Биологически активные аминокислотные производные поли-N-винилпирролидона и их металлокомплексы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

Ташмухамедов Равшан Иркинович

Биологически активные аминокислотные производные поли-К-винилпирролидона и их металлокомплексы

02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

□ОЗ 17437"?

Москва - 2007

003174377

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете имени Д И Менделеева (Москва, Россия) и на фирме «Фармед» (Ташкент, Республика Узбекистан)

Научный консультант

доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович

Официальные оппоненты

доктор химических наук профессор Коршак Юрий Васильевич

доктор химических наук профессор Паписов Иван Михайлович

Ведущая организация

доктор химических наук, профессор Телешов Эдуард Никанорович

Институт нефтехимического синтеза им.А.В.Топчиева РАН

Защита состоится «1» ноября 2007 г. в 15.00 час. на заседании Диссертационного совета Д 212,120.04 при Московской академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова (МИТХТ) (119571 Москва, пр.Вернадского, д.86) в ауд. Т-410.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова

Автореферат размещен на сайте www mitht ru

Автореферат разослан « ^ » ^ 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук, профессор

U12.120.04,

И.А.Грицкова

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность выбранной темы. Макромолекулярные системы, обладающие различной биологической активностью, в частности оказывающие лекарственное действие, обладают существенными преимуществами перед низкомолекулярными аналогами, а в ряде случаев определенные виды активности характерны только для макромолекулярных систем

К настоящему времени описано большое количество полимерных соединений различного химического строения, проявляющие биологическую активность как за счет макромолекулярной природы (полимеры с собственной биологической активностью), так и за счет определенного фрагмента, который может постепенно выделяться из полимера и поступать в биологический объект (системы с контролируемым выделением активного вещества)

В последнем случае определяющее значение имеет не только тип выделяющегося активного вещества и характер связи его с полимерным носителем, определяющей скорость выделения, но и строение самого полимерного носителя, который должен обладать высоким уровнем безвредности (особенно для систем, вводимых инъекдионно)

Поэтому во многих случаях в качестве основы для создания полимерных носителей лекарственных веществ используются полимеры, хорошо изученные как компоненты кровезаменителей, взаимодействие которых с организмом исследовано достаточно глубоко, в том числе поли-М-винилпирролидон, входящий в состав кровезаменителей дезинтоксикационного назначения

Важнейшим элементом создания лекарственных полимеров с контролируемым выделением активного вещества является выбор иммобилизуемого объекта, определяющего характер и уровень биологической активности, что отражено в громадном числе публикаций

В то же время, такая важная группа биологически активных полимеров как макромолекулярные производные биогенных металлов, в первую очередь переходных групп, которые могут явиться основой целого ряда терапевтических систем, исследована явно недостаточно

При этом существенно, что успешное использование таких систем связано с обеспечением постепенного поступления активного агента в организм в оптимальных дозах и исключение возможной токсичности, проявляющейся при повышенных концентрациях Это подразумевает использование для иммобилизации металлов оптимальных по своим характеристикам носителей, как с точки зрения полной выводимости из организма, так и с точки зрения отсутствия острой и длительной токсичности

Таким образом, весьма актуальным является разработка полимерных металлокомплексов, содержащих различные металлы, а в качестве

макромолекулярных носителей используются полимеры с высоким уровнем биологической безвредности

Цель работы состояла в разработке новых аминокислотных производных эпоксидсодержащего поли-Ы-винилпирролидона и их комплексов с переходными металлами, и исследовании их в качестве макромолекулярных систем, обладающих различными типами биологической активности

Научная новизна работы. Разработаны новые биологически активные аминокислотные производные поли-Ы-винилпирролидона и их металлокомплексы, характеризующиеся низкой токсичностью и проявляющие биологическую активность различного типа

Предложен новый метод функционализации поли-М-винилпирролидона, в том числе его промышленных образцов медицинского назначения, путем введения в него эпоксидных групп с использованием модифицированной реакции Дарзана, что позволяет получать реакционноспособные полимерные производные этого полимера с заранее заданным мояекулярно-массовым распределением

Получен ряд новых полимерных соединений низших а,га-аминокислот путем их реакции с эпоксидсодержащим поли-М-винилпирролидоном и металлокомплексов ряда переходных металлов на их основе

Впервые получены аминокислотные производные поли-М-винилпирролидона и их металлокомплексы с использованием в качестве носителя амфифильного полимера К-винилпирролидона, способного к образованию наноразмерных агрегатов в водных растворах, и изучены их свойства

Показано, что аминокислотные производные эпоксидсодержащих полимеров М-вигшлпирролидона и металлокомплексов на их основе обладают различными типами биологической активности Выявлена взаимосвязь между биологической активностью полимеров и их химическим строением

Практическая значимость работы.

Синтезированные полимеры и металлокомплексы на их основе обладают низкой токсичностью, и проявляют высокую иммуностимулирующую, иммуноадъювантную, антивирусную, гемостимулирующую активность, а также усиливают продуцирование интерферона, подавление репликации микроорганизмов под действием антибиотиков, что предполагает их использование в качестве основы или компонентов лекарственных препаратов

Эти данные указывают на перспективность использования синтезированных полимеров и их металлокомплексов в качестве основы лекарственных препаратов

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 220 стр машинописного текста и включает введение, обзор литературы, обсуждение результатов, основные выводы и список цитированной литературы из 243 наименований Работа содержит 39 таблиц и 34 рисунка

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1. Выбор метода синтеза полимерных носителей и полимерных металлокомплексов

Создание макромолекулярных систем, содержащих атомы переходных металлов, способных оказывать тот или иной терапевтический эффект, требовало выбора полимерных носителей, обладающих оптимальными характеристиками

В случае лекарственных полимеров такая оптимизация подразумевает придание системе биосовместимости, обеспечение требуемого уровня прочности связи между полимерным носителем и группировкой, определяющей биологическую активность Наконец, в случае использования полимера в виде водного раствора, например, при инъекционном введении, строение полимерного носителя должно обеспечить растворимость системы в воде

С учетом этих требований в качестве основы использовавшихся полимерных носителей был выбран поли-М-винилпирролидон (далее -ПВП), допущенный для инъекционного введения в организм как компонент кровезаменителей дезинтоксикационного действия

Для введения в состав полимера атомов металлов был использован метод комплексообразования В этом случае в боковые группы полимеров были введены группировки, способные к комплексообразованию В качестве таких группировок были использованы остатки низших а,о> алканаминокислот Использование в качестве комплексообразующего фрагмента аминокислот позволяло получать системы с высокой биосовместимостью

В качестве исходных полимеров, на основе которых были получены полимерные производные аминокислот, были использованы полимеры № винилпирролидона, содержащие боковые эпоксидные группы При синтезе таких полимеров были использованы подходы, позволяющие получить полимеры с оптимизированным молекулярно-массовым распределением

2.2. Синтез эпоксидсодержащих носителей

В качестве эпоксидсодержащего полимера М-винилпирролидона в работе был использован специально синтезированный эпоксидирсванный поли-№винилпирролидон (далее - ЭПВП), в том числе содержащий концевой гидрофобный фрагмент В ряде исследований для сравнения был

рассмотрен также сополимер К-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира

Для получения ЭПВП был использован новый подход, заключающийся во введении в ПВП эпоксидных групп в условиях модифицированной реакции Дарзана

Классическая схема реакции образования эпоксидов по Дарзану описана для взаимодействия эфиров хлоруксусной кислоты с карбонильными соединениями в щелочной среде, в первую очередь с кетонами В данном случае был использован нестандартный подход -взаимодействие с производным хлоруксусной кислоты - хлорацетамидом -карбонила пирролидонового кольца, т е карбонила циклического амида

-СН2-СН-

Г

т=о

С1СН2

о

С2Н5(Жа, С2Н5ОН -МаС1

- сн2—сн4

I 1

Л?

-СН,-

-сн-

=0

к.

-С^СН-С-

о I! о

Введение в ПВП эпоксидной группы, обладающей высокой реакционной способностью без дополнительного активирования позволяет рассматривать получаемый полимер в качестве потенциального носителя различных лигандов Синтезированный в данном случае зпоксидсодержащий полимер (ЭПВП) содержит в реакционноспособпом звене амидную группу, что позволяет обеспечить высокую общую полярность полимера

Это существенно с точки зрения возможности использования его в качестве носителя гидрофобных веществ, при сохранении растворимости всей системы в воде

Образование эпоксидсодержащего продукта при взаимодействии пирролидонового цикла с хлорацетамидом в условиях модифицированной реакции Дарзана, было подтверждено синтезом модельного соединения -эпоксидированного И-метилпирролидона (4-мети л-1 -окса-4-

азаспиро[2,4]гептан-2-карбокс.амида)

СН3

сн3

-±—>

C2H5ONa, С2Н5ОН -NaCl

ÜV^r®2

j о

о

Ход протекания реакции и чистоту полученного продукта контролировали методом тонкослойной хроматографии (элюент - диоксан вода = (5.2), пластинки фирмы «Süufol UV-254», Rf=0,57), а также методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматограф HP 1090, колонка ODS Hipersyl 100x2 мм, элюент - фосфатный буфер, скорость потока 0,25 мл/мин) Как было показано, продукт реакции является индивидуальным веществом без примесей исходных веществ или побочных продуктов

Реакцию проводили в среде этанола при 10°С Бесцветные кристаллы эпоксидированного N-метилпирролидона плавились при 171°С Его строение было подтверждено элементным анализом и данными ИК- и ЯМР- спектроскопии (Ж спектр 1250 см 1114 см"1, 930 см 770 см (оксирановый цикл), 3400 см (NH), 1650 см и 1440см (С=0 амидной группы) ПМР спектр (5, м д) 2,04 (м, 2Н, СН2), 2,42 (т, 2Н, СН2), 2,82 (с, ЗН, СН3), 3,50 (т, 2Н, СН2), 4,67 (NH2), 4,90 (с, 1Н, СН))

Для исследования особенностей протекания реакции с участием ПВП и нахождения оптимальных условий получения его эпоксидированного производного (ЭПВП), содержащего требуемое количеством эпоксидных групп, было исследовано влияние на протекание процесса различных факторов (концентрации и соотношения реагентов, температуры и времени реакции, а также строения используемого в качестве среды спирта и молекулярных масс ПВП)

В работе использовали ПВП с Мп= 9,0x10я, 25,4 (~25)хЮ3 и 39,8 (=40)

х103

Строение полученного полимера было подтверждено функциональным анализом (лотенциометрическое титрование), ИК спектральным анализом и ПМР-спектроскопией

Проведенные исследования показали, что взаимодействие хлорацетамида с ПВП проходит в мягких условиях (Т=10-12°С) При этом в оптимальных условиях образуется продукт с достаточно высоким содержанием эпоксидных групп (20-25 мол %)

В качестве примера на рис 1,2 приведены зависимости, характеризующие влияние на содержание в полимере ВП эпоксидных групп температуры реакции и соотношения хлорацетамид ПВП времени процесса для полимеров с различной молекулярной массой

Содержание

Рис 1 Зависимость количества эпоксидных групп от температуры (соотношение ПВП Хлорацетамид Na - 111 оеново-моль/моль/моль, концентрация полимера в растворителе 12,5 %, время проведения реакции 4 часа Молекулярная масса ПВП 1 - 40 тыс 2-25 тыс ; 3 - 9 тыс )

Как видно, повышение температуры реакции выше 20°С не приводит к повышению количества эпоксидных групп, что, возможно связано с их возможным гидролизом в щелочной среде

При этом было обнаружено, что во всех случаях при одинаковых условиях степени замещения пирролидоновых циклов спиро-циклами с эпоксидными группами определенным образом зависят от молекулярных масс полимеров Количество эпоксидированных звеньев повышается с уменьшением молекулярной массы полимеров, что, вероятно, определяется пространственными причинами

Хлорацетамид : ПВП, моль/осново-моль

Рис. 2. Зависимость количества эпоксидных групп от соотношения ПВП : Хлорацетамид (концентрация полимера в растворе 12,5 %, температура 1=10°С, время проведения реакции 4 часа. Молекулярная масса ПВП: 1 - 40 тыс. 2-25 тыс.; 3 - 9 тыс.).

Полученный ЭПВП представляет собой бесцветный порошок, растворимый в воде и полярных органических растворителях.

Для получения его аминокислотных производных и затем полимерных металлокомплекеов в работе был использован ЭПВП с содержанием эпоксидсодержащих звеньев 10,31 мол.% (-10 мол.%) и молекулярной массой около Мп = 9x103 (полимер, являющийся основой препарата «Неогемодез».

Для синтеза амфифильных полимеров ВП, содержащих боковые аминокислотные группы в качестве эпоксидированного носителя был использован ПВП, содержащий одну концевую гидрофобную алифатическую группу -С17Н35. (Мп~2000).

Эпоксидные группы вводили в этот полимер с использованием модифицированной реакции Дарзана. Содержание эпоксидных групп в полимере, использовавшемся для дальнейших превращений было ~ 9 мол.%. Наличие в полученных водорастворимых амфифильных полимерах гидрофобной концевой группы определяло их склонность к образованию начоразмерных агрегатов в водной среде.

