delivery Technology, 2008, V.8, N.6, P.2-27.

14. Skinner G. W. Correlating the Ejection Force of Tablets with the Toughnessof Binders in the Solid Dosage Forms. // AAPS Annual Meeting, 1098 San Francisco., P.96-97.

15. Дмитриевский Д.И., Перцев И.М. Изучение растворимости твердыхдисперсий эритромицина с поливинилпирролидоном. // Фармацевт, ж., 1986, №5, С.48-51.13.