Структурное изучение пентациклических гуанидиновых алкалоидов из дальневосточной морской губки Monanchora pulchra тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Табакмахер Ксения Михайловна

Структурное изучение пеитациклических гуанидиновых алкалоидов из дальневосточной морской губки МопапсЪога риШгга

02.00.10 - биоорганичсская химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

I у ЯН8 2015

Владивосток - 2014

005558144

005558144

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганичсской химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, Макарьева Татьяна Николаевна

Официальные опноненты:

Жукова Наталья Владимировна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории сравнительной биохимии Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН.

Жидков Максим Евгеньевич

кандидат химических наук, старший преподаватель кафедры органической химии Школы естественных наук Дальневосточного федерального университета.

Ведущая организация: Институт органической химии

им. Н.Д. Зелинского РАН, г. Москва.

Защита состоится М&фТО' г. в -/еРчасов на заседании диссертационного

совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганичсской химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423) 231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на сайте wtvw.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан

Ученый секретарь ¿й/^г'

диссертационного совета, к.б.н. //у Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пснтацикличсскис гуанидиновыс алкалоиды представляют собой уникальную группу вторичных метаболитов морского происхождения, найденных преимущественно в морских губках. Открытые всего 25 лет назад, они уже стали предметом исследований многих ученых, результаты которых публикуются в ведущих мировых научных журналах. С одной стороны, это связано с их необычным химическим строением, послужившим вызовом для химиков-синтетиков. Группы исследователей из США, Великобритании и Японии посвятили свои работы поиску универсальных путей синтеза этих алкалоидов. С другой стороны, практически все известные пснтацикличсскис гуанидины являются биологически активными веществами. Они демонстрируют цитотоксичсские, противогрибковые, антивирусные, антималярийные свойства, выступают в качестве блокаторов натриевых и кальциевых каналов, ингибируют рост ряда опухолевых клеточных линий. Было установлено, что некоторые представители данной группы способны in vitro ингибировать слияние оболочки ВИЧ-1 с клеточной мембраной. Также было показано, что эти вещества активны в отношении различных оппортунистических инфекций, развивающихся на фоне СПИДа. Недавно в литературе появились данные, касающиеся механизмов их противогрибкового и противоопухолевого действия.

Почти все известные алкалоиды данного класса были найдены в тропических видах губок. Однако в 2010 году сотрудниками лаборатории химии морских природных соединений (ЛХМПС) ТИБОХ ДВО РАН из дальневосточной морской губки Monanchora pulchra был выделен монанхоцидин А, ставший первым членом новой структурной подгруппы рассматриваемых соединений. Это послужило импульсом к проведению исследований, которым посвящена данная диссертация.

Выделение неизвестных ранее и необычных по структуре природных соединений, несомненно, является актуальной задачей биоорганической химии, поскольку знания, получаемые при се решении, вносят неоценимый вклад в понимание фундаментальных вопросов, таких как, пути биосинтеза исследуемых метаболитов или связь между их химической структурой и биологической активностью.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось выделение новых пснтацикличсских гуанидиновых алкалоидов из губки Monanchora pulchra, установление их строения и изучение биологической активности.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1) выделить в индивидуальном состоянии пснтацикличсскис гуанидиновыс алкалоиды из губки Monanchora pulchra; 2) с помощью физико-химических методов и химических трансформаций установить строение новых и провести структурную идентификацию ранее известных соединений исследуемого класса; 3) изучить биологическую активность выделенных метаболитов.

Научная новизна и практическая значимость работы. В процессе работы было изучено 10 образцов дальневосточной морской губки Monanchora pulchra, собранных вблизи Курильских островов во время нескольких рейсов НИС «Академик Опарин». В результате было выделено 12 пснтацикличсских гуанидиновых алкалоидов. Анализ данных, полученных при использовании методов ЯМР-спектроскопии, масс-спсктромстрии, а также химических методов исследования, показал, что 10 из них являются новыми представителями исследуемого класса и 2 - известными ранее. Некоторые из выделенных метаболитов содержат фрагменты или их сочетание, не встречавшиеся ранее у известных пснтацикличсских гуанидинов. Полученная новая структурная информация, в комплексе с имеющимися в литературе данными, позволила разработать схему возможных биосинтстических путей образования данных вторичных метаболитов в процессе жизнедеятельности губок.

Было проведено исследование противоопухолевой активности in vitro ряда выделенных пснтацикичсских гуанидиновых алкалоидов и показано, что они проявляют

выраженные цитотоксичсскис свойства, а также канцсрпрсвснтивную активность в нсцитотоксичсских концентрациях, кроме того эти соединения останавливают клеточный цикл в S-фазс, приводя к одновременной индукции апоптоза, который, скорее всего, носит р53-нсзависимый характер. Кроме того, изученные алкалоиды в субцитотоксических концентрациях активируют транскрипционную активность ядерного фактора АР-1 подобно цисплатину — противоопухолевому препарату, широко используемому в клинической практике.

В ходе исследования были отработаны и усовершенствованы методы выделения и установления строения пснтацикличсских гуанидиновых алкалоидов, получены сведения о физиологической активности этих соединений, открывающие перспективы их дальнейшего исследования в качестве противоопухолевых агентов и создания на их основе лекарственных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Морская губка Monanchora pulchra является богатым источником пснтацикличсских гуанидиновых алкалоидов.

2. Найдены новые представители рассматриваемого класса - монанхоцидины В, С, D, Е, монанхомикалины А, В, С и нормонанхоцидины А, В и D.

3. Монанхоцидины В и С - первые пентацикличсскис гуанидины, сочетающие в своих структурах полицикличсский фрагмент, найденный в соединениях этого класса из тропических губок, и морфолиноновос ядро как в монанхоцидинс А из дальневосточной губки. Монанхоцидины С и Е - гомологи монанхоцидина А, отличающиеся от него длиной и степенью развствлснности оксиполимстилснового фрагмента.

4. Монанхомикалины А и В являются первыми представителями рассматриваемых метаболитов, имеющими монанхоцидиновую «корабельную» часть и спсрмидиновую «якорную» часть птиломикалинового типа. Помимо этого, в пентациклическом коре монанхомикалина А содержится уникальный структурный элемент - я-пропильная группа при С-19.

5. Монанхомикалин С является первым гомологом птиломикалина А с модификацией в полицикличсском коре - н-пропильной группой при С-19.

6. Нормонанхоцидины А, В и D - структурные аналоги известных пснтацикличсских гуанидиновых алкалоидов, содержащие новый тип «якорной» части - производное 1,3-диаминопропана.

7. Полицикличсский кор данных метаболитов биосинтезируется предположительно по поликстидному пути.

8. Предшественниками оксиполимстилсновых фрагментов пснтацикличсских гуанидинов могут быть жирные кислоты, различающиеся, кроме длины углеродного скелета, еще и положением, а также количеством гидроксильных групп.

9. Исследованные алкалоиды проявляют высокую противоопухолевую цитотоксичсскую активность, а также канцсрпрсвснтивную активность в субцитотоксических концентрациях.

10. Некоторые пентацикличсскис гуанидины способны останавливать клеточный цикл, индуцировать апоптоз, а также в субцитотоксических концентрациях активировать транскрипционную активность ядерного фактора АР-1.

Апробация работы. Материалы работы были представлены в виде устных и стендовых сообщений на таких всероссийских и международных научных мероприятиях как: «XIV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии», Владивосток, 2012; Конференция молодых ученых «Взгляд в будущее», Владивосток, 2013; «9th IST Asia Pacific Meeting on Animal, Plant and Microbial Toxins», Vladivostok, 2011; 5th International Symposium «Chemistry and Chemical Education», Vladivostok, 2011; «International Symposium on Marine Bioprospecting», Korea, Seul, 2012; «llth International Congress on Targeted Anticancer Therapies», France, Paris, 2013.

Публикации. Основные результаты данных исследований опубликованы в следующих международных журналах: «Journal of Natural Products», «Tetrahedron Letters», «Natural Product Communications», «Annals of Oncology».

