Синтез функциональных полимерных суспензий для иммунологических исследований тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ГОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ ИМ. М.В. ЛОМОНОСОВА

РГ 6 Ой

На правах рукописи

> з у-:,;

УДК 678.061.06:615.4

АЛЬ-ХАВАРИН длгеисъ ИБРАГИМ

СИНТЕЗ «УШЯЕЮНАЛЬНИС ПОЛКНЕИШХ СУСПИВИЙ ДЛЯ ГОаШШОПГЮЖИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Специальность 02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений

АЗТОРЕМРЛТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1994.

Рг.оота выполнена в Московской Государственной Академии тонкой химической технологии им. В.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор H.A. Гркцкова кандидат химических наук П.В. Нусс

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор A.B. Зезин

'' W '"С

Jiöf-Top химических наук,профессор И.Д. Ходжаева

Ведущая организация: Научно-исследовательский физико-

химический институт им.Л.Я.Карпова

Защита состоится 1934 года в часов в

ауд. на заседании Специализированного Совета Д-063.41.05 при Москогской Государственно? Академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова по адресу: 11S831, ГСП, Г-436, Москва, м. Пироговская ул., д.1. О диссертацией модно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан "Ii" о S 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Сюьета. доктор химически^ наук,

профессор-' ^ / /л. , . „ А Гчищким A.Ii.

-------

-3-

ОВ'УП ХАРЛСГЕИгОТИКА р.июта

¿4^^^Ч°Р^рабдти_опрелеляется г.„иском простых и надежных методов синтеза функциональных полпмершх суспензий для использования в медицине и Биотехнологии.

Цо ль рл бг»ги_с ос т оя л а в нахождении условий создания синтеза ¿ункшюнальпых полимерных суспензий для диагностических тест-систем на их основе.

^^а^ная^ю^тамаработи^

- синтезированы лолистиролметакриловыб суспензии с узким распределением частиц по размерам и диаметрам в интервале 0,3-0,6 мкм, пригодные для иммунохимических исследований;

- показано, что при сополимеризации стирола с винилсульфонатсм в широком интервале его концентрации в отсутствие ПАЕЗ всегда образуются полимерные суспензии с широким распределением частиц по размерам вследствиэ протекания процесса по эмульсионному и суспензионному механизмам;

- установлена зависимость между концентрацией карбоксильных групп на поверхности частиц полимерной суспензии и количеством адсорбиоованного белка (на примере человеческого плазменного альбумина);

- в модельных условиях установлены концентрации белка, необходимые для достижения максимальной чувствительности диагностической тест-системы;

- созданы модельные диагностические тест-системы на основе полистиролметакриловых суспензий.

Практическая значимость работы.

- предложен простой и одностадийный способ синтеза полимерных суспензий с карбоксильными группами на поверхности частиц, узким распределением по размерам и диаметрам.1-в интервале 0,3 - 0,6 мкм для иммунохимических исследований;

- созданы модельные диагностические системы на основе полистиролметакриловых суспэноий.

Аатор за'^сцаот:

- способы получения полистиролметакриловых суспензий с узким распределением частиц по размерам с диаметрами 0,3 - 0,6 мкм, для иммунохимических исследований;

- кинетические закономерности сополимеризации стирола с ви-нилсульфснатом в широком интервале концентраций функционального со-мономера;

- влияние концентрации функционального сомономера в эмульсии на межфазное натяжение, устойчивость реакционной системы и полимерной суспензии, распределение частиц по размерам, адсорбцию белка;

г

- усжшъ! проведения адсорбции белка (на примере человеческого плазменного альбумина) на часткич полистиролметякр11яовых суспензий и оптимальнее концентрации белка, обескечивашие высокую чувствительность и специфичность реакции латексиой агглютинации.

Пу6ли«;щим. По результатам диссертационной работы опубликовано 5 статен.

Структура и___объем работы. Диссертационная работа изложена на V4

стрчндаш машинописного текста и состоит иа следующих разделов: введения, литературного oOsopa, экспериментальной части, результатов и обсуждения и ьыводов. Диссертация включает таблиц и Çû рисунков.Еиблиогра&иа содержит 143 наименований.

Исходник веи;е>отеа. Стирол марки "ч" осиная и от стабилизатора по известной методике. Викилсуль.£юьат натрия применяли без дополнительной очистки. ди-п-толил-о-карбалксксифелилкарбинса, персульфат калия, хлороформ, ацетон, толуол и другие реагента марки "хч" и "ч" использовали без дополнительной очистки. Дисперсионная среда - вода дкетиллат.

Ч31А - продукт фирмы "Rianai" (Будапешт, Венгрия). Молекулярная масса равна 67GOO.

Моходн.»адедавя»о«. Кинетику полимеризации исследовали дилатометрическим методом. Полимеризация проводили а бескислородных условиях при температуре [7СН0,5]'С. Характеристическую вязкость растворов полимеров определяли методом виэкоэикетрии. Молекулярные массы рассчитывали по уравнению: [ £ J - JMУ.

Мелфазное натяжение определяли методом сталагмометрии, размеры частиц •• методом сканирующей электронной микроскопии иа приборе "3-570" (Hit3Chl, Япония), количество белка, адсорбирсв&шого на частицам полимерных суспензий, определяли по методу, основанному на измерении убыли концентрации '¿елка из раствора в результате адсорбции. Измерение концентрации растворов человеческого плазменного альбумина проводили е спектро^отомере UV-ViS ""pecord М40".

