Выделение, установление структуры и изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов из губки Aaptos sp.

Дышловой, Сергей Анатольевич

Выделение, установление структуры и изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов из губки Aaptos sp. тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Дышловой, Сергей Анатольевич АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Владивосток МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Выделение, установление структуры и изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов из губки Aaptos sp.»

Автореферат диссертации на тему "Выделение, установление структуры и изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов из губки Aaptos sp."

На правах рукописи

Дышловой Сергей Анатольевич

Выделение, установление структуры и изучение биологической активности ааптамнновых алкалоидов из губки Аар1о5 $р.

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005044001 1 ' МАЯ тг

Владивосток - 2012

005044001

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН (Владивосток, Россия) и Университетской клинике Эппендорф при университете Гамбурга (Гамбург, Германия).

Научный руководитель:

Кандидат химических наук, старший научный сотрудник Фёдоров Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

Светашев Василий Иванович

Доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН, ведущий научный сотрудник Лаборатории сравнительной биохимии

Ермакова Светлана Павловна

Кандидат химических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН, старший научный сотрудник Лаборатории химии ферментов

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « 01 » июня 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.т.

Автореферат разослан «ХЧ-» апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным Всемирной организации здравоохранения в 2010 году онкологические заболевания стали основной причиной смертности в мире, обогнав по количеству летальных случаев сердечно-сосудистые заболевания. Несмотря на многочисленные исследования последних десятилетий по поиску и разработке новых противоопухолевых препаратов следует признать, что на настоящий момент лечение этих заболеваний все еще остается весьма проблематичным. Поэтому поиск и изучение новых противоопухолевых препаратов по-прежнему является актуальной проблемой современной науки. Известно, что около половины всех имеющихся лекарственных препаратов создано на основе природных соединений. Это связано с тем, что природные биологически активные соединения нередко являются очень активными и малотоксичными. Следует также отметить, что эти биомолекулы были отобраны в ходе эволюционных процессов как наиболее эффективные, и поэтому они являются хорошими моделями для дальнейших синтетических модификаций.

Наиболее богатым источником морских биологически активных соединений продолжают оставаться губки. Данный факт связывают с «неподвижным» образом жизни этих животных и, как следствие, необходимостью вырабатывать защитные химические вещества, которые могут не только играть определённую экологическую и физиологическую роль, но и выполнять другие биологические функции.

Таким образом, поиск и выделение вторичных метаболитов морских губок, исследование их химических структур, а также молекулярных механизмов биологического действия является актуальным с точки зрения получения новых веществ с уникальной активностью, в том числе противоопухолевой.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было выделение, установление структуры, а также изучение противоопухолевой активности и некоторых аспектов молекулярных механизмов действия ааптаминовых алкалоидов из морской губки АарШ ер. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать схемы и провести выделение в индивидуальном виде ааптаминовых алкалоидов, ответственных за противоопухолевую активность экстракта губки Аар1оз Бр.;

2. Установить строение выделенных соединений;

3. Исследовать канцерпревентивную, цитотоксическую и цитостатическую противоопухолевую активность выделенных алкалоидов, а также возможные механизмы этой активности;

4. С помощью методов протеомики и молекулярной биологии исследовать влияние выделенных алкалоидов на протеом опухолевых клеток человека и экспрессию некоторых генов.

Основкые положения, выносимые на защиту.

1. Морская губка Aaptos sp. содержит 3-(7У-морфолинил)-деметилоксиааптамин, 3-(метиламино)-деметилоксиааптамин, 2,3-дигидро-2,3-диоксоааптамин и б-^-морфолинилМ^-дигидро-б-оксо-деметилоксиааптамин, являющиеся новыми представителями класса ааптаминовых алкалоидов.

2. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из морской губки Aaptos sp. обладают канцерпревентивной и цитотоксической противоопухолевой активностью. Ааптамин, деметилоксиааптамин и изоааптамин проявляют одинаковую цитотоксическую активность по отношению к лекарственно-устойчивым NT2-R и лекарственно-чувствительным NT2 опухолевым клеткам человека.

3. Исследуемые алкалоиды по-разному влияют на транскрипционную активность ядерных факторов АР-1, NFkB и р53. Этот эффект зависит от концентрации и химической структуры соединений.

4. Ааптамин в нецитотоксических концентрациях оказывает антипролиферативный эффект на опухолевые NT2 клетки, останавливая клеточный цикл в фазе G2/M.

5. Цитотоксическое действие ааптамина обусловлено активированием фосфорилирования ERKs, повышением уровня транскрипционной активности АР-1, NFkB и р53 ядерных факторов с последующей индукцией апоптоза опухолевых клеток.

6. Под воздействием нецитотоксических концентраций ааптамина на NT2 клетки происходит гипузинирование эукариотического фактора инициации трансляции 5А-1, фосфорилирование кофилина-1, ап-регуляция CRABP2 с одновременным увеличением количества кодирующей его мРНК, а также изменение соотношения изоформ альфа-энолазы.

