Разработка иммуноферментного метода анализа некоторых алкалоидов катарантуса розового тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

МОСКОВСКИЙ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М. В. ЛОМОНОСОВА Специализировавши совет Д 063.41.01

На правах рукописи,

ВОЛКОВ СЕРГЕЙ КОНСТАНТИНОВИЧ

РАЗРАБОТКА ШМУНОФЕГМЕНТНОГО МЕТОДА АНАЛИЗА НЕКОТОРЫХ АЛКАЛОИДОВ КАТАРАНТУСА РОЗОВОГО'

02.00.10. Биоорганическая химия, химия природных-и физиолагичесш! октивннх веществ.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата гимичзских наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений.

Научный руководитель:

доктор химических наук - А.И.Мирошников

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор - Е. II. Звонков» . кандидат химических наук - В.В.Берэин

Ведущая организация - Химический факультет Московского "государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Защита диссертации состоится "1коЯ^Д 1992 г. в часов на заседании специализированного совета Л 063.41.01 при Московском институте тонкой химической технолога! им. М.В.Ломоносова по адре- • су: г. Москва, просп. Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского института тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова по адресу: г. Москва, ул. М. Пироговская, д. 1.

Учений секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

А.И.Лютик.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Изохшолиновый алкалоид винбласткн •- одно из наиболее активных и широко применяемых химиотераиевтических лекарственных веществ противоопухолевого действия.

Основным (и пока единственным) способом производства винблас-тина является извлечение его из растительного лекарственного сырья (СаИтагапОшз гозеиэ). Ввиду довольно низкого содержания винблас-•гина в катарантусе розовом (сотые доли процента) и наличия близких по структуре других соединений, получение его в чистом виде представляет значительные трудности. Это определяет и высокую стоимость винб.гастина (тысячи долларов за грамм).

Ежегодная потребность нашей страны в винблэстине 'около одного килограмма, тогда как его'производство - около 300 граммов в год. Кроме того, желательно было бы иметь некоторый резерв винбластина, который позволил бы наладить полусинтетическое производство другого противоопухолевого лекарствегаюго средства - винкристина.

Увеличение производства винбластина выдаигаот на первый план обеспечение производителей высококачественным сырьем с достаточно высоким содержанием винбластина. В связи с этим встает вопрос'о методе определения содержания вшйластина в катарантусе розовом.

Для определения содержания винбластина в растительном сырье в СНГ до сих пор пршенялись устаревшие методы, страдающие рядом су-ществешшх недостатков. 'Разработка новых методов, основанных на иснольоовотш високовф^октивной ¡шдкостной хроматографии (ВЭЖХ), позполлот повысить точность и сократит?, время анализа, Еще большего повышения объективности анализа можно .постичь при исиольяопптт

специфических антител к винОлае-уину - иммуноферментными методами анализа.

Иммуноферментиый метод анализа винОластина в сырье на только значительно сокращает время анализа, но и позволяет производить анализ большого количества образцов сырья практически одновременно, что открывает перспективу его широкого применения при селекции наи более продуктивных по винбластину сортов катарантуса розового.

Цель работы. Целью работы являлась разработка иммуноферментного метода количественного анализа винОластина в катарантусе розовом.

Научная новизна. Впервые разработан иммуноферментный метод количественного анализа винбластина в катарантусе розовом на основе использования антител к коныогату винОластина с белком, полученному глутаральдегидным методом. Исследовано перекрестное взаимодействие полученных антител о некоторыми алкалоидами катарантуса розового.

Разработан метод определения степени чистоты препаратов винбластина с помощью ВЭЖХ.

Разработаны методы количественного анализа винОластина в катарантусе розовом с использованием ВЭЖХ.

Для всех разработанных методов определены метрологические характеристики.

Практическая ценность работы. Разработанный иммуноферментный метод анализа содержания винОластина в сырье катарантуса розового доведен до возможности практического применения.

Метод определения степени чистоты препаратов винбластина и метод кодачестветшого анализа винОластина б катарантусе розовом с использованием В'ЭЖХ кашли применение при научшх исследованиях в

ряде отделов НПО ВИЛЛР и при прозводстве розевина - препарата вш-бластина, на производственно-экспериментальном заводе НПО ВИЛАР. В ходе работ по усовершенствованию технологии выделения винбластина из сырья проведано исследование стабильности винбластина в некоторых растворителях.