В сравнительных опытах для реакции с аминокислотами и далее для получения металлокомплексов в работе был также использован сополимер И-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира с содержанием эпоксидсодержащих звеньев 9,86 мол% (-10 мол%) и молекулярной массой Мп = 17х 103 (паровая осмометрия) и М\\- = 24х Ю3 (седиментация)

2.3. Синтез полимеров, содержащих аминокислотные остатки

Синтез полимеров, содержащих боковую группировку, способную образовывать хелатные комплексы с переходными металлами, проводили взаимодействием эпоксидсодержащих полимерных носителей, с низшими оцю-аминокислотами

Проходящая в этом случае реакция М-алкилирования аминогруппы аминокислоты принципиально не препятствовала последующему образованию комплексов как с участием карбоксильной группы, так и с участием аминогруппы (за счет свободной пары электронов) Реакцию полимерных эпоксидов с аминокислотами проводили рН > 7, когда разрушается цвиттер-ион аминокислот и их аминогруппа приобретает основные свойства и способность вступать в реакции алкилирования, в том числе, присоединяться к оксирановому циклу

В случае сополимера Ы-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира, содержащего монозамещенный оксирановый цикл, присоединение кислоты протекает в соответствии с правилом Красуского, когда аминогруппа направляется к СН2-группе

С другой стороны, в случае ЭПВП когда в реакцию с аминокислотой вступал 1,2-дизамещенный оксиран, реакция могла протекать в двух направлениях - с присоединением остатка аминокислоты к атому углерода, входящему в цикл, и с присоединением остатка аминокислоты к атому углерода, связанному с карбонилом амидной группы

ОН О

Поэтому, требовались дополнительные исследования для выявления строения продукта Для выяснения направления протекания этой реакции

было исследовано строение продукта присоединения аминокислоты в модельной реакции ее взаимодействия с эпоксидсодержащим N-метилпирролидоном с глицином

Реакцию взаимодействия ЭМП с глицином проводили при температуре 25°С в щелочной среде в течение 4 часов Полученный продукт, выделенный после нейтрализации раствора, перекристаллизовывали из этанола

Ход протекания реакции и чистоту полученного продукта контролировали методом тонкослойной хроматографии (элюент - метанол 10% аммиачный раствор = (4.1), пластинки фирмы «Silufol UV-254», Rf=0,67), а также методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматограф HP 1090, колонка ODS Hipersyl 100x2 мм, элюент - фосфатный буфер, скорость потока 0,25 мл/мин)

Полученный продукт представлял собой бесцветные кристаллы (t„„ = 196°С), растворимые в воде, диметилсульфоксиде Строение полученного продукта было определено методом ИК, ПМР спектроскопии

Анализ ИК-спектра ЭМП-глицин, снятого с таблеток КВг с исследуемым веществом с помощью микрофокусировочной приставки на ИК-Фурье спектрометре «Paragon 1000РС», показывает, что происходит исчезновение полос, принадлежащих эпоксидной группе 1250 см 930 см "' и 770 см , а также появление ряда других полос, соответствующие присоединению аминокислоты 1610 см 1335 см"1 (колебания карбоксильной группы), 1180 см"1 - участие образующейся C-N связи в скелетных колебаниях молекулы Также в спектре наблюдаются полосы 3400 см -1 (NH-группа), 1650 см "' и 1410 см (колебания С=0 амидной группы)

На ПМР спектре ЭМП-глицин (снят на приборе «Braker spectrometer 200 MHz», с использованием D20 в качестве растворителя и тетраметилсилана в качестве эталона ) наблюдаются следующие сигналы (5, м д ) 1,88 (м, 2Н, СН2), 2,17 (т, 2Н, СН2), 2,67 (с, ЗН, СН3), 3,02 (т, 2Н, СНг-глицина), 3,36 (т, 2Н, СН2), 4,05 (с, 1Н, СН)

При этом сигнал протонов с химическим сдвигом 3,02 мд. соответствует СН2 группе от глицинового остатка (смещается в высокочастотную область по сравнению с самим глицином, который имеет сигнал протонов СН2 группы с химическим сдвигом 3,42 м д ), а сигнал протона СН группы при раскрытии эпоксидного кольца с химическим сдвигом 4,02 мд незначительно смещается в область слабого поля с химическим сдвигом 4,05 м д

Учитывая, что в данной реакции возможно образование двух изомеров продукта реакции в зависимости от места присоединения остатка глицина в а или ß - положении по отношению к амидной группе при раскрытии оксиранового кольца, для определения места присоединения остатка глициьа был проведен анализ ПМР спектра полученного

соединения, а также анализ теоретически предполагаемых ПМР спекгров возможных изомеров (компьютерная программа АСОЬаЬ)

С> ОН СН3

У ^ /он

СН, Н2С с-сн-с'

СНз | I \шкн2

I N11 о НгС-СН2 I

ЛЧ. / // СН-?

н2с с-сн-с; 1 2

I I Ънкн2 .с

Н2С сн2 о" Ьн

1 (¡3-положение к амидной 2 (а-положение к амидной

группе) группе)

Было установлено, что различить изомеры 1 и 2 можно по сигналу протонов (СН) при раскрытии эпоксидного кольца, а также по сигналу протонов СОСН2 пирролидонового кольца Сигнал протона СН изомера 1 имеет такой же практически химический сдвиг 4,05 м д, как и в случае исходного вещества ЭМП (4,02 м д), если бы остаток глицина присоединялся в а - положение к амидной группе, то сигнал протона СН группы (при эпоксидном кольце) сместился бы в более сильное поле Сигнал протоноз СОСН2 пирролидонового кольца незначительно смещается в более сильное поле с химическим сдвигом 2,17 м д

Таким образом, присоединение остатка аминокислоты к эпоксидсодержащему звену полимера, очевидно, протекает, по атому углерода, являющемуся центральным в исходном спиросоединении.

Присоединение остатка глицина в ¡З-положение к амидной группе не противоречит теоретическим представлениям, что может быть, таким образом, представлено как.

СН,

СН,

I I I_ О о

ОН

~— га —с—> мн ¿Н I

ын

снг ^

он

-кн2

Для создания в полимерах боковых комплексообразующих групп был использован ряд а,со-аминокарбоновых кислот, содержащих между аминной и карбоксильной группами линейный алкиленовый радикал Это,

с одной стороны позволяло выявить влияние длины этого радикала на все протекающие реакции и строение образующихся металлскомплексов, а с другой выявить границы размеров циклов комплексов, позволяющие участвовать в их образовании и карбоксильной, и аминной группам

Поэтому в работе для получения боковых комплексообразующих групп были использованы аминокислоты глицин, (3-аланин, у-аминомасляная и 8-аминокапроновая кислоты, а протекание их реакций с ЭПВП может быть представлено следующим образом

-|сНг-С

л

С

и

■си.

С

1'Е

ш2-к—соон

Н20 МаОН

с^сн-1 о

-га2

-сн

I

-Я.

У"

сн2—сн-

ЦгГГН2

1—'лн он а

я

I

соон

сн2— сн-

с

—сн—с-

.1.. В

-ш2

ОН ОН О

-СН2- —^-СНг-^

Для уточнения условий проведения реакции эдоксидсодержащих полимерных носителей с аминокислотами было исследовано влияние на глубину протекания процесса ряда факторов - рН среды, температуры реакции, соотношения реагентов

При проведении реакции при различных значениях рН среды (рН создавался использованием различных фосфатных буферов) наблюдалось определенное повышение степени превращения эпоксидных групп при увеличении значения рН (исследовавшийся диапазон рН 7,6, 9,0 и 10,0) Поэтому в дальнейшем в реакцию вводили натриевые соли кислот при рН-10,0

Повышение степени превращения наблюдалось при снижении температуры реакции с 343 до 298К, что, вероятно, объясняется побочным гидролизом эпоксидных групп при повышенной температуре Дальнейшее снижение температуры не приводило к заметному возрастанию количества присоединившейся аминокислоты Реакцию проводили в течение 4 часов

Степень превращения зависела также от количества введенной в реакцию аминокислоты Так, в этой же паре реагентов (температура 298 К) при соотношениях аминокислоты и эпоксидных групп 21, 101 и 20 1 удалось повысить степень превращения с ~80 % до =85% Конечные продукты очищали диализом, сушили яиофильно и исследовали

Производные аминокислот растворялись в воде, амидных растворителях и диметилсульфоксиде В то же время, полимеры с аминокислотными остатками, полученные на основе ЭПВП, не растворялись или плохо растворялись (в зависимости от содержания в исходном полимере звеньев с эпоксидсодержащими группами) в спиртах и кетонах С другой стороны, полимеры, полученные на основе сополимера N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира, растворялись также в спиртах и кетонах Это различие в растворимое га определяется наличием в полимерах, полученных на основе ЭПВП боковых амидных групп, определяющих достаточно сильное межмолекулярное взаимодействие за счет водородной связи.

Строение полимеров, содержащих аминокислотные группировки, было подтверждено исследованием их ИК спектров (ИК-Фурье спектрометр "Paragon 10Q0PC")

Как и следовало ожидать, спектры полученных полимеров были менее дифференцированы, чем спектры низкомолекулярного модельного соединения Тем не менее! на них четко различимы области полос поглощения С=0 группы (от амида в пирролидоновом кольце, амида эпоксидсодержащего звена, а также от карбоксильной группы аминокислоты) Поглощение эпоксидных групп в полимерах обнаружено не было Подтверждают строение полимеров с боковыми аминокислотными группировками и спектры ПМР

Так, в спектре ПМР раствора ЭПВП-глицин (D20) наблюдаются изменения в области от 3,66 до 4,01 мд с увеличением относительной интенсивности пиков по сравнению с исходным ЭПВП, что может свидетельствовать о присоединении аминокислоты В спектре ПМР раствора ЭПВП-глицин в хлороформе-d) наблюдаются два положения сигналов связанной воды при 4,90 м д и 2,85 м д, которые находятся в более высокочастотной области по сравнению с ПВП и ЭПВП

В спектре ПМР раствора ЭПВП-р-алании наблюдаются те же характерные, что и для предыдущего соединения, особенности, увеличение относительной интенсивности низкочастотного широкого пика 3,66 м д и изменения в области от 3,66 до 4,01 м д Положение пика воды в спектре ПМР раствора ЭПВП-Р-аланин в хлороформе-d; находится в области 2,77 м д, при этом молекулы воды присоединяются почти к каждому звену полимера

Таким образом, в результате проведенных реакций образуются полимеры ЭПВП с аминокислотными остатками в боковой цепи В

модифицированных полимерах аминокислоты связаны с эпоксидными звеньями исходного полимера по аминным группам Причем присоединение к оксирановому циклу идет по углероду, находящемуся в азотсодержащем цикле

Степень превращения в полимерах ЭПВП с аминокислотными остатками определяли функциональным анализом по аминной и карбоксильной группам

В таблице 1 приведены также данные по рассмотренным полимерам на основе сополимера К-винилпирролндона и аллилглицидилового эфира

Таблица 1

Характеристики эпоксидсодержащих полимеров ВП, модифицированных аминокислотными остатками

ПОЛИМЕР Степень превращения,* масс %

По МН-группам По СООН-группам

ЭПВП-глицин - 78,2

ЭПВП-Р-аланин 82,2 83,1

ЭПВП -у-аминомасляная 83,4 84,5

кислота

ЭПВП-8-амино-капроновая 85,3 86,7

кислота

СПЛВП-АГЭ- глицин 79,2

СПЛ ВП-АГЭ - {з-аланин 85,9 81,5

СПЛ ВП-АГЭ - у- 87,2 86,0

аминомасляная кислота

СПЛ ВП-АГЭ - е- 88,4 87,2

аминокапроновая кислота

* По результатам потенциометрического титрования

Как видно из данных таблицы 1, функциональные анализы по двум различным группам дают сходные результаты для модифицированных полимеров с Э-аланином, у-аминомасляной и е-аминокапроновой кислотами Из таблицы также видно, что степень превращения несколько увеличивается в ряду от полимеров, содержащих остатки глицина, до полимеров с е-аминокапроновой кислотой

На основе эпоксидированного амфифильного ЭПВП (Мп = 2060, содержание эпоксидных групп 9,1 мол%) с использованием вышеописанной стандартной методики были получены продукты, содержащие остатки р-ал аника и 7-аминомасляной кислоты Степени

замещения эпоксидных групп в этих реакциях были соответственно 78,1 и 81,3%, те. эти полимеры содержали 7,1 и 7,4 мол% звеньев с остатками аминокислот

Они хорошо растворялись в воде и их критическая концентрация образования агрегатов, найденная стандартным флуоресцентным методом по солюбилизации пирена, была близка 6,1 мкМ

Кислотно-основные свойства модифицированного ЭПВП, содержащего аминокислотные остатки

При исследовании кислотно-основных свойств полученных полимеров ЭПВП с фрагментами глицина, Р-аланина, у-аминомасляной и 8-аминокапроновой кислот было показано, что они ведут себя в растворе как типичные полиэлектролиты

Определение констант основной (рКь) и кислотной (рКа) диссоциации проводили методом потенциометрического титрования с расчетом по уравнению Гендерсона-Хассельбаха

При сравнении абсолютных значений констант диссоциации для полимеров с аминокислотными остатками и их низкомолекулярных аналогов видно, что во всех случаях наблюдается незначительная тенденция к уменьшению значений рКъ и увеличению рКа для полимерных производных (в таблице 2 приведены соответствующие данные)

Таблица 2

Сравнение рКьи рКа модифицированных полимеров и их низкомолекулярных аналогов

Соединение рКь рКа

ЭПВП-глицин 9,9 3,18

ЭПВП-р-аланин 10,06 3,37

ЭПВП-у-аминомасляная кислота 10,1 4,00

ЭПВП-е-амйнокапронсвая кислота 10,19 4,43

Глицин 9,98 2,35

Р-аланин 10,15 3,28

у-аминомасляная кислота 10,38 3,90

е-аминокалроновая кислота 10.72 4,39

Т е гидроксильная группа, образующаяся после раскрытия оксиранового цикла, снижает основные свойства аминокислот, связанных с полимером Снижение основности аминогрупп уменьшает ионизацию карбоксильной группы аминокислотного остатка модифицированного полимера, вследствие чехо значения кажущихся констант кислотной

диссоциации (рКа) увеличиваются При этом, по мере удаления аминной группы от карбоксильной, значения рКа для модифицированных полимеров приближаются к значениям рКа их низкомолекулярных аналогов

Таким образом, были получены полимеры ЭПВП с аминокислотными остатками, строение которых было подтверждено методами ИК- и ПМР-спектроскопии, функциональным и элементам анализами Установлено, что степень превращения в модифицированных полимерах зависит от природы модифицирующих аминокислот и увеличивается с повышением их основных свойств Аналогичная картина наблюдалась в случае полимерных производных аминокислот, полученных на основе сополимера N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира

Исследование светорассеяния растворов аминокислотных производных

Как известно, на уровень биологической активности водорастворимых полимеров, вводимых в организм, существенное влияние оказывает их конформация в растворе, влияющая как на взаимодействие с мембранами и мембранными рецепторами клеток, так и на проникновение в клетку за счет процесса эндоцитоза В этих процессах значительное влияние оказывают как минимум размер макромолехулярного объекта

Для исследования поведения синтезированных полимеров в водном растворе было проведено изучение их светорассеяния При этом были рассмотрены полимеры с аминокислотными остатками на основе ЭПВП (Мп = 9x103, 9,9% эпоксидных групп) и сополимера N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира (Мп = 12x103, 9,7% эпоксидных групп)

Экспериментальная автокорреляционная функция была найдена с использованием прибора, снабженного диодным лазером (Coherent Radiation Model Innova) с длиной волны 532 нм

На рис 3 показаны распределения времен релаксации для полимера ЭПВП-глицин, ПВП и глицинового производного сополимера N-виншширролидона и аллилглицидилового эфира (СПЛ ВП-АГЭ-глицин) при различных углах рассеяния

ЭТТКи-Гяшшн

штн^йв^*:^}

к ■V1

2

4

Б

7

I.» I

-2 -1 0 1 2 3 4 5

Рис.3. Распределение времен релаксации в виде зависимостей функции

тА(т) = Щоб г) для растворов ПВП, (СПЛ ВП-АГЭ)-глицин, ЭПВП-

Как видно, на этих зависимостях хорошо различимы два пика (две моды - «медленная» и «быстрая»), показывающие, что в системе имеются группы частиц двух размеров - обладающие более быстрой и более медленной скоростью диффузии в растворе.