Всего по теме диссертации опубликовано 12 работ, из них: 4 статьи в рецензируемых международных журналах, 8 тезисов докладов в материалах российских и международных научных конференций и симпозиумов.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела биосинтеза и низкомолекулярных биорегуляторов ТИБОХ ДВО РАН 5 декабря 2014 г.

Личный вклад соискателя в проведение исследования. Соискателем были выполнены анализ литературных данных по теме исследования и планирование экспериментов; основная часть результатов получена лично автором и совместно с сотрудниками ЛХМПС и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН. Соискатель приняла участие в написании статей и подготовке докладов на конференции. На защиту вынесены только тс положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, посвященного гуанидиновым алкалоидам морских губок, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 176 источников. Работа изложена на 114 страницах, содержит 13 таблиц и 15 рисунков.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.х.н. Макарьсвой Т.Н. Автор также благодарит академика Стоника В.А. за консультации и помощь в работе; к.х.н. Денисенко В.А. и к.х.н. Дмитрснка П.С. за получение и помощь в обработке спектральных данных; м.н.с. Кузьмич А.С. и к.х.н. Дышлового С.А. за проведение экспериментов по определению биологической активности полученных веществ; н.с. Красохина В.Б. за определение видовой принадлежности исследованных губок; и весь коллектив Лаборатории химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН.

Используемые сокращения и обозначения: ТСХ - тонкослойная хроматография; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ТФУ - трифторуксусная кислота; MALDI-TOF-MS - Matrix-Assisted Lazer Desorbtion/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry — врсмяпролстная матрично-активированная масс-спсктромстрия с лазерной десорбцией/ионизацией; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; ДМСО -диметилсульфоксид; COSY - Corrélation Spectroscopy - корреляционная спектроскопия; HSQC - Heteronuclear Single Quantum Connectivity - гстсроядсрная одноквантовая корреляция; НМВС - Heteronuclear Multiple-Bond Corrélation - гстсроядсрная многополосная корреляция; ROESY - Rotation-frame Overhauser Effect Spectroscopy -спектроскопия ядерного эффекта Овсрхаузсра во вращающейся системе координат; NOE

- Nuclear Overhauser Effect - ядерный эффект Овсрхаузсра; ESI-MS - Electrospray Ionization Mass Spectrometry - электроспрсй-ионизационная масс-спсктромстрия; TOCSY

- Total Corrélation Spectroscopy - тотальная корреляционная спектроскопия; м.д. -миллионная доля; а.е.м. - атомная единица массы; IC50 - Inhibition concentration 50 -концентрация исследуемого вещества, ингибирующая жизнеспособность клеток на 50%; INCC50 - Inhibition of the Number of the Colonies C50 - концентрация вещества, при которой происходит ингибированис колонсобразования на 50%; АР-1 - Activator Protein 1

- активаторный белок-1, транскрипционный фактор.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение суммарных фракций гуанидиновых алкалоидов из губки Мопапскота рикНта и выделение индивидуальных соединений

Структурное и функциональное изучение метаболитов природного происхождения невозможно при отсутствии индивидуальных соединений, то есть их выделение является одной из главных экспериментальных задач. На пути сс решения встречается немало трудностей. Гуанидиновыс алкалоиды, как и большинство природных соединений, содержатся в объекте исследования в виде сложных смесей «близкородственных» веществ. Задачу выделения усложняет также и наличие разнообразных компонентов, не относящихся к исследуемому классу (неорганические примеси, липиды, стерины, и др.). Такие особенности требуют от исследователя комплексного использования различных методов разделения смесей и очистки веществ, например - экстракцию, хроматографическис методы, начиная с ТСХ и заканчивая ВЭЖХ, и другие.

Суммарные фракции пентацикличсских гуанидиновых алкалоидов получали следующим образом. Образцы исследуемой губки измельчали и экстрагировали этанолом. Отфильтрованные и упаренные экстракты очищали от неорганических солсй. Это достигалось за счет распределения компонентов полученного экстракта между водой и бутанолом. После упаривания бутанольного слоя остаток распределяли между водным этанолом и н-гсксаном для удаления неполярных компонентов. Далее водно-этанольные экстракты упаривали досуха. Остаток фракционировали с помощью гель-фильтрации на колонке с ссфадсксом 1Л1-20, собирая фракции, состоящие из веществ с близкими значениями молекулярных масс. В результате получили так называемые «сырые смсси» пентацикличсских гуанидиновых алкалоидов.

Выделение индивидуальных соединений из полученных суммарных фракций проводили при помощи ВЭЖХ на полупрспаративных колонках с обращенной фазой. В качестве элюента использовали системы водного этанола с добавлением ТФУ. Для обнаружения веществ применяли рефрактометрический детектор.

Описанную последовательность методов применяли для выделения веществ из 10 образцов морской губки МопапсИога рикИга (тип РопГега, класс Demospongiae, отряд РоесПо5с1епс1а, подотряд МухППпа, семейство СгатЬеШае). Всего из них выделено 12 пентацикличсских гуанидиновых алкалоидов, из которых 10 представляют собой новые соединения и 2 - известные ранее.

На рисунке 1 представлена общая схема выделения пентацикличсских гуанидиновых алкалоидов из образцов губки М. рикИга.

2. Установление строения пентациклических гуанидиновых алкалоидов из губки Мопапскота риккга

2.1. Монанхоцидины В-Е из губки № 036-152.

Из образца губки М. рикИга № 036-152 (о. Уруп, 45°57,9 с.ш.; 150°44,9 в.д., 66 м) выделено 5 алкалоидов: известный ранее монанхоцидин А (1) и четыре новых монанхоцидина - В (2), С (3), О (4) и Е (5) (рис. 1).

1. Конце нгрирование

2. Распределение между бутанолом и в о дсй

Водный слой

[ Бутанольный спой

.......^

Н-гексановый спой

1. Концентрирование

2. Распределение между н-гексаном и в о дным этанолом

^ г

.....

Водно-этанольный !

СЛОЙ !

Многорр атна* хр оматогр афия на колонке с с ефадекс ом 1-Н-20 (элюент - этанол")

«Сырая смесь» пентациклических гуанидиновых алкалоидов

Многократная обратнофазнал ВЭЖХ (элю ент - см е сь: 65%этанол,0.1 %ТФУ)

Индивидуальные п ент ациклические гуанидиновые алкалоиды

Рисунок 1 - Общая схема выделения пентациклических гуанидиновых алкалоидов из образцов губки М. ри1скга

В (+)-HRMALDI-TOF масс-спектре для монанхоцидина В (2) обнаруживается сигнал протонированной молекулы [М+Н]+ при mJz 831.5978, что соответствует молекулярной формуле C45H7sN608. Данные спектров ЯМР 'Н и С (ДМСО-cfc) для 2 показали наличие гуанидиновой группы (5ц 9.34, 9.68; 5с 148.3), двух метальных групп (8ц 0.75, 1.02; 8с 10.0, 21.3), одной двузамещенной двойной связи (8н 5.49, 5.65; 8с 133.3, 130.3), двух Л^-замещенных СН-групп (5н 3.92, 4.20; 8с 53.6, 52.0), четырех оксиметиновых групп (8н 4.35, 3.72, 4.08, 4.41; 8с 70.2, 66.4, 70.8, 80.9), одной оксиметиленовой группы (5ц 4.06; 5С 64.9), двух карбонильных групп (8с 168.3, 169.2), одной карбонил-связанной метановой группы (8н 3.03; 5с 49.2), трех четвертичных атомов углерода (8с 83.5, 80.3, 94.4), двух NH2-rpynn (8н 7.70, 7.73) и протонов метиленовых групп алифатического фрагмента (8Н 1.20-1.25; 8С 28.9-29.3). Интерпретация данных COSY, HSQC и НМВС спектров позволила установить, что соединение 2 содержит 2-аминоэтил-З-аминопропилморфолиноновое кольцо (рис. 2, фрагмент а), такое же как было ранее найдено в монанхоцидине А (1). Данные спектров ЯМР 'н и |3С для 2 также показали, что в отличие от 1 гуанидиновая пентациклическая часть монанхоцидина В содержит 7-этил-2,3,4,7-тетрагидрооксепиновый фрагмент (рис. 2, фрагмент б), также представленный в птиломикалине А (6) - первом представителе данного класса, выделенном из карибской губки Ptilocaulis spiculifer и из губки Красного моря Hemimycale sp. — и других известных пентациклических гуанидиновых алкалоидах. Об этом свидетельствуют химические сдвиги метальной группы при С-1 и метановых групп СН-3, СН-4 и СН-5, которые практически совпадали с таковыми в спектре для птиломикалина А (6). Наконец, длинная