РЕЗУЛЫАИ1 И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. СИ1ГЕЗ УСТОЙЧИВЫХ ПСШСГИРОЛ1СГГАКтАТ1!ЫХ СУСШШЙ с таким РАСПРЕДЕЛИ GG-J« ЧАСТИЦ по РАЗМЕРАМ.

Полистиролметакрилатвие суслекдии, содержащие на поверхности частиц карбоксил! nue группы, предстагдя'от большой интерес для создания диагностических тест-систем, в которых частицы суспензии используются в качестве носителей Оелков, коьалентно связанных с псверхк jctmo чаотиц. Эти суспевзяи должны удовлетворять достаточно

жестким требованиям: иметь увкое распределение частиц по размерам, средний диаметр не менее 0.4 мкм, сохранить устойчивость при крлле-йии. г растворах 0.1 N NaCl. в которых, как правило, проводит иммобилизацию СО", "Л.

Их обычно получают затравочной или бвзэмульгатооиой сожмкмо-ризацией гидрофобных мономеров с метакриловой кислотой. МАК. концентрация »»торой 'обычно составляет не менее 1.16 моль/л СО* млсс в расчете на мономер). Сополимеризацдо чаде всего проводят в условиях дробного введения мономеров или всех компонентов полимеризации. что необходимо из-аа низкой устойчивости реакционных систем. Этот способ синтеза суспензий трудоемок, плохо воспроизводим и малейшее отклонение от технолога1 приводит к потере устойчивости реакционной системы, образованию коагудаа, расширению распределения частиц по раомерчм. кроме того, частицы полимерной суспензии имеют средний диаметр много меньший требуемого.

С этой та41 си зрения приплекательчы результаты по гетерофаэной полимеризации гидрофобных, мономеров.в . основном стирола, в присутствии нерастворимых в воде поверхностно-активных веществ,ПАВ, таких ,как оксиэтилиросанные жирные кислоты природного происхождения . олигомерные пороке иды на основе полиэтшенгликоля и пирроме-тилового диангидрида ППЭГ , олигогликольмалемнать и ди-п-то-лил-о-карбалкоксифенилкарбинол, ЛТК. В этом случае полимерно-мономерные частицы. ПМЧ, образуются только из капель мономера, их число в реакционной системе много меньше, чем это имеет место при полимеризации мономеров в присутствии мицеллообраауыщих ИАВ, растворимых в воде .\ Уменьшение числа ГОЛ требует меньшего количества ПАВ для обеспечения их устойчивости, а формирование их.по одному механизму позволяет получать полимерные суспензии с. узким распределением частиц по размерам.

Этот подход к синтезу полимерных суспензий был использован при сополимериэации стирола и метакриловой кислоты.

• Синтез полистиролметакридатных суспензий предполагали провести в присутствии нерастворимого в воде стабилизатора ди-п-толил-о-кар-балкоксифенилкарбияола с использованием в качестве инициатора -персульфата калия.

Однако, наличие МАК в эмульсии предполагает понижение и дробление капель мономера до много меньших разменов, чем наблюдается в эмульсии . стирола. Сополимериэации мономеров в высокодисперсной эмульсии может привести, к образованию полимерной суспензии с размерами частиц меньше требуемых.

Другими словами,, концентрация МАК в эмульсии является фактором, определяющим дисперсность не только исходной эмульсии мономера. но и конечной полимерной суспензии.

Дисперсность исходной эмульсии мономера существенно зависит от межфазного. натяжения,<з<г В ¿итературе' сведения 'о влиянии концентрации .МАК на ^¿практически отсутствуют, по&тшу исследования был на-, чаты с изучения изменения на границе стирольнчй раствор МАК/ьсл* ный раствор МАК, стирольный раствор ди-п-толил-о-глрОалкоксифиил-карбинол иЫАК/водный раствор МАК от концентрации МАК.

Полученные результаты приведены на рис. 1 Видно, что МАК снид&-ет меяфазпое натяжение до 22 мН/м при ее концентрации, равной 0,23 моль/л. (2,03 масс в ргк'-чсте на мономер) стирола. Добавление ди-п-толил-о-карбалкоксифеши;кар011нол в стирольный раствор МАК изменяет характер изотермы адсорбции: «^снижается до 10 мН/м при концентрации МАК. равной 0.0Г>8 моль/л сиролз, а затем повышается при ее концентрации, равной 0,3485 моль/л стирола (3,0Х масс в расчете на монок-ер). Наблюдаемый характер зависимости обусловлен,по-видимому, изменением концентр-щии МАК и ди-п-тсаил-о-карбалшксифеиидкар- . Оитаа на границе раздела фаз.. Дан»«» не.изменению ог концентрации МАК коррелируют с результатами, полученными зри изучении дисперсности эмульсий методом лазерной спектроскопии.

Так, при концентрации МАК , ратной 0.0232 моль/л стирола (0.2Х масс в расчете на мономер) размеры капель эмульсии изменяются .> интервале от 1 до 5 мкм, а при концентрации МАК 0,3485 ыоль/л стирола от 0,2 до 1.0 мкм.

Полученные ревул!таты пояышют сделать вывод о том. что для снижения полимерных суспензий с требуемым размером частиц концентрация МАК в смеси мономеров не должна превышать 0,053 миль/л стиро .

лс».

Дисперсность эмульсии мономеров будет ьаьисеть и от того, в какой ее Фазе растворен МАК. Известно, что если функциональный мономер поместить в ту фазу, в которой он менее растворим, то при получении эмульсии может наблюдаться кжсоперенос МАК иэ одной фазы в другую согласно растворимости в них. При этом ьсьмочно снижение ¿а и микроэмульгирование мономера, т.е. образование высокодиснерсной эмульсии мономера, полимеризация ь которой вновь приведет к получению полимерных суспензий с размер; ми менее требуемых.