По видимому, в этом случае «быстрая» мода соответствует диффузии макромолекулярных клубков неассоциированных молекул, а «медленная» мода - их ассоциатам. Отнесение этих пиков к клубкам единичных макромолекул и ассоциатам подтверждено определением величин их средних гидродинамических радиусов.

Как было найдено, средний гидродинамический радиус Ш для исходного полимера ПВП и полимерных производных аминокислот находился в диапазоне 3,2-3,7 нм, а для объектов, соответствующих «медленной» моде, равнялся 93 нм.

Соотношение количеств ассоциатов и макромолекулярных клубков может быть оценено из соотношения площадей под модами. Хотя при рассмотрении интенсивности светорассеяния должно быть учтено, что молекулярные массы ассоциатов заметно выше, чем молекулярные массы макромолекулярных клубков единичных макромолекул.

Тем не менее, сравнение параметров мод корректно показывает тенденцию изменения соотношения различных частиц в растворе для различных полимеров. Значения этих соотношений приведены в таблице 3.

глицин

Как видно, сам ПВП обладает слабой склонностью к ассоциации в растворе, что известно из литературы С другой стороны, в случае аминокислотных производных площади под «медленной» модой значительно больше

Таблица 3

Соотношение площадей (А) под модами, отражающими медленную и быструю диффузию, на кривых распределения экспериментальных корреляционных функций для различных полимеров

Тип полимера - А*

Поли-К-винилпирролидон (ПВП) 0,192

Глицин - [Сополимер ВП-АГЭ] 0,558

Глицин - [ЭПВП] 0,921

А* - доля площади под пиком медленной диффузии к суммарной площади под пиками (определены для угла рассеяния 9=90°С)

При переходе от полимерного производного глицина, полученного на основе сополимера К-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира, к полимерному производному, полученному на основе ЭПВП наблюдается значительное увеличение количества ассоциатов, причем в данном случае агрегаты образуются даже в разбавленных растворах

Вероятно, это явление связано с наличием в полимерных производных аминокислот боковых функциональных групп, склонных к образованию водородных связей, а наличие в производных боковой первичной аминогруппы, по-видимому, повышает возможность межмолекулярного взаимодействия макромолекул полимеров в растворе

Как видно из данных рис 3, положение пиков для различных полимеров соответствует близким временам диффузии, что также указывает на близкие значения размеров макромолекулярных клубков различных полимеров, в том числе ПВП Те введение в полимеры аминокислотных групп не оказывает значительного влияния на размер их макромолекулярных клубков в водном растворе по сравнению с самим ПВП

В случае амфифильных полимерных производных аминокислот ¡3-аланина и у-аминомасляной кислоты размер агрегатов, определенный методом динамического светорассеяния, находился в диапазоне 150-200 нм Т е эти полимеры имели высокую склонность к образованию наноразмерных агрегатов в растворе, также как другие известные амфифильные полимеры винилпирролидона

Таким образом, исследования светорассеяния растворов полимерных производных аминокислот показали, что эти полимеры в отличие от самого

ПВП имеют определенную склонность к образованию ассоцяатов, в том числе в разбавленных растворах При этом эта склонность к ассоциации в большей степени выражена для аминокислотных производных ЭПВП

3.4. Синтез полимерных металлокомплексов и их исследование

Для получения полимерных металлокомплексов был выбран ряд переходных металлов, производные которых обладают биоактивностью -кобальт (II), германий (II), медь (II), цинк (II), марганец (II), платина (II)

Полимерные металлокомплексы получали смешением ацетоновых или дисксановых растворов хлоридов металлов с растворами полимеров в смеси растворителей метанол-ацетон (3 1) Смесь перемешивали и концентрировали на роторном испарителе до выпадения осадка, который очищали экстракцией ацетоном и высушивали в вакууме

Взаимодействие металла с лигандом изучали с помощью фотометрии, комплексонометрии» потенциометрии, вискозиметрии, а для определения характера донорных атомов, взаимодействующих с ионами металлов проведены исследования полученных полимерных металлокомплексов методами ИК-. ПМР, и ЭПР-спектроскопии.

При растворении в воде систем ЭПВП-глицин-СоС12 и ЭГГОП-В-аланин-СоС12 образуются растворы розового цвета, тогда как растворы исходных солей имели голубую окраску Максимум полосы поглощения находился при 520 нм Аналогичное изменение цвета наблюдается при растворении системы ЭПВП-р-аланин-СиСЬ, в сухом виде этот комплекс имеет светло-зеленую окраску, а в растворе бледно-зелено-голубую В спектре раствора ЭПВП-Р-аланин-СиС12 наблюдается широкая полоса поглощения в области 520-850 нм, с несколькими максимумами Изменение окраски при растворении свидетельствует об образовании аква-комплексов

Исследование ИК-спектров полимерных металлокомплексов на основе ЭПВП с аминокислотными группировками и СоСЬ и веСЬ показало, что взаимодействие кобальта (И) и германия (II) с модифицированными полимерами сопровождается характерными изменениями полос уа,(СОО) и уь(СОО) для остатков аминокислот

Так, при образовании металлокомплексов наблюдается исчезновение полос ассиметричных валентных колебаний карбоксильной группы (1560 см"1) и уширение полосы 1600 - 1650 см"1 за счет появления полос поглощения в области 1600-1605 см"1, которая относится к ассиметричным валентным колебаниям карбоксилатного иона Также наблюдается появление полос в области 1340 см"1, соответствующих симметричным валентным колебаниям карбоксилатного иона Это свидетельствует о замещении водорода карбоксильной группы на ионы металла с образованием связи Ме-0

При исследовании ПМР-спектров полимерных металлокомплексов, содержащих аминокислотные остатки с ОеС12, было показано, что для производных модифицированного ЭПВП имеет место изменение в области от 3,4 мд до 3,9 мд, Низкочастотная линия дифференцируется в низкочастотную область, что особенно характерно для комплекса соединения ЭПВП-глицин с ОеСЬ, а также изменение интенсивностей сигналов протонов и появление других сигналов в области от 1 м д до 1,4 м д, что характеризует образование нового соединения

Низкочастотные области ПМР-спектров для систем, образованных производными глицина и р-аланина (ЭПВП-глицин-ОеС12 и ЭПВП-р-аланин-ОеС12) заметно отличаются от низкочастотных областей производных у-аминомасляной и е-аминокапроновой кислот (ЭПВП-у-аминомасляная кислота-ОеСЬ и ЭПВП-8-аминокапроновая кислота-ОеС12) Это дало основание предположить различное строение металлокомплексов в этих системах

Для определения методом ЭПР координационной сферы ионов меди в комплексах были изучены полимерные металлокомплексы на основе ЭПВП, модифицированного аминокислотными остатками, и их низкомолекулярные аналоги в замороженных водных растворах при 77К

Спектры регистрировали на спектрометре "ЕК-200 0811С-Вгикег" В качестве растворителя использовали смесь Б20 СВ3СЮ=1 1 Концентрация иона металла в исследованных образцах составляла 1x10-2 моль/л Значения параллельной и перпендикулярной составляющих спина (§|) и константы сверхтонкого взаимодействия неспаренного электрона с ядрами меди (Ац ) и азота (ах1") рассчитывали согласно известным методам С целью выяснения состава и структуры полимерных комплексов были изучены их спектры ЭПР при постоянной концентрации ионов меди (II) и различных концентрациях и степени нейтрализации лигандов Идентификацию образующихся комплексов проводили путем предварительного исследования комплексообразования соответствующих низкомолекулярных аминокислот с медью (II)

Было выяснено, что характер зависимости состава комплексов от соотношения компонентов системы для низкомолекулярных металлокомплексов отличается от характера зависимостей для полимерных металлокомплексов

Так, при десятикратном избытке металла в отличие от медных комплексов глицина типа СиЬ+ и СиЬ2 в случае полимерного производного были обнаружены только комплексы состава СиЬ2

Такая склонность макромолекулярных лигандов к образованию полимерных комплексов состава СиЬ2 наблюдается и в случае полимерных производных других исследуемых аминокислот По-видимому, это является результатом возможности в случае гибкой полимерной цепи контакта двух аминокислотных групп, образующих комплекс

В то же время сохранение растворимости систем при образовании металлокомплексов указывает на наличие внутримолекулярного хелатирования, а не на образование межцепных хелатных группировок

Определение условий существования медных комплексов показывает, что если для полимерных производных глицина и ¡3-аланина комплексы состава СпЬ2 образуются при эквивалентных соотношениях реагирующих компонентов (у=1, степень нейтрализации лиганда а=1), то для у-аминомасляной кислоты уже необходим избыток металла (у=Ю) при степени нейтрализации лиганда (ос=0,1)

В случае полимерного производного в-аминокапроновой кислоты при увеличений соотношения металл / лиганд (у>10) вязкость растворов сильно возрастала, что препятствует проведению исследований

Возможно, в этом случае, когда карбоксильная группа значительно удалена от основной цепи полимера, имеет место межмолекулярное образование металлокомплекса, а комплекс состава СиЬ2 образуется только при значительном избытке ионов металла (у>100)

В первую очередь это связано с переходом от типа комплекса, образующегося в случае глицина и |3-аланина за счет участия в комплексообразовании и аминной, и карбоксильной групп, к системам, образующимся в случае у-аминомасляной и в-аминокапроиовой кислот только за счет взаимодействия металла и удаленной карбоксильной группы

И действительно, в спектрах медных комплексов глицина и Р-аланина и их полимерных производных в области (§х) разрешена дополнительная сверхтонкая структура (СТС) Это свидетельствует об образовании координационной связи между ионом металла и атомом азота аминокислоты

Для комплексов состава СиЬ+ дополнительная СТС состоит из трех линий разной интенсивности, что указывает на взаимодействие неспаренного электрона с одним ядром азота 2,066, а/'= 22,0)

В комплексах типа СиЬг дополнительная СТС разрешена в виде пяти линий, что служит доказательством участия в координации двух ядер атомов азота = 2.070, а^*^ 14,1) Т е в комплексах с полимерами, содержащими остатки глицина и В-аланина ионы металла связываются с участием и карбоксильных и аминных групп, образуя, соответственно, пяти и шестичленные хелатные циклы

С другой стороны, на ЭПР-спектрах комплексов полимерных производных у-аминомаслякой и е-аминокапроновой кислот и их низкомолекулярных аналогов в области дополнительная СТС не разрешена Это указывает на отсутствие в этих случаях координации иона Си + с атомом азота аминокислоты и указывает на образование только карбоксилатных комплексов

ото отличие, очевидно, связано с различием в строении комплексов, которые в случае аминокислот с короткой углеродной цепью образуются за счет взаимодействия иона меди с кислородом и азотом с образованием пространственно выгодных пяти- и шестичленных хелатных комплексов, а в случае аминокислот с более длинным углеводородным фрагментом, когда семи- и девятичленные хелатные комплексы стерически не выгодны - за счет взаимодействия только с карбоксильной группой

Можно было предположить, что в случаях с ЭПВП-глицин-ОеСЬ и ЭПВП-р-аланин-ОеСЬ образуются хелатные структуры с участием атомов кислорода и азота аминокислотного остатка и формируется координационная сфера вокруг центрального иона (Ое2 ), а в полимерных металлокомплексах с 7-аминомас ляной и е-аминокапроновой кислотами происходит образование карбоксилатных комплексов, которые объясняются более длинными углеводородными радикалами - (СН?^

На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что во всех комплексах ионы металлов связаны с атомом кислорода карбоксилатной группы аминокислотного остатка При этом в отличие от полимеров с у-аминомасляной и Е-аминокапроновой кислотами в комплексах полимеров, содержащих глициновые и ¡З-аланиновые остатки, ионы металлов координированы и с двумя атомами азота аминокислотного остатка

Расчет констант устойчивости в системе металл-лиганд проводили на основании результатов потенциометрического титрования раствора макромолекулярного яиганда в присутствии соли кобальта (мольное соотношение полимер металл составляет 110) 0,1 н раствором едкого натра, освобожденным от карбонатов при 298К (ионная сила 1=0,1)

В таблице 4 приведены данные по константам устойчивости К и константам равновесного обмена В комплексов с участием макромолекулярных лигандов с аминокислотными остатками и их низкомолекулярных аналогов

Как видно, устойчивость комплексов зависит от природы аминокислотного остатка в модифицированном полимере и устойчивость комплексов уменьшается в ряду от полимера с глицином до полимера с е-амикокапроновой кислотой

Таким образом, проведенные исследования устойчивости модифицированных полимеров с аминокислотными остатками показали заметные отличия их от низкомолекулярных производных Полимеры, вследствие концентрационного эффекта образуют с ионами металлов более устойчивые комплексы, чем низкомолекулярные К-производные аминокислот

Таблица 4

Комплексообразующие свойства аминокислот, их пептидов и полимерных

аминокислотных производных

Соединение Со2*

1вв

Глицин* 8,99 -

Глипилглицин* 5,88 -

Глицилглицйлглицин* 5,44 -

¡3-Алании* 6,14

ЭПВП-глицин 7,1 -7,5

ЭПВП-р-аланин 5,2 -7,2

ЭПВП-у-аминомасляная кислота 2,3 -3,2

ЭПВП-е-аминокапроновая кислота 1,5 -2,2

* Литературные данные

Для исследования свойств полимерных металлокомплексов был использован вискозиметрический метод, с помощью которого исследовали растворы ЭПВП, содержащего аминокислотные остатки, в смеси растворителей метанол ацетон (массовое соотношение 3 1) в присутствии ионов металла Со (П)

Анализ зависимостей г^д/С от мольного отношения [Со (Н)]/[полимер! при постоянной концентрации полимера (0,05 моль/л) показал, что повышение количества добавленного иона металла уменьшает вязкость раствора Это, по-видимому, означает, что вследствие внутрицепного хелатирования имеет место уплотнение макромолекулярного клубка

Характеристики полимерных металлокомплексов, использовавшихся при биологических исследованиях приведены в таблице 5

Как видно, в этом случае степень превращения в реакции комплексообразования достигала 80-90%

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что полимеры с аминокислотными остатками образуют с переходными металлами с высоким выходом комплексы двух типов -хелатные с участием атомов азота и кислорода (более характерные для низших аминокислот) и карбоксилатные с участием атомов кислорода (для аминокислот с более длинным радикалом между аминной и карбоксильной группами)