углеводородная цепь, замещенная морфолнноновой единицей в 2 присоединяется к «корабельной» части через сложноэфирную связь в м-положении, а не в ю-3 положении как найдено в монанхоцидине А (1). Таким образом, исходя из данных ЯМР-спектров установлено, что соединение 2 содержит фрагмент в (рис. 2).Строение этих фрагментов и связь между ними подтверждены анализом данных двумерных ЯМР-спектров, включая COSY, HSQC и НМВС эксперименты. Таким образом, монанхоцидин В (2) представляет собой новый пентациклический гуанидиновый алкалоид, имеющий модифицированную «якорную» часть по сравнению со всеми известными ранее пентациклическими гуанидиновыми алкалоидами из губок, кроме монанхоцидина А (1). К тому же, в отличие от 1, он содержит другой бис-спиро-полициклический фрагмент в «корабельной» части и оксисиполиметиленовый «мостик» - производное С^-со-гидрокси жирной кислоты.

Сравнение данных спектров ЯМР 'Н и ПС для 2 с таковыми для птиломикалина А и других родственных соединений показало, что все асимметрические центры в этих соединениях имеют одинаковую относительную конфигурацию. Это подтверждено анализом спектра ШЕ5У для 2 (ДМСО-</6). !^ОЕ корреляции между 21-ЫНЬ (5Н 9.68) и Н-3, Н3-1 и Н-19, Н3-1 и Н-10, Н3-1 и Н-13 (рис. 3) свидетельствуют о ЗЯ*, 8й* относительной конфигурации во фрагменте б (рис. 2). 155*, 195* относительная конфигурация установлена на основании ЫОЕ корреляций между 21-М1а (8ц 9.34) и Н-19, 21-ЫНа и Н-17. Корреляции между Н-10, Н-13 и Н-16 в спектре вместе с

наблюдаемыми константами взаимодействия между Н-13 и Н-14 (У = 5.0 Гц) указывают на то, что все эти протоны располагаются с одной стороны молекулы. Кроме того, КОЕ корреляции между ОН-43 (8Н 6.59) и Н-37, ОН-43 и Н-42 подтверждают трансрасположение гидрокси-групп и г/ш>расположение Н-37 и ОН-43 в «якорной» части (рис.

COSY — НМВС —.

г

47

Рисунок 2 - Фрагменты, найденные в соединениях 1-5

3).

'' 4 NOE

Рисунок 3 - Ключевые NOE корреляциии в ЯМР спектре 2

(+)-Н1ША1Л)1-ТОР масс-спектр для монанхоцидина С (3) содержит пик иона [М+Н]+ при т/г 845.6150, что соответствует молекулярной формуле С4бН8оМ608. Данные

спектров ЯМР ]Н и С (CD3OD) для 3 практически совпадают с таковыми для моианхоцидина В (2), но данные масс-спектрометрии показали, что молекулярная масса 3 на 14 а.е.м. больше, чем 2, то есть углеводородная цепь 3 содержит одну дополнительную СН2-группу^(производное Сп-со-гидрокси жирной кислоты). Сравнение данных спектров ЯМР Ни С для 3 с данными для 2 и их полное совпадение позволило приписать всем асимметрическим центрам молекулы такую же относительную конфигурацию, как и у 2.

(+)-HRMALDI-TOF масс-спектр монанхоцидина D (4) содержит пик иона [М+Н]+ при m/z 831.5920, что соответствует молекулярной формуле C45H78N6O8. То есть молекулярная масса 4 на 28 а.е.м. меньше, чем монанхоцидина А (1). Это свидетельствует о том, что углеводородная цепь 4 на две СН2-группы короче по сравнению с 1.

Данные спектров ЯМР 'Н и |3С (CD3OD) для 4 аналогичны таковым для монанхоцидина А (1), за исключением отсутствия сигналов для метальной группы при С-47 и оксиметиновой группы при С-23, которые характерны для разветвленной углеводородной цепи в 1. Тем не менее, в ЯМР-спектрах 4 присутствуют сигналы, соответствующие оксиметиленовой группе (-OCH?-: бн 4.13; 8С 67.2). Структура этого фрагмента (рис. 2, фрагмент в) подтверждена посредством данных ЯМР С. Сравнение данных спектров ЯМР 'н и 13С для 4 с таковыми для монанхоцидина А (1) показало, что относительная конфигурация асимметрических атомов в «корабельной» и «якорной» частях этих соединений совпадает. Таким образом, монанхоцидин D (4) представляет собой аналог 1 с модификацией в углеводородном «мостике».

(+)-HRMALDI-TOF масс-спектр для монанхоцидина Е (5) содержит пик иона [М+Н]+ при m/z 845.6120, что соответствует молекулярной формуле C46H8oN608. Молекулярная масса 5 на 14 а.е.м. меньше, чем 1. Это указывает на то, что углеводородная цепь, соединяющая «корабельную» и «якорную» части в 5, короче на одну СНг-группу по сравнению с 1. Действительно, данные спектров ЯМР *Н и |3С (CD3OD) для 5 практически совпадают с таковыми для монанхоцидина А (1). В этих спектрах отчетливо видны сигналы, относящиеся к СН3-47 и СН-23 группам. Структура соответствующего фрагмента (рис. 2, фрагмент г) подтверждена анализом данных двумерных ЯМР-спектров, вкючая НМВС. Сравнение данных спектров ЯМР 'Н и 13С для 5 с таковыми для 1 привело к выводу о том, что в обоих этих соединениях относительная конфигурация асимметрических атомов в «корабельной» и «якорной» частях совпадают. Таким образом, монанхоцидин D (4) представляет собой аналог 1 с модифицированным углеводородным фрагментом, образованным из С^-ш-З-гидрокси жирной кислоты.

Для подтверждения структур новых соединений были использованы химические превращения. Монанхоцидин В (2) подвергли восстановительной деградации обработкой NaBH4 в ЕЮН при 50°С в течение 20 часов. Это привело к потере С42-С45 фрагмента за счет разрыва связей у гемиаминальной при С-42 и гемиацетальной при С-43 групп. Связи у гемиаминальных групп при С-8 и С-15 групп были также разрушены.

Структура продукта этого превращения 7 (рис. 4) была установлена с использованием данных ЯМР, HRMALDI-TOF-MS, и MALDI-TOF-MS/MS экспериментов. Спектр ЯМР 'Н соединения 7 показал наличие трёх новых гидроксигрупп при С-3, С-19, и С-37 (8Н 4.52, 4.39 и 5.45 соответственно). Аналогичные преобразования были ранее описаны при установлении строения монанхоцидина А (1).

Рисунок 4 - Схема восстановительной деградации 2

Во время MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа соединений 1-5 наблюдается потеря одного и того же фрагмента: С42-С45. Интенсивные пики при m/z 773, 745, 759, 745, и 759 в рефлектронных спектрах 1-5 относятся к метастабильным ионам, подтверждающим отрыв фрагмента массой 101 Да от соответствующих [М+Н]+ ионов (рис. 5). Это было установлено посредством MALDI-TOF-MS/MS (LIFT) родительских ионов [М+Н]+ 1-5. Действительно, в этих случаях, в отличие от пиков метастабильных ионов, были получены пики ионов (М+Н-101)+ при m/z 758 (MS/MS 1), 730 (MS/MS 2), 744 (MS/MS 3), 730 (MS/MS 4) и 744 (MS/MS 5). Еще одним подтверждением метастабильного характера ионов с m/z 773, 745, 759, 745 и 759 явилось отсутствие их сигналов в масс-спектрах при проведении эксперимента MALDI-MS в линейном режиме.