На защиту выносятся следующие положения:

- разработка иммунофэрментного метода количественного анализа винбластина в катарантусе розовом;

- разработка метода определения степени чистота винбластина и полупродуктов его производства с помощью ВЭЖЗС;

- разработка метода количественного анализа винбластина в катарантусе розовом с помощью ВЭЖХ.

Апробация работа и публикации. Отдельные части работы доложены на Пятом Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии, Рига, 1990 г. .По материалам диссертации опубликовано четыре научные статьи.

Объем и структура работы. Дкссортецлоннйя работа состоит из сведения, обзора литературы, обсуждения результатов, экетторггентп-ч'ной части, выводов и списка цитированной литературы (215 пиитов')-¡¡пй). Диссертецпя содержит \6б страниц мапптописпого текста, тлглпоп И таблиц рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Содержание винбластина в ката-рантусе розовом является важной характеристикой сырья, так как от него зависят не только экономические показатели производства, но и качество конечного, продукта.

Имму!зоферментный метод количественного анализа винбластина в сырье позволяет значительно повысить скорость и точность анализа содержания винбластина.

Нами разработан непрямой конкурентный иммуноферментный метод количественного анализа винбластина в катарантусе розовом (рис. 1). Согласно схеме метода, на поверхности лунок планшета для микротитрования сорбируется ограниченное количество конъюгата винбластина с белком. В лунку помещается анализируемый образец и ограниченное количество специфических антител к винбластину. Вин-бластин образца конкурирует с винбластин-белковым конъюгатом в реакции связывания со специфическими антителами. После отмывки в лунках планшета остаются антитела, связавшиеся с ьинбластин-белка-вым конъюгатом. Затем в лунки добавляется конъюгат вторичных антител к ]£ 0 кролика с пероксидазой хрена, который связывается с константной частью специфических антител. Добавление в лунки планшета перекиси водорода и субстрата (орто-фчнилендиамина) приводит к образованию окрашенного продукта. Таким образом, чем больше винбластина будет в анализируемом образце, тем менее интенсивной будет окраска раствора в лунке планшета.

Из описания схемы анализа понятно, что главным компонентом ео

±

X

отмывка

X

им

р®

.и

ОН

Рисунок 1. Схема иммуноферментного метода анализа. Нп схвт Обозначены: т - винбластин: [ 1 | - конъкгат винблестина

с Озлком;

ни -

- спецшпвсккв антитела к винблзишу; вторичные антитез к С кролика, конъюгиро-

ванние с вероксидазой хренп; [С} - пуботрат (о-фетален-диамин); (Ш ~ окртпонннй продукт.

являются едацяфэтескив антитела к винблатшну. Спг/ч мзлркула вин-бласгсшя ив обладает иммуногошшми евоПстпами - сна не вызывает образования антител при попадании в организм кивотпога. Дчя выработки антител к вгибластипу, он должен бить присоедипэн к каксл-либо крупной молекуле (обычно к бзлку), ешгшвдщэй образование антител. По способу ;сотгьюгации с белком иммутшие матодч пчялкза ит-бластсша могут быть разделены на несколько групп.

Описапн способ)! конъюгации вштбластшт с белками по атому 0-3 (превращением вгатбластина в 4-д93оцетилрип1гастив-С-3"-1г,.1Дрпэид, а затем - в 4~дезацет1шв;шбластш1-с-3-карбт^'!:<и1); по атому О-17 (реягаугея с формальдегидом); по атомам С-^ а / (оу:,гонением двойной связи с образованием дисарбоксикислотного производного); С-12' (через пэра-аминобензойнуя кислоту). Антитела к таким коныогатвд,

Л-

- ь -

как правило, дают силышо перекрестные реакции со многими алкалоидами катарантуса розового. Иммунные метода, разработанные на основе использования таких антител использовались для определения содержания винбластина в крови пациентов, которым производились инъекции препаратов винбластина и для изучения фармакокинетики и метаболизма винбластина, то есть при анализе одного единственного алкалоида. При анализе винбластина в растениях в анализируемом образце присутствует большое количество алкалоидов, часто обладающих большим структурным сходством с винбластином.

