Разработка методов синтеза производных фаскаплизина - цитотоксического алкалоида из губки Fascaplysinopsis sp.

Жидков, Максим Евгеньевич

Разработка методов синтеза производных фаскаплизина - цитотоксического алкалоида из губки Fascaplysinopsis sp. тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Жидков, Максим Евгеньевич АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Владивосток МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.03 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Разработка методов синтеза производных фаскаплизина - цитотоксического алкалоида из губки Fascaplysinopsis sp.»

Автореферат диссертации на тему "Разработка методов синтеза производных фаскаплизина - цитотоксического алкалоида из губки Fascaplysinopsis sp."

Жидков Максим Евгеньевич

Разработка методов синтеза производных фаскаплизина-цитотоксического алкалоида из губки Лк Іу$іпорзіз ер.

02.00.03 - Органическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005062288

Жидков Максим Евгеньевич

Разработка методов синтеза производных фаскаплизина -цитотоксического алкалоида из губки Гаясар^шпорпз ер.

02.00.03 - Органическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дальневосточный федеральный университет» (ДВФУ)

Научный руководитель: Доктор химических наук, профессор

Каминский Владимир Абрамович

Официальные оппоненты: Макарьева Татьяна Николаевна

Доктор химических наук, старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН, главный научный сотрудник

Русинов Владимир Леонидович

Доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б. Н. Ельцина», директор Химико-технологического института

Ведущая организация: Московский государственный

университет имени М. В. Ломоносова, Москва

Защита состоится «16» мая 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте wvw.piboc.dvo.ru Автореферат разослан </х» апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Черников О. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ1

Актуальность темы исследования. Среди большого числа вторичных метаболитов морского происхождения, открытых на сегодняшний день, особое место занимает группа алкалоидов, в основе которых лежит пентациклическая система пиридо[1,2-а: 3,4-6 ]дииндола, более известные как фаскаплизиновые алкалоиды. Наиболее изученным представителем данной серии веществ является красный пигмент фаскаплизин, впервые выделенный из губки Бр. в 1988 году. Данное соединение обладает широчайшим спектром биологической активности, сочетая противобактериальное, противогрибковое и противовирусное действие с антиангиогенными свойствами и цитотоксической активностью в отношении различных типов опухолевых клеток. Молекулярные механизмы действия фаскаплизина включают интеркаляцию в ДНК, индукцию апоптоза, а также способность селективно ингибировать фермент СОК 4, который играет ключевую роль в регуляции клеточного цикла млекопитающих. Подобный набор свойств позволяет отнести фаскаплизин к числу перспективных соединений-лидеров для создания нового поколения противоопухолевых лекарственных препаратов. Это, в свою очередь, определяет актуальность проведения исследований в области синтеза широкого набора производных и аналогов нативного алкалоида для установления зависимости между их строением и проявляемой биологической активностью.

Степень разработанности темы исследования. Большинство ранее проведенных исследований в рамках обозначенной темы было направлено на разработку новых методов синтеза фаскаплизина или получение более доступных аналогов данного алкалоида. В результате было выявлено несколько типов новых физиологически активных веществ, обладающих, однако, более низкой биологической активностью по сравнению с нативным алкалоидом. Некоторые природные производные фаскаплизина, напротив, продемонстрировали более высокую активность по сравнению с родоначальным алкалоидом, но их всестороннее изучение ограничено малой доступностью данных соединений. Механизмы биологической активности фаскаплизина были изучены различными методами, но многие детали его взаимодействия с важнейшей терапевтической мишенью СОК 4 до сих пор не выяснены. Основным препятствием на пути дальнейшего изучения этой перспективной группы природных соединений является отсутствие универсальных методов синтеза производных гетероциклической системы пиридо[1,2-а: 3,4-¿'¡дииндола, лежащей в их основе. На сегодняшний день разработано несколько методов синтеза фаскаплизина, а также гомофаскаплизинов В и С, однако большинство из них включает большое число стадий, а также требует использования труднодоступных исходных соединений.

"Автореферат оформлен в соответствии с ГОСТ Р 7.0.11 - 2011 ДИССЕРТАЦИЯ И АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ Структура и правила оформления.

Цели и задачи. Целью данной работы является разработка эффективных методов получения производных фаскаплизина. Для её достижения необходимо было решить следующие задачи:

1) изучить возможность применения существующих методов синтеза фаскаплизина для получения его производных;

2) разработать новые методы синтеза фаскаплизина, которые могут быть использованы для получения широкого набора производных нативного алкалоида;

3) в рамках созданных методов осуществить целенаправленный синтез перспективных для дальнейшего изучения производных фаскаплизина.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые получены три природных бромпроизводных фаскаплизина - алкалоиды 3-бромфаскаплизин, 10-бромфаскаплизин и 3,10-дибромфаскаплизин. Разработаны два новых метода синтеза фаскаплизина, которые в дальнейшем могут быть использованы для получения его производных, содержащих заместители в циклах А и Е. Впервые было продемонстрировано активирующее действие микроволнового облучения в отношении реакции Минисци - важного метода ацилирования л-дефицитных гетероциклических систем.

Теоретическая и практическая значимость работы. В ходе выполнения данной работы методом ретросинтетического анализа были изучены возможные подходы к синтезу производных фаскаплизина. Методом молекулярного докинга была изучена зависимость между строением и CDK 4-ингибирующей активностью ряда производных фаскаплизина. Важным практическим результатом работы стало получение природных бромпроизводных фаскаплизина, биологическая активность которых не уступает, а по некоторым параметрам превосходит аналогичные показатели фаскаплизина. Один из разработанных синтетических методов позволяет получить фаскаплизин всего в две стадии из коммерчески доступных соединений, что существенно снижает себестоимость его получения. Кроме того, была доказана возможность применения данного метода для получения замещенных фаскаплизинов.

Методология и методы исследования. В рамках проведенных исследований был использован широкий набор методов, включая последние методологические разработки в области целенаправленного органического синтеза (микроволновое облучение, радикальное ацилирование 7t-дефицитных гетероциклических систем, процедура one pot), современные методы анализа состава смесей веществ и выделения из них индивидуальных соединений (газожидкостная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография, препаративная жидкостная хроматография среднего давления), методы установления строения полученных соединений (ИК- и ЯМР-спектроскопия, включая 20-эксперименты, масс-спектрометрия), а также методы компьютерного моделирования для теоретического изучения взаимодействия

полученных соединений с терапевтической мишенью и оценки их биологической активности.

Положения, выносимые на защиту.

1. На основе известного метода синтеза фаскаплизина разработана синтетическая последовательность для получения его производных, в рамках которой осуществлен первый синтез природных бромпроизводных фаскаплизина - алкалоидов 3-бромфаскаплизина, 10-бромфаскаплизина и 3,10-дибромфаскаплизина.

2. Разработаны два новых метода синтеза фаскаплизина, перспективные для синтеза производных нативного алкалоида, содержащих заместители в разных циклах базовой структуры: двухстадийный способ исходя из ß-карболина и о-фторбензальдегида и пятистадийный метод исходя из скатола и фенилгидразина.

3. Впервые показана возможность проведения под действием микроволнового облучения реакции Минисци — важного метода ацилирования я-дефицитных гетероциклических систем.

4. На основе одного из разработанных методов осуществлен целенаправленный синтез 9-бензоил-З-хлорфаскаплизина — перспективного ингибитора циклинзависимой киназы 4, важной терапевтической мишени.