25

Таблица 5

Содержание металла в полимерных металлокомплексах

Полимерный метаялокомплекс Содержание Со2+ Содержание Оег+

Масс .% Моль. % Степень превраще -ния, % Масс % Моль. % Степень превращения, %

ЭПВП - глицин 16,3 6,9 88,4 15,6 6,3 80,7

ЭПВП - р-аланин 18,1 7.4 89,9 17,2 7,1 86,3

ЭПВП - у- аминомасляная кислота 19,1 7,6 91,1 18,1 7,3 87,5

ЭПВП - Е- аминокапроновая кислота 20,6 7,7 90,4 19,2 7,4 86,8

3.5. Биологическая активность производных ПВП с аминокислотными боковыми группами и их металлокомплексов

Наличие в синтезированных полимерах фрагментов цепи ПВП и боковых аминокислотных группировок при оптимальных молекулярных массах позволило при высоком уровне биосовместимости обеспечить наличие у полимеров различных типов биологической активности, характерных для ионогенных макрс-молекулярных соединений, т е систем с собственной биологической активностью С другой стороны, связывание с полимерами комплексной связью биогенных металлов, позволило обеспечить их постепенное включение в биологические процессы, что характерно для систем с контролируемым выделением биологически активного агента

При исследования биологической активности синтезированных в работе полимеров были рассмотрены образны, содержащие аминокислотные остатки, полученные на основе зпоксидированного ПВП (ЭПВП) с Мп 9000 и содержанием эпоксидных групп 9,9 мол%, и его амфифильного производного с Мп 2000 и содержанием эпоксидных групп 9,0 мол % В ряде экспериментов также были исследованы полимеры, синтезированные на основе сополимера К-винилпирролидона с аллилглицидиловым эфиром с М„ 12000 и содержанием эпоксидных групп 9,7 мол% Также были исследованы металлокомплексы на основе этих модифицированных аминокислотами полимеров

3.5.1. Общая токсикологическая характеристика

Низкая острая токсичность синтезированных полимеров была подтверждена в опытах на культурах клеток и на опытных животных

Так, с использованием ряда культур клеток было показано, что при введении в клеточную суспензию (концентрации 2x106 клеток/мл) полимерных производных аминокислот глицина, ¡З-аланина, у-аминомасляной кислоты, е-аминокапроновой кислоты, полученных на основе ЭПВП в концентрациях до <2,0 мг/мл, токсического действия не наблюдалось

Такой же низкий уровень токсичности в этих опытах наблюдался при введении в клеточные суспензии комплексов этих полимеров и СоС,12 Цитотоксическое действие полимеров определяли, исходя из минимальной концентрации препарата, которая оказывала цитодеструктивное действие (лизис клеток, нарушение их морфологии)

Низкая острая токсичность полимеров и их металлокомплексов была подтверждена также в опытах на животных (белые беспородные мыши) при внутривенном введении В этом случае ЛД50 для производных всего ряда аминокислот была не ниже 4000 мг/кг В случае комплексов Со2+ значения ЛД50 были несколько ниже, но во всех случаях выше 1000 мг/кг (1050-2500 мг/кг) Причем, при этом значения ЛД5о понижались со снижением константы устойчивости металлокомплекса

Исследование скорости выведения кобальтовых металлокомплексов из организма путем почечной фильтрации исследовали на самцах крыс после однократного внутривенного введения Как было установлено, при внутривенном введении через 6 часов с мочой выводилась большая часть введенных полимеров (до 95%)

То есть, синтезированные полимеры с аминокислотными остатками в этих исследованиях показали достаточно высокий уровень биологической безвредности

3.5.1. Примеры биологической активности.

Как было установлено, полученные полимерные производные аминокислот и их металлокомплексы обладают различными типами биологической активности

Некоторые примеры результатов этих исследований в виде кратких описаний приводятся ниже в автореферате Подробное описание экспериментов и ряд других исследований приведены в тексте диссертации

Иммунная активность аминокислотных производных ЭПВП была изучена для случая антигенной стимуляции пролиферации (деления) лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека при использовании в качестве антигена столбнячного токсина Как было показано, все

рассмотренные полимеры обладают способностью усиливать образование иммунокомпетентных клеток Наблюдаемое адъювактное (усиливающее) действие полимеров (производных всего ряда аминокислот, полученных на основе ЭПВП), активно проявлялось на 5-7 день культивирования При этом активность производных сополимера N-винилпирролидона с аллилглицидиловым эфиром была значительно ниже, чем активность аминокислотных производных ЭПВП (данные приведены в диссертации)

При этом обращает на себя внимание более высокая активность амфифильных производных, которая, возможно, объясняется их склонностью к образованию ассоциированных структур в водной среле, что способствует взаимодействию полимеров с иммунными клетками как за счет интенсификации процессов эндоцитоза, так и гидрофобного взаимодействия с клеточными мембранами иммунных клеток

Противовирусная активность аминокислотных производных ЭПВП в отношении вируса энцефаломиокардита (штамм «Колумбия SK-Coi-SK») была исследована на клетках человека (J-41, J-96, шпер-нефрома, HeLa) Было установлено, что все полимеры с аминокислотными остатками оказывают более высокую противовирусную активность по сравнению с препаратом Ридостин

Противовирусная активность в отношении вируса гриппа (штамм A/Aichi/68 H3N2) была исследована на мышах линии СВА с применением системы ЭПВП-е-аминокапроновая кислота Препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг за 24 часа до заражения мышей и через 24 часа после заражения Выживаемость при введении препарата - 45-50% по сравнению с полной летальностью в отсутствии препарата

Антихламидийное действие системы (ЭПВП ß-аланин) + ОеСТг исследовали на мышах линии СВА Инъекция 10 мг/кг внутри-брюшинно через 24 часа после инфицирования С trachomatis привела к стимуляции образования в крови, легких и лимфатических узлах эндогенных интерферонов (а- и ß-интерфероны), являющихся одним из основных факторов подавления размножения хламидий. Препарат, в отношении подавления хламидиоза превосходил тетрациклин гидрохлорид в 2-2,2 раза

Усиление антихламидийного действия антибиотика (тетрациклин гидрохлорид) исследовали с использованием системы (ЭПВП + ß-аланин) + O.1CI2 , вводимой внутрибрюшинно через 24 часа после инфицирования С trachomatis По результатам цитоскопии индекс эффективности в лимфатических узлах и легких был, соответственно, в 3,2 и 2,5 раза выше, чем при лечении только антибиотиком

Повышение чувствительности клеток к интерферону исследовали на культуре мышиных клеток L929 с использованием системы (ЭПВП + глицин) + PtCl2 Было показано, что введение препарата в среду с клетками

(доза 250 мкг/1х105 кпеток/мд) повышало чувствительность клеток к интерферону в 32 раза

Повышение радиозащитного действия препарата Рефнолин (фактор некроза опухолей) Исследования проводили на мышах линии (СВАхС57В16) ^ при дозе 25 мкг/мышь при облучении в дозе 6,0 Гр В контрольной группе наблюдалась гибель всех животных В опытной группе количество выживших животных составило при использовании только Рефнолина - 60%, при использовании препарата 75%, при совместном использовании препарата и Рефнолина - 90%

Стимулирование процесса кроветворения исследовали на белых беспородных крысах и мышах с использованием кобальтовых комплексов полимеров с аминокислотными остатками Наблюдалось восстановление количества эритроцитов и гемоглобина, а также по выживаемости животных на фоне экспериментальной анемии, вызванной путем трехкратного подкожного введения солянокислого фенилгидразина

Таким образом, показано, что синтезированные полимеры с аминокислотными остатками характеризуются, как и ПВП, хорошими токсикологическими характеристиками При этом введение ионов металлов в состав полимеров незначительно повышает их токсичность и придает им новые биологические свойства

4, ВЫВОДЫ

1 Впервые синтезированы аминокислотные производные эпоксидсодержащего поли-М-винилпирролидона и их комплексы с переходными металлами, изучены их свойства и показано, что они характеризуются низкой токсичностью и проявляют биологическую активность различного типа

2 Выявлен новый путь протекания реакции Дарзана с участием карбонила циклических амидов и хлорацетамида, и с использованием этой реакции синтезирован эпоксидсодержащий полимер К-винилпирролидона Исследованием влияния на протекание реакции различных факторов найдены оптимальные условия ее проведения, позволяющие получать модифицированный поли-М-винилпирролидон с содержанием эпоксидных групп до 25 мол %

3 Получены М-замещенные полимерные производные низших а,ю-аминоксилот их взаимодействием с эпоксидсодержащим поли-Н-винилпирролидоном Установлено, что реакция аминокислот с дизамешеняым эпоксидом ¿-метил-1-окса-4-азаспиро[2,4]гептан-2-карбоксамидом протекает с присоединением остатка аминокислоты к атому углерода, входящему в пирролидиновый цикл

4 Показано, что аминокислотные производные эпоксидсодержащего поли-Ы-винилпирролидона образуют комплексы с переходными металлами, в которых металл связан с фрагментом аминокислоты или с участием атомов кислорода и азота или в виде карбоксилатного комплекса для аминокислот с более длинным углеводородным радикалом

5 Показано, что аминокислотные производные эпоксидсодержащего поли-К-винюширролидона в большей мере склоннны к образованию ассоциатов в водном растворе, чем аминокислотные производные сополимера N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира

6 Впервые синтезированы эпоксидные и аминокислотные производные амфифильного полимера N-винилпирролидона Показано, что эти полимеры склонны к образованию наноразмерных агрегатов в водном растворе

7, В опытах на животных m vivo и клетках m vitro установлено, что синтезированные полимерные производные аминокислот и их металлокомплексы при низкой острой токсичности проявляют различные типы активности - иммуностимулирующую иммуноадъювантную, интерферонстимулирующую, антивирусную, антимикробную, способствуют антиген-специфичной стимуляции лимфоцитов, стимулируют процесс гемопоэза В ряде исследований биологической активности синтезированных полимеров установлено, что она повышается с увеличением способности полимеров к агрегации в водном растворе

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

Статьи, опубликованные в научных журналах, рекомендованных

ВАК:

Ташмухамедов Р И, Ли В А, Брудзь С П, Штильман М И, Рашидова С Ш Сополимеры ВП с аминокислотными остатками // Высокомолекул соедин , 1989, В31, №5,353-355 Ташмухамедов Р И, Ли В А , Мусин Р И , Рашидова С Ш, Туляганов Р Т, Штильман М И Синтез и свойства комплексов металлов переходного ряда и полимеров с аминокислотными остатками // Хим -фарм журнал -1989 -N 12 -С 1447-1450

Ташмухамедов Р И, Ли В А, Турганов М М, Рашидова СIII ЭПР исследование медных комплексов сополимеров винилпирролидона с аминокислотными остатками // Высокомолекул соедин , 1990, А32, №5, 1027-1031

Lee V А, Musin R1, Tashmukhamedov RI, Shtilman MI, Rashidova S Sh Metal complexes of polymers with ammo acid residues Formation, stabihty and controiled biological activity// JControled Release - 1990 -V 14 -P 61-70

1 2

3

5 Штильман М И, Хвостова В Ю , Ташмухамедов Р.И, Головкова Т А, Tsatsakis А М, Эпоксидсодержащий поли-М-винилпирролидон // Пластмассы - 2001 -N7 -С 5-9

6 Barrtaki S., Baritaki S, Tzanakakis GN, Ahfragis J, Zafiropoulos A, Tashmukhamedov, RI, Tsatsakis, A, Shtilman, MI, Rizos, AK, Krambovitis, E Light scattering and in vitro biocompatibihty studies of poly (vinyl pyrrolidone) denvatives with annno-acid-dependant groups I1 J Biomed Mater Res , 2002, V 63, N 3, P 830-837

7 Ташмухамедов P И, Штильман M И, Хвостова В Ю , Клягина М В , Tsatsakis А М, Шашкова И М Поли-М-винилпирролидон с боковыми аминокислотными группами // Высокомолекул соедин , 2005, Серия А, т47, №6, С 1-4 (Tashmuhamedov RI, Shtilman MI, Khvostova V.Yu, Ktyagina MV, Tsaysakis AM, Shashkova IM Poly(N-vmylpyrrolidone) wito amino acid side groups, // Polymer Science, Ser B, 2005, Vol 47, N 5-6, PP 167-169

8 Ташмухамедов РИ, Клягина MB , Хвостова В.Ю , Штильман М.И Реакция дизамещенных эпоксидов с аминокислотами // ИзвВУЗов Химия и хим технол, 2006, Т 49, № 1, С 93-95

9 Ташмухамедов Р.И, Штильман М И, Хвостова В Ю , Клягина М В Присоединение аминокислот к дизамещенным эпоксидам // ИзвВУЗов Хими и хим техн. 2006, Т 49, № 1, С 93-95

10 Ташмухамедов РИ, Клягина MB , Хвостова В Ю , Штильман МИ Взаимодействие глицина с 4-метил-1-окса-4-азаспиро[2,4]гептанкарбоксамидом // Вестник РУДН Серия -Экология и природоведение, 2005, С 75-78

11 Ташмухамедов Р И, Клягина М В , Хвостова В Ю , Штильман М И Комплексы переходных металлов на основе аминокислотных производных эпоксидсодержащего поли-М-винилпирролидона // Вестник РУДН Серия - Экология и природоведение, 2005, С 79-85.