Влияние способа введения МАК в исходную ймульсию на микроэ-мульгирозание мономера изучали в статических -условиях при разных гьачениях рН ьсдной фази. оказалось, что тонкий едва заметный слой млкроэмульс'ип мономера образуется, прл растворе чии МАК в воде.-лишь. на четвертые сутки фН-10-11). -Прг рс.еиении Ч!АК в.с.тарол (рН-Зб,8) мнкроэмульгироваше мономера не наблюдали'в течение-.7'суток:'.'

Увеличение интенсивности ншфозм'ул-гиров.ачия происходило только ври повышении :рН водной фазы ;\о 11. Эту, результаты показывают,', что пр». р!1 водной фазы, раиной 3,6-0,8.,. то есть в. условиях преподе-.

б1д,нн/м

Ряс Иготериа мэх^ааного иагя*.еикя я.» rtw.me:

1 - стирай, шй раствор ЫАК/»слг:

2 - стирол иыА рлстеор Ш.К и 1Шюда.

Pnt. 2. Зависимость »ыясда полимеров, получзнных

• atc/rsTins ДГ», от времени при рмных soHüeiírpaKiwx ¡ÍAK, малк/i сти;:с«л (5 тсс.

* расчете Ht стпус;:):

I .. 0,Иб С Г > i 2 - 0,2323 (2)j".1 - C.CS2 (0,5) ¡

i - о,мзгз <о,гп о - о.оо (0).

ч - гуг^пк^-.^ризацил г.т;г?ояи с Ví.a ■а '"¡рн?' тстгки «TiC.

'íC-b^MHOt фаз * 1:9,

X = ?(J С, л^Р^Ч, ~ J,3o6-I0f ыляь/а .nvpjca. ■

-е' " ' - * : : : пня со!ю.';;!1ле;л:;.:;.и;ин стирога с- МАК, шжрюмульгировайие мономера практически и-.- будет иметь моста.

СоРолимери-^шго стирола с МАК проводили в дилатометрах при объемном соотношении стирол/вода, равном 1:9, температуре ?00 С, скорости перемешивания реакционной системы, равной 450 об/мин в присутствии и отсутствие ПАВ. В качестве инициатора использовали персульфат < лт, концентрация которого составляла 3.36- К^моль/л стирола (1 .02 «у-зсс в расчете на мономер).

Выбор персульфата калия обусловлен тем. что в его присутствии имеет место дополнительная стабилизация частиц суспензии за счет ориентации концевых сульфо-групп на их поверхности.

Следует помнить, что в отличие от традиционных способов полимеризаций, в качестве ПАВ кспольговади дя-п-тмил-о-карбаакоклифе-¡шг-арСинол, растворлмий в см о си мономеров, а концентрация МАК была существенно спилена по сравнению с обычно используемой.

Кинетические кривые ,<онвероия-время представлены на рис.2 Видно, что сополшеризания протекает с небольшие индукционным периодом, наличие которого сиявено, по-видимому, со временем Формирования шч. Величина индукционного периода уменьшается, а стационарная скорость полимеризации возрастает с увеличением количества МАК в смеси мономеров.Скорость сополимеригации при высокой концентрации МАК близка к наблюдаемой при эмульсионной полимеризации стирола.

Н;личие стабилизатора в эмульсии мономеров практически не изменяет скорость сополимсризации, но увеличивает устойчивость суспензии.

Данные по распределении частш сопаллмерных суспензий по размера, полученных в'отсутствие ди-п-толлл-с-карбалкоксифенилкарбинол при разном содержании МАК в исходной эмульсин приведены на рис,3.4. Видно, что концентрация МАК в исходной эмульсии существенно влияет на распределение частиц 1.0 размерам и средний диаметр частиц. Так, есж! при содержании МАК, равном 0.011 мол'</л с т и юл а (О, IX масс в расчете на мономер) , при полммерярании образуются суспенгии, 902 чг^тиц .которой имеют средний рагчер 0,6 мкм. тс при содержании МАК, равном 0,3405 моль/л стирола (3,0* масс в расчете на мономер), 85* частиц имеют средний диаметр частиц 0.3 мкм.

Средние молекулярные . массы полимеров возрастают с увеличение^ концентрат;« МАК, т.е. с уменьшением диаметра частиц. что связано со сьяхеяием концентрйшю радикадо» в объеме частиц и .умвньъеякеи* скорости реакции обрыва цепи.

Полученные результат' коррелируют с даянымл по кжп ичеоким ггиганокерноотям полимеризации и подтвеевдают. вывод о том, что '¡ри ¡»•¡соких концентрациях М.'.К пелллеризаи.ия протекает по эмульсионному

механизму, а при низких -. По суспензионному. '

------------------- -

¿c. 3. JjíKFOÍcrcrpbíwjt и rMCT'íPr^iíMU р»сп^де-*»ни* иестиц кошетрзв^впкркга»!;« cvc-пдезял» па*учеми1Я » utcjtctírf» yitHifW. LLui » .1сх»дюи

змупсии - O,Olid дк/* utfcpjía % ь»сс. » рьсчвт» и» cr*py»ï.

Гис. 4. ^»р'^этогр^и* м гистогрр.СР!*А*-

Ым «стиц голисти?ояыв1акри«о1эй сус-• п.н*ии, tio*ywu«iA я otcytct»*« ДТК, г.о Cwpuiwt ittri » kcxOAWj * ^иудьсмм - 0,3<£* wciw/д сгмрся. СЭЛ » » расчет» Ht стиро*).

