Разработка иммуноферментных методов определения биологически активных соединений растительного происхождения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ6 од

з о ЛВГ 1993 :

Г'СС'-С'-СКЛЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ЛКЛДЕ?Л1Я ТОНКОЙ ХИЛИЧН СКОЙ ТЕХНОЛОГИИ МЛ. ЛОМОНОСОВА (Г'ИТХТ)

На правах рукописи

ЕРЕГ.'ЕНКО • Сзотязиа Ндаолазснэ

РАЗРАБОТКА МИМУНОФЕР'ЛШТКЬК МЕТОДОВ ОГРЭДЕЛННУШ БИОЛОГМЧ5 ЛШ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

(слгциггаизсть - 02.09.10 биосргсна- »«хая хсиия, хютш природных и физкэяегичзски екти-кых г.сщестп)

Аоторофорат

Диссертации иг есмсхг.н-.сэ учоной с, епс^м кандидата п-'-ксеадх наук

г/ссксл - нзз

•; ■ • • • ,-а

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственйх и ароматических растений и Институте Оиоорганпчвской химии им. П.Ы.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Научный руководитель доктор химических наук А.И. Мирошиков

Официальные оппоненты:

доктор химических наук В.П. Демушкив

кандидат биологических наук С.П. Амбросова

Ведущая организация-Институт физиологии растений РАН

Защита диссертации состоится " " 1993 г. в " /Гс""" «часов на заседании специализированного совета Д 063.41.01 при ШШ им. Ы.В. Ломоносова по адресу: 117571, г. Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ по адресу: 119831, г.Москва, ул. М. Пироговская. I.

Автореферат разослан * " ■ Х993 г. -

Ученый секретарь специализированного совета Д 063.41.01

Кандидат химических наук / / А.И. лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Аудупштостъ ппобл^-ч. Успохи биотехнологии растений, особеппо разработка способов паращпвзнпя клеточшх культур rncEnz растепн!!, позволила значительно облегчить задачу получения ллячостж соэдинеапЯ растительного происхождения,- в частности лскорстЕошпг Есцзстз. .ГТрггаржл лекарственных ве-цоств, пспользусгin d ш,;лзрчсских количествах, могут слу-'

!31ть сорло'пшэ глщс03пдц (дпгопсттц, ллп1токс1ш) Digitalis Inrata, D. purpurea; протлвоопухолегаз препарата Catharantus roseua (ЕипОластгя, Ешкрпсгсп); пяальгогпкл Papaver GOCTirerirn (кодеин, repjan) з iriorno другие. Из-за слогаюсти хппчсского состава !,~icnn продуктов рзстлтольпого происхождения пештг'л хгглчссг.ого сштоза, ' до^о одпокогшопенппп продуктов, яо всегда ycncnnii. И по ¡тагах случаях нх биосинтез в рзстсппл оказшзасгсп предачтатольпш. Новая экспериментально созданная с:-.стс::з - клетки п ткаот шееза расте-"ГЛ, гарппнвзе.'лно па ептателыпа: ерздэх в строго контролируема условиях, позволяет создавать пргтгщгзщолшо попт тех-^ологгп-для прс:стлошосга п сольского хозяйства, одпоко отбор нопболео прддуктагштх клопов прл Емргтлвагош растительно:! т::гшп в культурз Сшззог чссто з-лрудпел из-за стсутстсия 4Jтстгггтодыгого Г'Оro.ro сярэдолсгпя плтсрссУЕЦПХ исслодоеято-ля С03ДШС1ШЙ. В деппем случае rrp*?::rctnio гс.^упоаналнза тше-07 г-л ур-"' и-р?л трэллпезвпя мэтодсп, тегт кзк

т.:' ■ :'.сгх": -л :;г.гогрс"ля, гсзспсг.тро^отрплгасског^Т-зк-I. . ";"! : ":;;:госл1г.а*.трс:гатогрс"":л, ::бо, кск прггзло, для ого тл по грзбуогся с.гг.-"тл ит-у■чгггзликл обрсботхо сор'^п, сспрл^яттгм с pcrcci jrov"|"i *?rci:t стрэлолгсг-гх вз-• ( "tj и- иг- "?р, п-сггут:* i. '"', :•: г .г'с:т-

hoö преимущество ихдаогяализо заключается в его экспроссности и i3okid::jo3iii анализировать одноврсмашо до ста образцов.