Степень достоверности и апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в виде устных и стендовых сообщений на «Научной конференции студентов и аспирантов ДВГУ», Владивосток, 2005; на П-ой Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 2006; на Международном симпозиуме «The 1st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences», Владивосток, 2008; на III-ей Международной конференции "Химия гетероциклических соединений", посвященной 95-летию со дня рождения профессора А. Н. Коста, Москва, 2010. По материалам диссертации опубликованы три статьи в зарубежных журналах из списка ВАК. Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании кафедры органической химии ФГАОУ ВПО ДВФУ 21 декабря 2012 г.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Применение метода синтеза фаскаплизина исходя из триптамина и

о-бромфенилуксусной кислоты для получения его производных

Очевидный подход к достижению поставленной цели заключается в адаптации известных в литературе способов синтеза фаскаплизина (1) для получения его производных. В качестве объектов получения были выбраны три известных на сегодняшний день природных бромпроизводных фаскаплизина -алкалоиды 3-бромфаскаплизин (2), 10-бромфаскаплизин (3) и 3,10-дибромфаскаплизин (4) (рисунок 1).

Х|=Н, Х2=Вг: 3-бромфаскаплизин (2) Х,-Вг, Х2=Н: 10-бромфаскаплизин (3) Х1=Х2=Вг: 3,10-дибромфаскаплизин (4) Х,=Н, Х2- С1: 3-хлорфаскаплизин (10)

Рисунок 1 - Строение бромфаскаплизинов 2 - 4 и 3-хлорфаскаплизина (10) После анализа данных литературы для проведения дальнейших исследований был выбран метод, предложенный Радченко О. С. и соавт. (рисунок 2). Для синтеза целевых соединений в рамках выбранной стратегии необходимо наличие триптамина (5), 6-бромтриптамина (6), 2-бромфенилуксусной (7) и 2,4-дибромфенилуксусной (8) кислот. Среди них только соединения 5 и 7 являются коммерчески доступными. Также было принято решение исходя из триптамина и коммерчески доступной 2,4-дихлорфенилуксусной кислоты (9) осуществить синтез хлорпроизводного фаскаплизина - аналога алкалоида 3-бромфаскаплизина, далее обозначаемого как 3-хлорфаскаплизин (10).

Рисунок 2 - Схема синтеза фаскаплизина по Радченко О. С. и соавт.

6-Бромтриптамин (6) был получен исходя из 6-броминдола (11) по известной схеме, модифицированной нами и представленной на рисунке 3. Исходный 6-броминдол был синтезирован исходя из 4-метиланилина (12) по известному методу с небольшими изменениями, что позволило упростить выполнение отдельных операций и несколько увеличило выход данного продукта. В соответствии с оригинальной работой индол 11 далее предстояло конвертировать в 6-бром-3-(2'-нитровинил)индол (13) путем введения его в реакцию с 1-Ы, Ы-диметиламино-2-нитроэтиленом. Вместо этого 6-броминдол сначала был трансформирован в 6-бром-З-форм ил индол (14). Взаимодействие последнего с нитрометаном в присутствии ацетата аммония привело к получению продукта 13 с высоким выходом, который затем был восстановлен в триптамин 6 действием комплекса ВН3-ТНР по описанной в литературе методике. Строение полученного продукта было доказано на основании совпадения его спектральных характеристик с известными для 6-бромтриптамина.

NH,

HNOj, h2so4, о «с

75%

1. NaN02, K2SO,,,

2. CuBr, HBr

1.Me,N-CH(OMe)¡, ДМФА, Д, 30 мин

2. Zu АсОН, 70 °С

65 4

N Н

Рисунок 3 - Схема синтеза 6-бромтриптамина (6)

2,4-Дибромфенилуксусная кислота (8) была получена в три стадии исходя из доступного З-бром-4-метиланилина (15) (рисунок 4). Промежуточные продукты 16 и 17 были синтезированы по известным методикам, также модифицированные нами. Так, после тщательной отработки условий проведения реакции Зандмейера с анилином 15 выход 2,4-дибромтолуола (16) удалось увеличить на 25 % по сравнению с описанным в литературе. Бромирование соединения 16 по метальной группе было проведено под действием N-бромсукцинимида (NBS) в присутствии азодиизобутиронитрила (AIBN). После кипячения полученного бензилбромида 17 в водно-спиртовом растворе цианида натрия был получен соответствующий нитрил, гидролиз которого привёл к целевому продукту 8. Структура полученного соединения была доказана на основании данных масс-спектрометрии (наличие в масс-спектре продукта обработки соединения 8 диазометаном кластера пиков М+ с m/z 306/308/310 в отношении 1:2:1) и ЯМР-спектроскопии (синглет при 3.79 м.д. (2Н), а также сигналы трех ароматических протонов, формирующие спиновую систему АВХ).

СН, СН,Вг 1) NaCN, C2H5OH, Н2С-СООН

^Вг 2) H2S04, Н20, Д, 12 ч ^Вг

NaN02, HBr; CuBr, HBr

NBS, AIBN, CC14

70%

Рисунок 4 - Схема синтеза 2,4-дибромфенилуксусной кислоты (8)

При попытке получения амидов 18а-г по аналогии с оригинальным методом путем пиролиза соответствующих аммониевых солей во всех случаях образовывались сложные смеси, что обусловлено, по-видимому, неустойчивостью этих соединений в данных условиях. Проведение реакции в аппарате для возгонки в вакууме позволило получить только амид 18г. Данное соединение возгонялось при выдерживании соли, образованной соединениями 5 и 9, при 200 "С и давлении 5 мм рт. ст. в течение 15 минут (рисунок 5, а). Выход продукта при этом составил 98 %. К сожалению, данная методика не позволила

получить амиды 18а-в. Предварительная трансформация фенилуксусных кислот в соответствующие хлорангидриды и введение их в реакцию с триптаминами 5 и 6 осложнялись протеканием побочных процессов, что привело к получению целевых амидов лишь с умеренными выходами (рисунок 5, б). Тогда в качестве конденсирующего реагента был использован Ы^'-дициклогексилкарбодиимид (БСС), который часто используют для синтеза пептидов. В ходе изучения реакции с ним (рисунок 5, в) оказалось, что её протеканию препятствует образование солей, происходящее при смешивании реактантов. Введение в реакционную смесь натриевой соли используемой фенилуксусной кислоты позволило сместить возникающее равновесие влево и получить амиды 18а-в с высокой степенью чистоты и выходами 88—89 % от теоретического даже при минимальной загрузке исходных соединений.

а. 200 "С. 5 мм рт. ст., 15 мин

/-- 18г

6. 50С12, пиридин, 20 "С

в. ОСС, СН,СН

кипччение, 1 ч

7: К,=Н, ^»Вг 8: К,-112=Вг в 9: Я,-1Ц=С1

18а 186 18в 18г

И,-«з=Вг, Я,=Н

Рисунок 5 - Схема синтеза амидов 18а-г Далее полученные амиды были введены в циклизацию Бишлера— Напиральского с целью синтеза дигидро-|3-карболинов 19а-г (рисунок 6). о

> 5

Р0С1„ сн3см, к /)-Д, 40 мин

18а-21а: 11,=И2=Вг, Я,=Н 186-216: Я,=Н, Я^Вг, Я,=Вг 18в-21в: К,= Я2-К,=Вг 18г-21г: Я,= ІЦСІ, 1Ц=Н

Мп02, РЬН, Д, Зч

Рисунок 6 - Схема синтеза р-карболинов 21а-г

После выделения полученных продуктов оказалось, что в присутствии кислорода воздуха они исключительно легко окисляются в дигидро-р-карболины 20а-г, которые являются конечными продуктами данной реакции. Для последующей ароматизации соединений 20а-г в р-карболины 21а-г реакционные смеси, полученные после конверсии амидов 18 в дигидро-Р-карболины 20, обрабатывали водой, продукты реакции извлекали бензолом, после чего экстракты кипятили с обратным холодильником со свежеприготовленным активным оксидом марганца (IV). Таким образом, в рамках одного эксперимента удалось совместить последовательное проведение двух синтетических стадий, что привело к получению Р-карболинов 21а-г с суммарными выходами 57—60 % непосредственно из соответствующих амидов, минуя потери, связанные с очисткой промежуточных соединений.