MALDI-TOF-MS

1 m/z 859 [М+Н]+ nVz75a

2 m/z 831 [М+Н]+ m/z 730

3 m/z 845 [М+Н]+ m/z 744

H2N^ "1m 4 m/z 831 [M+H]* "Ж*. m/z 730

*745

5 m/z 845 [M+Hf dfil*. ^744 *759

•-Метастабильный ион

Рисунок 5 - Гипотетическая схема формирования метастабильных ионов в процессе MALDI-TOF-MS соединений 1-5

Итак, детальное изучение новых монанхоцидинов показало, что они имеют ряд необычных структурных элементов. В частности, монанхоцидины В (2) и С (3) могут рассматриваться как неожиданные гибридные структуры, содержащие пентациклическую гуанидиновую систему («корабельная» часть) такую, как была найдена в соединениях из некоторых тропических губок и звезд, а морфолиноновое ядро («якорная» часть) такое же, как было найдено ранее в монанхоцидине А (1) из той же самой дальневосточной губки М. рик!гга. Новые алкалоиды монанхоцидины О (4) и Е (5) содержат обе («корабельную» и «якорную») части такие же как у монанхоцидина А (1), но имеют разные липидные мостики, в 4 - это производное со-гидрокси-гексадекановой кислоты, а в 5 - производное со-З-гидрокси-гептадекановой кислоты.

2.2. Монанхомикалины А и В из губки № 036-197

Из образца губки М. pulchra № 036-197 (о. Уруп, 46°07,0 с.ш.; 150°02,1 в.д., -150 м) выделено (рис. 1) два новых необычных пентациклических гуанидиновых алкалоида -монанхомикалины А (8) и В (9).

В (+)-HRMALDI-TOF масс-спектре монанхомикалина А (8) присутствует сигнал протонированной молекулы [М+Н]+ при m/z 813.6544, что соответствует молекулярной формуле C47H84N6O5. В (+)-HRESI масс-спектре основной пик соответствует двухзарядному иону [М+2Н]2+ при m/z 407.3320. Данные спектров 'Н и 13С ЯМР (ДМСО-d¿) для 1 показали наличие гуанидиновой группы (5н 8.98, 9.22; 5с 148.6), двух метальных групп (8н 0.95, 0.83; 8С 13.2, 13.7), одной дизамещенной двойной связи (8н 5.71, 5.43; 5с 134.2, 129.3), двух //-замещенных СН групп (8Н 3.90, 4.16; 8С 53.2, 52.8), двух оксиметиновых групп (5ц 4.49, 3.60; 5С 79.6, 69.7), одной оксиметиленовой группы (5Н 4.06; 5С 64.9), двух карбонильных групп (5С 168.4, 172.8), одной карбонил-связанной метановой группы (5ц 3.02; 8С 49.2), двух четвертичных атомов углерода (8С 88.3, 80.7), четырех ^-замещенных СН2-групп (5ц 3.30, 2.71, 3.23, 2.81; 5С 41.8, 36.7,46.7, 38.7), одной карбонил-связанной метиленовой группы (8Н 2.29; 8С 32.1), двух NH2-rpynn (8Н 7.70, 7.74) и протонов метиленовых групп алифатического фрагмента (8н 1.20-1.25; 8с 28.9-29.3).

Интерпретация двумерных спектров (COSY, HSQC, TOCSY и НМВС) показала, что левая сторона пентациклического кора соединения 8 идентична таковой в монанхоцидинах А (1), D (4) и Е (5). Однако его правая сторона содержит |2-пропилтетрагидро-2//-пиран (рис. 6, фрагмент а) вместо типичного для этих соединений 2-метилетрагидро-2Я-пирана. Действительно, в спектрах 'Н ЯМР соединения 7 наблюдается триплет метильной группы при 8н 0.83 вместо характерного дублета С-20 метальной группы при 5Н 1.09-1.13. Это было подтверждено и 2D ЯМР экспериментами. На основании данных *Н и 13С ЯМР спектроскопии было установлено, что в отличие от монанхоцидинов (1-5) соединение 8 содержит спермидиновый фрагмент (рис. 6, фрагмент б), который имеется в пталомикалине А (6). Наконец, интерпретация данных ЯМР показала, что соединение 8 имеет фрагмент «в» (рис. 6). Масс-спектрометрические данные позволили определить, что липидный мостик, связывающий пентациклическое ядро и спермидиновый фрагмент, является производным С^-ш-гидрокси жирной кислоты.

Структуры этих фрагментов подтверждены с помощью Н8(ЗС, экспериментов.

С05У и НМВС

— 23 ^

О

Рисунок 6 - Фрагменты, найденные в соединениях 8 и 9

В спектрах 'Н и 13С ЯМР для соединения 8 сигналам, соответствующим атомам водорода и углерода спермидинового фрагмента, сопутствуют сигналы меньшей интенсивности (-2:1). Эта особенность обусловлена явлением, так называемой ротационной изомерии, возникновение которого связано с затрудненным вращением вокруг амидной связи при 38-м атоме углерода (рис. 7).

Сравнение данных 'Н и 13С ЯМР спектров для монанхомикалина А (8) с соответствующими данными для монанхоцидинов А (1), О (4) и Е (5), показало, что относительная конфигурация всех асимметрических центров в пентациклических частях этих соединений одинакова. Это подтверждено анализом ЯОЕЗУ-спектра для 8 (ДМСО-11б). Диагностические МОЕ-корреляции между резонансами 21-МНв (9.22 м.д.) и Н-5, Н-7, Н-9 и между Н-3 и Н-5 указывали на 55* и 8й* относительные конфигурации с левой стороны пентациклического кора молекулы.

3.23 (46.7) ' [1 3.30(41 8) 2.71 (36.7)

О

основной

У

1.77(26 8) 2 82(38.7) 1 78(26.5) ^Нг

3.23 (44 0) 2 78 (36 8)

"V минорный

Рисунок 7 - Значения химических сдвигов в спектрах ЯМР 'Н и 13С (700 МГц, ДМСО-с/б) для ротационных конформеров спермидинового фрагмента соединения 8

Относительные конфигурации 155* и 195* во фрагменте «а» (рис. 7) подтверждены ШЕ-корреляциями между 21-1МНа (8.98 м.д.) и Н-19, Н-17. >ЮЕ-корреляции между Н-10, Н-13 и Н-16 в спектре ЯОЕБУ, вместе со значениями константы спин-спинового взаимодействия между Н-13 и Н-14 (У = 5.0 Гц) указывают на то, что все эти протоны находятся по одну сторону.

Таким образом, монанхомикалин А (8) является новым пентациклическим гуанидиновым алкалоидом, содержащим уникальный структурный элемент по сравнению со всеми известными ранее соединениями этого класса - н-пропильную группу при С-19. Для подтверждения структуры нового соединения была использована химическая трансформация. Так, обработка 8 №ВН4 в ЕЮН при 60°С в течение 23 часов привела к потере «якорной» части в результате гидролиза и восстановительного гидролиза сложноэфирной связи при С-22. Кроме того, произошел разрыв и восстановление гемиаминальных групп при С-8 и С-15, что в целом привело к получению соединений 10 и 11, а также спермидинового производного 12 (рис. 8). Их структуры установлены с использованием данных ЯМР и НКЕЗГМБ.