12 Ташмухамедов Р И, Клягина М В , Хвостова В Ю., Штильман М И Эпоксидсодержащий поли-Ы-винилпирролидон, модифицированный аминокислотами // Вестнике РУДН Серия - Экология и природоведение, 2005, С 86-88

13 Ли В А, Разиков РК Ташмухамедов РИ, Батырбеков АА, Муратходжаев Ф Н Иммунологические свойства металлокомилексов сополимеров винилпирролидона с аминокислотными остатками в боковой цепи // Иммунология, 1997, N1, с 35-37

Другие издания:

14 Ташмухамедов Р И, Крамбовитис Е, Тсатсакис А М, Батырбеков А А Иммунореактивные свойства производных поли-N-винилпирролидона с аминокислотными группами и их металлокомплексов. П Журнал теоретической и клинической медицины, 2007, №1. С 10-19 ~

15 Kuskov A.N, Shtilman MI, Goryachaya AV, Tashmuhamedov RI, Yaroslavov A A,, Torchilm V P , Tsaisakis A M , Rizos А К Polymeric Nanoscaled Drag Carriers Composed of Amphiphilic Poly-N-vmylpyrrolidones // Journal of Non-Crystallme Solids, 2007, (accepted)

16 Штильман M И, Рашидова С III, Ташмухамедов P И, Ли В А и др Сополимеризация аллилглидидилового эфира с N-винилпирролидоном 11 Хим технол, свойства и примен пластмасс / Ред А Ф Николаев- JI ЛТИ им Ленсовета- 1986- С111-120, Chem Abstr - 1987 - V 107 - 78350m

17 Штильман МИ, Брудзь СП, Рашидова С.Ш, Ташмухамедов РИ Радикальная полимеризация и сополимеризация моноаллильяых соединений МХТИ, М 1985 73с

18 Рашидова СШ, Ташмухамедов РИ Сополимеризация N-винилпирролидона и N-винилкапролактама с аллилглицидиловым эфиром// Сборник Синтез, свойства и применение полимеров на основе N-виниллактамов, 1990, 50-63

19 Клагина М В , Майборода С Б , Ташмухамедов Р И , Штильман М И Металлокомплексы полимеров с аминокислотными остатками // Успехи в химии и химической технологии- М Минобразования России - 2002 - Т 16 - N 3(20) - С 56

20 Клягина М В , Ловягин Ден А, Ловягиен Дм А, Ташмухамедов Р И , Штильман М И Водорастворимые металлокомплексы на основе производных поливинилпирролидона // Успехи в химии и химической технологии - М Минобразования России - 2003,- Т 17 - N 5 - С 68-71

21 Shtilman МI, Voskanyan Р S , Tashmuhamedov RI Polymers m bioactive systems // New Polymer Systems foi Biotechnological and Biomedical Application [8th International Seminar ISTC [Erevan, Armenia] 2005, P 159-164

22 Kuskov A N, Tashmukhamedov RI, Shtilman MI Amphiphilic polymers as the drugs earners // New Polymer Systems for Biotechnological and Biomedical Application [8th International Seminar ISTC [Erevan, Armenia] 2005, P 91

23 Kuskov A N , Tashmukhamedov RI, Vilemson A L, Shtilman MI, Lanonova NI, Tsatsakis A M Polymeric nano-sized carriers for creation of new systems for drug delivery 4 New Polymer Systems for Biotechnological and Biomedical Application [8th International Seminar ISTC [Erevan, Armenia] 2005, P 92-103

24 Tashmuhamedov RI, Klyagma M V , Shtilman MI Metal complexes on the base of new polymer earners // New Polymer Systems for Biotechnological and Biomedical Application [8M International Seminar ISTC. [Erevan, Armenia] 2005, P 176

25 Shtilman M.I, Voskanyan P S , Tashmuhamedov RI Polymers m bioactive systems // New Polymer Systems for Biotechnological and Biomedical Application [8th International Seminar ISTC [Erevan, Armenia] P 30-35

26 Кусков А.Н , Виллемсон A JI, Ташмухамедов Р И, Штильман М И Амфифильные производные поли-К-винилпирролидона и их взаимодействие с компонентами крови // Успехи в химии и химической технологии - М Минобразования России - 2005 - Т 19 -N 6(54)- С 71-72.

27 Ташмухамедов Р И, Разиков Р, Ли В А, Рашидова С Ш Устойчивость комплексов кобальта (II) и меди (II) с сополимером N-винилпирролидона в растворе /7 Тезисы доклада III съезда фармацевтов Узбекистана, г Ташкент, 19S7,164с

28 Ташмухамедов Р,И, Разиков Р К , Ли В А , Новые водорастворимые полимеры с аминокислотными остатками //Тез докл Ш Всес конф «Водораствориые полимеры и их применение», г Иркутск - 1987 -С 55

29 Lee V А, Tashmukhamedov RI, Turganov М М, Rashidova S Sh An ESR-study of copper (II) complexes of vmylpyrrohcione with ammoacids residues copolymers//Abstracts of XXlY-th AMPERE Congress on magnetic resonance and related phenomena Poznan, Poland -1988

30 Lee V A., Musin RI, Razikov R К, Tashmukhamedov RI Polymer metal complexes as biometal delivery systems// Abstracts of 33-rd IUPAC International Symposium on Macromolecules Montreal, Canada - 1990 -Session 3 4 4

31 Ли В A, Разиков P К, Ташмухамедов P И, Батырбеков А А Полимерметаллокомплексы Структура, устойчивость и иммунологические свойства // Тез докл 1 Респ научн конф по химии ВМС «Узбекистон МАКРО-92». Ташкент -1992-С 162

32 Штильман М И, Tsatsakis А М , Ташмухамедов Р И, Хвостова В Ю , Цветкова Л С , Чеботарь М И, Hatzidakis G, Шашкова И М Полимеры N-винилпирролидона, содержащие гидролизуемые группы // Всеросс конфер «Конденсационные полимеры Синтез, структура, свойства» [Янв 12-14, Москва ] - М 1999- ИНЭОС - С С1-31

33 Sztilman МI, Tsatsakis А М, Szaszkova IМ, Woskanian Р S , Brudz S P., Taszmuchamedov RI Biologicznie aktywne polimery problemy I perspektywy // Modyfikacja polimerow XIV konferencja naukowa [Kudowa Zdroj, 26-30 Sept ,1999] - Wroclaw - 1999 - P 120

34 Shtiimanm MI, Tashmuhamedov RI, Tsatsakis A M, Hvostova V Yu., Hadzidakis G , Assrthinakis P, Rashidova S Sh, Shashkova IM // 27th Intern Symp on Contr Release of Bioact Materials (Paris, 2000) - CRS -2000 -P 7009

35 Ershov FI, Shtilman MI, Narovlyansky A N, Mezentseva M V, Tashmuhamedov RI, Hvostova V Yu, Tsatsakis A M Polymeric formulation with antiviral activity./'/ Intern confer "Biologically active polymers" (Prague, 2000) - P 35

36 Shtilman MI, Tashmuhamedov RI, Hvostova V Yu , Tsatsakis A M, Hadzirakis J , Rashidova S Sh, Golovkova T A, Shashkova IM Metal complexes of amino acid derivatives of epoxide-cjntainmg poly-N-

vinyipyrrolidone// Intern confer "Biologically active polymers" (Prague, 2000)-P 36

37 Maiboroda S В , Loseva S V , Klyagma M В , Tashmuhamedov R, Kosharnaya О P, Shtilman MI Биодестр^ктируемые полимеры N-винилпирролидона // Modifikacja polimerow XV Konferencja naukowa [Wroclaw, 2001]-N50

38 Klyagma M V , Tashmuhamedov RI, Tsatsakis A M, Hvostova V Yu, Maiboroda V.B, Shtilman MI Metal immobilization on the polymer carriers containing complex-forming groups // Biomed 2002 (IXth International Symposium on Biomedical Science and Technology [19-22 Sept 2002, Kemer-Antalya, Turkey], 2002, P-49

39 Штильман M И., Кусков A H, Ташмухамедов P Й, Torchilm V P , Tsatsakis A M Амфифильные производные поливинилпирролидона -новые материалы для лекарственных систем // XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии Тезисы докладов [Казань, 21-26 сентября 2003] - 2003, С 467

40 Klyagma М V , Tashmuhamedov RI, Shtilman МI, Lovyagm Den А , Lovyagin Dm A Water-soluble metal complexes based on derivatives of poly-N-vinyipyrrolidone // European Material Research Society Fall Meeting [Warshaw, 15-19 September, 2003] - 2003, P 169

41 Klyagma MV, Tashmuhamedov RI, Shtilman MI, Mezenceva MV, Semermna VV, Narovlyansky AN Polymeric water-soluble metal complexes with biological activity // Biotechnology State of art and prospects of development [3rd Moscow International congress], 2005, P 48

42 Shtilman MI, Kuskov A N, Tashmuhamedov RI Microaggregates of N-vmylpyrrolidone amphiphilic polymers // XVII Int Conf "Modification of Polymers [Kudowa Zdroj, Poland, 12-15 Sept 2005], P 15

43 Tashmuhamedov R1, Klyagma M V , Hvostova V Yu, Shtilman MI Epoxycontammg poly-N-vmylpyrrolidone modified of ammoacids // XVII Int Conf "Modification of Polymers [Kudowa Zdroj, Poland, 12-15 Sept 2005], P 26

44 Tashmuhamedov RI, Klyagma M V , Hvostova V Yu, Shtilman M1 Complecex Of metals on the base of ammoacid derivatives of poly-N-vinylpyrrolidone // XVII Int Conf "Modification of Polymers [Kudowa Zdroj, Poland, 12-15 Sept 2005], P 27

45 Штильман M И, Кусков A H , Ташмухамедов P И, Тсатсакис A M Амфифильные полимеры - основа новых наноразмерных носителей лекарственных веществ // Тезисы докл Международной конференции «Биотехнология и медицина» [Москва,2006], С 37

46 Штильман МИ, Ташмухамедов РИ, Кусков АН, Горячая А В Амфифильные полимеры - новые материалы для медицины // Actual problems of polymer chemistry and physics [Tashkent, 17-18 Oct 2006], С 23-27

47 Shtiiman MI, Kuskov A N, Tsatsakis A M, Tashmuhamedov RI Self-assembly hydrophobically end-capped poly-N-vmylpyrrohdones m aqueous solutions // 33rd Annual Meeting of Controlled Release Society [Vienna, Austria, July,21-27,2006] P 723

48 Горячая А В, Штильман M И, Кусков А Н, Ван Дуань, Ташмухамедов Р И Полимерные мицеллы - новое поколение носителей лекарственных веществ // Биотехнология Состояние и перспективы развития [Москва, март 2007], 2007, С 59 (Goiyachaya А V , Shtiiman МI, Kuskov А N, Wang Duan, Tashmuhamedov R i Polymeric rtncells - new generation of drug carriers //Biotechnology State of the art arid prospects of development [Moscow, March 2007] 2007, P 59

49 Штильман M И , Ташмухамедов P И, Кусков A H, Артюхов А А, Брудзь С П Полимеры для создания биологически активных и лекарственных систем Ч Биотехнология Состояние и перспективы развития [Москва, март 2007], 2007, С 111 (Shtiiman МЛ/, Tashmuhamedov RI, Kuskov А N, Artyukhov A A, Brudz S Р Polymers for creation of biologically active and drug systems //Biotechnology State of the art and prospects of development [Moscow, March 2007] 2007, P 58

50. Ершов Ф И, Наровлянский A H, Ташмухамедов Р И и др Полимерные металлокомплексы с терапевтической активностью // Решение о выдаче патента РФ по заявке № 2002128394 (2003)

Заказ № ж_ _Объем 2,0 п д_Тираж 100 экз

Издательский центр РХТУ им ДИ Менделеева

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Металлокомплексы на основе водорастворимых полимерных комплексообразователей

2.1. Значение металлов и водорастворимых полимерных металлокомплексов в живых организмах

2.2. Общие положения процесса комплексообразования

2.3. Влияние различных факторов на процесс комплексообразования

2.3.1. Концентрационный фактор

2.3.2. Конформационный фактор

2.3.2.1. Связь конформационного фактора с вязкостью полимерных металлокомплексов

2.3.2.2. Связь конформационного фактора с концентрацией ионов металла

2.3.2.3. Параметры комплексообразования

2.3.3. Устойчивость полимерных металлокомплексов.

2.3.4. Пространственный фактор

2.3.5. Влияние растворителей

2.3.6. Электростатические эффекты

2.3.7. Влияние рН и ионной силы раствора

2.3.8. Влияние расположения функциональных комплексообразующих групп в полимерной цепи

2.3.9. Влияние присутствия солей щелочных металлов

2.3.10. Влияние молекулярной массы

2.4. Водорастворимые полимерные металлокомплексы в качестве основы лекарственных препаратов

2.4.1. Бактерицидное действие

2.4.2. Антираковое действие

2.4.3. Гемостимулирующая активность

2.4.4. Другие типы активности

2.4.5. Системы с комплексным действием

2.4.6. Системы, в которых точный характер действия не указан

2.4.7. Другие эффекты

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Объекты исследований

3.2. Эпоксидсодержащие полимеры 1Ч-винилпирролидона

3.2.1. Сополимер 1Ч-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира

3.2.2 Эпоксидированный поли-]Ч-винилпирролидон

3.2.3. Амфифильный эпоксидированный поли-1Ч-винилпирролидон

3.3. Синтез полимеров, содержащих аминокислотные остатки

3.3.1. Общие положения

3.3.2. Строение полимеров, содержащих аминокислотные остатки

3.3.3. Кислотно-основные свойства модифицированного ЭПВП, содержащего аминокислотные остатки

3.3.4. Исследование светорассеяния растворов аминокислотных производных

3.3.5. Аминокислотные производные амфифильного ЭПВП

3.4. Синтез полимерных металлокомплексов и их исследование

3.4.1. Общие положения

3.4.2. Строение полимерных металлокомплексов

3.4.3. Комплексообразующие свойства модифицированного ЭПВП, содержащего аминокислотные остатки

3.5. Биологическая активность производных ПВП с аминокислотными боковыми группами и их металлокомплексов

3.5.1. Токсичностьность полимеров ВП с аминокислотными остатками и их металлокомплексов

3.5.1.1. Острая токсичность полимеров с аминокислотными остатками и их кобальтовых комплексов

3.5.1.2. Фармакокинетика сополимеров с аминокислотными остатками и их кобальтовых металлокомплексов

3.5.2 Гемостимулирующая активность кобальтовых комплексов сополимеров ВП-АГЭ с аминокислотными остатками

3.5.3. Иммуноактивные свойства производных поливинилпирролидона с аминокислотными остатками и их металлокомплексов

3.5.3.1. Иммуноактивные свойства производных ПВП с аминокислотными остатками на опытных моделях in vitro

3.5.3.1.1. Исследования на культурах клеток

3.5.3.1.2. Влияние полимеров на поликлональную стимуляцию лимфоцитов

3.5.3.1.3. Влияние полимеров на антиген-специфичную стимуляцию лимфоцитов

3.5.3.1.4. Влияние полимеров на выделение иммуноглобулинов.

3.5.3.2. Иммунологические свойства сополимеров ВП-АГЭ с аминокислотными остатками и их металлокомплексов на опытных моделях in vivo

3.5.4. Противовирусная и потенцирующая активность производных ПВП с аминокислотными остатками и их ПМК

3.5.3.1. Противовирусная активность полимеров и их металлокомплексов опытных моделях in vitro

3.5.3.2. Противовирусная и потенцирующая активность полимеров и их металлокомплексов на опытных моделях in vivo

3.5.3.2.1. Интерферон-стимулирование системой ЭПВП + |3-аланин + GeCI2 при антихламидийном действии

3.5.3.2.2. Интерферон-потенциирующее свойство системы ЭПВП + глицин + PtCI2.