При выборе способа конъюгации винбластина с белком мы ориентировались на получение антител с возможно меньшими перекрестными реакциями с другими алкалоидами катарантуса розового, даже в ущерб различию между винбластином и винкристином. Это было сделано из следующих соображений:

1) Судя по литературным данным, добиться полной различимости между этими двумя алкалоидами практически невозможно. Содержание винкристина в растении на территории СНГ чрезвычайно мало; поэтому, дане значительная перекрестная реакция антител с винкристином не очень сильно повлияет на результат определения винбластина.

2) Содержание винбластина в катарантусе розовом в разных образцах составляет в среднем от 0,005 до 0,035%, а содержание, например, виндолина достигает 0,5%, то есть в 15 - 100 раз выше Поэтому, даже небольшая перекрестная реакция с виндолином будет сильно влиять на результат определения винбластина.

Для синтеза иммуногенного конъюгата винбластина с белком бнл выбран глутаральдегидаый метод, который позволяет получить антитела высокой специфичности, не взаимодействующие с мономерными алкалоидами , которых в растении очень много, и взаимодействующие только с лейрозином (0,23%) и винкристином (305). Содержание лейрозина

в растенул составляет от 100 до 300% от содержания винбластина, то есть лейрозин может завышать результат определения винбластина на 0,23 - 0,69%. Содержание винкристина в растении не превышает 555 от содержания винбластина, то есть винкристин может завышать результат определения винбластина максимум на 1,5%. Суммарное.завышение результата определения винбластина от перекрестных реакций с лей-розином и винкристином может достигать 2,2%, что незначительно скажется на опенке содержания винбластина в растении.

При проведении реакции конъюгации использовали разбавленный

(0,25%-ный) глутаровый альдегид. Использование такой концентрации

*

глутарового альдегида позволяет получить цепь, соединяющую вин*

бластин с Мелком, состоящую из пяти углеродных атомов.

' Взаимодействие винОластина с глутаровым альдегидом приводит к образовашш енамина. Альдегидная группа полученного енамина в кислых условиях способна взаимодействовать с первичными оминогруппзки белка (главным образом - с е-аминогруппаш остатков ттто). Это реакция позволяет получить целевой коныогпт пшвЗлзстюм с баллом:

* осн(сня),сна —>

" ! , л

В качестве белка - носителя г'аптена при синтезе иммуногенного конъюгата был выбран альбумин из сыворотки крови человека (ИЗА).

Очистку синтезированного конъюгата проводили колоночной хроматографией на сефадексе 0-50 в фосфатпо-солевом буфера.

Гаптенную плотность конъюгата определяли УФ-спектрофотометри-ей растворов синтезированного конъюгата, НБА и винбластина. Эмпирически, оптимальной считается гаптенная плотность в диапазоне от 10:1 до 25:1, хотя описаны случаи, когда хорошие антисыворотки были получены при использовании конъюгатов со значительно более низкими и более высокими гаптешшми плотностями. Расчеты гаптенной плотности полученного нами конъюгата двумя способами дали одинаковый результат - 2:1.

Иммунизацию кроликов, отбор крови и выделение антисыворотки проводили по общепринятым методикам.

Выделение из антисыворотки фракции глобулинов и ее очистку (проводили осаждением белков сульфатом аммония (50% от насыщения). Для лучшей очистки проводили осаждение глобулинов меньшей концентрацией сульфата аммония (33% от насыщения). В этих условиях альбумины остаются в растворе, а глобулины выпадают в осадок.

Из суммарной фракции глобулинов ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе в 0,01-0,0175 М фосфатном буфере, рН 6,5-6,6 выделяли фракцию иммуноглобулинов 0 (]£ О. При таких условиям 1в в не сорбируются на . ДЭАЭ-сорбентах, тогда как другие глобулины, в том числе и прочие иммуноглобулины задерживаются ионообменником.

Концентрацию 1я С определяли по оптической плотности раствора С при 280 им.

Для проведения имыуноферментного анализа необходимо иммобилизовать определенное количество молекул винбластина на поверхности лунок планаюта для мик;. этитроваиил. Для этого использовал! кош.ь-

гот винбластина с гемоциэгогаом виноградной улитки (1Ш1). KJJJ не имеет родство с HSA, поэтому антитела к IISA, обязательно образующиеся при иммунизации конъюгатом с USA, не должны взаимодействовать с Kill. Креме того, КЬН - очень большой белок (мол. масса от 3 до 7,5 млн.) и поэтому он хорошо сорбируется на поверхности лушк планшета для шкротитрованпл. Синтез конъюгата винбластина с KJJI проводили таким ко способом, что и синтез иммуногенногй конъюгата.