Среда методов иклукозладиза наиболее популяраш становится КША, что объясняется безопасностью а удобством работ с нэрадаоактишзш материалом в сравнении с К1Л, а тс:;с;о ьш-poiaiM распространением саиилалыш: спактрэ^отомотров, с помощью которых г,¡олшо проводить измерения опткчеег.ой плотности в S6 луйках шяшэта едгюйремзшю. яроскольку и в а и РИЛ действуют одви к то so теродинамячеекпе ограничения, а присутствие ферментативной метки Mosa! Оать обяаругшо, есл: сна находится б том :::а диапазоне молярных концентраций, с каком 00ПЧ1Х0 используются радаюакЕшшю поотош, то чувствительность и из<3;тратолыюсть обоих ызтодов оказизается сравнимой.

Пели и кссладоветш. • Цель» настоящей paöoiii яв-

ляется .созд&ша ^.мунооермептшх тзст-еистем, примшш-ыг: для использования в биотехнологии раскопай, пун опредолошгд сведущих шэкоиолекулдрицх соединении: стсфарпна - елсалоида Stephanla glabra Uiers, сбладазсцого' ьятшсолинзстерозпсЛ активностью; папаверина - алкалоида F.ijever somniferum, относящегося к спазмолитическим средствам; дигокенна и родствец-иш: соединений - сердечник глпкгшдов Digitalis laaata.

Для достижения этой цели решали следущие задачи:

1. Синтез коныойфованзых антигенов кизкомолекудярпцх соединений с белковши носителями, определение степени замещения полученных коньюгатов. Выбор оптимальных концентраций для сорбшш аа пластике при проведении твердофазного ИФА для' выявлении специфических антител.

2. Получение поликлональных сывороток с васониы титром антител к стефарину н папаверину. Оценка их специфичности.

3. Получение ыоноклональшп антител к дагоксдву, определение их характеристик. Наработка моноклональных антител в

препаративных количествах, выбор способа очистки антител.

4. Синтез меченых реагентов для иммуноферментного анализа и подбор оптимальных рабочих разведений.

5. Создание на основе полученных аитигел твердофазных иммуноферментных тест-систем для определения указанных соединений в экстрактах растений или клеточных культур. Подбор условий проведения экстракции-, и ИФА.

6. Сравнение результатов анализа проб традиционными методами (ВЭЖХ, ТСХ) и результатов, полученных методом ИФА.

Научная новизна. Впервые созданы высокочувствительные : иммуноферментныетест-системы для определения стефарина и папзверинз, осуществлен синтез' коньюгировэшшх антигенов и мечошх ферментом алкалоидов. :

Получены и охарактеризованы внсокоэффинные моноклональ-ные антитела к дигоксину, на основе которых предложен инги-биторный вариант Ш для определения дигоксина и родственных . соединений в растительных экстрактах. Специфичность, высокая ■ чувствительность и точность метода подтверждены с помощью данных ВЭЖХ-анализз.

Основные положения, выпоенные на защиту.

1. Разработан, твердофазный ИФА для количественного оп-_ ределения стефарина.

. . 2, Разработан, твердофэлный Шк для количественного оп- • ределения папаверина. : ;

3. Получены я охарактеризованы.моноклональпые антитела - к дигоксину.

4. Газработан ИФА для количественного определения ди-гоксигениновых гликозидов.

Практическая значимость работы. Чувствительность разработанных методов и простота выполнения анализа позволяют • использовать иастоявдае тест-системы в биотехнологии растений для изучения условий накопления вторичных метаболитов в растениях и для селекции клеточных основ.

Твердофазный ИФА определения стефарша шробнровап к используется в Институте ф'лзколопш растений для селекции клеточных клопов Stephanie; Glabra, продуцнруетдх стефар;ш. С учетом конкретных условий проведения анализов, били.подобраны оптимальные вариант экстракции алкалоидов из влаяной ткани.

Разработанная тест-система определения дигоксина и родственных соединений Сила использована для подтверздення данных селекционной работы по Digitalis lanata, проводимой в I3IQ ВИЛ?.