При увеличении концентрации МАК наблюдается заметное повышение устойчивости суспензий, и. начиная с ее концентрации , равной 0,174 моль/л стирола масс, в расчете на мономер), суспензия устой-

чина в 0,3 М растворе íJaCl . ■

lío л ученики экспериментальный материал иллюстрирует возможность получения полистиролмстакрилатних суспензий с узким распределением частиц по размечи* и диаметрам С.4-0,С мкм технологически удобным методом.

В процессе лодимерисации реакционные системы устойчивы (нет коагулкма). полимеризация протекает до полюй конверсии мономеров ад £2-24 часа (в зависимости от содержания МАК в эмульсии). В процессе хранения в течение С месяцев средний диаметр частиц не изменяется.

На рис.Ь.б представлены даяние по распределению частиц поли-мернпх суспензий,полученных и присутствии ди-п-толил-о-ка^аякокси-{■енилкарбииаяа. различаются по дисперсности. Полимерные суспензии. no.ivit'HHi.'e при concr.i:.M---p)!5íui¡!ji стирола с н;и!0альш>-й концентрацией í.íAK (3,0" масс ь расчете на стирол), характеризуются узким распределением частиц по р&гмер&м (03.Г", частиц имеют диаметр 0.3 мкм), при наименьшей концентрации МАК ь змуль';":: t0.ll масс в расчете на стирсл) оор/йуется суспензия, . fcüí которой им-ч/Т диаметр 0.6 мкм. а Т.07. частиц - диаметр в интервале 0,15-0,Я мкм. При концентрации МАК в змульспи. равной 0,5 и 1.CI масс в расчете на стирол, образуются полимерное суспензии с широким распределением частиц по размера)»:. • Частиц» сополп.мериих стирол-метакрилатных суспензий, синтезированные при разном содержании МАК в эмульсии, ьо-видимому, суаест-венно отличаются'состаьом поверхностного слоя. В первом случае, при высокой концентрации МАК в эмульсии, на поверхности частиц формируется адсорбционный слой, преимущественно состоящий из поверхностно связанных карбоксильных групп, а также полимерных цепей, содержащих Фрагменты молекул инициатора ориентироымих на границе раз-

дела Фаз. В этом случае, по видимому, молекулы стабилизатора ди-п-толил-о-карбалкоксиОенмкг^инола. как менее поверхностно- активные, ьмтесняотся из зоны адсорбции слоев в объем частиц.

При низкой концентрации 1Л/.К ъ эмульсии поверхностный слой ГОЛ состоит в основном из молекул ди-п-тсо;ад-о-к;1р0алкокси!1^нйлкарбинола. При других концентрациях МАК в эмульсии образуется полимерные суспензии, содержание те и другие частицу.

Образование полимерной суспензии с бимодальным распределением частиц по размерам при высокой концентрации МАК в исходной эмульсии обусловлено протеканием эмульсионной и суспензионной полимеризации стирола с МАК и формированием частиц по резным механизмам.

Ввсс-адя устойчивость полистиролметакрилатных суспензий, полу-

. "TT— •

( #><

Ne. 5. *<«рофэтсгр«4ил н гистогр»«.» рлслрочяечиц Ч«С5ИЦ flOlt>CTnpO*M«Tatfp<tfc¿»9t сусп«н*«а, no*ywíHxo» ■ лр.чеутст»и» £Гл, л? рм»«]**. Сод«р»*ди« J.A.4 в mck:vi:ä »чу i .сил . v.JIIj медь/« стирав» (J.I S шее. • стиро»).

.: г.етогро** р*спредв-«шгл ^ъстхц п . ►■•Д сус-

fl«HSMN, ло*уч«ино1 a прнеутеТ »■■ ff Л, no ралимрмм. СоА*ра«ии« UAX » меюдмо» эиуяьеми - 0,34ö5 иа1к/| сткрс,«« (3.0 1 м»се. ■ рвгчгт» и» etHDCi).

-12- " '' ченных в присутствии ди-п-толило-карбалкокси^нилкарбинола и в 'его отсутствие в растворах NaCl позволяет осуществлять ковалентное свя-зыкшие белка заданной концентрации с поверхностью микросфер.

2. СИНТЕЗ ПОЛМСТИРОЛВИНИЖЗГЛЫКИАПЮ СУСПЕНЗИЙ.

Из литературных данных следует, что полимерные суспенвии, частицы которых на поверхности содержат сульфо-группы, получают эмульсионной полимеризацией киниловьх мономеров с'сульфосодержащими ссмономерами. например, стиролсульфонатом., металлилсулыКшатом ,. винилсуль^онатбу и другими. Полимерные суспензии характеризуются высокой устойчивостью в процессе синтеза, при ..хранении виооким распределением частиц суспензии по размерам, диаметр изменяется в интервале 0,07-0,2 мкм.

Для синтеза полимерных сусшнэий, частицы1 которых на поверхности содержат сульфогруппы.и характеризуются у?,сим распределением по размерам нами была выбрана сополимеризачуя дтирола с ьинилсуль-Фоиатом в отсутствие ПАВ. Выбор этого спссобал-полимеризации был обусловлен тем. что в отсутствие ПАВ можно создать условия для формирования ГШ по одному механизму - из микрокапель мономера, что облегчает регулирование распределения .частиц по размерам.

Исследования проводили в широком интервале объемных соотношений мономер:вода, концентраций винилсульфоната и инициатора - персульфата калия, при температуре 70 * С и скорости перемешивания эмульсии мономеров - 460 об/мин.