Для проверки способности Ig G взаимодействовать с винбласти-ном проводилось тестирование взаимодействия-этой фракции с К1Л и с конъюгатом ЮЛ с винбластином. Тестирование проводили иммунофэр-монтннм методом с использованием конъюгата козьих антител к Ig-G кролика с троксидазой хрена (Calbloctiem, США). Подтверждение присутствия в полученной фракции Ig С, специфичных антител производилось построенном кривых разбавления (рис. 2). Из рисунка видно, что в сыворотке содержатся антитола не взаимодействующие с К1Л, но взаимодействующие с конъюгатом винбластша с КШ. Это говорит о способности некоторых антител взаимодействовать с винбластином.

По результатам титрования фракции Ig G выбрали разведение, при котором оптическая плотность раствора в лунках планшета составляет около 1/2 от максимальной: оптической плотности. Это разбавление составило 1:100.

Выбраннов разбавление фракции Ig G было использовано при определении разбавления конъмгата винбластина с KLII, используемого для покрнтия лунок планшетов. Для этого лунки планшетов покрывали конъюгатом винбластина с ЮЛ а- концентрации 10 нг/мл по белку и нижа, проводами тестирование ишунофэрмонтным методом с разбавлением фракции Ig G 1:20, 1:100 и 1:500 и строили кривые разбавления. По результатам титровашш выбирали концентрацию покрывающего конъюгата, при которой оптическая плотность раствора в лупках

0.7 0.6 0.6 0.4 0.3 0.2 0.1 0

12.6 26 60 100 200 400 600 1000 3200 04001260026600

разбавление

— 1 -*-2 -*-3

Тестирование активности Ig G: 1 - взаимодействие Ig G с конъюгатом винбластина с КШ; 2 - взаимодействие Ig G с КШ; 3 - контроль (взаимодействие сцворотки неиммушзц-ропашюго кролика с КХН).

планшета составляет около 1/2 от максимальной оптической плотности. Эта концентрация составила Ю-8 г/мл или 10 нг/мл.

Для определения диапазона определения винбластина и чувствительности метода при выбранных значениях концентрации покрывающего конъюгата и разбавления фракции Ig G проводили иммунофермеитный анолиз с добавлением в лунки планшета различных количеств винблас-тина. Поело этого строилась стандартная кривая метода (рис. 3-а ). Построокие стандартной кривой метода показало, что при концентрации покрывающего лунки планшета конъюгата винбластина с КГЛ 10 нг/мл по белку и разбавлзшш Фракции Ig G 1:100 икмуноформентный

оо 4П

Рисунок 2.

метод позволяет определять виибластин в диапазоне от 5 до 100 пг в лунке, то есть от 5 до 100 пг в 10 мкл, что соответствует концентрации 0,5 - 10 нг/мл винбластина в образце.

Преобразование стандартной кривой по методу Скэтчарда дает линейное представление стандартной кривой (рас. 3-й). Математическая обработка линейной формы стандартной кривой позволяет определить константу аффинности антител (Ка), которая составляет 1,07 * 109 М-1. Такая величина К„ свидетельствует о достаточно сильном взаимодействии между антителами и винбластином. Считается, что в иммунных методах анализа можно использовать антитела с К„ от 109 до 1012.

Достаточно высокая специфичность реакции антител с антигенами позволяв'!' определять содержание винбластина в сложной смеси ве-щэств, каковой является суммарный алкалоидный экстракт. Это дает возможность упрссйиь предварительную счистку анализируемого образца по сравнению с анализом методом ЮЖ.

СЮ

¿02

1 3

пд/т!

Ю01* В/В,

-л

X

N

0,1 0,3

-Ь -

1 3 10

пд/т1

3 о

Рисунок 3. а - Стандартная гсрикйя иммунофвриентногс метода. Ь - График Скэтчарда.

о

2

Ми остановились на у*;э испытанной ранее экстракции алкалоидов из сырья 00Ж-шм метанолом. Схема анализа представлена на рис. 4.

Из стандартной кривой метода и методики анализа следует, что разработанный иммуноформентшй метод позволяет определять содержание винбластина в сырье в диапазоне 0,0025 - 0,0556, что включает обычно встречающиеся значения содержания винбластина в растении (0,005 - 0,035%).