На завершающей стадии синтеза целевых производных фаскаплизина была проведена кватернизация соединений 21а-в путем нагревания субстратов в течение 20-40 минут при температуре 210—220 °С (рисунок 7). Во всех трёх случаях основной процесс осложнялся протеканием побочных реакций, что приводило к образованию нескольких продуктов, но благодаря низкой растворимости целевых соединений в органических растворителях их удалось выделить в индивидуальном виде. Далее бромид-анион в полученных четвертичных солях был заменен на хлорид-анион путем насыщения их растворов в метаноле хлороводородом с последующей отгонкой растворителя при пониженном давлении. Строение полученных соединений было доказано совпадением их спектральных характеристик с аналогичными данными, приведенными в литературе для природных бромфаскаплизинов.

220 "С, аргон, 20-40 мин 2-4

96-98 °

2-4, 10

ги-1 К|=1Ц=Вг,

216-3: Я,-Н, 1Ц=Вг Я,=Вг 21в-4: К,= 11,=Вг 21Г-10: Я,= Я2=С1, К,=Н

Рисунок 7 - Получение бромфаскаплизинов 2-4 и 3-хлорфаскаплизина (10)

При использовании данного метода для кватернизации Р-карболина 21г выход 3-хлорфаскаплизина составил только 20 %. С целью увеличения выхода этого соединения для инициирования реакции было использовано микроволновое облучение, позволяющее проведение энергоёмких процессов в более мягких условиях. После облучения соединения 21г целевой продукт удалось выделить с выходом, близким к количественному. Строение 3-хлорфаскаплизина было доказано на основании данных масс-спектрометрии, а

также путем сравнения величин химических сдвигов (ХС) сигналов протонов данного соединения в спектре ЯМР-'Н с соответствующими данными фаскаплизина, известными из литературы (таблица 1). Как следует из данных таблицы 1, химические сдвиги сигналов протонов в положениях 6-11 соединения 10 соответствуют ХС сигналов аналогичных протонов фаскаплизина, а сигналы протонов цикла Е, содержащего атом хлора, представлены ожидаемой спиновой системой АВХ-типа. Впоследствии микроволновое облучение было успешно использовано для синтеза соединений

2-4.

Таблица 1 — Химические сдвиги сигналов протонов в спектрах ЯМР-'Н фаскаплизина и

3-хлорфаскаплизина в МеОН-£)4 (нумерация атомов представлена на рисунках 1 и 7)

Атом Спектр ЯМР-'Н фаскаплизина. м.д. Спектр ЯМР-'Н 3-хлор-фаскаплизина, м.д.

1 8.08 (дд, 3=7.5, 1.3 Гц) 8.02 (д, 1=7 8 Гц)

2 7.80 (дд, 1=7.5, 0.9 Гц) 7.77 (дд, 1=7.8, 1.3 Гц)

3 8,00 (дд, 1=8.0, 1.3 Гц) -

4 8.34 (д, 1-8.0 Гц) 8.53 (д, 1=1.3 Гц)

б 9.38 (д, 1=6.2 Гц) 9.36 (д, 1-5.8 Гц)

7 8.97 (д, 1-6.2 Гц) 8.97 (д, 1=5.8 Гц)

8 8.50 (д, 1=8.0 Гц) 8.50 (д, 1=8.2 Гц)

9 7.56 (ддд, 1=8.0, 7.1, 0.9 Гц) 7.54 (т. 1=8.0 Гц)

10 7.91 (ддд, 1=8.0, 7.1, 1.3 Гц) 7.90 (т, 1= 7.6 Гц)

11 7.83 (дд, 1=8.0, 0.9 Гц) 7.82 (д, 1=7.6 Гц)

2 Разработка новых методов синтеза фаскаплизина, перспективных для получения его производных

Получение в рамках метода Радченко и соавт. соединений 2-4 и 10 является первым примером успешного синтеза замещенных фаскаплизинов. Тем не менее, получение широкого набора подобных соединений в рамках данного подхода связано со значительными трудностями, поскольку необходимые для этого производные триптамина и фенилуксусной кислоты труднодоступны. Таким образом, поставленная в рамках данной работы цель, заключающаяся в разработке простых и эффективных методов получения замещенных фаскаплизинов, была достигнута лишь частично. Это, в свою очередь, заставило нас продолжить исследования, сосредоточив усилия на разработке новых методов синтеза фаскаплизина, более перспективных для получения его производных.

За основу была взята идея использования в качестве исходного соединения такого легкодоступного предшественника, который содержит в своей структуре максимальное число циклов, соответствующих структуре фаскаплизина. Это позволяет перейти к целевому соединению наиболее коротким путем с внедрением необходимого заместителя на завершающих этапах синтеза. При таком подходе задача получения широкого набора производных фаскаплизина сводится к многократному воспроизведению короткой синтетической последовательности на большом количестве близких по структуре веществ. Недостатком данной стратегии является необходимость разработки отдельных синтетических методов для получения замещенных фаскаплизинов, содержащих заместители в разных циклах базовой структуры. В рамках данной работы были изучены подходы к синтезу производных фаскаплизина, содержащих заместители только в циклах А или Е (см. рисунок

2.1 Разработка метода синтеза фаскаплизина, позволяющего внедрение заместителя в цикл А

Наиболее эффективным подходом для получения производных гетероциклической системы пиридо[1,2-а: 3,4-6 ]дииндола, содержащих заместители в цикле А, является аннелирование индольного фрагмента к системе пиридо[1,2-а]индола. Данная стратегия ранее была реализована для получения алкалоида гомофаскаплизина С (22), скелет которого был сформирован путем проведения реакции Фишера между пиридоиндолом 23, полученным из скатола (24), и гидрохлоридом фенилгидразина (рисунок 8). Использование данного метода для получения фаскаплизина требует подбора таких условий окисления гомофаскаплизина С, при которых последовательно происходил разрыв связи С(13) - СНО и окисление атома С(13) до карбонильной группы. Эффективным способом проведения подобных реакций является перегруппировка Байера-Виллигера.

1).

м-ы

Рисунок 8 - Получение гомофаскаплизина С исходя из скатола и фенилгидразина

Исходя из общепризнанного механизма данной реакции гомофаскаштизин С под действием надкислот должен превращаться в сложный эфир 25, склонный к легкому гидролитическому расщеплению (рисунок 9). Продукт его гидролиза 26 в присутствии избытка надкислоты будет немедленно окисляться в целевой фаскаплизин. Для экспериментальной проверки этих теоретических рассувдений синтетический гомофаскаплизин С был введен в реакцию с иг-хлорпербензойной кислотой (/и-СРВА) (27) при комнатной температуре в течение 24 ч. В результате был выделен индивидуальный продукт, спектральные характеристики которого совпали с характеристиками фаскаплизина. Выход соединения 1 в данной реакции составил 67 %. Это превращение, по сути, формирует новый метод синтеза фаскаплизина, что, в свою очередь, открывает перспективу получения его производных с заместителями в цикле А исходя из пиридоиндола 23 и замещенных фенилгидразинов.