8

NaBH,

ЕЮН

U

4nh2 nh2

10 R=COOH m/z А36.3174

12 m/z 400.3946

11 R=CH20H /rVz 422.3378

Рисунок 8 - Восстановительная деградация соединения 7

(+)-HRMALDI-TOF масс-спектр для монанхомикалина В (9) содержит пик псевдомолекулярного иона [М+Н]+ при m/z 785.6288, что соответствует молекулярной формуле C45H8oN605. В (+)-HRESI масс-спектре основной пик соответствует двухзарядному иону [М+2Н]2+ при m/z 393.3160. Эта информация и данные спектров ЯМР Ни С (CD3OD) для 9 показали, что «корабельная» часть в 9 идентична таковой в монанхоцидинах А (1), D (4) и Е (5) и в ней не содержится дополнительного двухуглеродного фрагмента, как в монанхомикалине А (8). «Якорная» часть в 9 представляет собой остаток спермидина (рис. 6, фрагмент б), который был ранее найден в птиломикалине А (6), а также в монанхомикалине А (8) вместо 2-аминоэтил-З-аминопропил-морфолинонового ядра, характерного для монанхоцидинов (1-5). Данные спектров ЯМР 'Н и 13С для спермидиновой части 9, как и для 8, указывают на наличие ротационных конформеров для этого соединения. Полное совпадение 'Н и 13С ЯМР данных для пентациклической части молекулы 9 с соответствующими данными для монанхоцидинов А (1), D (4) и Е (5) указывает на идентичную относительную стереохимию у этих соединений. Таким образом, монанхомикалин В (9) является новым пентациклическим гуанидиновым алкалоидом, имеющим необычное сочетание «корабельной» части монанхоцидинового типа и спермидиновой «якорной» части птиломикалинового типа.

Таким образом, монанхомикалины А (8) и В (9) представляют собой неожиданные гибридные структуры, содержащие такую же «корабельную» часть, как была найдена в выделенном ранее монанхоцидине А (1) из дальневосточной губки, а «якорную» часть такую, как в птиломикалине А (6) из тропической губки. Помимо этого, в пентациклическом коре 8 содержится уникальный структурный элемент - н-пропильная группа при С-19.

Из образца губки М. pulchra № 041-029 (о. Кунашир, 44°42,2 с.ш.; 146°40,4 в.д., -114 м) выделено (рис. 1) 2 соединения: одно из них - это новый пентациклический гуанидиновый алкалоид - монанхомикалин С (13), а второе - известный ранее птиломикалин А (6). Птиломикалин А (6) ранее был найден в нескольких видах морских губок, таких как: Ptilocaulis spiculifer, Hemimycale sp., M. arbuscula, M. unguífera, и в двух видах морских звезд - Celerina hefferenani и Fromia monilis. Однако из губки М. pulchra он выделен впервые.

2.3. Монанхомикалин С из губки № 041-029

nh2

nh2

Молекулярная формула C47H84N605 рассчитана для 13 из масс-спектра ESI высокого разрешения, в котором обнаруживется пик псевдомолекулярного иона [М+Н] при m/z 813.6578. Подобно монанхомикалинам А (8) и В (9) основной пик в этом спектре при m/z 407.3336 соответствует двухзарядному иону [М+2Н]2+. Данные спектров ЯМР Н и "С (CD3OD) показали наличие двух метальных групп (5н 0.85, 0.87; 8С 11.8, 15.0), одной дизамещенной двойной связи (8Н 5.50, 5.71; 8С 134.8, 131.9), двух W-замещенных СН-групп (8Н 4.06, 4.34; 8С 56.2, 55.2), двух оксиметиновых групп (8Н 4.40, 3.69; 8С 72.9, 72.6), одной оксиметиленовой группы (8н 4.13, 8С 67.2), двух карбонильных групп (8с 171.0, 177.3), одной карбонил-связанной метановой группы (8н 3.08; 8с 51.5), двух гетерозамещенных четвертичных атомов углерода (8с 85.7, 82.8), четырех Л^-замещенных СН2-групп (8Н 3.46, 2.87, 3.38, 2.97; 5С 43.8, 38.7, 49.2, 41.0), одной карбонил-связанной метиленовой группы (8н 2.40; 8С 34.4), и протонов метиленовых групп алифатического фрагмента (6Н 1.28—1.32; 5С 31.1—31.7).

Интерпретация двумерных спектров показала, что левая сторона «корабельной» части 13 содержит семичленный цикл и идентична таковой в монанхоцидинах В (2) и С (3) из дальневосточной губки М. pulchra и в некоторых соединениях, найденных ранее в тропических губках или морских звездах. Однако правая сторона пентациклического кора содержит 2-пропилтетрагидро-2Н-пирановый фрагмент (рис. 9) в отличие от 2-метилтетрагидро-2Н-пиранового фрагмента, найденного во всех известных ранее пентациклических алкалоидах, за исключением монанхомикалина А (8). В подтверждение этой замены в спектре ЯМР 'Н для 13 наблюдался триплет, соответствующий С-47 метильной группе при 0.87 м.д., в отличие от характерного дублета, соответствующего С-20 метильной группе в области 1.09-1.13 м.д. в спектрах родственных соединений. Дальнейший анализ данных спектров ЯМР *Н и 13С для 13 показал наличие остатка спермиднна как в птиломикалине А (6) и монанхомикалинах А (8) и В (9). Дополнительный анализ данных одно- и двумерных ЯМР-спектров и масс-спектров показал, что «корабельная» и «якорная» части соединены между собой через неразветвленную полиметиленовую цепь, представляющую собой производное с1б-со-гидрокси жирной кислоты.

- cosy

нмвс

Рисунок 9 - COSY и НМВС-корреляции для 12

Как и в случае монанхомикалинов А (8) и В (9), в спектрах ЯМР 'Н и 13С для монанхомикалина С (13) сигналам, соответствующим атомам водорода и углерода «якорной» части, сопутствуют дополнительные сигналы меньшей интенсивности, что указывает на явление ротационной изомерии.

Сравнение данных спектров ЯМР 'Н и 13С для левой стороны «корабельной» части 13 с таковыми для монанхоцидинов В (2) и С (3), а для правой стороны корабельной части с таковыми для монанхомикалина А (8), позволило приписать следующие относительные конфигурации асимметрическим атомам углерода пентациклического кора: с левой стороны - это 3R*, 8R*, а с правой - 15S*, 19S*.

На основании вышеизложенных данных можно сделать вывод о том, что монанхомикалин С (13) является новым структурным аналогом пентациклических гуанидиновых алкалоидов из тропических губок, который представляет собой гомолог птиломикалина А (6), содержащий н-пропильную группу при С-19.

Структурная идентификация птиломикалина А (6) с известным веществом проведена путем сравнения полученных для него ЯМР-спектров с приведенными в литературе.

2.4. Нормонанхоцидины А, В и D из губки № 043-583

Из образца губки M. pulchra № 043-583 (о. Уруп, 45°55,1 с.ш.; 149°41,6 в.д., 207 м) выделено, наряду с известным ранее монанхоцидином А (1), три новых минорных пентациклических гуанидиновых алкалоида - нормонанхоцидины А (14), В (15) и D (16).

В масс-спектре ESI высокого разрешения для 14 обнаруживается пик иона [М+Н]+ при m/z 758.5792, что соответствует молекулярной формуле C43H75N5O6. Кроме того, присутствует пик, соответствующий двухзарядному иону [М+2Н]2+ при m/z 379.3331. Данные спектров ЯМР *Н и 13С (ДМСО-г/6) для 14 показали наличие гуанидиновой группы (5н 8.65, 8.84; 5С 148.5), трех метальных групп (5Н 0.95, 1.09, 0.84; 5С 13.2, 21.6, 9.5), одной

двузамещенной двойной связи (5Н 5.71, 5.43; 8С 134.2, 129.2), двух Л^-замещенных СН-групп (8ц 3.91, 4.19; 5С 53.2, 52.9), трех оксиметиновых групп (8М 4.50, 3.75, 4.75; 8С 79.6, 66.5, 16.4), двух карбонильных групп (8С 168.4, 174.7), одной карбонил-связанной метиновой группы (8М 3.00; 5С 49.0), двух четвертичных углеродов (5С 88.3, 80.7) и длинной алифатической цепи (8н 1.20-1.25; 8с 28.9-29.3).

