Амфифильные полимеры N-винилпирролидона тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

КУСКОВ АНДРЕЙ НИКОЛАЕВИЧ Амфифильные полимеры 1Ч-винилпирролндона

Специальность: 02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

003067022

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете имени Д.И.Менделеева

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

Паписов Иван Михаилович

доктор химических наук, профессор Гроздов Александр Григорьевич

Ведущая организация

Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН

Зашита состоится «24» января 2007 г. в 14— на заседании диссертационного совета Д 212.204.01 и Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева (125047 Москва, Миусская площадь, д.9.) в ауд. 443.

С диссертацией молено ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева

Автореферат диссертации разослан «19 » декабря 2006 г.

А

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.204.01, доцент, кандидат технических наук

Л.Ф. Клабукова

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Создание новых высокоэффективных наноразмерных систем доставки биологически активных веществ (БАВ) является одной из важнейших задач современной химии. Наиболее актуальным и перспективным представляется использование для создания таких систем доставки БАВ последних достижений макромолекулярной химии в области разработки биосовместимых синтетических полимерных систем, обладающих различными функциональными характеристиками. В первую очередь это относится к таким системам доставки, как полимерные наночастицы на основе амфифильных полимеров и модифицированные амфифильными полимерами липосомы, обладающие повышенной стабильностью. Известно, что амфифильные полимеры за счет наличия в их молекулах гидрофильных и гидрофобных фрагментов способны формировать самоорганизующиеся структуры или встраиваться в липосомальные мембраны. Полимерные наноносители на основе амфифильных полимеров вызывают все возрастающий интерес в фармакологии, так как они представляют один из видов терапевтических систем, способных транспортировать лекарственное вещество внутрь клеток. При циркуляции таких носителей содержащееся в них биологически активное вещество защищено от инактивации, а действие лекарственного препарата пролонгируется. Кроме того, преимуществами таких систем являются их быстрое и воспроизводимое получение в больших количествах, возможность включения в полимерные наноразмерные носители плохорастворимых в воде веществ и регулирования накопления полученных препаратов в различных органах и тканях организма в зависимости от размера и свойств частиц. В этой связи, очевидно, что разработка и исследование новых амфифильных полимеров и систем доставки БАВ на основе этих полимеров являются актуальным и перспективным направлением современной полимерной химии, биотехнологии и медицины.

Цели и задачи исследования. Данная работа направлена на разработку новых амфифильных полимеров М-винилпирролидона (ВП), содержащих гидрофильные и гидрофобные фрагменты различного строения, и на создание новых высокоэффективных наносистем для доставки БАВ на основе таких амфифильных полимеров. В работе были поставлены следующие задачи:

1) получение и исследование свойств амфифильных полимеров М-винилпирролидона разной молекулярной массы, содержащих одну концевую алифатическую группу различного строения;

2) разработка методов получения и исследование свойств полимерных наночастиц и липосом. модифицированных амфифильными полимерами;

3) получение и изучение строения и свойств полимерных наночастиц и полимер-модифицированных липосом, содержащих включенные биологически активные вещества;

4) исследование взаимодействия синтезированных амфифильных полимеров М-винилпирролидона с компонентами крови.

Научная новизна. В работе впервые получен ряд новых амфифильных производных поли-М-иинилпирролидона (ПВП), состоящих из гидрофильного фрагмента полимера разной молекулярной массы и одной концевой гидрофобной группы различного строения.

Впервые получены и охарактеризованы наночастицы на основе амфифильных производных поли-М-винилпирролидона и модифицированные амфифильными полимерами липосомы. Исследование полученных частиц с использованием ЯМР спектроскопии высокого разрешения, электронной микроскопии и динамического светорассеяния привели к выводу о том, что наночастицы из амфифильного ПВП представляют собой наноразмерные сферические агрегаты.

Установлено что модификация липосомальных мембран амфифильными полимерами М-винилпирролидона ведет к увеличению стабильности

модифицированных липосом против воздействия различных дестабилизирующих факторов.

Показано, что наноносители на основе синтезированных амфифильных полимеров способны с высокой эффективностью включать БАВ различной природы. Впервые были получены полимерные наночастицы, содержащие соевый ингибитор протеиназ типа Баумана-Бирк (BBI) и его гидрофобизованные производные (препараты белковой природы, обладающие противовоспалительным и антиканцерогенным действием), и липосомы, модифицированные амфифильными полимерами N-винилпирролидона, содержащие противогрибковые антибиотики нистатин и амфотерицин В.

Проведено изучение влияния полученных амфифильных полимеров на реологические свойства крови, на эритроциты крови и на систему комплемента сыворотки крови. Выявлено отсутствие активации системы комплемента, лизиса эритроцитов и изменения различных реологических свойств крови в присутствии амфифильных производных ПВП.

Практическая значимость. Показана перспективность использования синтезированных амфифильных полимеров N-винилпирролидона для создания наноразмерных носителей БАВ. Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что наночастицы из амфифильных производных ПВП и модифицированные такими полимерами липосомы можно использовать в качестве высокоэффективных и безвредных систем доставки различных БАВ, как низкомолекулярных, так и белкового типа, в том числе плохо растворимых в воде.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006), 33rd Annual Meeting & Exposition of the Controlled Release Society (Vienna, Austria, 2006), European Polymer Congress (Moscow, 2005), Всероссийской конференции инновационных проектов аспирантов и студентов «Индустрия наносистем и материалы» (Зеленоград, 2005), III Московском международном

конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы» (Москва, 2005), European Material Research Society Fall Meeting (Warsaw, Poland, 2004), 6th International Conference "Liposome Advances: Progress in Drug and Vaccine Delivery" (London, UK, 2003), IXth International Symposium on Biomedical Science and Technology "Biomed 2002" (Kemer, Antalya, Turkey, 2002).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 32 печатных работах, в том числе, 7 статьях в журналах и сборниках и 25 тезисах докладов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 166 страницах, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы; содержит 13 таблиц, 56 рисунков, 103 библиографические ссылки.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Получение и исследование строении и основных свойств амфифильных полимеров N-винилпирролидона

В работе новые амфифильные полимеры N-винилпирролидона получали двухстадийным методом. На первой стадии для получения полимеров N-винилпирролидона с регулируемым значением молекулярной массы, содержащих концевые функциональные группы, проводили радикальную полимеризацию мономера в присутствии инициатора - динитрила азоизомасляной кислоты (ДАК) и функционального передатчика цепи (регулятора роста цепи) — меркаптана. В качестве регулятора роста цепи использовали меркаптоуксусную кислоту (МУК), меркаптопропионовую кислоту (МПК) и 2-меркаптоэтиламин (МЭА).

Изучение кинетики полимеризации ВП в присутствии функциональных меркаптанов показало, что в данном случае имеет место взаимодействие меркаптанов с первичными радикалами, образующимися при распаде инициатора (ДАК), приводящее к повышению эффективности инициирования полимеризации. При этом радикал меркаптана, образующийся в результате отрыва атома водорода от SH- группы инициирует рост цепи полимера,

заканчивающийся передачей цепи на меркаптан (отрывом макрорадикалом атома водорода от 8Н- группы другой молекулы меркаптана), с образованием радикала меркаптана, инициирующего возникновение новой полимерной цепи.