2.2 Разработка метода синтеза фаскаплизина, позволяюи/его внедрение заместителя в цикл Е

Удобным способом формирования производных фаскаплизина с заместителями в цикле Е, является внутримолекулярная кватернизация атома азота пиридинового цикла замещенных 1-бензоил-|3-карболинов, содержащих хорошую уходящую группу во втором положении бензоильного фрагмента молекулы. Данная стратегия ранее была использована сразу в нескольких методах синтеза фаскаплизина, что свидетельствует о её высокой эффективности, селективности и надежности. Таким образом, для создания нового метода синтеза фаскаплизина, перспективного для получения его производных с заместителями в цикле Е, достаточно разработать эффективную

методологию получения замещенных 1-бензоил-Р-карболинов. Очевидный подход, связанный с действием бутиллития на защищенный по КН-группе (3-карболин и последующим добавлением к реакционной смеси замещенных бензоилхлоридов, был нами отвергнут, поскольку предполагает использование высокоактивных интермедиатов, что существенно ограничивает круг доступных для введения функциональных групп. Вместо этого для получения целевых соединений была выбрана реакция Минисци, отличительной особенностью которой является возможность её проведения между соединениями, содержащими широкий набор заместителей.

Реакция Минисци применяется для получения замещенных производных л-дефицитных гетероароматических систем под действием так называемых «нуклеофильных радикалов», у которых по соседству с радикальным центром расположен гетероатом, содержащий неподелённые пары электронов. На рисунке 10 приведен механизм реакции Минисци между исследованными нами реактантами — р-карболином (28) и о-фторбензальдегидом (29). Образование интермедиатов типа 30 происходит в результате атаки нуклеофильного радикала по а- и у-положениям относительно протонированного атома азота гетероциклической системы и является обратимым процессом (атака по положению 3 протонированного р-карболина менее выгодна и не реализуется). Для смещения равновесия в сторону продукта реакции (в данном случае соединения 31) необходимо действие окислителя для реароматизации замещенной гетероциклической системы.

in- = (СН3)3С-0-

Рисунок 10 - Механизм реакции Минисци между соединениями 28 и 29

Для получения исходного Р-карболина был модифицирован известный способ его синтеза one pot исходя из триптофана (32) (рисунок 11). На первом этапе рацемический триптофан был конвертирован в дигидро-Р-карболин 33 взаимодействием с формалином и последующей циклизацией полученного имина по Пикте-Шпенглеру. Дальнейшая обработка реакционной смеси бихроматом натрия приводила к декарбоксилированию и ароматизации полупродукта 33 в p-карболин. Для выделения целевого продукта была использована обнаруженная нами способность соединения 28 возгоняться из смеси веществ в индивидуальном виде при её нагревании в вакууме, что позволило существенно сократить затраты на его получение и очистку.

Рисунок 11 — Получение |3-карболина из триптофана методом опе ро!

Для проведения реакции Минисци между Р-карболином и о-фторбензальдегидом была использована стандартная методика, заключающаяся в прибавлении по каплям растворов сульфата железа (II) и /ирет-бутилгидропероксида к охлаждаемой смеси исходных соединений в 50 %-ном растворе уксусной кислоты в присутствии серной кислоты. В результате из реакционной смеси был выделен целевой продукт бензоилирования 31, однако выход данного соединения не превышал 7-8 % (рисунок 12). Дальнейшее прибавление смеси компонентов, инициирующих реакцию, оказалось неэффективно, поскольку приводило к преимущественному получению соединения 34 - продукта диацилирования р-карболина по положениям 1 и 3. Это можно объяснить присутствием электроноакцепторного заместителя в соединении 31, что делает его мишенью для преимущественной атаки при повторной генерации нуклеофильных радикалов. Также из смеси был выделен продукт метилирования р-карболина по положению 1 (35), которое происходит в результате атаки субстрата метальным радикалом, образующимся при фрагментации радикала (СНз)зСО'.

Рисунок 12 — Реакция Минисци между соединениями 28 и 29 (базовая методика)

Низкий выход целевого продукта первоначально мы связали с введением в реакцию малых количеств исходных соединений и, как следствие, низкой концентрацией реактантов в реакционной смеси. Однако увеличение загрузки не позволило повысить выход соединения 31. Многочисленные попытки улучшить выход путем изменения скорости прибавления компонентов инициирующей смеси, соотношения реагирующих веществ, температурного режима и времени проведения реакции не принесли желаемого результата. Протеканию реакции Минисци с альдегидами также препятствует их низкая растворимость в реакционной смеси, что приводит к образованию гетерогенной

системы и затрудняет генерацию ацильных радикалов. Обычно данное затруднение преодолевают путем подбора оптимального соотношения растворителей, которые используют в данной реакции, однако в нашем случае это никак не способствовало увеличению выхода продукта ацилирования. Попытки замены о-фторбензальдегида на более растворимые о-нитро-, о-гидрокси- и о-аминобензальдегид также не увенчались успехом.

Это привело нас к закономерному выводу, что низкий выход продукта 31 обусловлен недостаточной реакционной способностью исходного Р-карболина, в структуре которого присутствует я-избыточная индольная гетероциклическая система. В данном случае повышения выхода продукта ацилирования можно было добиться только увеличением «нуклеофильных» свойств атакующего радикала. В литературе имеются сведения о применении для этой цели ацеталей соответствующих альдегидов, у которых в непосредственной близости от радикального центра находятся сразу два атома кислорода. Для экспериментальной проверки этих предположений был получен этиленацеталь о-фторбензальдегида (36). После введения его в реакцию Минисци с Р-карболином продукт 31 был выделен с выходом 35 % (рисунок 13). Хотя эффективность этой процедуры оказалась выше, чем в упомянутых ранее подходах к синтезу продукта 31, неудовлетворительный выход этого соединения заставил нас перейти к рассмотрению других способов генерации ацильных радикалов.

Рисунок 13 - Реакция Минисци между (З-карболином и этиленацеталем о-фторбензальдегида

Наиболее очевидным из них является нагревание реакционной смеси для инициации разрыва лабильной связи 0-0 /яргт-бутилгидропероксида, для чего было использовано микроволновое облучение. Уже при первой попытке проведения реакции Минисци между р-карболином и о-фторбензальдегидом под действием микроволнового облучения было отмечено значительное увеличение содержания целевого продукта в реакционной смеси по сравнению с ранее полученными результатами. После тщательной отработки условий реакции выход соединения 31 составил 65 %, при этом побочные продукты 34 и 35 присутствовали лишь в следовых количествах (рисунок 14). В литературе не было найдено сведений о проведении реакции Минисци в аналогичных условиях, возможно, что полученный нами результат является первым примером подобной активации.

Рисунок 14 - Реакция Минисци между соединениями 28 и 29 под действием микроволнового

облучения

Далее для конверсии соединения 31 в фаскаплизин в соответствии с методикой, использованной для синтеза бромфаскаплизинов 2-4, его выдерживали при температуре 220 °С в течение 40 минут, однако это привело к полному осмолению реакционной смеси (рисунок 15). Применение микроволнового облучения в данном случае также оказалось неэффективным. При попытке получить бромсодержащий аналог соединения 31 исходя из Р-карболина и о-бромбензальдегида в условиях реакции Минисци выход продукта был крайне низким, что обусловлено, по-видимому, стерическим влиянием объемного атома брома в положении 2 бензальдегида.

220 °С, 40 мин

-X--

М\У, 150-250 Вт, 40 мин -^-

Ру'НСІ, 200-210 °С, 40 мин 80%

Рисунок 15 - Получение фаскаплизина из р-карболина 31

Фаскаплизин удалось получить из Р-карболина 31 при выдерживании данного соединения при 200-210 °С в смеси с гидрохлоридом пиридиния, активирующее действие которого на протекание подобной реакции ранее было показано французскими химиками. Результатом проведенных исследований стала разработка самого простого и эффективного на сегодняшний день метода синтеза фаскаплизина исходя из Р-карболина в две стадии с суммарным выходом 52 %, который в перспективе может быть использован для получения его производных с заместителями в цикле Е.