Интерпретация данных одно- и двумерных ЯМР-спектров (COSY, HSQC, НМВС) для 14, а также сравнение их с таковыми для монанхоцидина А (1) и монанхомикалина В (9) показало, что, во-первых: полициклические части этих соединений идентичны, а во-вторых: «якорная» часть нового соединения не относится ни к «морфолиноновому» ни к «спермидиновому» типу (рис. 10). В отличие от соединений с «морфолиноновым» типом «якорной» части в спектре ЯМР 'Н нового соединения отсутствует характерный дублет протона при С-42 в области 4.41 м.д. Кроме того, сигнал, соответствующий протону карбинольной группы при С-37 смещен в сильное поле (3.82 м.д). Это указывает на то, что связанный с ним атом углерода входит не в морфолиноновый цикл, а в алифатический фрагмент. Проанализировав приведенные ЯМР данные и, учитывая, что молекулярная масса нормонанхоцидина А на 101 а.е.м. меньше массы монанхоцидина А (1), сделан вывод, что его «якорная» часть представляет собой производное 1,3-диаминопропана. Дальнейший анализ ЯМР *Н данных выделенного метаболита выявил наличие разветвления оксиполиметиленового фрагмента, как ранее было найдено в монанхоцидине А (1), на которое указывает триплет, соответствующий метальной группе при С-43 в области 0.84 м.д. Таким образом, «корабельная» и «якорная» части соединены между собой через производное С^-со-З-гидрокси жирной кислоты.

nh2

COSY — НМВС

Рисунок 10 - COSY и НМВС-корреляции для 14

Практически полное совпадение данных ЯМР *Н и 13С для 14 с таковыми для монанхоцидина А (1) позволило приписать асимметрическим атомам углерода пентациклического кора следующие относительные конфигурации: с левой стороны - это 55*, 8R*, а справа - 155*, 195*.

Таким образом, нормонанхоцидин А (14) является аналогом известных пентациклических алкалоидов, содержащим новый тип «якорной» части.

Два других соединения из того же образца губки М. pulchra - нормонанхоцидины В (15) и D (16) - не удалось выделить в индивидуальном виде доступными нам методами. Поэтому они охарактеризованы как смесь (1:1) при использовании данных масс-спектрометрического и ЯМР-спектроскопического анализа.

Молекулярные формулы C41H71N5O6 для соединений 15 и 16 рассчитаны из HRESI масс-спектров, в которых наблюдается пик псевдомолекулярного иона [М+Н] при m/z 730.5477, а также пик, соответствующий двухзарядному иону [М+2Н]2+ при m/z 365.7775.

Анализом данных одно- и двумерных ЯМР-спектров для смеси 15 и 16 выявлено наличие 2 типов пентациклического кора: структура одного из них полностью совпадает с таковыми в нормонанхоцидине А (14), монанхоцидинах А (1), D (4), Е (5) и монанхомикалине В (9), а структура другого идентична таковым в монанхоцидинах В (2),

С (3), монанхомикапине С (13) и птиломикалине А (6). Соотношение (1:1) для двух типов пентацикличееких ядер установлено интегрированием характеристичных сигналов в ЯМР-спектре СНз-1, СНз-20, Н-3, Н-5 и Н-9. Дальнейшая интерпретация данных ЯМР показала, что «якорные» части этих соединений одинаковы и идентичны таковой в нормонанхоцидине А (14). Совокупность данных масс- и ЯМР-спектров позволила установить, что «якорная» и «корабельная» части в этих соединениях связаны друг с другом через неразветвленную полиметиленовую цепь, представляющую собой производное С^-со-гидрокси жирной кислоты.

Таким образом, нормонанхоцидины В (15) и D (16) - это новые пентациклические гуанидиновые алкалоиды, имеющие модифицированную «якорную» часть по сравнению со всеми известными ранее соединениями данного класса, кроме нормонанхоцидина А.

2.5. Идентификация веществ из губок 041-187,043-425, 043-487,043-600, 043-603, 043-604

Образцы губки М. pulchra губок 041-187, 043-425, 043-487, 043-600, 043-603, 043604 были собраны у островов Уруп и Расшуа в северо-западной части Тихого океана во время 41-го и 43-го экспедиционных рейсов на научно-исследовательском судне «Академик Опарин». В соответствии со схемой, представленной на рис. 1, из них выделены монанхоцидины А (1), В (2) и D (4). Идентификация полученных алкалоидов с известными веществами проведена на основании данных ЯМР-экспериментов и масс-спектрометрии высокого разрешения.

3. Биосинтез

На основании литературных данных, а также информации, полученной при выделении пентацикличееких гуанидиновых алкалоидов и изучении выделенных соединений, предложена схема гипотетических путей биосинтеза их полициклической части (рис. 11). Предполагается, что оба типа пентациклического кора (как с пяти-, так и с семичленным циклом с левой стороны) могут образовываться из предшественников поликетидного типа. Такие предшественники должны содержать или 9 ацетатных и одну пропионатную единицу (для всех известных пентацикличееких гуанидиновых алкалоидов, кроме монанхомикалинов А (8) и С (13)), или 10 ацетатных и одну пропионатную единицу при биосинтезе 8 и 13. Для образования пентациклической системы должно произойти присоединение гуанидиновой единицы к такому предшественнику. Порядок биосинтетических этапов, также как и источник гуанидина, еще не выяснен.

Такое гипотетическое построение пентациклической системы основано на работах, посвященных синтезу соединений данного класса. Исходя из описанных превращений и анализируя структуры выделенных нами новых пентацикличееких гуанидиновых алкаклоидов, предполагается, что гуанидин может присоединиться к 6nc-a,ß-ненасыщенному кетону, к такому, как I или II (рис. 11), с последующей имин-енаминной таутомеризацией шиффовых оснований [трансформация (а)]. Дальнейшие стадии могут включать окислительные реакции (б) до предполагаемых интермедиатов III и IV, между которыми возможно взаимопревращение вследствие аллильной перегруппировки. Завершение построения пентациклической системы может происходить за счет модификации таких интермедиатов реакциями циклизации-элиминирования [трансформации (в), (г)].

Интересно, что алкалоиды губки М. pulchra, собранной в разных местах вблизи Средних Курильских островов, отличаются структурами их «якорных» частей. Мы условно разделили изученные нами образцы на 2 хемотипа (табл. 1). Те из них, которые

Монанхоцидины A, D, Е: R=H Монанхомикалин A: R=Et Монанхомикалин В: R=H

. . и 'Якорная ° О часть"*

Птиломикалин А: R=H, Р1=Н Крамбесцидин 800: Р=Н, Р1=Н Крамбесцидины 816, 826, 830, 844: Р=Н, Я1=ОН Целеромикалин: Я=Н, Р1=Н Фромиамикалин: Р=Н, R1=H 13,14,15-Изокрамбесцидин 800: R1=H Монанхоцидины В, С: Г^Н, R1=H Монанхомикалин С: Р=Е1, R1=H

Рисунок 11 - Схема гипотетических путей биосинтеза «корабельной» части пентациклических гуанидиновых алкалоидов

ацетатный остаток ^^ пропионатный остаток "якорные части имеют различную структуру

содержат соединения с 2-аминоэтил-З-аминопропилморфолиноновым ядром, мы назвали «морфолиноновым типом». Другие, в составе которых обнаружены алкалоиды со спермидиновым фрагментом, получили название «спермидинового типа». Причины таких различий в настоящее время не ясны. Кроме того, нет данных и о возможных путях формирования того или иного типа «якоря» в ходе биосинтеза.