3.5.3.2.4. Цитокин-потенциирующее действие системы ЭПВП + у-аминомасляная кислота + СоС

3.5.3.2.5. Потенциация действия антибиотика в присутствии системы ЭПВП + (3-аланин + СиСЬ

3.5.3.2.6. Противовирусная активность системы ЭПВП + £-аминокапроновая кислота в отношении вируса гриппа

4. ВЫВОДЫ

Актуальность выбранной темы. Хорошо известно, что макромолекулярные биологически активные системы, обладающие различной биологической активностью, в частности, оказывающие лекарственное действие, часто обладают существенными преимуществами перед низкомолекулярными аналогами, а в ряде случаев определенные виды активности характерны только для макромолекулярных систем.

К настоящему времени описано большое количество полимерных биологически активных соединений различного химического строения, проявляющие активность как за счет своей макромолекулярной природы (полимеры с собственной биологической активностью), так и за счет определенного фрагмента, который может постепенно выделяться из полимера и поступать в биологический объект (системы с контролируемым выделением активного вещества).

В последнем случае определяющее значение имеет не только тип выделяющегося активного вещества и характер связи его с полимерным носителем, определяющей скорость выделения, но и строение самого полимерного носителя, который должен обладать высоким уровнем безвредности (особенно для систем, вводимых инъекционно).

Поэтому во многих случаях в качестве основы для создания полимерных носителей лекарственных веществ используются полимеры, хорошо изученные как компоненты кровезаменителей гемодинамического или дезинтоксикационного действия, как правило, являющиеся достаточно крупномасштабными продуктами, взаимодействие которых с организмом изучено в большей степени.

В первую очередь указанная безвредность определяется способностью полимерного носителя распадаться в организме на выводимые или включающиеся в процессы метаболизма фрагменты, как 7 это имеет место в случае полисахаридов, например, декстрана, гидроксиэтилкрахмала, некоторых полимеров аминокислот или способностью к выведению из организма преимущественно за счет почечной фильтрации, как это происходит при введении в организм низкомолекулярных карбоцепных полимерных компонентов кровезаменителей - поли-М-винилпирролидона, поли-М-(2-гидроксипропил)метакриламида, поливинилового спирта.

Процесс производства таких низкомолекулярных полимеров технологически направлен на то, чтобы они не содержали в своем составе высокомолекулярных фракций, аккумулирующихся в организме с патологическими последствиями (например, препарат на основе поли-]М-винилпирролидона «Неогемодез» («Гемодез Н»)).

В то же время, дополнительные функциональные группы, с использованием которых проводится иммобилизация низкомолекулярного лиганда, в этот полимер, как правило, вводят с использованием сополимеризации, когда продукт этой реакции требует обязательного достаточно сложного фракционирования и очистки от низкомолекулярных примесей. Поэтому интерес представляет использование в качестве носителей лекарственных веществ продуктов превращения непосредственно допущенных к применению полимеров, например, полимерных компонентов кровезаменителей.

При этом следует отметить, что если для полимеров полисахаридного типа введение функциональных групп, требуемых для связывания биологически активных лигандов хорошо описаны (диальдегиддекстран, карбоксиметилдекстран и т.п.), то методы введения функциональных групп, например, в такой наиболее хорошо исследованный полимер карбоцепного типа, как поли-]Ч-винилпирролидон, практически не изучены. 8

Важнейшим элементом создания лекарственных полимеров с контролируемым выделением активного вещества является выбор иммобилизуемого объекта, определяющего характер и уровень биологической активности. И в этом направлении в широком круге лабораторий проведена большая работа, результатом которой явился синтез полимерных производных низкомолекулярных лекарственных веществ большинства известных групп, что отражено в громадном числе публикаций различного типа и патентной литературе.

В то же время, введение в полимерный носитель различными типами химической связи атомов биогенных металлов, в первую очередь переходных групп и их биологическая активность исследованы явно недостаточно. В большинстве случаев работы в этом направлении связаны с синтезом и исследованием производных цис-дихлордиаминоплатины (+2) (Цисплатина), нашедшего применение в составе антираковых препаратов.

С другой стороны, различные типы активности проявляют и другие биогенные металлы. При этом существенно, что их успешное использование связано, в том числе с обеспечением постепенного поступления в организм в оптимальных дозах и исключение возможной токсичности, проявляющейся при повышенных концентрациях.

Это подразумевает использование для иммобилизации металлов оптимальных по своим характеристикам носителей, как с точки зрения полной выводимости из организма, так и с точки зрения отсутствия острой и хронической токсичности. В то же время большинство полимерных носителей, используемых в настоящее время для связывания металлов, в первую очередь с образованием хелатных соединений, не являются оптимальными при взаимодействии с организмом и часто содержат группы, приводящие к высокому уровню токсичности или к другим побочным видам активности. 9

Таким образом, весьма актуальным является разработка полимерных металлокомплексов, в которых могут быть включены различные металлы, а в качестве макромолекулярных носителей используются полимеры с высоким уровнем биологической безвредности, складывающимся из полной выводимости из организма, отсутствия токсичности и различных видов отрицательной побочной активности.

Цель и задачи работы. Исходя из этой задачи в данной работе был разработан новый тип полимерных носителей, пригодных для создания макромолекулярных комплексов широкого круга биогенных переходных металлов, содержащих боковые комплексообразующие аминокислотные группы и полученных на основе заранее синтезированного и охарактеризованного поли-1Ч-винилпирролидона с использованием ранее не описанного метода введения в этот полимер эпоксидных групп.

Конкретными целями работы явились:

• Разработка доступного и воспроизводимого метода введения в заранее синтезированный поли-1М-винилпирролидон реакционноспособных эпоксидных групп, способных вступать в различные реакции, в частности, во взаимодействие с аминокислотами и исследование полученного полимера.

• Разработка реакций взаимодействия эпоксидсодержащего поли-1М-винилпирролидона с аминокислотами различного строения, подтверждение их строения, как продуктов взаимодействия с дизамещенными оксиранами, исследование их свойств и выявление наличия биологической активности в зависимости от строения системы.

• Синтез на основе полученных полимерных производных аминокислот как комплексообразующих агентов полимерных комплексов ряда переходных металлов, выявление их строения в зависимости от

10 строения аминокислотной группировки и определение уровня их биологической активности в тестах на клеточных объектах.

• Исследование возможности использования в этих процессах амфифильных агрегатообразующих производных поли-1Ч-винилпирролидона.

• В ряде разделов работы рассмотрены полимерные комплексы металлов, получаемые на основе ранее синтезированных нами аминокислотных производных другого эпоксидсодержащего производного поли-К-винилпирролидона - сополимера ]ЧГ-винилпирролидона с незначительным (около 10 мол.%) звеньев аллилглицидилового эфира.

Научная новизна работы. Разработаны новые биологически активные аминокислотные производные поли-1Ч-винилпирролидона и их металлокомплексы, характеризующиеся низкой токсичностью и проявляющие биологическую активность различного типа.

Предложен новый метод функционализации поли-К-винилпирролидона, в том числе его промышленных образцов медицинского назначения, путем введения в него эпоксидных групп с использованием модифицированной реакции Дарзана, что позволяет получать реакционноспособные полимерные производные этого полимера с заранее заданным молекулярно-массовым распределением.

Получен ряд новых полимерных соединений низших а,со-аминокислот путем их реакции с эп оксид со держащим поли-1Ч-винилпирролидоном и металлокомплексов ряда переходных металлов на их основе.

Впервые получены аминокислотные производные поли-]\Г-винилпирролидона и их металлокомплексы с использованием в качестве носителя амфифильного полимера 1Ч-винилпирролидона, способного к

11 образованию наноразмерных агрегатов в водных растворах, и изучены их свойства.

Показано, что аминокислотные производные эпоксидсодержащих полимеров 1<Г-винилпирролидона и металлокомплексов на их основе обладают различными типами биологической активности. Выявлена взаимосвязь между биологической активностью полимеров и их химическим строением.

Практическая значимость работы.

Синтезированные полимеры и металлокомплексы на их основе обладают низкой токсичностью, и проявляют высокую иммуностимулирующую, иммуноадъювантную, антивирусную, гемостимулирующую активность, а также усиливают продуцирование интерферона, подавление репликации микроорганизмов под действием антибиотиков, что предполагает их использование в качестве основы или компонентов лекарственных препаратов.

Эти данные указывают на перспективность использования синтезированных полимеров и их металлокомплексов в качестве основы лекарственных препаратов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 220 стр. машинописного текста и включает введение, обзор литературы, обсуждение результатов, основные выводы и список цитированной литературы из 243 наименований. Работа содержит 39 таблиц и 34 рисунка.

4. ВЫВОДЫ

Впервые синтезированы аминокислотные производные эпоксидсодержащего поли-1Ч-винилпирролидона и их комплексы с переходными металлами, изучены их свойства и показано, что они характеризуются низкой токсичностью и проявляют биологическую активность различного типа.

Выявлен новый путь протекания реакции Дарзана с участием карбонила циклических амидов и хлорацетамида, и с использованием этой реакции синтезирован эпоксидсодержащий полимер 14-винилпирролидона. Исследованием влияния на протекание реакции различных факторов найдены оптимальные условия ее проведения, позволяющие получать модифицированный поли-1Ч-винилпирролидон с содержанием эпоксидных групп до 25 мол.%.

Получены ]М-замещенные полимерные производные низших а,со-аминоксилот их взаимодействием с эпоксидсодержащим поли-]М-винилпирролидоном. Установлено, что реакция аминокислот с дизамещенным эпоксидом 4-метил-1-окса-4-азаспиро[2,4]гептан-2-карбоксамидом протекает с присоединением остатка аминокислоты к атому углерода, входящему в пирролидиновый цикл.

Показано, что аминокислотные производные эпоксидсодержащего поли-14-винилпирролидона образуют комплексы с переходными металлами, в которых металл связан с фрагментом аминокислоты или с участием атомов кислорода и азота или в виде карбоксилатного комплекса для аминокислот с более длинным углеводородным радикалом.

Показано, что аминокислотные производные эпоксидсодержащего поли-]М-винилпирролидона в большей мере склоннны к образованию ассоциатов в водном растворе, чем аминокислотные производные сополимера ]М-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира.

193

6. Впервые синтезированы эпоксидные и аминокислотные производные амфифильного полимера N-винилпирролидона. Показано, что эти полимеры склонны к образованию наноразмерных агрегатов в водном растворе.

7. В опытах на животных in vivo и клетках in vitro установлено, что синтезированные полимерные производные аминокислот и их металлокомплексы при низкой острой токсичности проявляют различные типы активности - иммуностимулирующую, иммуноадъювантную, интерферонстимулирующую, антивирусную, антимикробную; способствуют антиген-специфичной стимуляции лимфоцитов, стимулируют процесс гемопоэза. В ряде исследований биологической активности синтезированных полимеров установлено, что она повышается с увеличением способности полимеров к агрегации в водном растворе.

1. Крисс E.E., Волченскова A.C., Григорьева A.C. Координационныесоединения металлов в медицине.- Киев, 1986.- 216 с.

2. Carraher С.Е. Biological activities and medical application of metalcontaining macromolecules. // In: Bioactive Polymer Systems. / Ed. by

3. Gebelein C.G., Carraher C.E. New York; London:Plenum Press, 1985. P.651.674.

4. Николаев Л.А. Металлы в живых организмах.- М.: Просвещение, 1986.- 127 с.

5. Shin Un Sup; Sang Hui. Role of metals in living bodies and study on the roles. // Seokang University, S. Korea. Hwahak Sekye 1997, V.37, N.9, P.23-31.

6. Эйхгорн Г. Неорганическая биохимия.-М.: Мир., 1978, Т.1.- 620 с.

7. Уильям Д. Металлы жизни.-М.: Мысль.-1975.-236 с.

8. Нейко Е.М. Применение микроэлементов в клинике. // В кн.:

9. Ферменты, металлы, металлоферменты в диагностике и лечении. Тездокл. Всес.конф., Ивано-Франковск., 1982, С. 14-15.

10. Мартин Р. Ведение в биофизическую химию.- М.: Мир.-1966.- 430 с.

11. Тодзима Н. Функциональные высокомолекулярные комплексы. //

12. Polym. Appl., 1990, V.39, № 6, С.268-274.

13. Seki I., Sato Т., Washino H. Hydrophilic polymer and radioactive metal complexes as locally administered radio-therapeutic agents for treatment of cancer and inflammantory diseases. // Japan Kokai Tokkyo Koho JP, 16 Jan. 1996.-19pp.

14. Hsic Gring-Ho, Jang Jin-Sheng. Polymer metal complexes. // Dep. of Chemical Engineering National Tsing Hua Univ., Hsinchu, Taiwan, 1995, V.53, N.2, P.203-213.

15. Платэ H.A. Васильев A.E. Физиологически активные полимеры.-М.: Химия, 1986.-296 с.

16. Осипова Е.А. Водорастворимые комплексообразующие полимеры.// Соровский общеобразовательный журнал, 1998, № 7, С.45-51. Давыдова С.Л., Платэ Н. А., Картин В.А. // Успехи химии, 1970, Т.39, С.1980-1989.

17. Hoeschele G.K., Andelman J.B., Gregor H.P. Metal-polyelectrolyte complexes. V. Preparation and properties of a new polychelate-polyvinylacetonyl ketone. // J.Phys.Chem., 1958, V.62, №10, P. 12391244.

18. Gregor H.P., Luttinger L.B., Loeble E.M. Metal-polyelectrolytecomplexes of copper with cross-linked polyacrylic and polymethacrylicacids.// J. Phys. Chem., 1955, V.59, №34, P.366-368.

19. Gregor H.P., Luttinger L.B., Loeble E.M. Metal-polyelectrolytecomplexes. III. Entropy and entalpy of complexation for polyacrylic acidcopper systems.//J. Phys. Chem., 1955, V.59, № 6, P.559-560.

20. Gregor H.P., Luttinger L.B., Loeble E.M. Metal-polyelectrolytecomplexes. IV. Complexes of polyacrylic acid with magnesium, calcium,manganese, cobalt and zinc.// J. Phys. Chem., 1955, V.59, № 9, P.990991.

21. Gold D.H., Gregor H.P. Metal-polyelectrolyte complexes. IX. The poly-N-ethyleneglicine-copper (II) complexes.// J. Phys. Chem., 1962, V.66, №2, P.246-249.

22. Gold D.H., Gregor H.P. Metal-polyelectrolyte complexes. VIII. The poly-N-vinylimidazole-copper (II) complex.// J. Phys. Chem., 1960, V.64, №10, P. 1462-1467.

23. Давыдова C.JI., Барабанов B.A., Платэ H.A. Комплексы 3 d-переходных металлов с макромолекулярными лигандами (3-диктоэфирного типа.// Журн. неорг. Химии, 1970, Т.20, № 7, С. 18671871.