АпроОпшт работг. Материалы диссертации докладывалась на конференциях: Всесоюзной конференции "Современные направления создания |".:здитшских дпагаоетикушв" (декабрь, 1983 г., Москва), Украинской республиканской конференции "Применение ккмунофор.'.:ентного анализа в медицине" (ноябрь, 198Э г.)

Иубжкащпт. Материалы диссертации отражены в 4 статьях, 3 тезисах.

Обьен и структура диссертации. Диссертация изложена на страшщах машинописного текста н состоит из введения, обзора литературы, теоретической ц экспериментальной частей, выводов, списка литературы, включелдего источника. Работа иллюстрирована схемами, " таблицами, рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Разработка 'иммупофврментной тест-системы для количественного определения стефарина •

В качестве реагентов в твердофазном иымуноферментном методе определения стефарина использовали политональные ад-

титола к данному алкалоиду и коныэгат стефаринэ с ферментом (пероксндаза из корней хрена). Антитела получали иммунизацией кроликов коныогировашшм антигеном стсфарин - бычий сывороточный альбумин (содержавши 45 молей стефарина на I моль белка). Иммуйоген бал синтезирован по следующей схеме I:

н,ео

ии

С0

НО-М

ь

ЛСо.

ш

ысосн^со-т

По аналогичной схеме получали коньюгат гаптена с . ферментом. ' •

Титры антител к стефарину определяли твердофазным КФА , предварительно ЕЫбрав оптимальное значение концентрации котаюгированного антигена стёфарин - бычий сывороточный альбумин для сорбции на твердой фазе. Антистефариновые антитела обнаруживали в сыворотках иммунизированных животных в высоких титрах - до 10®.

В иммунсферментпом методе определения стефарина использовали Фракцию , выделенную из сыворотки кроликов ионооб-

манной хроматографией на DEAE - целлюлозе, после Предварительного осакдения насыщенным раствором сульфата аммония и диализа.

Специфичность полученных антистефаршовых антител оценивали по их способности вступать в перекрестные реакциями с другими алкалоидами Stephania glabra, такими как циклеащш, тудуранин и их производными, суммарной фракцией алкалоидов, не содержащей стефарина, а также шндаршгом, папаверином (форлулы соединений приведены на рис.1). К сорбированным на твердой фазе антителам добавляли 10-кратные разведения указанных алкалоидов в инкубационном буфере и раствор стефарина, меченого пероксидазой. Алкалоиды не ингибировали реакцию антител с меченым стефарином. Однако следует отметить, что биосинтез алкалоидов St. glabra еще недостаточно изучен. Исходя из иымунохимических свойств полученных антител - в коныогировашом антигене, использованном для иммунизации лабораторных животных, ■ стефарин присоединен к белковому носителю через атом азота (см. схему получения коньюгата) - можно предположить, что такие антитела должны вступать в перекрестные реакции с производными стефарина, имеющими заместители при азоте, если таковые будут присутствовать в анализируемых образцах.

В предлагаемом методе стефарин исследуемого образца конкурирует с меченным пероксидазой стефарином , за ограниченное количество специфичных антител, сорбированных на 96-луночяые полистироловые планшеты. Для проведения анализа исследуемые пробы смешивали с достоянным количеством меченого алкалоида, выбранным после преварительного титрования

^VY4»

H5coKXJ'

"OCH3 Циклеапип

Норщпсдоеппп

Стефарпп

Тудурзшш

'Папспорпл

Глпдаргп;

Ряс. I. Формулы покотораз соэдзкпгй, пспользуогпх для оцсшсл споцЩпчпостл сптптол :: csc'-зр^пу.

э

котюгато стсфарин - нороксндаза, после 30-*дзутно2 шасуйз^ ЦШ1 измеряли ферментативную активность, связанную с твзрдоЗ фазой. Исходя из значений оптической плотности, полученных для стандартных растворов стофарша пзвзстноЯ колцэитрзциа, строила калибровочный граф;», на основании которого опрздо-лялп концентрацию стефарлна в образцах. Получкше дшшо хорошо коррелировали с данными ТСХ-ааашза (г = 0,89),

Чувствительность разработанной . тест-система составляет 10 иг/мл, что соответствует приблизительно I ют сухой № 10 шг влаацой ткани Зг. еХаЬга. Реально 86 для проведения анализа требуется то количество тканп, которое коано достаточно гсчно взвоешь. Рабочий диапазон тост-системы: Ю пг/т - I мсг/мл.