3 Применение новых методов синтеза фаскаплизина для получения его

производных

Далее необходимо было показать возможность применения разработанных методов для получения замещенных фаскаплизинов, перспективных для дальнейшего изучения. Среди всего спектра биологической активности фаскаплизина наибольший интерес представляет его способность селективно ингибировать фермент СОК 4. Для выявления производных нативного алкалоида, обладающих большим сродством к этой важной терапевтической мишени, был проведен молекулярный докинг серии замещенных фаскаплизинов с теоретической моделью СБК 4, построенной по гомологии с известными структурами родственных киназ СОК 2 и СОК 6.

Для отработки метода и оценки СОК 4-ингибирующей активности ранее полученных соединений сначала было изучено взаимодействие фаскаплизина, а также 3-бромфаскаплизина (2), 3-хлорфаскаплизина (10), 10-бромфаскаплизина (3) и 3,10-дибромфаскаплизина (4) с АТФ-связывающим сайтом СБК 4. В результате для фаскаплизина был получен комплекс, содержащий описанный в литературе набор межмолекулярных контактов. Расчетная величина энергии связывания составила для него минус 8.3 ккал/моль, что соответствует Ю50 0.77 дМ и хорошо согласуется с экспериментально установленным для фаскаплизина значением 0.55 цМ. После изучения галогенпроизводных фаскаплизина 2-4 и 10 были получены, в целом, аналогичные комплексы, при этом во всех случаях наблюдалось увеличение сродства к терапевтической мишени. Это согласуется с известным фактом, что бромфаскаплизины 2 и 3 обладают большей активностью в отношении различных типов опухолевых клеток по сравнению с незамещенным фаскаплизином.

По данным расчетов, в наибольшей мере увеличению СОК 4-ингибирующей активности способствует введение атома галогена в положение 3 фаскаплизина. Это обусловлено наличием в структуре сайта связывания небольшой гидрофобной полости вблизи данной области, что приводит к возникновению дополнительных межмолекулярных контактов. Данный эффект в наибольшей мере проявился для 3-бромфаскаплизина (Е„. составила минус 9.3 ккал/моль) и 3-хлорфаскаплизина (Есв. равна минус 9.1 ккал/моль). Замена данных заместителей на другие функциональные группы неизменно приводила к уменьшению сродства к терапевтической мишени. Введение атома галогена с противоположной стороны молекулы, в цикл А, вызывало небольшое смещение положения лиганда в сайте связывания и также увеличивало его сродств к терапевтической мишени. Так, для 10-бромфаскаплизина расчетная величина Есв составила минус 8.9 ккал/моль. Комбинация сразу двух атомов брома в структуре 3,10-дибромфаскаплизина (4) привела к тому, что расчетная энергия связывания данного соединения достигла максимального значения минус 9.8 ккал/моль.

Поскольку фаскаплизин в комплексе с СВК 4 контактирует с внешним вестибюлем сайта связывания со стороны цикла А, наиболее очевидным подходом для модификации его структуры без риска нарушения существующей системы межмолекулярных контактов является введение заместителя в положения 8-11 базовой структуры. Детальный анализ строения полученного комплекса показывает, что оптимальными для замещения являются положения 8 и 9 фаскаплизина. Изучение природы аминокислотных остатков, непосредственно прилегающих к сайту связывания, свидетельствует, что дополнительные межмолекулярные контакты могут быть образованы, в основном, за счет сил Ван-дер-Ваальса. Это, в свою очередь, определяет необходимость внедрения заместителя, обладающего развитой молекулярной поверхностью. В ходе докинга серии производных фаскаплизина, замещенных по положениям 8 и 9, наилучшие результаты продемонстрировали соединения, содержащие бензильный и бензоильный заместители в положении 9 исходной системы. Таким образом, наиболее перспективным объектом для синтеза является дизамещенное производное фаскаплизина, содержащее бензоильный (или бензильный) заместитель в положении 9 и атом галогена в положении 3 базовой структуры.

Для получения подобного соединения был адаптирован разработанный нами двухстадийный метод синтеза фаскаплизина исходя из р-карболина (рисунок 16).

Рисунок 16 - Трехстадийный синтез соединения 39 исходя из р-карболина

На первом этапе предполагалось получить 6-бензоил-(3-карболин (37) путем электрофильного ацилирования соединения 28 по Фриделю-Крафтсу хлорангидридом бензойной кислоты. Продукт ацилирования 37 был получен нагреванием (3-карболина в избытке бензоилхлорида в присутствии А1С13 в качестве катализатора. Выход целевого продукта составил при этом 50 %. В масс-спектре электронного удара соединения 37 наблюдается ожидаемый пик

молекулярного иона М+ с m/z 290. В ИК-спектре данного соединения присутствуют характеристичные полосы поглощения NH-группы (3410 см"1) и карбонильной группы (1646 см"1). В спектре ЯМР^Н наблюдаются 10 сигналов протонов, отнесение которых не вызвало затруднений. Данный спектр свидетельствует о сохранении в исследуемом соединении пиридинового цикла, в то же время появляется спиновая система АВХ-типа, что обусловлено введением заместителя в положение 6 ß-карболина. В спектре ЯМР-!2С присутствуют 16 сигналов атомов углерода, среди которых характеристичным является сигнал атома углерода карбонильной группы при 196.7 м. д.

Далее полученный продукт предстояло ввести в реакцию Минисци с соответствующим образом замещенным бензальдегидом. Среди возможных 2,4-дигалогензамещенных бензальдегидов нам был доступен только 2,4-дихлорбензальдегид (38), поэтому целевым объектом синтеза был выбран 9-бензоил-З-хлорфаскаплизин (39), для которого расчетная величина Есв составила минус 9.7 ккал/моль. Анализ структуры теоретического комплекса соединения 39 с АТФ-связывающим сайтом CDK 4 показал сохранение для данного соединения уникальной системы межмолекулярных контактов, характерной для фаскаплизина. Соединение 37 было введено в реакцию Минисци с 2,4-дихлорбензальдегидом под действием микроволнового облучения в соответствии с ранее описанной методикой. После обработки реакционной смеси выход целевого продукта 40 составил только 30 %, что может быть связано с негативным влиянием атома хлора во втором положении бензальдегида. В масс-спектре электронного удара полученного соединения присутствует кластер пиков молекулярного иона М1" с m/z 444/446/448. В ИК-спектре данного соединения присутствуют характеристичные полосы поглощения NH-группы (3370 см"1) и двух карбонильных групп (при 1659 и 1646 см'1). В спектре ЯМР-'Н наблюдаются 12 мультиплетных сигналов протонов, отнесение которых не представляется возможным. В спектре ЯМР-13С присутствуют 23 сигнала атомов углерода, среди которых выделяются сигналы атомов углерода двух карбонильных групп при 196.0 и 196.2 м. д.

На завершающей стадии синтеза кватернизацию соединения 40 не удалось провести ни при нагревании, ни под действием микроволнового облучения. Однако при его нагревании в присутствии гидрохлорида пиридиния соединение 39 было получено с выходом 80 %. В масс-спектре полученного продукта присутствует ожидаемый кластер пиков молекулярного иона с m/z 409/411 (1:0.3). В спектре ЯМР-13С данного соединения также наблюдаются 23 сигнала атомов углерода, из которых наиболее характеристичными являются сигналы углеродов двух карбонильных групп при 180.2 и 195.5 м. д. В спектре ЯМР-'Н полученного продукта в МеОН-сЦ присутствуют 11 сигналов протонов, отнесение которых не вызвало затруднений. Сигналы протонов Н-6 и Н-7 представлены двумя дублетами в самом слабом поле с общей константой спин-спинового взаимодействия (КССВ). Сигналы протонов Н-2' и Н-6' (аналогично

сигналам протонов Н-3' и Н-5') бензоильного заместителя были отнесены на основании удвоения их интегральной интенсивности, а сигнал протона Н-4' - на основании наличия общей с ними КССВ, равной 7.4 Гц. Сигналы остальных протонов формируют две спиновые системы АВХ-типа и были отнесены на основании совпадения химических сдвигов сигналов протонов Н-1, Н-2 и Н-4 со значениями химических сдвигов сигналов аналогичных протонов в спектре 3-хлорфаскаплизина (10).