24. Барабанов В.А, Давыдова С.Л., Платэ Н.А. Исследование устойчивости комплексов переходных металлов с некоторыми макромолекулярными лигандами. // Ж.физ.химии, 1968, Т.42, №4, С.990-992.

25. Давыдова С.Л., Платэ Н.А., Каргин В.А. Синтез и химические превращения металлосодержащих макромолекул. // Успехи химии, 1970, Т.39, № 12, С.2256-2286.

26. Давыдова С.Л., Барабанов В.А. О константах устойчивости комплексов ионов металлов, закрепленных на макромолекулярныхлигандах.// В кн.: Катализаторы, содержащие нанесенные комплексы, Новосибирск, 1988.-ч. 1.- С. 127-130.

27. Давыдова C.JL, Барабанов В.А. Характеристика процесса связывания двухвалентной меди макромолекулярными лигандами.// 13-е Всес. Чугаевское совещание по химии комплексных соедиений. Тез. Док.-М.,1978, С.113.

28. Nishikawa H., Tsuchida Е. Complexation and form of polyvinylpyridine derivates with copper (II) in aqueous solution.// J. Phys. Chem., 1975, Y.79, № 19, P.2072-2076.

29. Tsuchida E., Nishide H. Polymer-metal complexes and their catalytic activity.// Adv.Polym. Sci., 1974, V.24, P.l-87.

30. Nishikawa H., Tsuchida E. Complexation and form of polyvinylpiridine derivates with copper (II) in aqueous solution.// J. Phys. Chem., 1975, V.79, № 19, P.2072-2076.

31. Кушнер В.Т. Конформационная изменчивость и денатурация белков.-Л.: Наука.-1977.-230 с.

32. Бектуров Е.А., Кудайбергенов С.Е., Жаймина Г.М. Исследование комплексов гидрохлорида поли-2,5-диметил-4-винилэтинил-пиперидола-4 с ионами переходных металлов.// Высокомол. Соедин., 1983, Т.25Б, № 11, С. 821-825.

33. Teyssie P., Decone С., Teyssie М.Т. Structure and properties of polymeric chelates. IV. Structure and shape of polyvynilamine chelates in aqueous solution.// Macromol. Chem., 1965, V.84, P. 51-63.

34. Жаймина Г.М., Кудайбергенов С.Е., Бабаев Т.М., Мусаев У.Н., Бектуров Е.А. Комплексообразование полипиперида метакриловой кислоты с ионами меди (II) в водном растворе.// Журн. Прикл. Химии, 1984, № п, С.2474-2477.

35. Bekturov. E. A., Kudaibergenov S. E., Zhaimina G. M. Saltykov Y. P. Complexation of polyallylamine with transition metal ions in aqueous solution.// Macromolec. Chem. Rapid. Commun., 1986, V.7, №6, P.339-343.

36. Rashidova S.Sh., Urinov E.U., Khodjaev S.G. Molecular parameters and conformational properties of certain copolymers of N-vinyllactams and their metal complexes.// MACRO'87. 31st IUPAC Macromol. Symp., Merseburg, June 30th—July 4 th, 1987.-98 p.

37. Авлянов Ж.К. Кинетика и механизм образования комплексов полиакриалт-аинонов с ионами металлов: Дис. Канд. Хим. Наук.-М., 1998.-124 с.

38. Shirai H., Nio Y., Kurose A., Hayashi S., Hoyo N. Formation of Си (II) and Fe (III) polyvynilalcohol mixed complexes and their catalytic activities for decomposition of hydrogen peroxide.// J. Chem.and Ind. Chem., 1978, № 1, P. 117-123.

39. Bekturov E. A., Kudaibergenov S. E., Kanapyanova G. S., Kurmanbaeva A. A. Complexation of poly(N-vinylpyrrolidone) and N-vinylpyrrolidonecopolymers with cupric (II) ions in aqueous solution.// Polym. Commun., 1984, V. 25, № 7, P. 220-223.

40. Ли B.A. Синтез комплексов поливинилпирролидона с металлами и их физико-химические свойства: Дис. Канд. Хим. Наук.-Ташкент, 1981.-127 с.

41. Madan S. К., Sturr J.A. Amides as ligands. VIII. Inorganic complexes of y-butyrolactam and N-methylbutylactam.// J. Inorg. Chem., 1967, V.29, P.1669-1683.

42. Francesca O.M. An ESR study on the interaction of copper (П) with pyridine and poly-2-vynilpyridine in ethanol solutions.// Colloids and Surfaces, 1984, V. 12, № 3-4, P.305-318.

43. Bernhardt P.V., Sharpe P. A novel tricopper (II) complex of a polyaminealcohol. // J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1998, № 7, p. 1087 -1088.

44. Зиямов Дж., Ширходжаева Г.Р., Рашидова С.Ш. Исследование комплекса поли-№-винилпирролидона с солью СоС12; в неводных растворителях методами ИК- и электронной спектроскопии.// Узб. хим.ж., 1986, № 5, С. 22-25.

45. Зиямов Дж., Ширходжаева Г.Р., Рашидова С.Ш. Исследование взаимодействия кобальтового комплекса поли-1Ч-винилпирролидона с молекулами воды и этилового спирта.// Докл. АН УзССР, 1986, №8, С. 34-35.

46. Methenitis Costas, Morcellet-Sauvage Joelle, Morcellet Michel. The interaction of poly(N-methacryloyl-L-alanine) with copper (II). 1. Potentiometric study.// Polym. Bull., 1984, V.12, № 2, P. 133-139.

47. Ермаков С.С., Красиков Б.С. Особенности полярографического поведения комплексов меди (II) с полиэтиленимином при различных рН раствора.// Вест. ЛГУ, 1985, № 25, С. 57-60.

48. Hikichi Kunio, Tanaka Hiroyuki, Konno Akira. Nuclear magnetic resonance study of poly(y-glutamic acid) —Cu(ll) and Mn(ll) complexes.// Polym. J., 1990, V. 22, № 2, P. 103—109.

49. Херинг Р. Хелатообразующие иониты.-М.: Мир, 1971.-167 с.

50. Teyssie M.T., Teyssie P. High polymer chelate. I. Structure and stability of polymethacroylacetone chelates.// J. Polym. Sei., 1961, V. 50, P. 253262.

51. David C., De Pauw A., Geuskens G. Effect de la tacticite de l'acide polymethacrylique sur la vitesse de formation de chelates avec les ions Cu2+.// J. Polym. Sei., 1968, Part C, № 22, P. 319-327.

52. Kurimura Yoshimi, Kikuchi Takashi, Tsuchida Eishun. Electron-transfer2+reaction of macromolecular cobalt(lll) complex with Ru(NH3)6. . Effect of microenvironment occupied by polymer backbone.// Macromolecules.-1989, Vol. 22, № 4, P. 1645-1648.

53. Pezron E., Leibler L., Lafuma F. Complex formation in polymer-ion solutions. 2. Polyelectrolyte effects.// Macromolecules, 1989, Vol. 22, № 6, P. 2656-2662.

54. Biederman V. H., Steininger F. Metallkomplexe mit polymeren liganden. XV. Darstellung von metallkomplexe mit poly-l-vinyl-2-pyrrolidinin und ihre reaktion mit molekularem Wasserstoff.// Chemiker-Zeitung, 1976, №3, P. 141-142.

55. Kobayashe Shito, Suh Kyung Do, Shirokura Yukio. Chelating ability of poly (vinyl amine): effects of polyamine structure on chelation.// Macromolecules, 1989, Vol. 22, № 5, P. 2363-2366.

56. Rivas B.L., Pereira E.D., Mondaca M.A., Rivas R.J., Saavedra M.A. Genotoxicity study of water-soluble cationic polymers and their polymer-metal complexec with biocidal activity. // J.Appl.Polym.Sci., 2003, Y.87, N.3, P.452-457.

57. Mcdonald W.F., Wright S.C., taylor A.C. Antimicrobial polymers and rendering the surface of a substrate antimicrobial. // U.S. Pat. Appl. Publ. US 2003032765 (2003); Chem.Abstr., 2004, V.138, 155134.

58. Анненкова B.3., Казимировская В.Б., Жданкович Е.Л., Никифорова Т.И. и др. Новые водорастворимые полимеры, обладающие антимикробной активностью. // Хим.фармап.ж. 1990, Т.24, № 6, С. 34-36.

59. Gordon R., Schering A.G. Ferromagnetic, diamagnetic or paramagnetic particles useful in the diagnosis and treatment of disease: Пат. № 88730053. Опубл. 06.09.89.

60. AlcockH. //Science, 1976, V.193, P.1214-1217.

61. Allcock H. // Polym.Prepr., Am.Chem.Soc., Div.polym.Chem., 1977, V.18, P.857-859.

62. Carraher C.E. Biological activities of cis-dichlorodiamineplatinum and its derivatives. // In: Bioactive Polymer Systems. / Ed. by C.G.Gebelein, C.E.Carraher, Plenum Press: New York London, 1985. P. 587-620.

63. Dunkan R., Ferruti H., Evagorou E.G. Diamido-diamine polymer -platinum compounds for tumor? And preparation thereof. // PCT Int. Appl. WO 9847496 (1998); Chem.Abstr., 1999, 339862v.

64. Иорданская Л.И., Стоцкая Л.Л., Кулабухова Т.К., Щитков К.Г., Ильина А.И. Поликарбоксилатные комплексы платины с противоопухолевой активностью. // Хим.фармац.ж., 1995, Т.29, № 5, С. 27-29.208

65. Wang Zhuting Synthesis and characterization of DVE-co-MA derivatives of cis-platinum complexes.// Chin.J.Polym.Sci., 1989, V.7, N.2, P. 159164.

66. Allcock H. // In: Organometallic Polymers / Eds. C.Carraher, J.Sheets and C.Pittman, Acadmic Press: New York, 1878, P.238-288.

67. Ташмухамедов Р.И., Ли В.А., Мусин Р.И., Туляганов Р.Т., Рашидова С.Ш., Штильман М.И. Синтез и свойства комплексов металлов переходного ряда и полимеров с аминокислотными остатками.// Хим. Фарм. Ж., 1989, Т. 23, № 12, С. 1447-1450.

68. Lee Y.A., Rashidova S.Sh., Musin R. I., Aliev Ch. U. Polyvinylpyrolidone metal complexes and their biological activity.// 31th IUPAC Macromol. Symp. Merseburg, June 30th-July 4th, 1987., 1987, C. 173.

69. Мусин Р.И., Туляганов P.T., Алиев Х.У. Фармакологическое исследование металлокомплексов ПВП.// Синтез, свойства и применение полимеров на основе N-виниллактамов, Ташкент, 1990, С.197-209.

70. Мусин Р.И., Ли В.А., Тулганов Р.Т., Калугина Г.Н., Рашидова С.Ш. Синтез и биологическая активность кобальт-содержащих комплексов поливинилпирролидона.// Хим. Фарм. Ж., 1989, Т. 23, № 5, С. 554557.

71. Рашидова С.Ш., Ли В.А., Ким А.А. Способ получения полимерных комплексов переходных металлов. // Авт.свид. СССР № 821445 (1979); РЖХимия, 1980, 22 С 447.

72. Rashidova S.Sh. // In: New Polymer Systems for Biotechnological andth

73. Biomedical Application 8 International Seminar ISTC. [Erevan, Armenia. 2005, P.92-103.

74. Ranney David F. In vivo agents comprising cationic metal chelators with acidic saccharides and glycosaminoglycans.// GBR Pat 160085 (1997) Access Pharmaceuticals, Inc., Appl. 29.11.93.

75. Lawrence Richard P., Lange Ralf A., Wu Chin, Helenek Mary J. Iron-dextran formulation.// Pat. 536984(1997) Luitpold Pharmacuticals, Inc., Appl. 29.9.95.

76. Tabata Y., Matsuoka H., Kurose Т., Murai K. Interferon-polymer complexes and medical use thereof. // PCT Int.Appl. WO 2002083166 (2002); Chem.Abstr. 2003, v. 137, 316088.

77. Basalp A., Mustafaeva Mustafaev M. Immunogenic Cu2+ induced biopolymer systems comprising a steroid hormone, protein antigen, and synthetic polyelectrolites. // Hybridoma and Hybridomic, 2002, v.21, N.l, P.45-51.

78. Исикава А., Исида Ю. Полимеры, содержащие германий.// Пат. Японии (1979); РЖХимия, 1980, 17 О 193.

79. Домнина Е.С., Байкалова JI.B., Скушникова А.И. Новые мономеры имидазольного ряда и их использование.// Тез.докл. Регион. Конф. Сибири и Дальн. Востока «Перспективы развития малотоннаж. химии» Красноярск, 3-5 окт.1989., 1989, С. 80-81.

80. Carraher С.Е. // J.Chem.Ed., 1981, V. 58, Р.91-96.

81. Bolotin Е.М. Composition for delivery of therapeutics and other materials, and methods of making and using the same. // PCT Int.Appl. WO 2003072143 (2003); Chem.Abstr., 2004, v. 139, 235328.

82. Winston A. Iron-complexing bioactive polymers. // In: Bioactive Polymer Systems. / Ed. by C.G.Gebelein, C.E.Carraher, Plenum Press: New York; London:, 1985. P. 621-649.

83. Winston Anthony. Bioactive hydroxamic acid polymers for ion chelation.// Polym. News.,1984, Vol.10, № 1, P. 6-12. (126)

84. Попов B.A., Лопатинский В.П., Новиков В.Т. Комплексообразование гидроксамовых. кислот с ионом железа.// Матем. науч.-практ. конф., посвящ. 85-лет. хим.-технол. фак. Томск, 21-22 мая, 1985., 1985, С.8-11.210

85. Winston A., Varaprasad D. V. P. R., Metterville J.J., Rosenkrantz H. Evaluation of polymeric hydroxamic acid iron chelators for treatment of iron overload.// J. Pharmacol, and Exp.Ther., 1985, Vol.232, № 3, P. 644649.

86. Коршак B.B., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. М.: Наука. -1984-261 С.

87. Shtilman M.I. Immobilization on polymers.- YSP: Utrecht-Tokyo. -1993.-479 P.

88. Сидельковская Ф.П. Химия N-винилпирролидона и его полимеров. М.: Наука.-1970.- С.72-75.

89. Guner A., Sevil A.U., Guven О. Complexation of poly(vinylpyrrolidone) and gelatin with transition metal chlorides in aqueous solution. // J.Appl.Polym.Sci., 1998, V.68, N.6, P. 891-895.