11. Разработка икмуноферментной тест-систем для количественного оаределешя папаварша

В качество реагентов в твердофазном ишуноферментном методе определения папаверина использовали полнклональше антитела к данному алкалоиду и коныогат папаверина с пе-роксвдазой из корней хрена. Антитела получали иммунизацией кроликов кошьюгированнш антигеном папаверин - бычий сывороточный альбумин (содержащие 15 моль папаверина на I моль Селка). Ишуноген был синтезирован по следующей схеме 2:

и&^^мощсн&со-вм

Г

2.

ЗГА

По аззлогтглсЗ сгсз Сил получсз ксшггэт сггзсзскпэ-рза с порсксадззоЗ пз хрс^э.

с^гргггн. с^здз—гггэ зпгсэ езтлгол п снде-лспзв гг.гдо'зггсву.ггакяа СР-ХГЛ пз с~сротск проводили так-гсх з случсэ паяукпзя сятя:ая з сте'арт'иу. Титры антител з сспс-сргпу еоетеггз Ю4 - Ю5 .

Спсцг^плссть езтзгзл к папаверину оценивали по способ-гости вступать о пермфзегско реакции с другим алкалоидам г:с::з, иптрг'-зр протснипсч, .кодеином, тебаинсм, нарцеином, "згрглтггсу, перзотоппнш, корешем, здлотерпптонппом, а также сс--рг~с."*.ся з Рсрзуег есга1Гегиа ызконовой кислотой (форлу-•¿с'.гггггг! грггзлг™! яэ рзс. 2). 10-тл лрзтпнэ разведения пс~г'с?Э э гзкубецзеннем буфера а раствор меченого гсрсзсядазоЗ пг^сгсргпа добаЕътлл к сорбированном антителам; дсгг:э создззкпя пз пнгзСлррваля рзакциз антител с.неченнм гйлгпэрзнем. '

Па ссиогз получепйах поотслопальпых антител к папаверину ""л разработал коявурэятЕна мрясат-ПГА. для определения г^игг^г^пз э растительных экстрактах и водных растворах зл-*1 "То спнтзтпчосксго прслзЕоддого - З-асшспгпгсэра-3 пргджаспзсм иотедэ пппсгзр:ш анализируемого образца •сггзуеаюуо? з иочрпш порск&гдассз пелаггрппем за огргютен-тоэ .-с.'пчостзо ссрбзроэктах из .тззрдсЗ фазе ентител.

папаверин

Г/-СН3

Морфин \ •

Наркотин

у-СИ*.

ос%1 л

ось н/о^аь

Тебапн

^^ <о- ^ Л,.

ч0"

Протопин «¿-аллокриптонин Наркотолин

Рис. 2. Формулы некоторых соединений, используемых для оценки специфичности антител к папаверину. .

Чувствптольпость метода составила I яг/мл. Работай диапазон: I пг/мл - 100 нг/мл.

III. Разработка злордофазного пммуиоферментиого анализа для определения догоксплз и родственны;: соединений в Digitalis lcnata основе мопоклоп-лызнх антител к дигокси-ну

Все кокьюгоровашше . антигены - сердечных гликозидов с белковыми носителями Сшл синтезированы по методу, omicaimo-

. Получены слздугщзе киньюгзты: дигоксин-человечий сывороточный альбумин (стопеаь замещения 9 моль цигоксина • на,

Г»

ноль белка) - был.использован для иммунизации чтаэтких: дп-гогсш-Ончий сыворсточний -сяьСумнн (степень зведения .12/-моль/моль Озлка) - применяли в твердофазном ПЭд для обдару-:и1пи антидн^окгиневцх апготел; ;; ланагосид С - геиоцаашш -(степень замззевпя 120; - использовали и качестве реагоэто о созданной тест-системе. Во время работы была использовав! 3 различные схемы цммунпзацш '¿сей, проведено оценка их фекатлзности для данного аятаг-^а.