7. Ааптамин, деметилоксиааптамин и изоааптамин по-разному влияют на протеом NT2-R опухолевых клеток, что выражается в воздействии на внутриклеточные уровни разных белков. Ааптамин в первую очередь проявляет свою антипролиферативную активность, тогда как деметилоксиааптамин и изоааптамин - цитотоксическую активность, реализующуюся по апоптотическому пути.

активности, влиянии на клеточный цикл и транскрипционную активность некоторых ядерных факторов. Исследование протеома клеток, обработанных ааптаминовыми алкалоидами, выявило некоторые уникальные изменения в белковом составе этих клеток. В частности, в обработанных ааптамином NT2 и NT2-R клетках была зафиксирована активация эукариотического фактора инициации трансляции 5А-1 (eIF5A), подобный эффект никогда ранее не наблюдался при действии низкомолекулярных веществ на клетки. Впервые были охарактеризованы некоторые особенности механизма действия ааптаминовых алкалоидов. Всё это создаёт основу для дальнейших исследований веществ этого типа как потенциальных хемопревентивных и терапевтических противоопухолевых препаратов.

Апробация работы. Результаты работы представлены на международных симпозиумах «Targeted Anticancer Therapies-2012» в 2012 г., Амстердам, Нидерланды, и «Targeted Anticancer Therapies-2011» в 2011 г., Париж, Франция; на Второй международной российско-корейской конференции «Current issues of natural products chemistry and biotechnology» в 2010 г., Новосибирск, Россия; на Международном симпозиуме по морским биоресурсам Вьетнама, 2010 г., Ханой, Вьетнам; на XII Всероссийской молодёжной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 2009 г., Владивосток, Россия; на Первом дальневосточном международном симпозиуме, посвященном наукам о жизни «Life Science», 2008 г., Владивосток, Россия; на X Международной молодёжной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 2007 г., Владивосток, Россия; а также на других конференциях.

Публикации. Всего опубликовано 27 работ - 9 научных статей, 1 патент и 17 тезисов докладов. Из них по теме диссертации 13 работ, в том числе 3 научных статьи, 1 патент и 9 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 144 цитируемых работы. Работа изложена на 145 страницах, содержит 35 рисунков и 14 таблиц.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.х.н. Фёдорову С.Н. Автор благодарит также к.х.н. Шубину Л.К. за неоценимый вклад в химическую часть настоящего исследования; академика Стоника В.А. и д.х.н. Макарьеву Т.Н. - за ценные консультации; м.н.с. Кузьмич A.C. и н.с. Радченко О.С. - за помощь в проведении ряда экспериментов; д.х.н. Калиновского А.И. и к.х.н. Дмитренка П.С. - за получение и помощь в обработке спектральных данных; н.с. Красохина В.Б. - за определение видовой принадлежности изученных морских организмов; к.х.н. Ермакову С.П. за ряд советов по организации биологической части исследования и чл.-корр. РАН Васьковского В.Е. - за помощь в работе с научной литературой и сборе информации. Автор также выражает глубокую признательность своим немецким коллегам из Университетской клиники Эппендорф при университете Гамбурга (Гамбург, Германия), и в особенности,

доктору Фридману Хонекеру, доктору Штефану Балабанову и профессору Карстену Букамаеру.

Используемые сокращения. 2Б-Вестерн-блоттинг - двумерный Вестерн-блоттинг; 2D-PAGE - двумерный электрофорез в полиакриламидном геле, используемый при анализе протеома клеток; АР-1 - активаторный белок-1, транскрипционный фактор; CRABP2 — клеточный ретиноевая кислота-связывающий белок 2; DHS - деоксигипузин синтаза; DOHH - деоксигипузин гидроксилаза; eIF5A - эукариотический фактор инициации трансляции 5А-1; EGF - эпидермальный фактор роста; GC7 - М1-гупнил-1,7-диаминогептан; IC50 - (Inhibition concentration 50), концентрация исследуемого вещества, при которой происходит уменьшение количества жизнеспособных клеток на 50%; INCC50 - (Inhibition of the number of the colonies C50) концентрация вещества, при которой происходит ингибирование колонеобразования (трансформации) клеток JB6 Р+ С141 в мягком агаре на 50%; MG-132 - М-(бензилокси-карбонил)лейциниллейциниллейциналь; MTS - 5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4,5-диметилтиазолил)-3-(4-сульфофенил) тетразолий, внутренняя соль; NFkB - ядерный фактор кВ, транскрипционный фактор; pi - изоэлектрическая точка; противоопухолевая активность - в данной работе - активность вещества по отношению к опухолевым клеткам, так или иначе приводящая к их гибели или замедлению пролиферации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом исследования являлись ааптаминовые алкалоиды, выделенные из водно-этанольного экстракта морской губки Aaptos sp., отобранной в ходе скрининга морских губок на противоопухолевую цитотоксическую активность.