На рис. 1 представлены зависимости количества выделяемого из реакционной смеси полимера (А) и среднечисловой молекулярной массы Мп (Б) поли-М-винилпирролидона от количества введенного в реакцию меркаптана.

100 -, 16 >

Рис. 1. Влияние количества введенного меркаптана [Б] (1 - МУК, 2 - МПК, 3 - МЭА) на выход выделяемого из реакционной смеси ПВП (А) и его

среднечисловую молекулярную массу (Б) ПВП. [ВП] = 25 % вес.; [ДАК] = 1 % вес.; Т = 343 К; растворитель - диоксан

Полученные результаты показывают, что при введении в реакционную смесь небольшого количества меркаптанов могут быть получены с достаточно высоким выходом низкомолекулярные полимеры с молекулярными массами, требуемыми для создания на их основе наноразмерных систем доставки БАВ (М„= 1500-15000).

При этом активность исследованных меркаптанов как регуляторов роста и передатчиков цепи уменьшается в следующей последовательности:

В результате проведенной радикальной полимеризации ВП в присутствии инициатора (ДАК) и регулятора роста цепи (МУК, МПК или МЭА) были получены серии полимеров с различными (контролируемыми) значениями

О 0,05 0.1 0,15 0,2

[8], моль/моль мономера

0 т-----1---п-10 0,05 0,1 0,15 0,2 [8], моль/моль мономера

Ш-СНг-СООН > Ш-СНг-СНг-СООН > Н8-СН2-СН21ЧН2

молекулярной массы, содержащие одну концевую функциональную группу, входящую в состав меркаптана (карбоксильную или аминную).

Реакции полимеризации ВП для каждого из меркаптосоединений могут быть представлены в общем виде следующим образом:

п СН2—СН

I

н;;-сн2-соон ДАК

СУ

Н

-Г- сн-снД-8-сн2-соон

СУ

(1)

Н5-С:Н2-СН2-СООН Т ДАК

¿у» ¿у.

пСН2=(^Н Н'Р-(|:Н-СН2-р-8-СН2-СН2-СООН (2)

п СН2=СН

НБСН;—СН2~КН2 ДАК

СУ

Н-[—^Н-СН2-]-8-СН2-СН2-КН2 (3)

а*0

То, что все полученные полимеры содержали одну концевую функциональную группу, было подтверждено соответствием молекулярных масс полимеров, определенных по содержанию в них концевых функциональных групп методом потенциометрического титрования, и, альтернативно методом паровой осмометрии.

На второй стадии процесса введение в полученные полимеры концевой гидрофобной группы проводили обработкой карбоксилсодержащих полимеров, карбоксильная группа которых была активирована

НЫ'-дициклогексилкарбодиимидом (ДЦГК), длинноцепными первичными или вторичными алифатическими аминами различного строения (н-гексиламин, н-октиламин, н-додециламин, н-гексадециламин, н-октадециламин, ди(н-гексил)амин, ди(н-октил)амин, ди(н-октадецил)амин, с образованием Ы,1чР-дициклогексилмочевины (ДЦГМ).

Схема получения амфифильных производных из синтезированных полимеров М-винилпирролидона, содержащих концевую карбоксильную группу, может быть представлена следующим образом:

ДЦГК

Г -| -О НгЫЧСН^СНз г -1 V

И ^ ОН "ДЦГМ Ч Л

¿у (уо

ДЦГК /(СН2)М СНз

Жх О

Г -1 ,0 (СНгкСНз г -| V ДСН^СНз

н-сн СИ2 | 5-СН2 С --- - -——» НчСНСН,--;^ СН2 С"М

ч ^ ОН -ДЦГМ -Т "(СН^СНЗ

где т = 5, 7, И, 15 или 17, в зависимости от используемого для модификации первичного или вторичного амина.

Аминосодержащие семителехелевые полимеры для получения амфифильных производных обрабатывали хлораншдридами длинноцепных алифатических кислот (лауриновой, пальмитиновой, стеариновой, арахиновой и бегеновой) с выделением хлористого водорода. Общая схема модификации полимеров, содержащих концевую аминогруппу для получения их амфифильных производных, может быть представлена следующим образом:

9

С1-С-(СН2)ЙСН3 ^ н Рсн-СН215-(СН2)2-"ЫН2 К(С2-Н5)з-» н^н-сн^чсн^-кн ¿-(аУй-СИз

I - на т п

г"

сг с

где ш = 10, 14, 16, 18 или 20 в зависимости от используемой для получения амфифильного полимера алифатической карбоновой кислоты.

Таким образом, путем модификации полимеров М-винилпирролидона различной молекулярной массы, содержащих одну концевую карбоксильную

или аминную группу, их взаимодействием с длинноцепными алифатическими аминами или хлорангидридами алифатических кислот соответственно, были получены амфифильные полимеры, содержащие в качестве гидрофильного фрагмента водорастворимый поли-Ьт-винилпирролидок разной молекулярной массы (Мп=1500+14000), а в качестве гидрофобного фрагмента длинноцепной первичный (С^Сгг) или вторичный ((Сб)2^(С)8)2) радикал.

Строение синтезированных амфифильных полимеров было подтверждено методами ИК-спектроскопии и ЯМР спектроскопии высокого разрешения на ядрах 13С и !Н (400 МГц).

Для каждого из полученных образцов амфифильного ПВП определены значения критической концентрации агрегации (ККА) методом, основанным на солюбилизации водонерастворимого флуоресцентного красителя (пирена); полученные значения для всех амфифильных полимеров находятся в

микромолярном диапазоне (таблица 1).

Таблица 1

Значения ККА для амфифильных полимеров ВП.

Строение полимера Молекулярная масса полимерного фрагмента Код полимера Критическая концентрация агрегации, микромоль/л

ПВП-Б-СНг-СОШ-С 18Н37 1500 ПВП-ОД 1500 4,0

ПВП-Э-СНг-СОХН-С] 8Н37 2000 ПВП-ОД 2000 5,3

ПВЛ-Б-СНг-СОКН-СиНз? 2600 ПВП-ОД 2600 5,8

таП-в-СНг-СОШ-С! ?Н37 3300 ПВП-ОД 3300 6,5

ПВП-8-СН2-СОШ-СПН37 4000 ПВП-ОД 4000 7,3

ПВП-8-СН2-СОШ-С1 ?Н37 6500 ПВП-ОД 6500 9,4

ПВП-8-СН2-СОШ-С15НЗЗ 4000 ПВП-ГД 4000 15,4

ПВП-З-СНз-СОШ-СггНгз 4000 ПВП-ДЦ 4000 18,5

ПВП-8-СН2-СОМН-С8Нп 4000 ПВП-Окт 4000 22,1

ПВП-8-СН2-СОШ-С(Н13 4000 ПВП-Гек 4000 -

ПВП-8-СН2-СОК-(С6Н1З)2 4000 ПВП-Гек2 4000 12,1

ПВП-З-СНг-СОЩСвНиЬ 4000 ПВП-Окт2 4000 14,0

ПВП-8-СН2-СОХ-(С18Нз7)2 4000 ПВП-ОД: 4000 25,2

2.2. Полимерные наночастицы: получение и свойства

Наночастицы из синтезированных амфифильных полимеров ВП (таблица 1) были получены с использованием методов прямого растворения, диализа и эмульсионного метода. Визуализация полученных частиц при помощи трансмиссионной электронной микроскопии показало, что они представляют собой в водных системах образования, близкие к сферическим.