Таблица 1 — Предполагаемые хемотипы губки М. pulchra

№ образца пентациклические гуанидиновые алкалоиды, найденные в образце фрагмент «якорной» части предполагаемый хемотип

036-152 монанхоцидины А-Е (1-5) 36 н ^ СЖ ии г зтТ Т«э 45 О^М^'ОН ын2 «морфолиноновый»

041-187 монанхоцидины А (1), В (2), D (4)

043-425 монанхоцидин А (1)

043-487 монанхоцидины А (1), В (2), D (4)

043-583 монанхоцидин А (1), D (4)

043-600 монанхоцидины А (1), В (2), D (4)

043-603 монанхоцидин А (1), D (4)

043-604 монанхоцидин А (1), D (4)

036-197 монанхомикалины А (8), В (9) 2» у13 в «спермидиновый»

041-029 монанхомикалин С (13), птиломикалин А (6)

Мы предполагаем, что монанхоцидины с морфолиноновым циклом в «якорной» части, как в 1-5, биосинтезируются из предшественников, содержащих спермидиновую (I) или оксиспермидиновую (И) единицу (рис. 12). Такой биосинтез может протекать

через дополнительное окисление предшественника в неизвестный интермедиат (III), с последующей циклогемиацетализацией, подобно тому, как это происходит в моносахаридах.

Выяснение путей образования метаболитов исследуемой группы, содержащих «спермидиновый» тип «якорной» части, является предметом дальнейших исследований.

I R=H III

II R=OH 1-5 Рисунок 12 - Схема гипотетических путей биосинтеза «якорной» части

«морфолинонового» типа

Примечательной структурной особенностью пентациклических гуанидиновых алкалоидов, найденных в тропических губках, является то, что связывание «корабельной» части со спермидином происходит через оксиполиметиленовые мостики, предшественниками которых являются длинноцепочечные са-окисленные жирные кислоты. Длина их углеводородных остовов в разных соединениях варьируется от С15 до Си. В преобладающем большинстве известных представителей данной группы метаболитов липидная «связка» представлена производным 16-гидроксигексадекановой кислоты.

Таблица 2 - Предполагаемые жирнокислотные предшественники пентациклических _гуанидиновых алкалоидов из губки М. pulchra_

Соединение Предшественник

монанхомикалины А (8), В (9), С (13) птиломикалин А (6) СГ^ОН 16-гидроксигексадекановая кислота

монанхоцидины В (2), D (4) 0^0 н 2,16-дигидроксигексадекановая кислота

монанхоцидин С (3) „ОН НО^— п О^ОН 2,17-дигидроксигептадекановая кислота

монанхоцидин Е (5) О^ОН 2,15-дигидроксигептадекановая кислота

монанхоцидин А(1) Sb О^ГОН 2,16-дигидроксиоктадекановая кислота

Анализ структур пентациклических гуанидиновых алкалоидов, выделенных нами из дальневосточной губки М. ри1с1гга, показал, что жирнокислотные предшественники могут

различаться не только длиной углеродного скелета, но и положением, а также количеством гидроксильных групп (табл. 2). Так, в монанхомикалины А (8), В (9) и С (13) входят производные 16-гидроксигексадекановой кислоты, а в монанхоцидинах А (1) и Е (5) - это соответственно производные 2,16-дигидроксиоктадекановой и 2,16-дигидроксигептадекановой кислоты.

4. Исследование in vitro противоопухолевой активности выделенных соединений

Цитотоксическая активность выделенных метаболитов исследована на клеточных линиях HL-60, ТНР-1 (лейкемия человека), MDA-MB-231 (рак молочной железы человека), HeLa (рак шейки матки человека), а также на нормальных мышиных эпителиальных клетках линии JB6 Р+ С141. Результаты биотестирования представлены в таблице 3.

Для ряда полученных соединений проведено исследование канцерпревентивной активности с помощью метода мягкого агара. Метод основан на способности мышиных эпителиальных JB6 Р+ С141 клеток трансформироваться в опухолевые под действием эпидермального фактора роста (EGF) в качестве промотора и, как следствие, образовывать колонии в мягком агаре. Результат исследования представлен в таблице 4.

Таблица 3 - Цитотоксическая активность исследуемых соединений

вещество 1С 50, мкМ

HL-60" ТНР-Г HeLa" MDA-MB-2310 JB6P+ С141°

монанхоцидин А (1) 0.54 6.39 2.00

монанхоцидин В (2) 0.20 0.58 1.36

монанхоцидин С(3) 0.11

монанхоцидин D (4) 0.83

монанхоцидин Е(5) 0.65

монанхомикалин А (8) 0.12

монанхомикалин В (9) 0.14 1.54 1.72

монанхомикалин С (13) 1.84 8.20 1.30

птиломикалин А (6) 1.10 4.30 0.50

нормонанхоцидин А(14) 2.1 3.8

смесь нормонанхоцидинов В (15) и D (16) 3.7 6.8 5.20

цисплатин 4.75 23.00 30.20

"Клетки обрабатывали соответствующим веществом в течение 72 ч, "клетки

обрабатывали соответствующим веществом в течение 48 ч.

Проведённые эксперименты показали, что выделенные алкалоиды способны ингибировать злокачественную трансформацию .1В6 Р+ С141 клеток в концентрациях, в 3-8 раз меньше цитотоксических. Наибольшую канцерпревентивную активность из исследованных алкалоидов проявили монанхоцидины А (1) и В (2) (наибольшее значение отношения 1С5о/ПМСС50).

Таблица 4 - Ингибирование исследуемыми веществами ЕСИ-индуцированной опухолевой трансформации мышиных эпителиальных клеток Л36 Р+ С141 (канцерпревентивная активность) в сравнении с цитотоксической активностью по отношению к тем же клеткам

вещество 1С50, мкМ, ШСС5о, мкМ 1С50/1МСС50

монанхоцидин А(1) 2.00 0.27 7.41

монанхоцидин В (2) 1.36 0.17 8.0

монанхомикалин С (13) 1.30 0.26 5.0

птиломикалин А (6) 0.50 0.17 2.94

Исследование влияния выделенных веществ на клеточный цикл клеток Л36 С141, а также их способность индуцировать апоптоз проводилось методом проточной цитометрии. Показано, что обработка клеток всеми исследуемыми веществами в цитотоксических концентрациях приводит к остановке клеточного цикла в 8-фазе (интерфазе), то есть на стадии репликации ДНК, а также вызывает индукцию апоптоза. Кроме того, установлено, что при обработке клеток исследуемыми соединениями в цитотоксических, апоптоз-индуцирующих концентрациях не происходит увеличения транскрипционной активности белка-супрессора опухолей р53. Данный факт свидетельствует о том, что индуцируемый апоптоз может носить р53-независимый характер, а значит, выделенные вещества могут быть перспективны в качестве средств химиотерапии р53-дефицитных опухолей, устойчивых к большинству известных в настоящее время препаратов.

Также исследовано влияние выделенных веществ на транскрипционную активность ядерного фактора АР-1. Фактор транскрипции АР-1 принимает участие в экспрессии множества генов, вовлеченных в такие ключевые процессы, как пролиферация, дифференциация, опухолевая промоция и трансформация клеток, воспаление и ингибирование апоптоза. Для всех исследованных пентациклических гуанидиновых алкалоидов, при обработке ими клеток в нецитотоксических концентрациях, наблюдается увеличение транскрипционной активности ядерного фактора АР-1 и его ингибирование под действием цитотоксических концентраций веществ.

Примечательно, что цисплатин - известный и давно применяемый в клинической практике противоопухолевый препарат имеет точно такие же профили влияния на транскрипционные активности факторов АР-1 и р53, как и исследованные алкалоиды.

Таким образом, выделенные алкалоиды проявляют высокую противоопухолевую цитотоксическую активность, а также канцерпревентивную активность в нецитотоксических концентрациях. Соединения способны влиять на клеточный цикл, останавливая его в Б-фазе, и приводят к одновременной индукции апоптоза, который, скорее всего, носит р53-независимый характер. Исследованные пентациклические гуанидиновые алкалоиды в субцитотоксических концентрациях способны активировать транскрипционную активность ядерного фактора АР-1, подобный эффект наблюдается при обработке клеток цисплатином - известным и давно используемым в клинической практике противоопухолевым препаратом.