В ходе гогшЕзает; кягз» по олаоЗ из дягеелыпв схем наш боли проведай: зезаяк^:« ааггеяг;вского лстиаулягсрэ. разрабатываемого л йЯХТ. со-алзхсо, использование сгету-ляторэ для данного езтнге:::. те дз-": "

Для получег-ж ысксгслспашох ачтигел садеиокнты лиш: ВЛЬВ/с с в^сожл т::гр:г« з:т:гед :: дзгсксиву слизала по методу Келпра к ^пле^трГлз с глотке;.-! находящейся в логарифмической фазе рост; сте&лшеа tr.izzr.22 аелскв ХбЗ.Ав 6553, на секретирусдей ^•.¿.'■г.огл^оуятш. Псгле опашня кя&тах ьугь-' ТЕЕировалл ко сп-'с^т^с.! срсдо. содерхк;оа гагексазгаи амиЕоптерзя г ло г."опои. Суиераа- -

танта гшшо&рэшиз гвердгззг:^ И2Л, ептнгелз обягруггрзлз с номещьв Хфоллчьяг. антител, г. 1дС ¡.''гш. гйчелаг перэхевда-оой, 'гакш образам гяяшклз только клони, сродуцпрЗгЕсгз тпдагокешюше сигнал- С. с^ло г^лзле^о 12 сол-хн-

толйкых клонов. Срзс паз сгобрзлн ■••:,

сатптел . с сорбировадза сзпяхао« -„иг. ^г-с..:^:-^

днгоксином в шацеатрецг; 50 Посла гэгг?л=:аго хро-

нирования мотодои щедолииа развгде:нгЛ вег !_.:рсс:^:о клони цродолгала продущфосзгь ' отп^п'агсппс^э ентнтола. Затем клонн бнлп црзопклинизг^-: евлеглззг:,

Дигокслгеншовшэ гликозида

Г.1ш:озид

о ЙГ-В3-

ДИГОКСИИ

Дезацетпллавэтозид С

С1Ч)з- Ланатозид С

I

Ас

Ц- остаток дититоксозы С1- остаток глюкозы

ДигдтоксигеналоЕЫо глшюзвдн

л Й

Глнко&пд

15- Дигитокспгзнин Пз- ' Ядгагоксин 61-1)3- Дезэцетиллаяатозид А С]-Вз~ Ланатозид А Ас

Гигоксигенпвоше гликозиды

И

ГЛИХ031ТД

Н- Лиоксигенпн

Бз- ГИГОКСИЛ 01—1)3— Ланатозид Б . Ас ■

Рве! 3. Формулы некоторых 'соединений, используемых при оценке спецйЯячвоств антиднгокешовых антител.

Нами Сила предпринята попытка приводить очистку аптктвл с помощью »Мшшой хроматографа: (на нолучешом иа:.ш г4&ш-псм сорбента днгоксш-AXfl-Gell ГО и па сорбенте протеин Л -сефароза). Однако подобрать услсслл элвции, при которых бы не наблюдалось значительной потери антигеп-связываадей активности антител, на?.: на удалось, поэтому очистку мопокло-палыцаг антител к дигсксин« проводил? с псшць» ионнообаен-пой хроматограф;:« па ЭЕЛЕ-целлюлого, после предварительного оеахдештя сульфатом амкошш из асцитной зздкостн. Продуктив-носуь штамма DI8 составила црв культивировании в культуре: 30-40 мкг/мл при плотности меток г<лл.шонЛи, при наращивании в асщтах: 5-8 мг/мл.

Клон DI3 продуцирует эиштела, относящиеся к подклассу GI, что бшш ерздел-ао твердефззнш' ИФА с использованием меченых перокепдазой коз ми антител к подклассам шейного Igu. Гомогенность полученных антител подтверждена при помощи электрофореза в 10 % :юг зкрилэтццом геле в присутствии до-дэцилсульфата : атрия. Константа ьза"\;одействия антител с дп-' гоксиеом (Ьхю" ) была определена ь Гарвардской ыэдицинской школе (Бопюп, США) использозшгсм ^Н-дигоксши.