В растении винбластину сопутствует более ста соединений, относящихся к груше 1шдолышх алкалоидов. Наибольшим структурным сходством с винбластином обладают винкристин, катараниш и вин,долин, которые могут взаимодействовать с антителами к винбластину.

• При .исследовании степени перекрестного узнавания проводилось выяснение диапазона определения некоторых родственных винбластину веществ в условиях, выбранных для проведения анализа втбластина.

Сырье

80%-ный ЫеОН, 64°С, 30 мин. Суммарный экстракт j

Фосфатносолевой буфер с тритоном Х-100 Анализируемый раствор

иммуноферментний анализ , Результат

Рисунок 4. Схема иммуксферментного анализа винбластина в сырье.

Построение кривых, аналогичных стандартной кривой, для вин-кристина, виндолина и катарантшт, позволило выяснить степонь вза-шодзйствия получешшх нами антител с этими алкалоидами (рис. 5). Для этого определялись абсциссы точек построенных кривых, в которых оптическая плотность раствора в лунках планшета составляет Ъ0% от максимального значения. Отношение абсцисс этих точек к абсщюее аналогичной точки на стандартной кривой метода дает степень взаимодействия антител с этими алкалоидами. Установлено, что перекрестная реакция антител с вшшристгаюм составляет 30%, с виндо.пи-пом - 0,1 Ж н с катарантшюм - 0,05%.

Исходя из данных о содержашга в катарантусе розовом винкрис-тина, виндолина и катаранткьа паяю ожидать, что завышение результата анализа вцвбластина из-за перекрестных реакций с этими алкалоидами может достигать 16-17%.

Иммуноферментный метод количественного анализа нинбластина достаточно быстр и занимает около 4-5 часоь.

Относительная оюиб.ги отдельного определения довольно высока -30%, однако, возыотаость проведения анализа одновременно в относительно большом количестве новторностей позволяет снизить ощибку среднего результата до приемлемых значений.

Для проверки достоверности результатов анализа, получаемых иммуноферментннм методом, необходимо знать действительное содержание винбластина в сырье. Однако, до последнего времени достоверного метода количественного анализа винбластина в сырье не было. Поэтому, нам пришлось разработать метод количественного определения винбластина в сырье с использованием ВЗЖХ, как одного из наиболее точных методов определения биологически-активных соединений растительного происхождения.

Разработка тякпю метода и-'Тр^.осьала наличия пропиратсс пш(-

бластина с тоадо йайай'й&ш содежанием основного вещества. До по»

следнего времени йадеКноГо метода определения процентного содержания винбластина в препаратах не било. Поэтому.пришлось начинать с разработки метода определения степени чистоты препаратов винблас-

Н СООНв Е1

катарантин

н®(г ^ тг "х^ оде |НО ХООМв

"о

ВШ1ДОЛ1Ш

— 1 -+- 2 —3 4 к

Рисунок 5. Шшшо'Шютшв Щ а с винбластином - Ч, винкристтшом -2, вййдоЛйном - 3 и катарантином - 4.

иша с помощью ВЭЖХ.

ВИШфИСТНЦ

00„г

• - 15 -2. Метод определения степени чистоты препаратов випОлБстша.

До недавнего времени содержание примесей в препаратах винбластина определяли устаревшим методом визуальной оценки тонкослойных хро-матограмм определенных количеств препарата. Величина пятен и количество вещества в них оценивалось после обнаружения алкалоидов на пластинке раствором церий(IV)аммонийсульфата.

Нами установлено, что предел детектирования алкалоидов церий (IV) аммонийсульфатом составляет 0,7-0,8 мкг, что, при нанесении на пластинку 50 мкг препарата, не позволяет обнаружить примеси, составляющие менее 1,5%. Кроме того, площадь пятен алкалоидов на хроматограмме нелинейно зависит от количества вещества, а точность визуальной оценки количества вещества в пятнах на хроматограмме, как правило, не превышает 20%. Вое это делает оцешсу степени чистоты препарата подобными методами крайне ненадежной.

Нами разработан метод определения степени'чистоты препаратов винбластина с помощью 1:Этот метод более надежен, точен и объективен, чем применявшийся ранее метод с использованием ТСХ.

При разработке метода определения степени чистоты "препаратов винбластина с помощью ВЭЖХ ш ориентировались на разделеш!в примесей в условиях изократического злюированияи, так как ато наиболее простой и дешевый вариант проведения ВЭЖХ.