Размер час1иц полимерной суспензии и ее устойчивость в порву» очередь будут зависеть от концентрации персульфата калия и винилсульфоната, определяющих количество ионогенных групп на поверхности частиц. . •

Концентрацию инициатора изменяли в интервале от 1,67-1(5* моль/л стирола до 6,71-;бамоль/л стирола (от 0,1* до 2.ОХ масс в расчете на стирол). Исследования проводили при разных концентрациях винилсульфоната (ВС) равных 0,697 lôf 3.40 l6f 0,97-1С1*И 0,139 моль/л стирола (от 0.IX-до'2.ОТ масс в расчете на стирол).

Как и следовало ожидать .скорость сополимериэации стирола с ви-нилсульфонатом возрастает с увеличением концентрации персульфата калия пропорционально степени 0,5. т.е. процесс подчиняется обычным закономерностям радикальной полимеризации. . ■

Изменение концентрации винилсульфоната в 20 раз практически ке . отразилось на скорости сополимеризации, характере кинетической кри-' вой конверсия-время и молекулярной массе полимера. ■•"''..

Устойчивость полимерных суспензий в растворах NaCl была ьысо-

-л

кой: уже при концентрациях персульфата качия и ВС равных 1.67.10 и 3.4а-10J моль/л стирола соответственно, суспензия устойчива в 0.2М растворе NaCl, а при концентра!Шях персульфата калия и ВС равных 3,35'Ю-* и 6.97' iff' моль/л стирола соответственно - в О.ЗМ растворе NaCl.

Практически все суспензии содержат частицы двух размеров, причем во всех случаях независимо от концентрации инициатора и ви-нилсульфоната содержание частиц большего диаметра (0.5-0,8 мкм) составляет 60-80Х, а 20-40Х - частицы с диаметром 0,1-0,2 мкм (рис.7). Присутствие высокодисперсной фракции частиц вполне объяснимо:' винилсульфонат и персульфат калия растворимы п йодо и частицы формируются в процессе сополимеризации и по механизм^ гомо •• геьной нуклеации. > j

Зависимость молекулярных масс полимеров от концентрации персульфата калия имеет экстремальный характер. Это обусловлено протеканием полимеризации в частицах разного размера, содержащих неодинаковое количество радикалов.

Показано, что при введении ВС в стирол вследствии перераспределения ВС мезду мономерной и водной Фазами резко расширяется распределение части'д по размерам, появляются частицы, средний диаметр которых равен 0,2 мкм. причем чх много больше, чем 20?.. I •

Увеличение содержания мономера в исходной эмульсии приводит к повышения размера частиц суспензии Например,при концентрации ВС и персульфата калия, равных 3,355-1бл моль/л стирола,увеличение объемного соотношения стирал:вода от 1:9 до It 2 приводит к возрастанию средних размеров частиц суспензии от 0,50 мкм до 1.8 мкм. Распределение частиц по размерам во всех случаях широкое.

Тагам образом, проведенные исследования показали, что концентрация инициатора, винилсульфоната и способ^получения эмульсии (введение функционального сомономера в стирол или в воду) существенно влияют на распределение частиц по размерам.Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при сополимеризации стирола с ви-ннлсульфонатом невозможно получить полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам из-за протекания эмульсионной полимеризации в полимерно-иономерных частицах, образованных по механизму гомогенной нуклеации. Однако, большая разница в диаметрах частиц двух фракций предполагает возможность разделения частич по размерам методом центрифугирования и после этого их использования в качестве затравочных для синтеза полимерных суспензий.

»с

П- П

с? 03 СЧ 05 га 07 4.1

^гзд* ......... л

ШЖПЯВЙ

Рис. 7. ¿¿жрофотзгра^ия и гистэгра^а распределение ча.стиц пояцсхиррлсульфэнатной суспензии по размерам, полученной при содержании р*аном 3,36-Ю*3 моль/л стирола (0,1 % «асс. л-расчете на-стирол) и концентрации вкнил-суль^рната- ВС. равк&й 0,139 иопъ/л стирола (2 2 ыасс. а- расчете на- стирол).

зо-

20

3.АДСОРБЦИЯ БЕЛКОВ 11А ПОВЕРХНОСТИ ПОЛИСТИРОЛМЕТАКРИЛАПШ СУСШВИЙ.

Влияние концентрации акрилоього мономера в исходной эмульсии на диаметр частиц полимерной суспензии, распределение их по размерам, на адсорбцию белка и чувствительность полученных на основе полимерных суспензий тестов в литературе описан весьма скудно. Однако, эти данные необходимы для выбора условий синтеза тестов с максимально возможной чувствительностью.

В данной главе приведены данные по исследованию влияния распределения частиц полистиролметакрилатных суспензий по размерам и концентрации звеньев метакриловой кислоты в сополимерной цепи, присутствия стабилизатора, растворимого в мономерной фазе эмульсии на адсорбцию белка - человеческого плазменного альбумина. ЧПА. Кроме того, сопоставлены количественные закономерности адсорбции белков на поверхности частиц суспензии с чувствительность» диагностической тест-системы, характеризующей ее работу.

Применяли пслистиролметакриллтные суспензии получали а присутствии ДТК и в его отсутствие.

Выбор в качестве исследуемого белка - ЧПА определяется его доступностью и наибольшей охарактеризованностью.

ЧПА очищали от примесей, низкомолекулярных веществ, димеров и агрегатов, методом жидкостной гель-хроматографии на носителе ЗерЬаго5е СЬ-бВ.

Концентрация суспензии полимерних частиц, используемая в процессе адсорбции,составляла 2-2.22.