Специфичность мопоклопальных антител к дигокешу представлена в таблице I. Евши данные, полученные твердофазным ИФА (в качество антигена использовали коньюгат ди-1"окоин-бнчяй #сывороточшй альбуглш), были подтиередепк п до-, полнепи п-рзкроста аптптсл с дл л:и:геишю:л) с 1;с..с;;ь:л метода РИА в Гарвардской иеяасшсг.сП слссла. Сор:,:улх: соодшхе-шШ приведена на рте. 0.

Таблица I.

Специфичность моноклоналышх антител Ш8

Соединение Перекрестные реакции,^

Дигоксин 100

Дезоцетилланатознд С 8Э

Ланатозид С 9?

Метилдигоксин* 46

Дигскспгешш 10

Дигитоксил 48

Лезацетнллапа?озпд А V

Ланатозид А 10

Дигитоксигенин 1,5

Гитоксш 0,07

Ланатозид В 0,01

Гитоксигенин < 0,01

Строфантин К < 0,001

* - полусинтетическое производное.

В качестве реагентов использовали коныогат ланатозид С-гёмоцианин и дигоксии-специфичные моноклональные антитела, меченые пероксидазоя из корней хрена. В предлагаемом методе карденолида исследуемого образца конкурируют с. конъюгатом ланатозид С - гемоцианин, сорбированным на полистироловые планшеты, за постоянное число меченых антител' ц растворе.

Метод ИФА с использованием меченых ферментом антител

выбран из следующих соображений: во-первых, быстрое выполнение анализа (две стадии инкубации и одна промывка); во-вторых, системы, работающие в условиях избытка моноклональных антител, дают возможность использовать тестируемый антиген в более широком диапазоне концентраций, чем в случае конкурентного анализа с применением меченого антигена , что очень существенно при тестировании экстрактов растительных культур, где содержание карденолидов может различаться в несколько раз. Еще одно преимущество метода меченых моноклональных антител заключается в практически полном исключении. так называемых матричных эффектов. И, наконец, немаловажным является возможность получения коныогатов антитело - Фермент, сохраняющих активность, по стандартным методикам; при получении" коныогатов шакшслекулярных соединений с ферментом часто наблюдается экранирование гаптена белком (как было у нас при попытке синтеза коньюгата дигокскн-пероксидаза).

Для проведения анализа в лунки 96-ти луночных планшетов с сорбированным антигеном и измеряемыми пробами добавляли постоянное количество меченых антител, и.после I ч инкубации измеряли ферментативную активность, связанную с твердой фазой. По значениям поглощения, полученных для стандартных растворов дигоксина •звестной концентрации, строили калибровочный график, на основании которого определяли концентрацию дигоксина и родственных соединений в образцах.

Нами было проанализировано 14 различных образцов Digitalis Lanata. Результаты анализа хорошо коррелируют с данными суммарного содержания ланатозида С, дезацетилланато-зида с и дигоксина, полученными с помощью ^ЭЖХ (при проведении анализа в одинаковых условиях г = 0,92). На рис. 4 и 5 приведены примеры определения концентрации карденолидов в образцах I и 3 двумя методами. В таблице 2 представлены соотношения карденолидов в некоторых образцах, измеренные предлагаем.! методом и методом ВЭЖХ

Рис. Ч. ВЭЖХ - анализ образцов 01;ч1а11з 1ала(а; а - хроматогргмма 200 мкл образца 1; б - хроматогрзмма 200 мкл образца 3; 1 - дезацетилланатознд С; 2 - ланатозид С; 3 - дигоксин.

" - кллнбровочний график о-двукратные [»звемкня oípaaus t » -MtfXfc. mus рггадеяяя обраапа i

Рис S . Опрежслошс стирании мрдеиилвдм > образцу 1 и 3 метолом ИФА

'la (5 лиц о 2.

Ссотлс. ::SrotnHfOE!íX глгосозидоп и образцах D. lcnat.fi, со;.г " ;. <.лашческон саду НПО Б1®.

Српвттвае.-.ие обрззцц БЭГ{-анал13 с сгсчзтом по методу внешнего стандарта Твердофазный ША"

1/3 1,26 1,25

1/2 1,028 1,05

2/3 т , 20 1.20

4/5 1,15 1,13

1-3 - потеря осунулся лисдпл.чго к:сушеятис свежих листьев D.lanata.