При хроматографическом разделении основных соединений, в том числе и алкалоидов, требуотся, чтобы значение рН подвюшой фазы превышало 7. Относительно высокое значение рН необходимо для предотвращения ионизации этих соединений и для получения узких пиков на хроматограмме. При обычной колоночной хроматографии часто выбирают значешю pli подвитой Фазы н диапазоне 8-10, но ¡три тага« ш-соких значениях рН Ш|ЧШпот растворяться саликыоль, а сорбита с

привитыми фазами, как правило, теряют модифицирующие группировки.

»

Тем ne менее, для большинства случаев разделения алкалоидов могут быть использованы сорбенты с привитыми фазами и подвижные фазы,-значение рН которых слегка превышает 7, Мы выбрали колонку с сили-кагелем, модифицированным октадецильными группами (Separon SIX 018), и подвижную фазу, состоящую из 65% метанола и 35% 5 мМ <НН4)2НР04, pli 7,3.

Детекция алкалоидов в элюате осуществлялась по поглощению ультрафиолетового света с длиной волны 254 нм. Применение ультрафиолетового детектора для количественного анализа, строго говоря, требует калибровки ответа детектора но удельной экстинкции каждого вещества. Однако, учитывая, что при выделении винбластина из растительного сырья в виде примесей выделяются родственные ему алкалоиды, а хромофорной группой у всех этих алкалоидов"является индол, можно допустить, что относительные экстинкции всех сопутствующих соединоний близки. Это подтверждается как сходством их спектров поглощения, так и тем, - что.;, дотекцил элюата при различных длинах волн (254, 290 и 313 им) дает практически одинаковые значения степени чистоты препарата.

Процентное содержание винбластина определяют как отношение площади пика винбластина к суше площадей всох пиков хроматограм-мы, за исключением пика растворителя.

Метод быстр (анализ занимает около 30 мин.) и точен (относительная ошибка единичного определения составляет 2,2%).

3. Метод количественного определения Еинбластина в сырье.

В настоящее время в CHI1 при количественном анализе винОластина в сирье применяется хроматоколориметрический метод (метод 1), являющийся модификацией фармакопейного метода анализа (BSC 42-1106-81. Временная фармакопейная статья. Лист катарантуса розового). Схема проведения анализа хроматоколориметрическим методом представлена на рис. б. Метод трудоемок, долог (анализ занимает 3,5 - 4 дня) и недостаточно точен (ошибка единичного определения составляет 12 -21%, в зависимости от качества сырья).

Согласно прописи хроматоколориметрического метода, на стадии ТСХ используются хроматографические пластинки, приготовленные из груОо фракционированного силикагеля. Это не позволяет уверенно разделить сложную смесь димерных алкалоидов. Hai.ni установлено, что зона силикагеля, вырезаемая с пластинки после ТСХ, содержит кроме винОластина еще несколько алкалоидов, количество которых достигает 20-70% от общего количества алкалоидов в зоне. То есть хроматоколоршлетрический метод дает результат, отражающий содержание суммы нескольких алкалоидов, находящихся в хрсматографической зоне вместе с виноластиком.

Известно, .что эффективность разделения в адсорбционной хроматографии зависит, кроме ряда прочих факторов, и от однородности размера частиц сорбента. Мы предложили использовать спосоО приго-тевлешш хорошо фракционированного силикагеля и пластинок из этого силикагеля, что позволило до некоторой степени повысить эффективность тонкослойной хроматографии.

Использование ВЭЖХ позволяет устранить некоторые недоста'пш хроматоколориметричеекого метода. В разработанном ними методе (метод 2) Фракцию дим^рних плтодсидов, полученную, как и в хромотоко-

Сырье

5%-ный СИ3С00Па толуол

Бензольный экстракт

НарБОд,

упаривание

Соф;)доке Ш-20

Фракция димерннх алкалоидов

упаривание

тех

1Ж~ная НС1

Винбластш

тропеолин

(йфашенный продукт

хлороформ

Хлороформный раствор

ОВ

'490

растворение в подвижной фазе

добавление внутреннего стандарта

ВЭЖХ

растворение в смеси бензол-мэтанол (1:1)

тех

элшровакиз зоны

винбластина

упаривание

растворение в подвижной фазе

ВЭЖХ

Результат

Результат

Результат

Метод 1

Метод 2

Методы 3 и 4

Рисунок 6. Схема анализа содержания ваыбластила в сырье хроматоко-лорииотрическим (метод 1) и жидкос'тнохроматографичоски-ми (методы 2, 3 и 4) методами.