Размер образующихся наночастиц определяли методом динамического светорассеяния. Размер частиц, полученных из амфифильных полимеров ВП, при концентрациях полимера, близких к значению его критической концентрации агрегации (30-50 нм) совпадает с рассчитанным для этих полимеров теоретическим размером мицелл. Дальнейшее увеличение концентрации полимера в растворе до концентраций, в несколько раз превышающих ККА, ведет к слипанию и агрегации мицеллярных наночастиц с образованием более крупных (до 500-800 нм) сферических агрегатов.

Данные электронной микроскопии вместе с результатами динамического светорассеяния показали, что средний размер всех наночастиц, полученных методом диализа и эмульсионным методом, был меньше среднего размера наночастиц, полученных прямым растворением полимеров. При этом для наночастиц, полученных эмульсионным методом, характерно более узкое распределение по размерам, а на процессы самосборки амфифильных молекул существенное влияние оказывают свойства растворителей (полярность и ионная сила раствора).

Наибольший практический интерес представляет эмульсионный метод получения наночастиц, позволяющий более легко варьировать свойства наночастиц. Кроме того, этот метод применим к более широкому кругу полимерных молекул, обладающих как слабо, так и сильно выраженными гидрофобными свойствами.

2.3. Липосомы, модифицированные амфифильными полимерами ВП: получение и свойства

Как было установлено, гидрофобные группы полученных амфифильных полимеров в водных растворах доступны для взаимодействия с гидрофобными фрагментами других молекул, находящихся в системе, в том числе с молекулами липидов, образующими липосомальную мембрану. В данном случае модификацию липосомальных мембран амфифильными производными ПВП проводили одновременно с формированием липосом. Для этого в исходную смесь липосом-формирующих липидов (фосфатидилхолин и кардиолипин) добавляли разные количества амфифильных полимеров.

Проведенные исследования устойчивости модифицированных амфифильными полимерами ВП липосом под действием различных разрушающих факторов (детергенты, поликатионы, спиртовые растворы, ультразвуковое воздействие) подтвердили повышенную стабильность Модифицированных липосом.

Эффективность защиты липосом можно контролировать, изменяя молекулярную массу модифицирующего амфифильного ПВП и его содержание в липосомальной мембране. При этом было установлено, что существует определенное оптимальное соотношение размеров гидрофильных и гидрофобных фрагментов молекул модифицирующего амфифильного полимера. Наибольший защитный эффект удалось получить для амфифильных полимеров ВП с молекулярной массой М„=2500^-5000 и содержанием полимера в липосомальной мембране 10-45 мольных %.

Проведенные научной группой под руководством профессора В.П. Торчилина в Northeastern University (Бостон, США) биологические испытания полимер-модифицированных липосом на животных (белые линейные мыши) показали, что модификация липосом на основе фосфатидилхолина и холестерина амфифильным ПВП повышает

продолжительность циркулирования липосом в кровеносном русле и снижает их захватываемость клетками ретикуло-эндотелиальной системы.

2.4. Полимерные наночастицы с включенными БАВ

В работе были получены полимерные наночастицы с включенным соевым ингибитором протеиназ типа Баумана-Бирк (BBI) или его гидрофобизованньми производными, содержащими один (Оле-BBI) или два (Оле2-ВВ1) олеоильных остатка. При этом удалось получить высокий процент включения препаратов BBI в полимерные наночастицы (до 95 %). Увеличение содержания BBI в растворе ведет к уменьшению размера образующихся частиц.

Методом трансмиссионной электронной микроскопии было показано, что образующиеся частицы имеют сферическую форму. Следует отметить, что в отличие от нативного BBI, его производные Оле-BBI и Оле2-ВВ1 инициируют образование агрегатов при очень низких концентрациях амфифильных полимеров в воде. Оба гидрофобизованных производных BBI также уменьшают средний размер образующихся частиц.

Совместно с научной группой профессора Н.И. Ларионовой в МГУ им. М.В. Ломоносова было проведено исследование влияния низких значений рН раствора на сохранение активности белков BBI, включенных в полимерные наночастицы. Полученные результаты показывают, что включение белка в полимерные наночастицы защищает его от инактивации.

2.5. Модифицированные амфифильными полимерами липосомы с включенными БАВ

В работе в качестве объектов для включения в липосомы, модифицированные амфифильными производными ПВП, и обладающими повышенной стабильностью, были использованы антифунгальные антибиотики нистатин и амфотерицин В. Липосомы для их иммобилизации формировали из смеси фосфатидилхолин/холестерин. Модификацию липосомальных мембран и включение в липосомы фунгицидов осуществляли одновременно с

формированием липосом (работы проводили совместно с лабораторией профессора И. А. Ямско ва в ИНЭОС им. А.Н. Несмеянова РАН).

Методами динамического светорассеяния и трансмиссионной электронной микроскопии было установлено, что образующиеся модифицированные липосомы с включенными фунгицидами имеют сферическую форму, узкое распределение по размерам, и средний диаметр 150+250 нм. Повышение содержания амфифильного полимера в липосомах с 3 до 10 мольных процентов значительно увеличивало стабильность модифицированных амфифильными полимерами липосом.

Путем повышения концентрации нистатина и амфотерицина В в исходной смеси при формировании липосом, удалось получить модифицированные липосомы, содержащие до 20 весовых % включенного антибиотика. При этом выходы по антибиотику составляли до 75 %.

Противогрибковую активность новых липосомальных форм нистатина и амфотерицина В определяли с использованием агаровой среды, по отношению к культуре гриба Ригапит охуврогит ВКМР-26040/0603. Исследование антифунгальной активности полученных липосомальных препаратов показало, что липосомы с антибиотиками, модифицированные амфифильными производными ПВП, обладали более высокой активностью по сравнению с неиммобилизованными антибиотиками при значительно большей устойчивости препаратов по отношению к немодифицированным липосомальным системам.

2.6. Взаимодействие амфифильных полимеров ВП с компонентами крови

: Научными группами под руководством Н.И. Ларионовой (в МГУ им. МЛЗ. Ломоносова) и Н.А. Горбуновой (в Гематологическом научном центре РАМН) были проведены исследования по изучению взаимодействия синтезированных амфифильных полимеров ВП с компонентами крови.

С- помощью пиреновой метки было установлено, что полимерные наночастицы на основе амфифильных ПВП были стабильны в присутствии

сыворотки крови человека. Были проведены тесты по прямому литическому действию амфифильных полимеров ВП различного строения на эритроциты человека. Было определено, что полимеры с молекулярной массой 1500+5000 не лизируют эритроциты крови.