Получение производного фаскаплизина 39 открывает возможность для всестороннего изучения биологической активности этого перспективного ингибитора СОК 4, а также доказывает возможность применения разработанного нами метода синтеза фаскаплизина исходя из р-карболина и о-фторбензальдегида для получения производных фаскаплизина, содержащих заместители в различных положениях базовой структуры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проведенных исследований можно сделать следующие основные выводы.

1. На основе известного метода синтеза фаскаплизина исходя из триптамина и о-бромфенилуксусной кислоты разработана последовательность синтетических операций, применимая для получения его производных с заместителями в циклах А и Е.

2. Осуществлен первый синтез природных бромпроизводных фаскаплизина - алкалоидов 10-бромфаскаплизина, 3,10-дибромфаскаплизина и 3-бромфаскаплизина, а также его хлорзамещенного аналога 3 -хлорфаскаплизина.

3. Показано, что алкалоид гомофаскаплизин С под действием надкислот превращается в фаскаплизин, что открывает новый путь синтеза фаскаплизина, перспективный для получения его производных с заместителями в цикле А исходя из замещенных фенилгидразинов.

4. Разработан новый двухстадийный метод синтеза фаскаплизина исходя из Р-карболина, перспективный для получения его производных с заместителями в цикле Е.

5. Впервые показано, что микроволновое облучение может быть использовано для активации реакции Минисци - важного метода ацилирования я-дефицитных гетероциклических систем.

6. Исходя из р-карболина осуществлен целенаправленный синтез 9-бензоил-З-хлорфаскаплизина, который по данным молекулярного докинга является перспективным ингибитором фермента циклинзависимой киназы 4.

Очевидным направлением развития данной работы является применение разработанных методов для получения широкого набора производных фаскаплизина с целью проведения их всестороннего биотестирования и установления функциональной зависимости между строением полученных соединений и проявляемой ими биологической активностью.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. The first syntheses of 3-bromofascaplysin, 10-bromofascaplysin and 3,10-dibromofascaplysin—marine alkaloids from Fascaplysinopsis reticulata and Didemnum sp. by application of a simple and effective approach to the pyrido[l,2-a:3,4-b ']diindole system / M. E. Zhidkov, О. V. Baranova, N. N. Balaneva, S. N. Fedorov O. S. Radchenko, S. V. Dubovitskii // Tetrahedron Lett.- 2007.-V. 48,- P. 7998-8000.

2. The anticancer activity of 3- and 10-bromofascaplysins is mediated by caspase-8, -9, -3-dependent apoptosis / A. S. Kuzmich, S. N. Fedorov, V. V. Shastina, L. K. Shubina, O. S. Radchenko, N. N. Balaneva, M. E. Zhidkov, J. Park, J. Y. Kwak, V. A. Stonik // Bioorg. Med. Chem.- 2010,- V. 18.- P. 3834-3840.

3. A new method for the synthesis of the marine alkaloid fascaplysin / M. E. Zhidkov, О. V. Baranova, N. S. Kravchenko, S. V. Dubovitskii // Tetrahedron Lett.- 2010,- V. 51,- P. 6498-6499.

4. Пат. 2457840 Российская Федерация, МПК А61К35/56, А61Р35/02. Средство, предотвращающее трансформацию нормальных клеток млекопитающих в опухолевые, и ингибирующее в них активность р53 и индуцирующее активность АР-1 ядерных факторов / Савина А. С., Федоров С. Н., Шубина JI. К., Радченко О. С., Жидков M. Е., Баланева H. Н., Стоник В. А. ; заявитель и патентообладатель Учреждение Российской академии наук Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН. - № 2011108924/15 ; заявл. 09.03.11; опубл. 10.08.12, Бюл. № 22.

5. Жидков, M. Е. Исследования в области синтеза бромпроизводных фаскаплизина - новых алкалоидов из губок Fascaplysinopsis reticulata и Didemnum sp. / Жидков M. Е., Баранова О. В., Дубовицкий С. В. // Материалы научной конференции студентов и аспирантов ДВГУ,-Владивосток : Изд-во ДВГУ, 2005,- С. 17.

6. Жидков, M. Е. Синтез бромфаскаплизинов - цитотоксических алкалоидов из морских беспозвоночных / M. Е. Жидков, H. Н. Баланёва, О. С. Радченко, С. В. Дубовицкий, В. J1. Новиков // Материалы II региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии»,- Владивосток : ДВО РАН, 2006.- С. 47-48.

7. Zhidkov, M. Е. Modelling, syntheses and bioassays of some derivatives and analogs of marine alkaloid fascaplysin / M. E. Zhidkov // Materials of the 1 st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences.- Vladivostok : DVO RAN, 2008.-P. 80.

8. Жидков, М. Е. Моделирование, синтез и биотестирование серии селективных ингибиторов СОК 4 на основе пиридо[1,2-а:3,4-6']дииндола / М. Е. Жидков, С. В. Дубовицкий // Сборник материалов III Международной конференции "Химия гетероциклических соединений", посвященная 95-летию со дня рождения профессора А. Н. Коста,- М : Изд-во МГУ, 2010. С. У25.

Соискатель

Жидков М.Е.

Жидков Максим Евгеньевич

Разработка методов синтеза производных фаскаплизина -цитотоксического алкалоида из губки Рахсар1у$'тор515 ер.

02.00.03 - Органическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 12.04.2013 Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1.39. Уч.-изд. л. 1.44 Тираж 120 экз. Заказ 92 Отпечатано в типографии Издательско-полиграфического комплекса ДВФУ 690990, Владивосток, ул. Пушкинская, 10

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Жидков, Максим Евгеньевич, Владивосток

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный федеральный университет» (ДВФУ)

На правах рукописи

04201356702

Жидков Максим Евгеньевич

Разработка методов синтеза производных фаскаплизина - цитотоксического

алкалоида из губки РаБсарІузіпорБЬ ер.

02.00.03 - Органическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: Каминский В. А., д.х.н., профессор

Владивосток - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 3_7

1 Обзор литературы 8-45

1.1 Пиридо[ 1,2-я:3*]дииндольные алкалоиды: структурное разнообразие и область распространения 8-11

1.2 Общая характеристика биологической активности фаскаплизина и родственных ему природных соединений 11-15

1.3 Циклинзависимая киназа 4 как перспективная терапевтическая мишень для создания новых противоопухолевых лекарственных препаратов 15-20

1.4 Ингибиторы СОК как перспективные противоопухолевые препараты. СБК 4-ингибирующая активность фаскаплизина 20-27

1.5 Непланарные аналоги фаскаплизина 27-29

1.6 Химические свойства фаскаплизина 29-32

1.7 Методы синтеза пир идо [1,2-а: 3,4-6 дииндольной гетероциклической системы и их применение для получения фаскаплизиновых алкалоидов 32-45

2 Обсуждение результатов 46-89

2.1 Применение метода синтеза фаскаплизина, в котором исходными соединениями являются триптамин и о бромфенилуксусная кислота, для получения его производных 46-62

2.2 Разработка новых методов синтеза фаскаплизина, перспективных для получения его производных 62-78

2.2.1 Разработка метода синтеза фаскаплизина, позволяющего внедрение заместителя в цикл А 63-67

2.2.2 Разработка метода синтеза фаскаплизина, позволяющего внедрение заместителя в цикл Е 67-78

2.3 Применение новых методов синтеза фаскаплизина для получения его

производных 78-89

3 Экспериментальная часть 90-111

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 112

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 113

СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ 114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115-129