90. Штильман М.И. Эпоксидсодержащие полимеры как носители биологически активных веществ. // Итоги науки и техники ВИНИТИ., 1986, Вып.21, С. 159-187.

91. Коршак В.В., Штильман М.И., Залукаева Т.П. Полимеры N-винилпирролидона и аллильных мономеров.// Высокомол.соедин., Сер.Б., 1979, Т.21, N.12, С.912-916.

92. Коршак В.В., Штильман М.И., Залукаева Т.П., Козлов А.А. Исследование особенностей сополимеризации N-винилпирролидона и аллильных мономеров.// Высокомол.соедин., Сер.Б., 1980, Т.22, N.8, С.591-594.

93. Торчилин В.П., Штильман М.И., Козлов А.А., Ильина Е.В., Брудзь С.П., Лившиц А.Б. Реакция белков с водорастворимыми эпоксидсодержащими полимерами.// Высокомол.соедин., Сер.Б., 1985, Т.27, N.12, С.896-898.

94. Хадайбергиев М.А. Механизм сополимеризации N-винилпирролидона с аллилглицидиловым эфиром. // Узб. Химич. Ж., 1996, N.5-6, С.52-56; Chem. Abstr., 1997,154428 p.

95. Sorokin A. Influence of the intramolecular distridution of vinyl acetate groups in polyvinyl alcohols on their physicochemical and biological properties. // Polym. Mater. Sci. Eng., 1998, .78.- РЛ6-17; Chem.Abstr., 1999, V. , 306490u.

96. Химическая энциклопедия.-M.: Изд-во «Советская энциклопедия».-1988.-Т.1.-с. 623.

97. Tashmuhamedov R.I., Shtilman M.I., Khvostova V.Yu., Klyagina M.V., Tsaysakis A.M., Shashkova I.M. Poly(N-vinylpyrrolidone) with amino acid side groups.// Polymer Science, 2005, Ser.B, Vol.47, N.5-6, PP. 167169.

98. Torchilin V.P. // J. Contrail. Rel., 2001, V. 73, P. 137-172.

99. Liaw J., Aoyagi Т., Kataoka K., Sakurai Y., Okano T. // Pharm. Res. 1998, V.15, P 1721-1726.

100. Yasugi K., Nakamura Т., Nagasaki Y., Kato M., Kataoka K. // Macromolecules, 1999, V.32, P. 8024-8032.

101. Jeong Y.-I., Nah J.-W., Lee Y.-K., Kim S.-H., Cho C.-S. // J. Contrail. Rel., 1999, V. 188, P. 49-58.

102. Gref R., Minamitake Y., Peracchia M.T., Trubetskoy V.S.,Torchilin V.P., Langer R. // Science, 1994, V.263, P.1600-1603.

103. Ташмухамедов Р.И., Штильман М.И., Хвостова В.Ю., Клягина М.В., Tsatsakis A.M., Шашкова И.М. Поли-М-винилпирролидон с боковыми аминокислотными группами. // Высокомолекул.соедин., 2005, Серия А, т.47, №6, С. 1-4.

104. Torchilin V.P., Levchenko T.S., Whiteman K.R., Yaroslavov A.A., Tsatsakis A.M., Rizos A.K., Michailova E.V., Shtilman M.I. // Biomaterials, 2001, V. 22, N. 15, P. 3035-3044.

105. Kuskov A.N., Shtilman M.I., Torchilin V.P., Tsatsakis A.M., Sharipovath

106. E.I. Amphiphilic polymers. // IX Int. Symp. on Biomedical Science and Technology. Kemer-Antalya, 2002., 2002, Oil.

107. Штильман М.И., Кусков A.H., Ташмухамедов P.И., Torchilin V.P., Tsatsakis A.M. Амфифильные полимеры винилпирролидона. // Тез. Докл. XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Казань, 2003. 2003, С.467.

108. Малиновский M.C. Окиси олефинов и их производные.-М.:Химия, 1961.-553 с. (231)

109. Пишнамазаде Б.Ф., Мамишев А.Х. О порядке раскрытия эпоксидного кольца 1,2-эпокси-З-аллилоксипропана в зависимости от условий проведения реакции.// Азерб.Хим.Ж., 1971, № 2, С.46-50.

110. Альберт А., Сержент Е. Константы ионизации кислот и оснований.-М-Л.: Химия, 1964.-180 с.

111. Петров А.А., Бальян Х.В., Трощенко А.Т. Органическая химия.-М.: Высшая школа.-1973.-624 с.

112. Ташмухамедов Р.И., Штильман М.И., Хвостова В.Ю., Клягина М.В. Присоединение аминокислот к дизамещенным эпоксидам. // ИзвВУЗов. Хими и хим.техн., 2006, Т.49, № 1, С.93-95.

113. Ташмухамедов Р.И. Синтез и свойства металлокомплексов сополимеров виниллактамов и аллилглицидилового эфира с аминокислотными остатками.: Дисс. Канд. Хим. Наук.- Ташкент, 1987.-167 с.

114. Baritaki S., Krambovitis E., Alifragis J., Rizos A.K., Shtilman M.I., Tsatsakis A.M. Immunoreactivity and light scattering studies of polyvinylpyrrolidone polymeric derivatives. // J.Non-Cryst.Solids., 2002, V.307, P.898-901.

115. Rizos A.K., Doetchman D.C., Dwer D.W., Tsatsakis A.M., Shtilman M.I. Study of dichlophenac polymeric derivatives with a 12-doxyl spin probe. //Polymer, 2000, V.41, P.l 131-1138.

116. Rizos A.K., Tsatsakis A.M., Shtilman M.I., Brown W. Dynamic light scattering study of 1-naphylacetic acid polymeric derivatives. // Noncryst.Solids, 1998, V.235-237, P.652-657.

117. Rizos A.K., Tsatsakis A.M., Shtilman M.I., Brown W. Dynamic light scattering study of 1-naphylacetic acid polymeric derivative? A novel plant hormone. // Polymer, 1998, V.39, N 39, P.4729-4734.

118. Rizos A.K., Tsatsakis A.M., Shtilman M.I., Brown W. Dynamic light scattering study of indolbutyric acid polymeric derivative. // Polymer, 1998, V.39, N8-9, 1753-1756.

119. Rizos A.K., Tsatsakis A.M., Shtilman M.I., Doetchnam D.C. Dynamics of self-release polymeric derivatives. // ABS Papers Am.Chem.Soc., 1999, V.218, P.14-15.

120. Jakes J. Regulatized positive exponential sum (REPES) program A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. // Collection of Czechoslovak chemical communications. 1995, V.60, P.1781-1797.

121. Eisele M., Burchard W. Slow mode diffusion of poly(vinyl pyrrolidone) in semidilute regime. // Macromolecules, 1984, V.17, P.1636-1638.

122. Kivelson D., Neiman R. //J.Chem.Phys., 1961, V.35, N.l, P.149-152.

123. Sartori R., Rencoret G., Rencoret G., Mora A., Perez C., Pastene R., Sariego R., Moya S.A. The novel use of Rh(I) complexes with naphthyridine ligands and poly(oxyethylene) as antitumorals.//Anticancer Drugs., 1996, Vol.7, N.l, P.87-92.

124. Mustafaev M.I., Norimov A.Sh. Polymer-metal complexes of protein antigens-new highly effective immunogens.// Biomed Sci., 1990, Vol.1, N.3, P.274-282.

125. Яцимирский К.Б. Введение в бионеорганическую химию.-Киев:Наук.думка.-1976.-143 с.

126. Metal ions in biological systems: Vol.14. /Ed. H.Sigel, Dekker: New-York.- Basel, 1983.

127. Гар Т.К., Миронов В.Ф. Биологическая активность соединений германия.-М.: НИИТЭХИМ, 1982.-45 с.

128. Biederman H.G., Graf W. Metallkomplexe mit polymeren liganden. V. Ubergangsmetallkomplexe mit poly-l-vinyl-pyrrolidinon.// Z.Naturforsh.-1974, Vol. 286, S.65-67. (164)

129. Рашидова С.Ш., Ли B.A., Ким A.A Способ получения полимерных комплексов переходных металлов.// Патент № 2756826 (1981), Заявл. 18.04.79.

130. Nakamoto К., Morimoto Y., Martell А.Е. Ifrared spectra of aqueous solutions. II. Metal chelate compounds of amino acids.// J. Amer. Chem. Soc., 1961, Vol. 83, № 20, P.4528-4532.

131. Нейдинг А.Б. Магнетохимия.-М.: ВИНИТИ, 1970.-269 с.

132. Takenaka A., Oshima Е., Yamada S., Watanabe Т. Crystal structures of copper (II) complexes with amino acids.//Acta Cryst., 1973, Vol.B 29, P.503-514.

133. Маров И.Н., Костромина H.A. ЭПР и ЯМР координационных соединений.-М.: Наука, 1979.-268 с.

134. Семенов А.Д., Залетов В.Г., Семенова И.М. Спектры ЭПР и характеристика связи металл-лиганд комплексов меди (II) с некоторыми аминокислотами. // Теор. и эксперим.хим., 1969, Т.5, №4, С.523-528.

135. Marinsky J.A. // Coord. Chem. Rev., 1976, V.19, РЛ25-129.

136. Imai N., Marinsky J.A., Macromolecules, 1980, V.13, P.275-279.

137. Пршибил P. Комплексоны в химическом анализе.-M.: Изд-во иностр. Литер., 1985.-187 с.

138. Яцимирский К.Б. Константы устойчивости комплексов металлов с биолигандами.//Справочник.-Киев.: Наукова думка, 1979.-228 с.

139. Бектуров Е.А., Бимендина П.А., Кудайбергинов С.Е. Полимерные комплексы и катализаторы.-Алма-Ата: Наука, 1982.-192 с.216

140. Raditsch M., Witzemann V. PVP-containing solutions for analysis of divalent cation-dependent NMDA responses in Xenopus oocytes. FEBS Lett. 1994, V.354, P. 177-182.

141. Gaballo A., Zanotti F., Raho G., Papa S. Disulfide cross-linking of subunits F(l)-gamma and F(0)I-PVP(b) results in asymmetric effects on proton translocation in the mitochondrial ATP synthase. // FEBS Lett.,1999, V.463,P.7-11.

142. Tzatzarakis M, Tzatzarakis AM, Lotter M, Shtilman MI, Vakalounakis DJ. Effect of novel water soluble polimeric forms of sorbic acid against Fusarium oxysporum f.sp.radicis-cucumerinum.// Food Add. Contam.,2000, V.17, P.965-971.I

143. Risbud M, Bhonde M, Bhonde R. Chitosan-polyvinylpyrrolidone hydrogel does not activate macrophages: potentials for transplantation applications. // Cell Transplant., 2001, V.10, P.195-202.

144. Шустов В.Я. Микроэлементы в гематологии// M., Медицина, 1967, 157 с.217

145. Ноздрюхина Jl.В. Биологическая роль микроэлементов в организме животных и человека. М., Наука, 1977. 211 с.

146. Davydova S.L., Plate N.A. Problems of complex formation with macromolecular ligands // Coord.Chem.Rev., 1975, V.16, № 3, p. 195225.

147. Tsuchida E., Nishide H., Polymer-metal complexis and their catalytic activity // Add.Polym.Sci., 1977, V.24, P.l-87.

148. Ташмухамедов Р.И., Ли B.A., Мусин Р.И., Туляганов Р.Т., Рашидова С.Ш., Штильман М.И. Синтез и свойства комплексов металлов переходного ряда и полимеров с аминокислотными остатками // Хим.-фрам.журнал, 1989, №12, С.1447-1450.

149. V.A.Lee, R.I.Musin, R.I.Tashmukhamedov, M.I.Shtilman, S.Sh.Rashidova. Metal complexes of polymers with amino acid residues. Formation, stability and controlled biological activity // J. Controlled Release, 1990, V.14, P.61-70.

150. Ли В.А., Разиков P.K., Ташмухамедов Р.И., Батырбеков А.А., Муратходжаев Ф.Н. Иммунологические свойства металлокомплексов сополимеров винилпирролидона с аминокислотными остатками в боковой цепи. // Иммунология, 1997, № 1, С.35-37.

151. Рашидова С.Ш., Хаитов P.M., Батырбеков А.А., Ходжаев С.Г. Регуляция гемо- и иммуногенеза низко- и макромолекулярными металлокомплексами // Иммунология, 1984, № 1, с.50-53.

152. Рашидова С.Ш., Ходжаев С.Г., Хаитов P.M., Батырбеков А.А., Рафиков Р.З., Ташев М.Ш. В кн. «Синтез, свойства и применение полимеров на основе N-виниллактамов», Ташкент: Фан, 1990, С.210-226.

153. Borrebeack СА. Strategy for the production of human monoclonal antibodies using in vitro activated В cells // J.Immunol Methods 1989; V.123, P.157-165.218

154. Zafiropoulos A., Andersson E., Krambovitis E., Borrebaeck C.A. Induction of antigen-specific isotype switching by in vitro immunization of human naive В lymphocytes // J.Immunol.Meth., 1997, V.200, P. 181190.

155. Zafiropoulos A, Kandilogiannaki M, Dahlenbord C, Borrebaeck С A, Krambovitis E. In vitro induction of somatic mutations in human peripheral В lymphocytes // Int. J. Mol Med 2000; V.6, P.475-484.

156. Fujieda S, Zhang K, Saxon A. IL-4 plus CD40 monoclonal antibody induces human В cells gamma subclass-specific isotype switch: Switching to gamma 1, gamma 3, and gamma 4, but not gamma 2. // J. Immunol 1995, V.155, P.2318-2328.

157. Baritaki S, Zafiropoulos A, Georgopoulos E, Souris S, Krambovitis E. Generation of human anti-MUC3 Ig G antibodies after in vitro immunization of naive peripheral blood B-lymphocytes // Cancer Immunol. Immunother., 2001, V.50, P. 109-114.

158. Петров P.B., Хаитов P.M. Н Журн.микробиол., 1982, №12, c.22-25.

159. Петров P.B., Хаитов P.M., Атауллаханов Р.И. Иммуногенетика и искусственные антигены. М., Медицина, 1983. 255 с.

160. Jerne N.K., Nordin А.А. II Science, 1963, V.40, Р.405-407.

161. Прегер С.М. Микроэлементы и иммунологическая реактивность организма. Томск: изд.Томск.гос.ун-та, 1979. 166 с.238. .Эндоцитоз и экзоцитоз. М.: Изд.МГУ, 199.

162. Nishiyama, N., Kato Y., Sugiyama Y., Kataoka K. Cisplatin-loaded polymer-metal complex micelle with time-modulated decaying property as a novel drug delivery system. // Pharmaceutical Research, 2001, Y.18, N.7, p. 1035-1041.