Также изучена активация системы комплемента в присутствии амфифильных полимеров ВП. Выявленное отсутствие воздействия амфифильных полимеров ВП на активацию системы комплемента доказывает то, что исследованные полимеры не инициируют каскады комплемента и не уменьшают литический потенциал системы. Проведены исследования влияния полученных амфифильных полимеров ВП на реологические свойства крови доноров. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что все исследованные образцы амфифильных полимеров ВП, в концентрациях, соответствующих дозам возможного инъекционного введения в организм человека, не влияют на реологические свойства крови. Эти исследования подтверждают биосовместимость полученных амфифильных полимеров.

3. ВЫВОДЫ

1. Путём проведения радикальной полимеризации Ы-винилпирролидона в присутствии меркаптанов, содержащих дополнительную функциональную группу, с последующим введением концевого длинноцепного алифатического радикала, синтезированы биологически совместимые амфифильные полимеры, содержащие одну концевую гидрофобную группу и способные к образованию агрегатов и модификации липосомальных мембран с получением наноразмерных систем доставки лекарственных веществ.

2. Выявлены условия проведения реакций, позволяющие получить амфифильные полимеры М-винилпирролидона, содержащие в качестве гидрофильного фрагмента поли-М-винилпирролидон с заданными величинами молекулярной массы в диапазоне Мп=1500+15000, а в качестве концевого гидрофобного фрагмента длинноцепной первичный (С6 + С22) или

вторичный ((Сб)2 - (С ]8)2) алифатический радикал. Показана возможность введения в полученные амфифильные полимеры дополнительных альдегидных групп сополимеризацией Ы-винилпирролидона с п-аллилоксибензальдегидом.

3. Показано, что полученные амфифильные полимеры образуют в водных системах сферические агрегаты с размерами от десятков до сотен нанометров 6 зависимости от строения полимера и способа получения наночастиц. При этом установлено, что значение критической концентрации образования агрегатов уменьшается с уменьшением молекулярной массы полимерного фрагмента и увеличением длины гидрофобной концевой группы. Сравнение -методов получения наночастиц (метод прямого растворения, диализный и эмульсионный методы) показало, что частицы полученные диализным и эмульсионным методом имеют меньший размер и более узкое распределение по размерам.

4. Показано, что амфифильные поли-Ы-винилпирролидоны способны к встраиванию в мембраны липосом, повышая их устойчивость к действию разрушающих факторов (ультразвука, детергентов и поликатионов, спиртовых растворов). Модификация липосом амфифильными полимерами И-винилпирролидона увеличивают время циркуляции липосом в крови, и уменьшают их захват печенью (опыты на животных).

5. Установлено, что включение в наночастицы на основе амфифильных полимеров М-винилпирролидона соевого ингибитора протеиназ типа Баумана-Бирк и его гидрофобизованных производных повышает их растворимость в воде и устойчивость к инактивации.

6. Показано, что липосомы, модифицированные амфифильными полимерами № винилпирролидона, с включенными противогрибковыми антибиотиками нистатином и амфотерицином В, обладают более высокой антифунгальной активностью чем неиммобилизованные антибиотики и повышенной

стабильностью по сравнению с ^модифицированными липосомальными препаратами.

7. Исследование взаимодействия синтезированных амфифильных полимеров N-винилпирролидона с компонентами крови показало отсутствие их влияния на систему комплемента сыворотки крови и эритроциты. Введение полимеров в кровь не влияет на ее различные реологические свойства.

4. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кусков А.Н.. Штильман М.И., Тсатсакис А.М., Торчилин В.П., Ямсков И.А. Синтез амфифильных полимеров N-винилпирролидона и акриламида различного строения. // Журнал прикладной химии, 2005, т. 78(5), с. 822-826.

2. Виллемсон А.Л., Кусков А.Н.. Штильман М.И., Галебская Л.В., Рюмина Е.В., Ларионова Н.И. Взаимодействие полимерных агрегатов стеароил-поли-М-винилпирролидона с компонентами крови. // Биохимия,

2004, т. 69(6), с. 765-773.

3. Штильман М.И., Кусков А.Н., АртюховА.А., Тсатсакис A.M. Полимеры медико-биологического назначения и биоматериалы на их основе: проблемы и перспективы. // Полимеры и медицина, 2005, т. 1, с. 25-31.

4. Кусков А.Н. Новые наноразмерные полимерные носители биологически активных веществ. // Всероссийская конференция инновационных проектов аспирантов и студентов «Индустрия наносистем и материалы», Зеленоград,

2005, с. 105-108.

5. Кусков А.Н., Виллемсон А.Л., Ташмухамедов Р.И., Штильман М.И. Амфифильные производные поли-М-винштпирролидона и их взаимодействие с компонентами крови. // Успехи в химии и химической технологии, 2005, т. 19, №6(54), с. 71-72.

6. Kuskov A.N.. Tashmuhamedov R.I., Villemson A.L., Shtilman M.I., Larionova N.I., Tsatsakis A.M., Yamskov I.A. Polymeric nano-scaled carriers for creation of new drug delivery systems. // International conference "New polymer systems for biotechnological and biomedical applications", Yerevan, Armenia, 2005, p. 92-103.

7. Kuskov A.N.. Shtilman M.I., Goryachaya A.V., Tsatsakis A.M., Torchilin V.P. Amphophilic poly-N-vinylpyrrolidones - promising basis for novel drug delivery systems. // Cellular & Molecular Biology Letters Supplement, 2005, v. 10, p. 83.

8. Кусков A.H.. Горячая A.B., Штильман М.И. Микроагрегаты на основе амфифильных полимеров N-винилпирролидона. // Успехи в химии и химической технологии, 2004, т. 18, №2(42), с. 37-41.

9. Кусков А.Н., Виллемсон A.JL, Нуцков В.В., Штильман М.И. Амфифильные полимеры N-винилпирролидона. Поведение в водных растворах. Модификация липосом. // Успехи в химии и химической технологии, 2003, т. 17, №5(30), с. 91-98.

10. Shtilman М., Kuskov A., Villemson A., Larionova N. Novel polymeric nanoparticles loaded with model proteins. // 33rd Annual Meeting & Exposition of the Controlled Release Society, Vienna, Austria, 2006, p. 455-456.

11. Shtilman M., Kuskov A.. Tsatsakis A. Self-Assembly of hydrophobically a-end-capped poly-N-vinylpyrrolidones in aqueous solutions. // 33rd Annual Meeting & Exposition of the Controlled Release Society, Vienna, Austria, 2006, p. 931-932.

12. Кусков A.H. Полимерные наночастицы и новые системы доставки плохорастворимых лекарственных веществ на их основе. // Международная конференция «Биотехнология и медицина», Москва, 2006, с. 29.

13. Кусков А.Н.. Штильман М.И., Виллемсон А.Л., Тсатсакис A.M., Торчилин В.П., ЯмсковИ.А., Ларионова Н.И. Амфифильные полимеры N-винилпирролидона - новые носители лекарственных препаратов. // Третий Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005, с. 47-48.

14. Shtilman M.I., ..Torchilin V.P., Tsatsakis A.M., Kuskov A.N.. YamskovI.A. Biomaterials: problems and development of the industry. // 7th International Seminar "Scientific advances in chemistry: Heterocycles, Catalysis, and Polymers as Driving Forces", Yekaterinburg, Russia, 2004, p. 22.