Величину адсорбции ЧПА на полимерных частицах рассчитывали по разности концентраций белка до и после адсорбции.отнесенной к общей площади поверхности. Концентрацию белка в супернаталте после центрифугирования определяли спектрофотометриче^ки на спектрофотометре цч-71з Ересогс! «40, в кварцевом кювете толщиной 0.2 см, при Д »279 нм.

Для изучения процесса адсорбции белка на полимерной поверхности была создана модель антигенного латекс-теста с адсорбированными молекулами ЧТА на полимерных микросферах.

Напомним.что при низкой концентрации МАК в эмульсии (0,22 масс в расчете на стирол) в процессе сополимеризации стирола с МАК в отсутствие стабилизатора образуются полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам, средний диаметр частиц составляет 0.0 мкм. Увеличение концентрации МАК в 10 раз при прочих равных условиях сополимеризации (концентрации инициатора, температуре, соотношении мономерной и водной фаз) приводит к образованию поли-

-16- ■

; - .ч

мерной суспензии с широким распределением частиц по размерам. Средние диаметры частиц составляют 0.4 и 0.15 мкм. их содержание составляет 85 и 1БХ от обкего числа частиц соответственно. Поверхностный слой частиц суспензий. полученных при разной концентрации МАК в исходной эмульсии, различается концентрацией поверхностно-связанных карбоксильных сульфо-групп, а следовательно зарядом и устойчивостью частиц .

Изменение заряда поверхности частиц и состава поверхностного слоя не может не отразиться на адсорбции белка на поверхности частиц суспензии.

Для того, чтобы оценить это влияние, адсорбцию ЧПА на сополи-мерных частицах исследовали при ионной силе среды 0.05 M и при следующих значениях рН; 4.0; 6.0; 7.0; 8,0. После смешивания н инкубирования равных объемов полимерной суспензии и растворов белков различной концентрации в течение 16-18 часов несвязав'аийсч с частица.«« белок удаляли центрифугированием с последующей промывкой суспензии соответствующим буфером. На рис. В,У предстаыкны изотера адсорбции ЧПА на сополимериых микросферах с ПС/МАК^ и ПСЛ'-АК^ полученных в отсутствие ди-п-толил-кгфбахгазкснфеншкаЬоонсаа при рН среды 4.0; 6.0; 7.0; 8.0. Видно; Что характер кривых адсорбции ЧПА на полимерных микросферах практически одинаков, различаются они ^наклоном кривых, величиной максимальной адсорбции и временем ее достижения.

В.таблице 1 приведены значения предельной адсорбции ЧПА на полимерных частицах, -полученных в присутствии ди-и-толил-о-карбал-коксифеннлкарбанола и в его отсутствие при различны^ значениях рН среди, Величина предельной адсорбции ЧПА зависит от количества звеньев МАК в сополимере и выше ла ,частицах суспензии, полученных при меньшей концентрации МАК в эмульсии. По-видимому, о увеличением в поверхностном слое частиц количества полимерных цепей, содержащих звенья МАК, т.е.1 с повышением отрицательного заряда поверхности возрастает, силы электростатического отталкивания между частицами и молекулами белка. Максимальное количества белка адсорбируется на полимзрнах частицах при рН среды, равном 4.0. В щелочной области значений pit (6.0; 7.0; 8.0) величина адсорбции белка на поверхности частиц о разной»концентрацией функциональных групп практически одинакова. Однако, при. pli среды 8.0 предельная адсорбция ЧПА на частицах с высокой концентрацией карбоксильных групп существенно ниже, чем при pli 0.0 и 7.0. И:в этом случае, по-видимом\, возрастает отрицательный варяд полимерных частиц и электростатическое отталкивание между частицами и молекулами белка.

Рис. to. Изотермы 4'.ik не т.6:Tr,...x по'гистирог-

метагрилэ^ьгх суспензии, п-энученних ■ отгутоп/е ХТГ.. при kAj' » ис^одн^я г-уньеии,

р«а»ю* ¿ % масс. i расчете н* стчрэа, при % рваных значения* pH средыг

1 - 4,0; г - 6.0; 3 - 7,0; 4 - tí,о,.

к« .15

. Рис.

<a«e¡wst «дс.зрвааи Ч.Н н» члстпцх п:.-.«гир:»-мтлгртзпж сустеияхж, пс«ученных • стгус:«/» мГ.{. чрк *:,.«цеит;ьзк« Ш ■ мхэдг* эму»: cm, га»и'.'й 0,2 Я.ыасс f yacvcTf чЯ стирок, np:î раянья staiiOi'.H'-x p;J. : - 4,0 ; 2 • С,С ; 2 - 7,0 t ; - h,О

Значения предельной адсорбции Т!ПА на чаог.шгх полис/;иролметакриловых суспензий; получении« :.. в отсутствие и присутствие КТК

Таблица 1

I---—I—:-;--1--:—!---—------

| I в отсутствие ДТК | в присутствии ДТК , . |--—----1---------

I рН | Гпред. мг/м

I ■ ь-- I .--Ч----т----

| | ПСТ/МАКад | ПСТ/МАКад | ПСТ/МАК0| | ПСТД(АК,„

I--—Н—--1——:-1--:—I--

| 4.0 г 4.46 | 3.20 | 2.0 I 3.0

| 6.0 | 3.60 I 1.70 | 0.8 I 1.3

| 7.0 | 3. БО | 1.76 | 0.66 | 1.0

I 6.0 I 3.66 I 0.70 | О.Бб I 0.9 .