4,5 •- ис/.зра образцов сухой ткани.

Чувстслтольпссть созданной ?есг-спсге.\;ы составляет 0,1 пшь /мл (или 0,08 ;жг/мл) цягоксала, чтq позволяет достоверно определят?. ссдсрззш« кордегтидов в IG0 мкг влаявой пли 10 мкг сухой ткана. дал проведения япзлиза но требуется сложая предварительная обработка образца .приводящая к потеря» ъедастз, иск в глучзс ВЗКХ, кроме того, предлагаемся система позволяет анализировать большое число образцов одновременно. Рабочий диапазон теся-а.адемы: 0,1 нкг/мл - 2 мкг/мл.

ЕЫБОДЫ

I. Получены высокоспецифнчше полкклонэлшые антитела к алкалодом стефзрпну яг Stepíianla glabra Miera , и папаверину

пз Fnpaver bocnlierua. Осуществлен '-илтсэ коыьюгировзшшх антигенов алкалоидов с белковым носителем и алкалогщов, мэ-ч'ешгх ферментной нзткой.

2. На основе получении;; антител создана твердофазные Ешунсфермоитше тзст-систе;,л для определения указанных алкалоидов. Чувствительность разработанных методов определения стефарина и папаверина позволяют использовать их в биотехнологии растений. для селмадш клеточных клонов, . для анализа лекарственного сырья и контроля за качеством кедлшнеких препаратов.

3. Получены п охарактеризованы шеокоаффлшше конокло-нальшэ антитела к juiroiccuiy.

4. На основе ¡локомокг.лших антител к дигоксиду создан твердофазный иетуцеферхнлшй метод определения дкгоксина п родственных соединений г- рзстктслышг экстрактах. Специфичность, высокая чуистзг^сли'ссть и точность ыетода подтверп-дена с помоцьа дгнлп.: иэлл-анализа, что позволяет применять разработанный «охок в оистахнологап растений для изучения условий накопления длго^нгешшеилк. хгакозадоз в Dlgltalio lanata н селекци;: клеточныл г-чолоь, продуцирукднх дцголсин.

CID'GOI: РДРОТ. (ЯУНЛ1ГЛЕЛ!Ш1К LO 5SE ДПССЕРШШ

I. Далклсза U.U., „Чуйкова С.Ii., Оадоева

И.и.; Взсйлск ¡¡предикой I.M. спвздоло-

■.■rw:: 'xtcp^c-,.^!^:.: Л; .■ : ■

i'i'i-j // :. i. ; ■ . . и i, -

c. (/>-;.-ü.

?;. V.i:.., Cyau ••• ) -L., .-

O.Ii., i ; c:vx.; },'.i'., -jv::u:o:j '.'..„- . ' .]

. (. i :: ... •: j

Р. Г. Получение моноклоналышх антител к дигокспну // Биотехнология, -1993.-IM,-с. 38-40.

4. Еременко С.IL, Сухов И.Е., Мкрошников А.И. Определений карденолидов и Digitalis lanata твердофазным иммунофер-мойтяым методом // Биоорг. ли., -1993,-NIO.

5. Дашлова Н.П., Луцкова С.Н., Фадеева И.И., Василов Pit1. Иммуноферментпый метод количественного определения сте-фзрЙна // Тез. докл. всесоюзн. конф. "Современные напразле-йЙЙ, создания медицинских диагнсстикумов" - Москва.-IS8d.-c.52.

; : 6. Луцкова С.II., Данилова Н.П., Середа A.B., Василов Получение поликлональгак антител к папаверину для рэз-рзйотки ккмунофермептного метода определения папаверина // Щ):к<ш. всесоюзн. конф. "Современные направления создания ti-ЗШйнских диагностикумов" - Москва.- I9S8.-c.53. V 7. Луцкова С.Н., Данилова Н.П., Василов Р.Г. Разработка кЭДИоферментноЙ тест-системы для определения дигоксина на ochoce моноклональных антител к дигокспну // Тез. докл. укр. j)öcif,. копф. "Применение иммуноферментного анализа в медицине" - Харьков.- 198?,.- с 17.

ГМказ

178 тирад 80 экз.Ротапринт МГОХГ