Приложение А 1 Сравнение данных спектров ЯМР *Н и 13С синтетического и природного З-бромфаскаплизина (3) в МеОН-сЦ 130

Приложение А 2 Сравнение данных спектров ЯМР 5Н и 13С синтетического и природного 10-бромфаскаплизина (4) в МеОН-сЦ 131

Приложение А 3 Сравнение данных спектров ЯМР *Н и 13С синтетического и природного 3, 10-дибромфаскаплизина (S) в МеОН-сЦ 132

Приложение Б 1 Спектр ЯМР^Н соединения 124 133-134

Приложение Б 2 Спектр ЯМР- С соединения 124 135

Приложение Б 3 Спектр COSY-45 соединения 124 136

Приложение Б 4 Спектр HSQC соединения 124 137

ВВЕДЕНИЕ1

Актуальность темы исследования. Среди большого числа вторичных метаболитов морского происхождения, открытых на сегодняшний день, особое место занимает группа алкалоидов, в основе которых лежит пентациклическая система пиридо[1,2-а: 3,4-Ь]дииндола, более известные как фаскаплизиновые алкалоиды. Наиболее изученным представителем данной серии веществ является красный пигмент фаскаплизин, впервые выделенный из губки Fascaplysinopsis sp. в 1988 году. Данное соединение обладает широчайшим спектром биологической активности, сочетая противобактериальное, противогрибковое и противовирусное действие с антиангиогенными свойствами и цитотоксической активностью в отношении различных типов опухолевых клеток. Молекулярные механизмы действия фаскаплизина включают интеркаляцию в ДНК, индукцию апоптоза, а также способность селективно ингибировать фермент CDK 4. Данный фермент играет ключевую роль в регуляции клеточного цикла млекопитающих. Подобный набор свойств ставит фаскаплизин в ряд перспективных соединений-лидеров для создания нового поколения противоопухолевых лекарственных препаратов. Это, в свою очередь, определяет актуальность проведения исследований в области синтеза широкого набора производных и аналогов нативного алкалоида для установления зависимости между их строением и проявляемой биологической активностью.

Степень разработанности темы исследования. Большинство ранее проведенных исследований в обозначенной области было направлено на разработку новых методов синтеза фаскаплизина или получение более доступных аналогов данного алкалоида. Последние привели к открытию нескольких типов физиологически активных соединений, обладающих, однако, более низкой биологической активностью по сравнению с нативным алкалоидом. В отличие от них некоторые природные производные фаскаплизина продемонстрировали более

1 Работа оформлена в соответствии с ГОСТ Р 7.0.11 - 2011 ДИССЕРТАЦИЯ И АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ Структура и правила оформления.

высокую активность по сравнению с родоначальным алкалоидом, однако их всестороннее изучение ограничено малой доступностью данных соединений. Механизмы биологической активности фаскаплизина были тщательно изучены различными методами, но многие детали его взаимодействия с важнейшей терапевтической мишенью СБК 4 до сих пор не выяснены. Основным препятствием на пути дальнейшего изучения этой перспективной группы природных соединений является отсутствие универсальных методов синтеза производных гетероциклической системы пир идо [1,2-а: 3,4-б^дииндола, лежащей в их основе. На сегодняшний день разработано несколько методов синтеза фаскаплизина, а также гомофаскаплизинов В и С, однако большинство из них включает большое число стадий, а также требует использования труднодоступных исходных соединений.

1) изучить возможность применения существующих методов синтеза фаскаплизина для получения его производных;

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые получены три природных бромпроизводных фаскаплизина - алкалоиды 3-бромфаскаплизин, 10-бромфаскаплизин и 3,10-дибромфаскаплизин. Также были разработаны два новых метода синтеза фаскаплизина, которые в перспективе могут быть использованы для получения его производных, содержащих заместители в циклах А и Е. Кроме того, в ходе проведения исследований впервые было продемонстрировано активирующее действие

микроволнового облучения в отношении реакции Минисци - важного метода ацилирования 7г-дефицитных гетероциклических систем.

Теоретическая и практическая значимость работы. В ходе выполнения данной работы методом ретросинтетического анализа были изучены возможные подходы к синтезу производных фаскаплизина. Кроме того, впервые методом молекулярного докинга была изучена зависимость между строением и CDK 4-ингибирующей активностью ряда производных фаскаплизина. Важным практическим результатом работы стало получение природных бромпроизводных фаскаплизина, биологическая активность которых не уступает, а по некоторым параметрам превосходит аналогичные показатели фаскаплизина. Один из разработанных синтетических методов позволяет получить фаскаплизин всего в две стадии из коммерчески доступных соединений, что существенно сокращает издержки и снижает себестоимость его получения. Кроме того, была доказана возможность применения данного метода для получения замещенных фаскаплизинов.

Методология и методы исследования. В рамках проведенных исследований был использован широкий набор методов, включая последние методологические разработки в области целенаправленного органического синтеза (микроволновое облучение, радикальное ацилирование я-дефицитных гетероциклических систем, процедура one pot), современные методы анализа состава смесей соединений и выделения из них индивидуальных компонентов (газовая хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография, препаративная жидкостная хроматография среднего давления), методы установления строения полученных соединений (ИК- и ЯМР-спектроскопия, включая 2В-эксперименты, масс-спектрометрия), а также методы компьютерного моделирования, в том числе молекулярный докинг, для теоретического изучения взаимодействия полученных соединений с терапевтической мишенью и оценки их биологической активности.

Положения, выносимые на защиту.

3. Впервые показана возможность проведения под действием микроволнового облучения реакции Минисци - важного метода ацилирования я-дефицитных гетероциклических систем.

4. На основе одного из разработанных методов осуществлен целенаправленный синтез 9-бензоил-З-хлорфаскаплизина - перспективного ингибитора циклинзависимой киназы 4, важной терапевтической мишени.

Степень достоверности и апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в виде устных и стендовых сообщений на «Научной конференции студентов и аспирантов ДВГУ», Владивосток, 2005; на П-ой Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 2006; на Международном симпозиуме «The 1st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences», Владивосток, 2008; на П1-ей Международной конференции "Химия гетероциклических соединений", посвященной 95-летию со дня рождения профессора А. Н. Коста, Москва, 2010. По материалам диссертации опубликованы три статьи в зарубежных журналах из списка ВАК. Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании кафедры органической химии ФГАОУ ВПО ДВФУ 21 декабря 2012 г.

1 Обзор литературы

1.1 Пиридо[1,2-а:3,4-Ь']дииндолъные алкалоиды: структурное разнообразие и

область распространения

Значительные достижения медицины в последние десятилетия во многом связаны с постоянным внедрением в терапевтическую практику современных лекарственных препаратов, что, в свою очередь, определяет потребность в выявлении всё новых физиологически активных соединений (ФАС), пригодных для создания на их основе лекарственных средств. В настоящее время вторичные метаболиты морских организмов рассматриваются как перспективные источники подобных соединений. В первую очередь это относится к алкалоидам, которые отличает огромное разнообразие структур в сочетании с высокой физиологической активностью. Среди них особое положение занимает группа близких по строению природных соединений, выделенных из морских беспозвоночных и называемых фаскаплизиновыми алкалоидами. Родоначальником данной серии веществ является красный пигмент фаскаплизин (Гаэсар^т, 1), впервые выделенный в 1988 году из губки Fasca/?/v5шор5,/5 эр. [1], в основе которого лежит пентациклическая гетероциклическая система пиридо[ 1,2-а: 3,4-Ь *]дииндола (2), не встречавшаяся до этого среди вторичных метаболитов (рисунок 1). Впоследствии этот алкалоид был неоднократно обнаружен в других беспозвоночных наряду с ранее неизвестными соединениями, близкими ему по строению.