ВЫВОДЫ

1. При исследовании 10 образцов из разных сборов дальневосточной морской губки М. ри1скга выделено 12 пентациклических гуанидиновых алкалоидов. С помощью физико-химических методов и химических трансформаций установлено строение 10 новых соединений и проведена структурная идентификация 2 соединений с известными ранее веществами.

2. Анализ спектральных данных показал, что новые соединения - монанхоцидины В и С - представляют собой гибридные структуры, сочетающие в себе «корабельную» часть,

характерную для соединений этого класса из тропических губок и «якорную» часть, ранее найденную только в монанхоцидинс А из дальневосточной губки. Монанхоцидины С и Е являются гомологами монанхоцидина А.

3. Установлено, что новые соединения - монанхомикалины А и В - гибридные структуры, содержащие пснтациклический кор монанхоцидинового типа и спермидиновую «якорную» часть птиломикалинового типа. Кроме того, в пентацикличсском коре монанхомикалина А содержится уникальный структурный элемент - этильная группа при С-20.

4. Показано, что новое соединение - монанхомикалин С - является структурным аналогом пснтациклических гуанидиновых алкалоидов из тропических губок, который представляет собой гомолог птиломикалина А, содержащий н-пропильную группу при С-19.

5. Установлено, что новые соединения - нормонанхоцидины А, В и D - структурные аналоги пснтациклических гуанидиновых алкалоидов из тропических и дальневосточных морских губок, содержащие новый тип «якорной» части - производное 1,3-диаминопропана.

6. На основании новой структурной информации, в комплексе с имеющимися в литературе данными, предложена схема гипотетических путей биосинтеза полициклической части пснтациклических гуанидиновых алкалоидов.

7. Анализ структур выделенных нами новых метаболитов из дальневосточной губки M. pulchra показал, что жирнокислотныс предшественники оксиполиметилсновых «мостиков» могут различаться не только длиной углеродного скелета, но и положением, а также количеством гидроксильных групп.

8. При исследовании биологической активности выделенных алкалоидов выяснено, что данные метаболиты проявляют высокий цитотоксичсский эффект в отношении трех линий клеток рака человека, а также обладают канцерпревентивной активностью в нсцитотоксичсских концентрациях.

9. Показано, что некоторые из исследованных соединений останавливают клеточный цикл в S-фазс, приводя к одновременной индукции апоптоза, который, скорее всего, носит р53-независимый характер. Кроме того, данные вещества в субцитотоксических концентрациях способны активировать транскрипционную активность ядерного фактора АР-1, подобно цисплатину - известному и давно используемому в клинической практике противоопухолевому препарату.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Makarieva T.N., Tabakmaher K.M., Guzii A.G., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Shubina L.K., Kuzmich A.S., Lee H.S., Stonik V.A. Monanchocidins B-E: polycyclic guanidine alkaloids with potent antileukemic activities from the sponge Monanchora pulchra // J. Nat. Prod. 2011. V. 74, No. 9. P. 1952-1958.

2. Makarieva T.N., Tabakmaher K.M., Guzii A.G., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Kuzmich A.S., Lee H.S., Stonik V.A. Monanchomycalins A and B, unusual guanidine alkaloids from the sponge Monanchora pulchra // Tetrahedron Lett. 2012. V. 53, No. 32. P. 4228^231.

3. Tabakmakher K.M., Denisenko V.A., Guzii A.G., Dmitrenok P.S., Dyshlovoy S.A., Lee H.S., Makarieva T.N. Monanchomycalin C, a new pentacyclic guanidine alkaloid from the Far-Eastern marine sponge Monanchora pulchra II Nat. Prod. Commun. 2013. V. 8, No. 10. P.1399-1402.

4. Dyshlovoy S.A., Venz S., Guzii A., Makarieva T., Tabakmakher K., Stonik V., Balabanov S., Bokemeyer C., Honecker F. Marine alkaloid monanchocidin: a proteomic-based screening of protein targets in cisplatin-resistant tumor cells // Ann. Oncol. 2013. 24 (suppl 1). P. ¡23—¡24.

5. Makarieva T.N., Guzii A.G., Tabakmaher K.M., Ogurtsova E.K., Stonik V.A. Biologically active guanidine alkaloids from Far-Eastern marine sponges // Proceedings of International Symposium on Marine Bioprospecting. 24 May, 2012. International Conference Hall Korea Ocean Reserch and Development Institute. Seul, 2012. P. 16-17.

6. Makarieva T.N., Tabakmaher K.M., Guzii A.G., Stonik V.A. New cytotoxic compounds from marine sponges // 9th 1ST Asia Pacific Meeting on Animal, Plant and Microbial Toxins, Vladivostok. 2011. September 4-8. P. 60-61.

7. Makarieva T.N., Tabakmaher K.M., Guzii A.G., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Shubina L.K., Kuzmich A.S., Lee H.S., Stonik V.A. Monanchocidins A-D: new polycyclic guanidine alkaloids with potent. antileukemic activities from the sponge Monanchora pulchra // 5th International Symposium. Chemistry and Chemical Education. Vladivostok. 2011. September 12-18. P. 50-51.

8. Табакмахер K.M.,. Кузьмич A.C, Макарьсва Т.Н. Монанхомикалины А и В -необычные гуанидиновые алкалоиды из губки Monanchora pulchra II XIV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии: тез. докл. МЭС, ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток 11-18 сентября 2012 г. С. 56. Электронное издание.

9. Табакмахер К.М., Дышловой С.А., Макарьсва Т.Н. Монанхомикалин С - новый пснтацикличсский гуанидиновый алкалоид из дальневосточной морской губки Monanchora pulchra И Конференция молодых ученых «ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ», ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток 7-14 ноября 2013 г. сб. тр. С. 22-23.

10. Табакмахер К.М., Дышловой С.А., Кузьмич А.С., Макарьсва Т.Н. Нормонанхоцидины A-D - новые минорные пентацикличеекие гуанидиновые алкалоиды из дальневосточной губки Monanchora pulchra II XV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС, ТИБОХ, Владивосток 5-15 сентября 2014 г.: сб. тр. Владивосток: ДВО РАН, 2014. С.46.

11. Дышловой С.А., Табакмахер К.М., Фенц С., Хаусшильд Д., Гузий А.Г., Макарьсва Т.Н., Стоник В.А., Букамаср К., Балабанов Б., фон Амсберг Г., Хонскер Ф. Автофагия и псрмсабилизация лизосом как механизм противоопухолевого действия морского гуанидин-содержащсго алкалоида Монанхоцидина А. // XV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС, ТИБОХ, Владивосток 5-15 сентября 2014 г.: сб. тр. Владивосток: ДВО РАН, 2014. С. 10.

12. Щскалева Р.К., Табакмахер К.М., Макарьсва Т.Н., Стоник В.А., Федоров С.Н., Дышловой С.А. Изучение противоопухолевой активности гуанидиновых алкалоидов морской губки Monanchora pulchra II XV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС, ТИБОХ, Владивосток 5-15 сентября 2014 г.: сб. тр. Владивосток: ДВО РАН, 2014. С. 58.

Ксения Михайловна ТАБАКМАХЕР

СТРУКТУРНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПЕНТАЦИКЛИЧЕСКИХ ГУАНИДИНОВЫХ АЛКАЛОИДОВ ИЗ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЙ МОРСКОЙ ГУБКИ MONANCHORA PULCHRA

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано к печати 26.12.2014 г. Формат 60x90/16. Печать офсетная. Усл.п.л. 1,0. Уч.-изд.л. 0,99. Тираж 120 экз. Заказ 108

ФГУП «Издательство Дальнаука» 690041, г. Владивосток, ул. Радио, 7

Отпечатано в Информационно-полиграфическом хозрасчетном центре ТИГ ДВО РАН 690041, г. Владивосток, ул. Радио,7