гориметрическом методе, упаривают и растворяют в подвижной фазе. К юлученному раствору добавляют свежеприготовленный раствор гидро-слорида глауцина в метаноле (внутренний стандарт) и хроматографи-эуют на колонке с обращеннофазовым сорбентом Separon SIX С18 с детектированием элюата по поглощению ультрафиолетового света с дли-зой волны 254 нм. Количество винбластина определяют по соотношению площадей пиков глауцина и винбластина с помощью калибровочного графика.

Условия проведения ВЭЖХ выбраны такими же как и в методе определения степени чистоты препаратов винбластина.

Выбор метода анализа с внутренним стандартом продиктован тем, что использовашшй в работе хроматограф LC 822 (Laboratornl prl-stroje, ЧСФР) был оснащен инжектором типа "stop-flow", который не обеспечивает воспроизводимости объема вводимой пробы. Выбор в качестве внутреннего стандарта глауцина обусловлен тем, что глауцин имеет коэффициент молярной экстинкции при 254 mi сравнимый с коэффициентом молярной экстинкции винбластина, а пик глауцина не перекрывается с пиками сопутствующих винбластину алкалоидов. Кроме того, гидрохлорид глауцина недорог и стабилен при хранении в сухом виде.

Жидкостнохроматографический метод (метод 2) позволил сократить продолжительность анализа до 2,5 дней и повысить точность определения винбластина: относительная ошибка единичного определения составляет 8%. Однако, ряд недостатков, свойственных хромато-колориметрическому методу, сохранился и в жидкостнохроматогра^и-ческом методе. Дело в том, что колонка с сефадексом LH-2Q может быть успешно использована только при разделении первых 5-10 образцов сырья. При дальнейшей работе разрешающая способность сефщокса снижается и фракция димерных алкалоидов оказывается загрязненной

мономерными алкалоидами, которых в сырье очень-много. Это затруд-

г

няет проведение ВЭЖХ и искажает результаты анализа, так как на стадию ВЗЖХ поступает слишком сложная смесь алкалоидов, причем инки некоторых из них перекрываются с пиками винбластина и глауцина.

Это, а также постоянные трудности с поставками сефадекса 1Л-20, привели к появлению нового жидкостнохроматографического метода анализа (метод 3). Согласно схеме этого метода, бензольный экстракт, полученный как и в предыдущих методах, хроматографируют на пластинке Б11иГо1 ОТ 254-, обработанной 0,3%-ным КОН в этаноле и элюируют винбластин с пластинки \,ь%-шм диэтиламином в метаноле. Элюат упаривают, растворяют в подвижной фазе и проводят ВЭЖХ, как описано выше. Содержание винбластина определяют с помощью калибровочного графика по площади или высоте пика винбластина.

Использование ТСХ на силуфоле позволяет получить фракцию винбластина, загрязненную лишь небольшим количеством (до пяти) алкалоидов достаточно четко отделяющихся при ВЭЖХ.

ВЭЖХ проводится как и,в предыдущем методе, но в данном случае хроматограф был оснащен петлевым инжектором, что позволило воспроизводимо наносить на колонку пробу определенного объема и отказаться от использования внутреннего стандарта.

Метод 3 еще более сокращает Бремя анализа (до 1,5-2 дней). Относительная ошибка единичного определения составляет 10%.

Однако выяснилось, что этот метод отягощен некоторой систематической ошибкой - он занижает результат определения. Занижение результатов объясняется использованием для ТСХ пластинок, обработанных гидроокисью калия." Гидроокись калия, локально повышая зна-значение рН, способствует разложению винбластина.

В результате исправления г,того недостатка был разработан еще один жидкостнохроматографический метод анализа винбластина (метод

4-). В атом методе ТСХ проводится на необработанных пластинках "Сорбфил" (ПКБ Пластмаш ИБС АН СССР) с силшшгелем СТХ-1А (5-17 мкм) в системе, содержащей Ш^ОН. В остальном метод аналогичен предыдущему.

Относительная ошибка единичного опродоления метода 4- составляет 7%. Время, необходимое д.,;И определения содержания винбластина и сырье, шце немжич- сократилось и составило 1,5 дня. .