Рисунок 1 - Строение фаскашшзина и лежащего в его основе пиридо[ 1,2-«: 3,4-Ь дииндола

Современная классификация фаскаплизиновых алкалоидов, охватывающая всё разнообразие данной группы природных соединений, была предложена в работе Segraves и соавт. [2] и включает три типа структур (рисунок 2).

Тип 1а о Тип 16 он Тип 1в Н я фаскаплизин (1) Х1 = Н, Х2 = Н, Х3 = СГ 3-бромфаскаллизин (3) Х1 = Н, Х2 = Вг, Хз = СГ 10-бромфаскашшзин (4) Х1 = Вг, Х2 = Н, Хз = СГ 3,10-дибромфаскаплизин (5) Х1= Х2 = Вг, Хз = СГ фаскаплизин А (6) X! = Н, Х2 = Н, соон хз= Оч^^ 1 ' соо- гомофаскаплизин А (7) 11=Н, Х=Н гомофаскаплизат А (8) Е.=СН2СООН, Х=Н 3-бромгомофаскаплизин А (9) 11=СН2СООН, Х=Вг тхорекгандрамин (10) ОН лЬ НО ^^ ^ гомофаскаплизин В (11) К = СО-СООМе, X = Н гомофаскаплизин В-1 (12) К = СО-СОСЖ, Х = Н 3-бромгомофаскаплизин В (13) К = СО-СООМе, X = Вг 3-бромгомофаскаплизин В-1 (14) Е. = СО-СООЕ^ X = Вг гомофаскаплизин С (15) К = СНО, X = Н 3-бромгомофаскаплизин С (16) Я = СНО, X = Вг

Тип 2 н ретикулатин (17) К = СООМе, Х1 = Х2 = Н 14-бромретикулатин (18) Я = СООМе, X! = Н, Х2 = Вг 7,14-дибромретикулатин (19) К = СООМе, Х1 = Х2 = Вг ретикулатат (20), К = СООН, Х1= Х2 = Н 14-бромретикулатат (21) К = СООН, Хх= Н, Х2 = Вг ретикулатол (22) К = ОН, Х1 = Х2 = Н 14-бромретикулатол (23) Я = ОН, Х1 = Н, Х2 = Вт

Тип 3 О-П ОДго н О \3 X секофаскаплизин (24) Я = СН3, X = Н 3-бромсекофаскаплизин А (25) К = СН3, Х=Вг 3-бромсекофаскаплизин В (26) Я = Н, X = Вг

Рисунок 2 - Многообразие фаскаплизиновых алкалоидов, классификация заимствована из [2]

Тип 1 объединяет соединения, в основе которых лежит система пиридо[1,2-а:3,4-Ь']дииндола. Он включает в себя 15 представителей и на

основании характерных различий в строении разделён на три подтипа. Помимо фаскаплизина к подтипу 1а относятся 3-бромфаскаплизин (3), 10-бромфаскаплизин (4), 3,10-дибромфаскаплизин (5) и фаскаплизин А (6). Гомофаскаплизин А (7), гомофаскаплизат А (8), 3-бромгомофаскаплизин А (9) и тхорестандрамин (10) составляют подтип 16. Подтип 1в представлен гомофаскаплизином В (11), гомофаскаплизином В-1 (12), 3-бромгомофаскаплизином В (13), 3-бромгомофаскаплизином В-1 (14), гомофаскаплизином С (15) и 3-бромгомофаскаплизином С (16). Два других структурных типа объединяют в себе производные Р-карболина, арилированные по атому азота пиридинового цикла молекулы. Тип 2 содержит семь алкалоидов: ретикулатин (17), 14-бромретикулатин (18), 7,14-дибромретикулатин (19), ретикулатат (20), 14-бромретикулатат (21), ретикулатол (22) и 14-бромретикулатол (23). Тип 3 включает в себя соединения, содержащие карбонильную группу в положении 1, и представлен тремя алкалоидами: секофаскаплизином (24), 3-бромсекофаскаплизином А (25) и З-бромсекофаскаплизином В (26).

Объединение обозначенных алкалоидов в единую группу основано на предположении о том, что они являются продуктами единого биосинтетического пути (рисунок 3), в основе которого лежит димеризация триптофана (27), а также

З -бромсекофаскаплнзин А (25)

МеОН

З-бромсекофаскзплкшн В (26)

[О]

14-6ромретгасулаггат (21) -

-СО /

/ МеОН

14-6ромретикулатси: (23)

1Ф-6роъфетнкупатин (18)

соон

3,10-днбромфаскаплизин (5)

н,о,

МеОН

ЩО

** ( 7,14-днбромретнкулатнн (19)

/ ноос/^н3

/ 27 (Й=Н) шш 28 (Й=Вг)

З-бромфзскашшзнн (3) 1О-бромфаскашшзин (4) фяриаилниит? (1)

З-бромгомофаскашшзнн В (15)

3-6ромгомофаскзплкшн А (9)

З-брамгомофасхаплнзин С (іб)

-со,

(не пыдплпн)

3-6ромхх>мофаскаплизнн В-1 (14)

Рисунок 3 - Предполагаемый механюм биосинтеза фаскаплизиновых алкалоидов [2]

его 6-бромзамещенного производного 28. Эту гипотезу косвенно подтверждает существование специфического гена, ответственного за биосинтез бис-триптофана [3,4].

Среди организмов, продуцирующих рассматриваемые соединения, чаще всего встречаются морские губки, обитающие в бассейнах Тихого и Индийского океанов: Fascaplysinopsis reticulata, собранные у побережья Фиджи и Индонезии, Fascaplysinopsis sp. (Фиджи и Палау), Hyrtios cf. erecta (Фиджи) и Thorectandm sp. (Палау). Фаскаплизины, относящиеся к типу 1а, также были выделены из асцидий Didemmm sp., встречающихся в разных регионах, включая прибрежные зоны Фиджи, Соломоновых островов, островов Микронезии и Полинезии. В таблице 1 представлены сводные данные о продуцентах различных представителей данной группы алкалоидов, а также местах их сбора.

Таблица 1 - Продуценты фаскаплизиновых алкалоидов и места их сбора [2]

Код коллекции Таксономическое название продуцента Место сбора Обнаруженные алкалоиды Литература

Fascaplysinopsis sp. Фиджи 1 1

87057 F. reticulata Фиджи 1, 7,11, 24,15 5

88106 F. reticulata Фиджи 1,11, 24,15 5

89051 F. reticulata Фиджи 1,11,17, 24,15 5,6

Fascaplysinopsis sp. Палау 1 7

Hyrtios cf. erecta Фиджи 1,7 8

0CDN5079 Thorectandra sp. Палау 1, 10 9

Smertospongia sp. Острова Кука 1 10, 11

89128 F. reticulata Фиджи 1, 17, 20 12

95604 F. reticulata Индонезия 3. 18, 21 12

Didemnum sp. Фиджи 1,9 13, 14

115Т93 Didemmm sp. Микронезия 1,3 12

10IN95 Didemmm sp. Индонезия 1.3 12

12 F. reticulata Бассейны Тихого и 1, 3-7.15,17-23,

коллекций 25, 26

2 Didemnum sp. Индийского океанов 1, 3, 7,12-15 2

коллекции

1.2 Общая характеристика биологической активности фаскаплизина и родственных ему природных соединений

Спустя почти четверть века после первого выделения фаскаплизина в журнале «Mini-Reviews in Medicinal Chemistry» вышел обзор, целиком посвященный данному алкалоиду [15]. Это свидетельствует о значительном интересе к нему, что обусловлено сочетанием в фаскаплизине, с одной стороны, широкого спектра биологической активности, а, с другой, наличием у него уникальных свойств, определяющих перспективное направление создания нового поколения противоопухолевых лекарственных препаратов. В этой связи материал, посвященный б