1_1_.__-О.______ __'л.___I_

Влияние условий иммобилизации белка на полимерных микросферах на чувствительность получаемого латекс-теста оценивали методом РЛА. Как было показано выше.суспензию полимерных частиц, с адсорбированными на их поверхности молекулами ЧПА, агглютинировали моноспецлфи-ческой антисывороткой, действующим началом которой являются антитела к. иммобилизованному белку (ЧПА), специфически связывающиеся только с зтим белком. Чувствительность метода РЛА оценивали по максимальному разведению антисыворотки, при котором РЛА еще обнаруживается. V',

На рис.10. 11 представлены зависимости чувствительности РДА от концентрации ЧПА в растворе.при различных значениях рН среды.

Видно, что чувствительность РЛА при различных значениях рН среды практически не зависит от исходной концентрации ЧПА (при С >1 мг/мл). Возрастание чувствительности РЛА для всех вначений р>1 среды при низких концентрациях ЧПА в исходном растворе обусловлено неспецифической реакцией. С увеличением содержания МАК в поверхностном слое частиц полимерной"суспензии чувствительность РЛА снижается. ."■■■' •.' Таким образом, проведенные исследования показывают, что для получения латекс-тестов о оптимальными свойствами на основе по-листиролметакрцлатных суспензий целесообразно прогодихь сополимери-'агавт. мономеров при концентрациях МАК не выше-0,2323 моль/л стирола. Однако^ чолистиролметакрилатные суспензии.полученные при .не• высоких концентрациях МАК в эмульсии,устойчиьы в растворах МаС1 при гаяцентрьщда не более 0.1 N. т.е. : иммобилизация болта на поверхность микросфер осуществляется на грани устойчивости системы.

;' Бо.'^уе высокой > стабильностью характеризуются иолистиролметакри• латные суспензии, полученные в присутствии стабилизатора ди-н-то-.

I

ч

I

-19/

Pu». 10. Змкеилзгтк ovtcrmreíiJioerJ ?** пниьернш .«усяммМ. язи.-ыиж » oteyîCT»« ДИ, прк кзнцентрг-w« ПЛ.! • ксхздю» элульсиа, р«»-иаа 2,0 1 usee. * р«гч«» на старо», от юнцещраЦии Ti* ■ растюр« (» lMtp«<) при риэимх значен*« pif cptjui: I - 4,0; Z - Ô,U; 3 - 7,0¡ 4 - b,0.

Рис. Il . Зааис.ы^-ть чуктютмыисп РЛА паюиерге» .е>*сз«ию,' ямуч««** ■ -лсутгтм* ДМ, при

»-K^TpiüH 1 КСХЭДМЭЯ ШуНЬСИ.!, раа-*-Я Ч,г 1 иасс. ■ расчете .ча строи; от «•„■»и'.з^гтч-.-.:* «¿л а р..т>о?ч (i титрах»

три раз-и/,пп«чгч;|яг< р,i срыы: I - ¿ - 7.0; Э - O.J.

л^л-о-карбалкоксифенадуарбинола, ЛТК. Они устойчивы в 0,3 N раствора* Иг.С1. Эти суспензии были получены в тех яе условиях,. концентра-' ; ция ДТК была равна 12 масс в расчете на стирол. Полимерные суспс-н-51М ичели узкой распределение частиц по размерам, но разный диаметр: при концентрации мегакриловой кислоты равной 0.2Х и 2,ОХ в расчете на стирол 0.4 и 0,6 мкм соответственно.

Модно думать, что в этом случае состав поверхностного слоя частиц различается тем. что при нивкой концентрации звеньев МАК в полимеркой цепа, он состоит из молекул ди-п-толил-о-карбалкоксифе-иилкарбинола и звеньев МАК, ориентированных на границе раздела фаз, а при высоком содержании звеньев мак - ди-н-толил-о-карбалкоксифе-ни-икарбинол вытесняется более поверхностно активными карбоксильными группами молекул МАК в псш^еркой цепи в объем частиц. В польву этого свидетельствует уменьшение диаметра частиц, которой практически равен диаметру частиц суспенвии, полученной в отсутствие ДТК.

Дшныо по адсорбции ЧПА на этих сонол«мерных микросферах( суспензии и чувствительности РЛА в зависимости от концентрации Оед-\ ка приведены на рис. 12-16.

Ив атом случае при увеличении рН среды количество адсорбированного на поверхности частиц человеческого плазменного альбумина уменьшается, а при повышен™ содержания МАК в полимерных цепях в лочсрхностном слое микросфер адсорбция ЧПА возрастает при всех значениях рН.

Обращает на себя внимание разница в значениях максимальной адсорбции ЧПА на микросферах. содержащих и не-содержащих в поверхностном слое молекулы ди-п-толш^о-карбалкокоифенилкарбинола (т;гб-лииа 1). Например, при р11-4, в первом случае Гц*. равно 2,0 мг/м . а во втором - 4,45 мг/м т.е. присутствие стабилизатора в новерхнсхзт- • нем слое частиц ухудшает адсорбцию ЧПА. На поверхности частиц суспензии, подученной при сополимеривации мономеров при высокой концентрации МАК ЗХ масс, в расчете на стирол в присутствии стабилизатора, адсорбция ЧПА 3,0 мг/м . Это близко к, значению Гии1>. для частиц, полученных в отсутствие ди-п-толил-о-карбалкоксифенилкарбинола. ■ .".'.''' '-"':. ■.'..'.-'".'.. V'. •/•'..::'..'