15. Shtilman M.I., Kuskov A.N., Tsatsakis A.M., Tzatzarakis M.N., YamskovI.A., Torchilin V.P. Poly-N-vinylpyrrolidone amphiphilic derivatives: microaggregates forming. // European Material Research Society Fall Meeting, Warsaw, Poland, 2004, p. 78.

16. Shtilman M.I., Babievsky K.K., BerezinB.B., Krajukhina M.A., Kuskov A.N.. SamoilovaN.A., TikhonovV.E., YamskovI.A. Synthesis of immobilized fungicides with optimal properties. // International conference "Modern Trends of Organoelement and Polymer Chemistry", Moscow, 2004, P107.

17. Shtilman M.I., Kuskov A.N.. Villemson A.L., Galebskaya L.V., Tsatsakis A.M., Larionova N.I., YamskovI.A., Torchilin V.P. Amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidone: aggregation in water solution and interaction with blood components. // 6lh International conference "Liposome Advances: Progress in Drug and Vaccine Delivery", London, UK, 2003, p. 127.

18. Kuskov A.N.. Shtilman M.I.. Torchilin V.P., Tsatsakis A.M., Sharipova E.I. Amphiphilic derivatives of poly-N-vinylpyrrolidone - new biomaterials for liposome membrane modification. // IXth International Symposium on Biomedical Science and Technology "Biomed 2002", Kemer-Antalya, Turkey, 2002, O-ll.

19. Кусков А.Н., Виллемсон A.JI., Ларионова Н.И., Штильман М.И. Влияние молекулярной массы на самоорганизацию амфифильных производных поли-И-винилпирролидона. // Успехи в химии и химической технологии, 2002, т. 16, №3(20), с. 57.

20. Sharipova E.I., MalihE.V., Kuskov A.N.. VillemsonA.L., LarionovaN.I., Shtilman M.I., Torchilin V.P. Амфифильные поли-Ы-винилпирролидоны. Самоорганизация в водных растворах. // XV Konferencja naukowa "Modifikacja polimerow", Wroclaw, Poland, 2001, p. 74.

21. Штильман М.И., Ларионова НИ., Шарипова Е.И., Малых E.B., Виллемсон А.Л., Кусков А.Н. Амфифильные производные поли-1Ч-винилпирролидона. Поведение в водных растворах. // Международная конференция молодых ученых «От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок: экологически безопасные технологии», Тверь, 2001, с. 32.

Заказ № 635. Объем 1п.л. Тираж ЮОэкз. Отпечатано в ООО «Петроруш» г.Москва,ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1 о

2.1. АМФИФИЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРЫ:

СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА

2.1.1. Строение амфифильных полимеров

2.1.2. Поведение амфифильных полимеров в растворах

2.1.3. Термодинамические аспекты ассоциации амфифильных полимеров

2.2. НАНОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ АМФИФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ

2.2.1. Основные типы полимерных наночастиц

2.2.2. Получение полимерных наночастиц из амфифильных полимеров

2.2.3. Получение полимерных наночастиц содержащих БАВ и их свойства

2.3. ПОЛИМЕРНЫЕ НАНОСИСТЕМЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ЦЕЛЕЙ

2.3.1. Требования, предъявляемые к полимерным системам доставки

2.3.1.1. Состав полимерных систем доставки

2.3.1.2. Размер полимерных систем доставки

2.3.1.3. Скорость выделения БАВ

2.3.3. Примеры использования наноразмерных систем доставки биологически активных веществ на основе амфифильных полимеров

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ И ВЫБОР ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.2. АМФИФИЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРЫ Ы-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА: ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА

3.2.1. Полимеризация N-винилпирролидона в присутствии меркаптосоединений

3.2.2. Получение амфифильных производных поли-Ы-винилпирролидона

3.2.3. Изучение строения полученных полимеров

3.2.4. Синтез сополимеров N-винилпирролидона с п-аллилоксибензальдегидом

3.2.5. Синтез амфифильных производных сополимеров N-винилпирролидона и п-аллилоксибензальдегида

3.2.6. Исследование водных растворов сополимеров N-винилпирролидона и п-аллилоксибензальдегида и их амфифильных производных

3.3. НАНОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ АМФИФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА

3.3.1. Определение критической концентрации агрегации амфифильных поли^-винилпирролидонов

3.3.2. Получение полимерных наночастиц

3.3.3. Характеристика полимерных наночастиц

3.3.4. Изучение структуры полученных наночастиц методом 'Н-ЯМР спектроскопии высокого разрешения

3.3.5. Устойчивость дисперсии наночастиц на основе амфифильных полимеров N-винилпирролидона

3.3.6. Устойчивость полимерных наночастиц к нагреванию

3.4. ЛИПОСОМЫ, МОДИФИЦИРОВАННЫЕ АМФИФИЛЬНЫМИ ПОЛИМЕРАМИ N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА

3.4.1. Получение липосом, модифицированных амфифильными полимерами N-винилпирролидона

3.4.2. Исследование влияния амфифильных полимеров на свойства модифицированных липосом

3.4.3. Изучение устойчивости модифицированных липосом

3.4.4. Исследование поведения липосом, модифицированных амфифильными полимерами, in vitro

3.4.5. Исследование поведения липосом, модифицированных амфифильными полимерами, in vivo

3.5. НАНОНОСИТЕЛИ НА ОСНОВЕ АМФИФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ Ы-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА

С ВКЛЮЧЕННЫМИ БАВ

3.5.1. Полимерные наночастицы с включенным соевым ингибитором протеиназ типа Баумана-Бирк

3.5.2. Липосомы, модифицированные амфифильными полимерами, с включенными противогрибковыми антибиотиками

3.6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АМФИФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ Ы-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА С КОМПОНЕНТАМИ КРОВИ

3.6.1. Устойчивость полимерных наночастиц в присутствии компонентов крови

3.6.2. Литическое действие амфифильных полимеров на компоненты крови

3.6.3. Активация системы комплемента в присутствии амфифильных полимеров М-винилпирролидона

3.6.4. Влияние амфифильных полимеров Ы-винилпирролидона на реологические свойства крови

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. МАТЕРИАЛЫ

4.2. МЕТОДЫ

4.2.1. Полимеризация Ы-винилпирролидона в присутствии меркаптосоединений

4.2.2. Изучение кинетики полимеризации М-винилпирролидона в присутствии меркаптосоединений

4.2.3. Модификация полимеров, содержащих концевую карбоксильную группу

4.2.4. Модификация полимеров, содержащих концевую аминогруппу

4.2.5. Синтез п-аллилоксибензальдегида

4.2.6. Сополимеризация Ы-винилпирролидона и п-аллилоксибензальдегида

4.2.7. Синтез амфифильных сополимеров

К-винилпирролидона и п-аллилоксибензальдегида

4.2.8. Измерение мутности растворов сополимеров Ы-винилпирролидона и п-аллилоксибензальдегида

4.2.9. Анализ полимеров Ы-винилпирролидона и сополимеров >1-винилпирролидона с п-аллилоксибензальдегидом

4.2.9.1. Определение содержания карбоксильных групп в полимерах

4.2.9.2. Определение содержания аминогрупп в полимерах

4.2.9.3. Определение содержания альдегидных групп в сополимерах М-винилпирролидона