Сравнение результатов анализов сырья разными методами показало, что модифицированный фармакопейный метод (метод 1) значительно завышает, а один из жидкостнохроматографических методов (метод 3) - занижает результат анализа. Два других жидкостнохроматографических метода (методы 2 и 4) дают практически одинаковые результаты, которые, по-видимому, близки к истинному содержанию винбластина в сырье.

Жидкостнохроматографические методы позволили повысить точность и достоверность определения, сократить "время и стоимость анализа, уменьшить количество используемых органических растворителей и дефицитных импортных материалов.

Последний метод (метод 4) показался нам достаточно удобным для использования его в качестве метода сравнения при разработке иммуноферментного метода анализа винбластина в сырье.

Сравнение результатов определения количества' винбластина в сырье кидкостнохроматографическим методом (метод 4) и иммунофер-ментшм методом показало, что оба метода дают близкие результаты о довольно высокой степенью корреляции: коэффициент линейной корреляции (г) составляет 0,993.

Сравнение характеристик методов.количественного анализа винбластина в сырье- показывает, что иммунофермонтный метод является

наиболее быстрым, требует минимальных количеств растворителей обладает наиболее широким диапазоном определяемых значений ( рис 7).

Быстрота проведения анализа винбластина иммуноферментным ме тодом и возможность анализа нескольких образцов одновременно по зволяют прогнозировать, что он может найти применение в селекцион ной работе - при отборе наиболее -продуктивных сортов катзрантус розового.

Разработанные методы унплиза винбластина с использование ВЭХСХ были использованы при анализе сырья, полупродуктов и продук тов производства розовина - препарата винбластина, а также пр усовершенствовании технологии производства розевина.

Значительное количество проведенных анализов позволяет еде лать вывод, что применявшийся до сих пор хроматоколориметричесш]

Встречающиеся в природе,, значения •

ВЭЖХ

уууП хроматоколориметрический

шмунофэрментшШ

I-'-1-1-1-'—п--1-1

О 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

Содержание винбластина в СатсгапгШа гозеиз,.%

Рисунок 7. Сравнение диапазонов количественного определения В1 Оластина в сырье разшми методами.

лотод (метод 1) значительно завышает результат определения. Это завышение позволяет объяснить ряд случаев, когда из, казалось бы, кондиционного сырья не удается выделить должного количества вин-Зластина, что приводит в производстве к нарушении материального Заланса и превышению норм расхода энергии и материалов. Это дает эснование рекомендовать снизить норму содержания винбластина в сырье. Определение конкретной величины содержания винбластина в сырье требует дополнительных исследований, однако, ориентировочно можно полагать, что норма содержания винбластина в сырье может быть около 0,01%.

Метод количественного определения винбластина в катарантусе . розовом с помощью ВЭЖХ предложено включить в проект новой фармакопейной статьи.

вывода

!. Впервые разработан иммуноферментный метод количественного определения винбластина в катарантусе розовом на основе использования антител к конъюгату винбластина с белком, полученному глу-таральдегидным методом.

2. Разработан метод определения степени чистоты препаратов винбластина с помощью ВЭЖХ.

3. Разработан метод количественного определения винбластина в катарантусе розовом с помощью ВЭЖХ.

Содержание диссертационной работы .отражено в следующих публикациях:

1. Волков С. К. Алкалоиды квтарантуса розового. (СаШзгапИшз гозе- ■ из). Иммунохимические методы анализа // Лекарственное растениеводство. Обзорная информация.- М.: ВНИИСЭНТИ НПО "Медбиоэкономика", 1990.- Вып. 1,- С. 13-25.

2. Волков С. К., Гродницкал Е. И. Количественный анализ винбластина в ХЗ<ИТюгапЬЬиз гозеиз // Пятый Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии, Юрмала, 20-22 ноября 1990 г. Тезисы докладов.- Рига: 1990.- С. 117.

3. Волков С. К., Гродницкая Е. И. Определение относительного' количественного содержания винбластина в розевине методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Хим.-фарм. к,- 1991.- Т. 25, № 9.- С. 77-78.

4. Волков С. К., Гродницкая Е. И. Количественный анализ винбластина в СоЛЬагапгТшз гозеиз // Ж. физ. химии.- 1991.- Т. 65, № 10.- С-. 2860-2862.

Подписано к печати 23.09.92. Зак. 635. Тир. 100.

Иолиграфиредприятие ШО ВИЛА?