Максимальная чувствительность РЛА наблюдается при величинах адсорбции человеческого плазменного альбумина, не достигших пре-; дельного значения и составляющих 0,3-0.4 от максимальной адсорбции и при значениях рН среды, лежащих выше иэозлектрической точки белка. "—у., •- V.': ; •" '■,.•

Чувствительность РЛА в тестах, полученных с использованием частиц полимерной суспензии, синтезированных в присутствиестабилизатора, ди- п- толил- о-карОалкоксифенилкарбинола, о'каз цшеъ ниже наблюдаемой в тестах, при получении которых ЧПА адсорбировали на мик-

¡>i!C. 12. йэчерл» *scc¡>5.s«t ЧП4 н» «aevmax newciiç;*-нетахри-сньл суспензия, пэпученнь.-* i ;.т.{, при к;нце!ггр«и;:и llViI > исходной чмуя.сиа, ра»юй 0,1 * и»сс. • расчете н* стир:», при

лначгн;!лх р- среды: I - 4,0; ¿ - 6,0: о - O.K.

о

Рис. 13. «¡»»теряв щгегоаии ЧПА на «»стиаах пэнистирэл-'РТЬКрЯГ.^ГНХ суспчгпия, по'учекных я присуствиь ДТ";, к.'чизктрации i исходной эмульсии, pafHca 3,0 í касс. в расчете н» «■тирол.при fftV-i'x nMS4"H>í.4X pH ср :ды: i - 4,0 ; 2 - С,С ; 3 - fe,0 .

суспензий, лэдуианньз « присуствке ДГК, при концентрации ЛАК в исходной эиульсии, равной о,1 % масс, к расчете на стирол, от концентрации ЧПА а раствор« (■ титрах) при разных значениях рЙ среди: I - 4,0 ; 2 - 6.0 ; 3 - Ь.О . .

30007000. 60005000-¿300.

аооа.

2004 1000-

'.о г,О 3,0 *,0 5,0 /7

С»»*, А/Г/*/

Рис. 16 . Зависимость чувствительности РЛА полимерных

суспензий, полученных в лрисустеие при концентрации МАЛ в исходной эмульсии, равной 3,0 % масс, в расчете на стирол, от концентрации ЧПА в в разоре (в титрах) при. разных эначен/.ях рН среды: I - 4,0 ; 2 - С,О ; 3 - 6,0 .

росферн, синтез которых проводили в отсутствие стабилизатора.

Таким образом, необходимо находить компромисс между условиями синтеза и свойствами суспензии, выбирая концентрации стабилизатора и МАК таковыми, чтобы обеспечить как стабильность суспензии в процессе создания теста и при хранении, так и необходимую чувствительность РЛА. Были найдены оптимальные условия синтеза полимерных суспензий: концентрация ди-п-толил-о-карбалкоксифенилкарбинола - и масс в расчете на стирол, содержание МАК в исходной эмульсии - 0,21 масс в расчете на стирал.

Условия адсорбции: концентрация белка в растворе менее I мг/мл. рН ср?ды 5,8, ионная сила - 0,1М.

в и в о х и

3. Синтезированы полистиролметакриловые суспензии с узким распределением частиц по размерам и диаметром 0,3 -0,6 мкм, устойчивые в процессе хранения и при иммобилизации белка в физиологическом растворе.

2. Установлено, что при сополимеризации стирола с винилсульфо-натом в широком интервале его концентрации образуются полимерные суспензии с двумя наборами частиц из-за протекания процесса по эмульсионному и суспензионному механизму.

3. Установлено, что с увеличением содержания метакриловой кислоты в сополимере адсорбция белка на поверхности частиц возрастает.

■1. Показано, что адсорбция белка на поверхности частиц суспензии уменьшается с возрастанием рН среды, максимальная адсорбция наблюдается вблизи и.э.т белка (рН-4.0).

5. Установлено, что устойчивость полимерной суспензии, полученной в присутствии .стабилизатора, повышается, а адсорбции Оепка на поверхности частиц снижается по сравнению с наблюдаемыми в его отсутствие.

6. В модельных условиях с использованием полистиролметакриловых суспензий, полученных в присутствие стабилизатора установлены концентрации белка, необходимые для достижения максимальной чувствительности реакции латексной агглютинации.

Основное содержание диссертации опубликовано в слздукячих статьях :

¡. Грицкова И. А.,. Крашенинникова И.Г., Дорохова Е. А., Пуоо П.В., Аль-Хаварни Л. Ч. Адсорбция белков' на поверхности частиц польстиролметакриловш суспензий (принята в печать в редакции Ксш-лойдного журнала)..

V,. Грицкова И. А.. Крашенинникова И.Г., Аль-Лаварпн Д.И.. Нусо П.В., Дорохова Е.А., Гжива-Ниссиньока Н. Устойчивее полистиродме-такрилатние суспензии с узким распределением частиц по размерам (принята в печать в редакции Коллойдного журнала).

а. Грицкова И.А., Крашенинникова И.Г.. Аль-Хаварин Д.И., Нусс П.В., Дорохова Е.А., Гусев С.А. Адсорбция белков на полистирольных микросферах и постановка реакции латекс-агглютинации (принята в печать в редс1кции Колдойдного журнала).

4. Грицкова М.А.. Крашенинникова И.Г., Дорохова Е.А., Нусс П.В., Аль-Хазарин Л.И. Исследование адсорбции белков различной природы на поверхности частиц полистирольной суспензии (принята в печать и журнал "Полимер" республики Польша).

'Тираж ЕО

Заказ СО

Ротапраиткая.МИТХТ .¿ш.М.В.Ломоносова М.Пироговская -уд. ДЛ

Бесплатно