4.2.9.4. Определение молекулярной массы полимеров методом паровой осмометрии

4.2.10. Определение критической концентрации агрегации

4.2.11. Получение полимерных наночастиц прямым растворением

4.2.12. Получение полимерных наночастиц диализным методом

4.2.13. Получение полимерных наночастиц эмульсионным методом

4.2.14. Изучение механической устойчивости полимерных наночастиц

4.2.15. Включение соевого ингибитора протеиназ типа Баумана-Бирк и его производных в полимерные наночастицы

4.2.16. Получение липосом, модифицированных амфифильными полимерами М-винилпирролидона

4.2.17. Исследование влияния на стабильность модифицированных липосом дестабилизирующих агентов

4.2.18. Флуориметрическое исследование стабильности липосом, модифицированных амфифильными полимерами

4.2.19. Включение нистатина и амфотерицина В в липосомы, модифицированные амфифильными полимерами

4.2.20. Количественное определение нистатина и амфотерицина В спектрофотометрическим методом

4.2.21. Исследование влияния ультразвукового воздействия на стабильность модифицированных липосом с включенными биологически активными веществами

4.2.22. Исследование влияния на стабильность модифицированных липосом процессов замораживания/размораживания

4.2.23. Изучение устойчивости агрегатов амфифильных полимеров в присутствии сыворотки крови

4.2.24. Измерение размеров наноносителей

4.2.25. Трансмиссионная электронная микроскопия

5. ВЫВОДЫ

5. ВЫВОДЫ

1. Путём проведения радикальной полимеризации Ы-винилпирролидона в присутствии меркаптанов, содержащих дополнительную функциональную группу, с последующим введением концевого длинноцепного алифатического радикала, синтезированы биологически совместимые амфифильные полимеры, содержащие одну концевую гидрофобную группу и способные к образованию агрегатов и модификации липосомальных мембран с получением наноразмерных систем доставки лекарственных веществ.

2. Выявлены условия проведения реакций, позволяющие получить амфифильные полимеры М-винилпирролидона, содержащие в качестве гидрофильного фрагмента поли-Ы-винилпирролидон с заданными величинами молекулярной массы в диапазоне Мп=1500+15000, а в качестве концевого гидрофобного фрагмента длинноцепной первичный (Сб + С2г) или вторичный ((Сб)2 (С^г) алифатический радикал. Показана возможность введения в полученные амфифильные полимеры дополнительных альдегидных групп сополимеризацией Ы-винилпирролидона с п-аллилоксибензальдегидом.

3. Показано, что полученные амфифильные полимеры образуют в водных системах сферические агрегаты с размерами от десятков до сотен нанометров в зависимости от строения полимера и способа получения наночастиц. При этом установлено, что значение критической концентрации образования агрегатов уменьшается с уменьшением молекулярной массы полимерного фрагмента и увеличением длины гидрофобной концевой группы. Сравнение методов получения наночастиц (метод прямого растворения, диализный и эмульсионный методы) показало, что частицы, полученные диализным и эмульсионным методом, имеют меньший размер и более узкое распределение по размерам.

4. Показано, что амфифильные поли-Ы-винилпирролидоны способны к встраиванию в мембраны липосом, повышая их устойчивость к действию разрушающих факторов (ультразвука, детергентов и поликатионов, спиртовых растворов). Модификация липосом амфифильными полимерами Ы-винилпирролидона увеличивают время циркуляции липосом в крови, и уменьшают их захват печенью (опыты на животных).

5. Установлено, что включение в наночастицы на основе амфифильных полимеров Ы-винилпирролидона соевого ингибитора протеиназ типа Баумана-Бирк и его гидрофобизованных производных повышает их растворимость в воде и устойчивость к инактивации.

6. Показано, что липосомы, модифицированные амфифильными полимерами Ы-винилпирролидона, с включенными противогрибковыми антибиотиками нистатином и амфотерицином В, обладают более высокой антифунгальной активностью чем неиммобилизованные антибиотики и повышенной стабильностью по сравнению с ^модифицированными липосомальными препаратами.

7. Исследование взаимодействия синтезированных амфифильных полимеров М-винилпирролидона с компонентами крови показало отсутствие их влияния на систему комплемента сыворотки крови и эритроциты. Введение полимеров в кровь не влияет на ее различные реологические свойства.

1. Jeon Н.К., Schulze J.S., Macosko C.W. Block copolymers. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. Elsevier, 2001, P.683-688.

2. Yasugi K., Nagasaki Y., Kato M., Kataoka K. Preparation and characterization of polymer micelles from poly(ethylene glycol)-poly(lactide) block copolymers as potential drug carrier. // J. Contrail. Rel., 1999, V.62, P.89-100.

3. Allen C, Han J., Yu Y., Maysinger D., Eisenberg A. Polycaprolactone-b-poly(ethylene oxide) copolymer micelles as a delivery vehicle for dihydrotestosterone. // J. Contrail. Rel., 2000, V.63, P.275-286.

4. Riess G. Micellization of block copolymers. // Prog. Polym. Sci., 2003, V.28, P.l 107-1170.

5. Klibanov A.L., Maruyama K., Torchilin V.P., Huang L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. // FEBS Lett., 1990, V.268, P.235-238.

6. Lasic D.D., Woodle M.C., Martin F.J., Valentincic T. Phase behavior of'stealth-lipid' decithin mixtures. // Period. Biol., 1991, V.93, P.287-290.

7. Русанов А.И. Мицеллообразование в растворах поверхностно-активных веществ. СПб.: Химия, 1992,358 с.

8. Hadjichristidis N., Pispas S., Floudas G. Block Copolymers: Synthetic Strategies, Physical Properties, and Applications. New York: John Wiley & Sons, Inc., 2003,409 p.

9. Reinhart T., Bauer K.H. The hemolysis and solubilization behavior of nonionic polymer surface active agents. // Pharmazie, 1995, V.50, P.403-407.

10. Tuzar Z., Kratochvil P. Micelles of block and graft copolymers in solution. In: Surface and colloid science (Matijevic E., editor). New York: Plenum Press; 1993, V.15, P.l-83.

11. Yasugi K., Nagasaki Y., Kato M., Kataoka K. Preparation and characterization of polymer micelles from poly(ethylene glycol)-poly(D,L-lactide) block copolymers as potential drug carrier. // J. Controll. Rel., 1999, V.62, P.89-100.

12. Hraska Z., Riess G., Goddard P. Synthesis and purification of a poly(ethyleneoxide)-poly((3-benzyl-glutamate) diblock copolymer bearing tyrosine units at the block junction. // J. Polymer., 1993, V.34, P.1333-1338.

13. Kabanov A., Batrakova E.V., Alakhov V.Yu. Pluronic block copolymers as novel polymer therapeutics for drug and gene delivery. // J. Controll. Rel., 2002, V.82, P. 189-212.

14. Winnik F.M., Davidson A.R., Hamer G.K., Kitano H. Amphiphilic poly(N-isopropylacrylamide) prepared by using a lipophilic radical initiator: synthesis and solution properties in water. // Macromolecules, 1992, V.25, P.1876-1880.

15. Gao Z., Eisenberg A. A model of micellization for block copolymers in solutions. //Macromolecules, 1993, V.26, P.7353-7360.

16. Ivanova R., Lindman B., Alexandridis P. Modification of the lyotropic liquid crystalline microstructure of amphiphilic block copolymers in the presence of cosolvents. // Adv. Coll. Interface Sci., 2001, V.89-90, P.351-382.

17. Пчелин В.А. Гидрофобные взаимодействия в дисперсных системах. М.: Знание, 1976, 64 с.

18. Stigter D. Micelle formation by ionic surfactants. I. Two phase model, Gouy-Chapman model, hydrophobic interactions. // J. Coll. Inter. Sci., 1974, V.47, P.473-482.

19. Astafieva I., Zhong X., Eisenberg A. Critical micellization phenomena in block poly electrolyte solution. // Macromolecules, 1993, V.26, P.7339-7352.

20. Kon-No K., Jin-No Т., Kitahara A. Solubility, critical aggregating or micellar concentration, and aggregate formation of nonionic surfactants in nonaqueous solutions. // J. Colloid. Interface Sci., 1974, V.49, P.383-389.

21. Arshady R. Dendrimers assemblies nanocomposites. London: Citus Ltd, 2002, 576 p.

22. Mittal K.L., Lindman B. Surfactants in Solution, vols. 1-3. New York: Plenum Press, 1991.

23. Ostro M.J. Liposomes: from biophysics to therapeutics. Princeton, New Jersey: Marcel Dekker Inc., 1987, 418 p.

24. Winterhalter B.M., Frederik P.M., Vallner J.J., Lasic D.D. Stealth liposomes: from theory to product. // Adv. Drug Deliv. Rev., 1997, V.24, P.165-177.

25. Le Bang Son, Kaplun A.P., Symon A.V., et al. // J. Liposome Research., 1998, V.8, P.78-85.

26. Torchilin V.P. Polymer-coated long-circulating microparticulate pharmaceuticals. // J. Microencapsulation, 1998, V.15, P.l-19.

27. Hrkach J.S, Peracchia M.T., Bomb A., Lotan N., Langer R. Nanotechnology for biomaterials engineering: structural characterization of amphiphilic polymeric nanoparticles by H-NMR spectroscopy. // Biomaterials, 1997, V.18, P.27-30.

28. Honda C, Sakaki K., Nose T. Micellization of an asymmetric block copolymer in mixed selective solvents. // Polymer, 1994, V.35, P.5309-5318.

29. Nose T., Iyama K. Micellization and relaxation kinetics of diblock copolymers in dilute solution based on A-W theory: I. Description of a model for core-corona type. // Comp. and Theor. Polymer Sci., 2000, V.10, P.249-257.

30. Muller R.H., Mehnert W., Lucks J.S., Schwarz C, zur Muhlen A., Weyhers H., Freitas C, Ruhl D. Solid lipid nanoparticles (SLN) an alternative colloidal carrier system for controlled drug delivery. // Eur. J. Pharm. Biopharm., 1995, V.41, P.62-69.

31. Archady R., Guyot A. Functional polymer colloids. London: Citus Ltd, 2002, 540 p.

32. Torchilin V.P. Structure and design of polymeric surfactant-based drug delivery systems. // J. Contrail. Rel., 2001, V.73, P.137- 172.

33. Matijevic E. Uniform inorganic colloid dispersions. Achievements and challenges. // J. Phys. Chem., 1993, V.97, P.8-16.

34. Torchilin V.P. Drug targeting. // Eur. J. of Pharm. Sci., 2000, V.l 1, P.81-91.

35. Maeda H., Wu J., Sawa T., Matsumura Y., Hori K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics. // J. Contr. Rell.,2000, V.65, P.271-284.

36. Buckton G. Interfacial phenomena in drug delivery and targeting. Harwood Academic Publishers, 1995,208 p.

37. Lasic D.D. Liposomes: synthetic lipid microspheres serves as multipurpose vehicles for the delivery of drugs, genetic material and cosmetics. // Am. Sci., 1992, V.80, P.20-31.

38. Shek P.N., Barber R.F. Liposomes: a new generation of drug and vaccine carriers. //Mod. Med. Canada, 1986, V.41, P.314-382.

39. Allen T.M., Hansen C.B., De Menenez D.E.L. Pharmacokinetics of long-circulating liposomes. 11 J. Adv. Drug Deliv. Rev., 1995, V.16, P.267-284.

40. Govender T., Riley T., Ehtezazi T., Garnett M.C., Stolnik S., Ilium L., Davis S.S. Defining the drug incorporation properties of PLA-PEG nanoparticles. // Int. J. Pharm., 2000, V.1999, P.95-110.

41. Katayose S., Kataoka K. Water-soluble polyion complex associates of DNA and poly(ethylene glycol)-poly(L-lysine) block copolymer. // Bioconj. Chem., 1997, V.8, P.702-707.

42. Stolnik S., Ilium L., Davis S.S. Long circulating microparticulate drug carriers. // Advanced Drug Delivery Review, 1995, V.16, P. 195-214.

43. Kreuter J. Peroral administration of nanoparticles. // Adv. Drug Deliv. Rev., 1991, V.7, P.71-86.

44. Akerman M.E., Chan W.C., Laakkonen P., Bhatia S.N., Ruoslahti E. Nanocrystal targeting in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci., 2002, V.99, P.12617-12621.

45. Gupta A.K., Wells S. Surface-modified superparamagnetic nanoparticles for drug delivery: preparation, characterization and cytotoxicity studies. // Trans Nanobioscience, 2004, V.3, P.66-73.

46. Bharali D.J., Sahoo S.K., Mozumdar S., Maitra A. Cross-linked polyvinylpyrrolidone nanoparticles: a potential carrier for hydrophilic drugs. // J. Coll. Interface Sci., 2003, V.258, P.415-423.

47. Gaur U., Sahoo S.K., DePrahlad T.K., Ghosh C., Maitra A., Ghosh P.K. Biodistribution of fluoresceinated dextran using novel nanoparticles evading reticuloendothelial system. // Int. J. Pharm., 2000, V.202, P. 1-10.

48. Speiser P.P. Nanoparticles and liposomes: a state of the art. // Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 1991, V.13, P.337-342.

49. Jiao Y., Ubrich N., Marchand-Arvier M., Vigneron C, Hoffman M., Lecompte T., Maincent P. In vitro and in vivo evaluation of oral heparin-loaded polymeric nanoparticles in rabbits. // Circulation, 2002, V.105, P.230-235.

50. Hunter R.J. Introduction to Modern Colloid Science. Oxford: Oxford University Press, 1993, 346 p.

51. Kwon G.S., Kataoka K. Block copolymer micelles as long circulating drug vehicles. // Adv. Drug Deliv. Rev., 1995, V.16, P.295-309.

52. Kabanov A.V., Batrakova E.V, Alakhov V.Yu. Pluronic block copolymers as novel polymer therapeutics for drug and gene delivery. // J. Controll. Rel., 2002, V.82, P.189-212.

53. Barichello J.M., Morishita M., Takayama K., Nagai T. Absorption of insulin from Pluronic F-127 following subcutaneous administration in rats. // Int. J. Pharm, 1999, V.184, P.189-198.

54. Takeuchi H., Matsui Y., Yamamoto H., Kawashima Y. Mucoadhesive properties of carbopol or chitosan-coated liposomes and their effectiveness in the oral administration of calcitonin to rats. // J. Controll. Rel., 2003, V.86, P.235-242.

55. Sheikh N.A., Shamisi M., Morrow W.J. Delivery systems for molecular vaccination. // Curr. Opin. Mol. Ther., 2000, V.2, P.37-54.

56. Muller R.H. Emulsions and NanosuspensionsAJStuttgart: Scientific Publishers, 1998, 348 p.

57. Trubetskoy V.S., Frank-Kamentsky M.D., Whiteman K.R., Wolf G.L., Torchilin V.P. Stable polymeric micelles: lymphangiography contrast media for gamma scintigraphy and magnetic resonance imaging. // Acad. Radiol., 1996, V.3, P.232-238.

58. Kwon G. S., Naito M., Yokoyama M., Okano T., Sakurai Y., Kataoka K. Physical entrapment of Adriamycin in AB block copolymer micelles. // J. Controll. Rel., 1995, V.12, P.192-195.

59. Buckton G., Interfacial phenomena in drug delivery and targeting. Harwood Academic Publishers, 1995,376 p.

60. Гельдфейн М.Д. Кинетика и механизм радикальной полимеризации виниловых мономеров. Саратов: изд-во Саратовского университета, 1986, 139 с.

61. Drobnik J., Kaval J., Dabrowska L., et.al. // J. Polym. Sci.: Polym. Symp., 1979, V.66, P.75-81.

62. Сидельковская Ф.П. Химия N-винилпирролидона и его полимеров,-М.: Наука, 1970,150 с.

63. Ito К., Effect of Radical Scavenger on Initiation Efficiency. // Journal of polymer science: part A-l, 1972, V.10, P.57-62.

64. Липатов Ю.С. Справочник по физической химии полимеров. Киев: Наукова Думка, 1984, 374 с.

65. Физер Л., Физер М. Реагенты для органического синтеза. М.: Мир, 1970, Т.1., С.422-424.

66. Мани Р., Смит Д. Путеводитель по органическому синтезу. М.: Мир, 1985, С.329-332.

67. Оудиан Д. Основы химии полимеров. М.: Мир, 1974, 614 с.

68. Ушаков С.Н., Трухманова Л.Б., Маркелова Т.М., Кропачев В.А. О сополимеризации кротонового альдегида с винилпирролидоном. // Высокомолекул. соед., 1967, Т.9(А), №5, С.999-1004.

69. Cannon J.A., Fettes Е.М., Tobolsky A.V. Chain transfer of styrene with various dihalids and thew preparation of polystyrene dihalides. // J. Am. Chem. Soc, 1952, V.74, P.1854-1855.

70. Bevington J., Troth H. Tracer studies of transfer reactions. Part 3. Diphenylamine with various monomers. // Trans. Farad. Soc., 1963, V.59, P.1348-1352.

71. Гладышев Г.П. Полимеризация винильных мономеров. Алма-Ата: Акад. наукКаз. ССР, 1964, 322 с.

72. Liaw J., Aoyagi Т., Kataoka К., Sakurai Y., Okano Т. // Pharm. Res., 1998, V.15, P.1721-1726.

73. Kwon G.S., Okano T. Polymeric micelles as new drug carriers. // Adv. Drug Deliv. Rev., 1996, V.21, P.107-116.

74. Allen C., Maysinger D., Eisenberg A. Nano-engineering block copolymer aggregates for drug delivery. // Coll. and Surf. B: Biointerfaces, 1999, V.16, P.3-27.

75. Zhang L., Eisenberg A. // Science, 1995, V.268, P. 1728-1731.

76. Bootz A., Vogel V., Schubert D., Kreuter J. Comparison of scanning electron microscopy, dynamic light scattering and analytical ultracentrifugation for the sizing of poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles. // Eur. J. of Pharm., 2004, V.57, P.369-375.

77. Nuopponen M., Ojala J., Tenhu H. Aggregation behaviour of well defined amphiphilic diblock copolymers with poly (N-isopropylacrylamide) and hydrophobic blocks. // Polymer, 2004, V.45, P.3643-3650.

78. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991,544 с.

79. Gorski N., Kalus J. Determination of the structure of tetradecyldimethylaminoxide micelles in water by small-angle neutron scattering. // J. Phys. Chem. B, V.101, P.4390-4393.

80. Jenning V., Mader K., Gohla S.H. Solid lipid nanoparticles (SLNTM) based on binary mixtures of liquid and solid lipids: a 1H-NMR study. // Int. J. Pharm., 2000, V.205, P. 15-21.

81. Lee H., Jung S.W., Kim I.S., Jeong Y.I., Kim S.H. Polymeric nanoparticle composed of fatty acids and poly(ethylene glycol) as a drug carrier. // Int. J. Pharm., 2003, V.24, P.23-32.

82. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. СПб.: Химия, 1995, 399 с.

83. Щукин Е.Д., Перцов А.В., Амелина Е.А. Коллоидная химия. М.: Высшая школа, 2004,446 с.

84. Tobyo M., Gref R., Sanchez A., Langer R., Alonso M.J. Stealth PLA-PEG nanoparticles as protein carriers for nasal administration. // Pharm. Res., 1998, V.15, P.270-275.

85. Birk Y. The Bowman-Birk Inhibitor. // Int. J. Peptide Protein Res., 1985, V.25, P.113-131.

86. Kennedy AR. Protease inhibitors as cancer chemopreventive agents. New York and London: Plenum Press, 1993, 315 p.

87. Larionova N.I., Gladysheva I.P., Polekhina O.V., Kurochkina L.P., Gorbatova E.N. Synthesis and biodistribution of Bowman-Birk soybean proteinase inhibitor conjugate with amphiphilic polyester. // Appl. Biochem. Biotechnol., 1996, V.61, P. 139-148.

88. Малых E.B., Тюрина О.П., Ларионова Н.И. Ацилирование соевого ингибитора протеиназ типа Баумана-Бирк производными ненасыщенных жирных кислот. // Биохимия, 2001, Т.66, С.549-554.

89. Малых Е.В., Ларионова Н.И. Изучение антипротеиназной активности ацилированных производных соевого ингибитора протеиназ типа Баумана-Бирк. // Биохимия, 2002, Т.67, С. 1676-1681.

90. Виллемсон А.Л., Малых Е.В., Штильман М.И., Ларионова Н.И. Самоорганизующиеся сиситемы на основе амфифильного поливинилпирролидона и их взаимодействие с модельными белками. // Биохимия, 2003, Т.68, С. 1063-1069.

91. Groll А.Н., Shah P.M., Mentzel С., et al. Trends in postmortem epidemiology of invasive fungal infections at a university hospital. // J. Infect, 1996, V.33, P.23-32.

92. Cohen S., Berstein H. Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines. New York: Marcel Dekker, 1996, p. 1-49.

93. Ройт А. Основы иммунологии. M.: Мир, 1991, 327 с.

94. Торопцева А.А. и др. Лабораторный практикум по химии и технологии ВМС. Л.: Химия, 1972,414 с.