1. Выдёление и установление химического строения ааптаминовых

алкалоидов

Ааптаминовые алкалоиды выделяли из двух сборов морской губки Aaptos sp. Из водно-этанольного экстракта губки первого сбора Aaptos sp.l, с помощью колоночной хроматографии на полихроме-1, силикагеле и последующей ВЭЖХ на обращенной фазе, был выделен новый ааптаминовый алкалоид - 3-(//-морфолинил)-деметилоксиааптамин (6), а также пять ранее известных соединений: ааптамин (1), деметилоксиааптамин (2), изоааптамин (3), 3-(изопентиламино)-деметилоксиааптамин (4) и З-(фенетиламино)-деметилоксиааптамин (5) (рис. 1). Из второго сбора губки Aaptos sp.2, собранного в том же месте, что и губка Aaptos sp.l, но двумя годами ранее, наряду с известными были выделены еще 3 новых ааптаминовых алкалоида: 3-(метиламино)-деметилоксиааптамин (7), 2,3-дигидро-2,3-диоксоааптамин (8), 6-(,А/-морфолинил)-4,5-дигидро-5-оксо-деметилоксиааптамин (9) (рис. 1). Известные алкалоиды идентифицировали сравнением их спектральных данных с опубликованными в литературе, структура новых соединений была

установлена при помощи анализа их масс-спектров, спектров 'Н и |3С ЯМР а также на основании данных экспериментов НМВС, ШС^С и Ш КОЕ.

осн3

сн.о

сн3о.

осн,

осн3

(5)

(б) Я =

(7) Я = ЫН—СНз

Рисунок 1. Ааптаминовые алкалоиды из губок АарШ эр. 1 и Аар1о.1 $р.2

Однако полученные спектральные данные для соединения б не позволяли сделать однозначного заключения о его строении и предполагали две равновероятные структуры б и ба (рис. 1). Поэтому было проведено восстановление соединения б / ба дитионитом натрия с последующей обработкой диазометаном (рис. 2), которое привело к образованию ааптамина (1) и подтвердило скелетную систему соединения 6. К настоящему времени известно лишь несколько морфолиповых производных, выделенных из морских организмов. Алкалоид 6 является первым ааптаминовым алкалоидом, содержащим морфолинильный фрагмент.

2. Изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов 2.1. Исследование цитотоксической активности

Цитотоксическую активность выделенных алкалоидов 1-9 по отношению к десяти линиям опухолевых клеток человека и мыши, а также одной линии нормальных мышиных эпителиальных клеток изучали МТ8-методом. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Цитотоксическая активность алкалоидов 1-9

Тип опухоли Клеточная Линия Вещество (1С™. мк-М)

I 2 3 4 5 £ 7 8 9

Моноцитарная лейкемия ТНР-1 161.3 40.9 32.2 66.3 99.6 181.6 150.2 >200 >200

Промиелоцитарная лейкемия HL-60 14.8 2.4 2.7 30.4 - 15.7 - - -

Рак шейки матки HeLa 151.1 18.6 50.7 82.3 120.5 101.9 - - -

Рак кишечника DLD-1 177.8 24.1 - - - - - - -

Рак кишечника SNU С-4 267 22.3 35.S 58.2 181.8 237.6 - - -

Меланома SK-MEL-28 156.5 35 70.3 121.2 189.1 432.7 - - -

Рак молочной железы MDA-MB-231 147.2 9.1 10.6 42.3 251.2 26.3 - - -

Нейробластома* Neuro2a 63.2 5 3.3 - - 51.2 - - -

Мышиные эпителиальные клетки** JB6P* С141 42.6 7.3 18.8 57.8 151.8 107.6 >200 - -

Тестикулярная карцинома NT2 100.5 4.4 13.2 - - - - - -

Тестикулярная карцинома (цисплатин устойчивая линия) NT2-R 106.2 4.5 12.5 - - - - - -

* опухолевые мышиные клетки; ** нормальные мышиные клетки

Наибольшую цитотоксическую активность из выделенных веществ проявлял деметилоксиааптамин (2), немногим менее активен был изоааптамин (3), остальные алкалоиды проявляли значительно более слабую цитотоксическую активность. Кроме того, как видно из таблицы изученные вещества проявляли более сильное цитотоксическое действие по отношению к клеткам промиелоцитарной лейкемии (HL-60). Также примечательно, что ааптамин (1), деметилоксиааптамин (2) и изоааптамин (3) показывали одинаковую цитотоксическую активность как по отношению к чувствительным NT2, так и по отношению к лекарственно устойчивым NT2-R клеточным линиям.

2.2. Исследование канцериревентивной активности

Потенциальную канцерпревентивную активность ааптамина (1) и его аналогов 2-6 исследовали методом мягкого агара. Метод основан на способности мышиных эпителиальных JB6 Р+ С141 клеток трансформироваться в опухолевые под действием эпидермального фактора роста (EGF) в качестве

промотора и образовывать колонии в мягком агаре. Канцерпревентивную активность веществ описывают с помощью концентраций, вызывающих 50% ингибирование числа колоний трансформированных клеток (ШСС50)-Проведённые эксперименты показывали, что исследуемые алкалоиды способны ингибировать злокачественную трансформацию Л36 Р+ С141 клеток в нецитотоксических концентрациях. Чем больше относительная разница между 1С50 и ШСС5о, тем больший потенциал имеет вещество в качестве профилактического препарата. Отношение 1С5(ДМСС5о представлено в таблице 2. Лучший результат по этому показателю демонстрировал ааптамин (1), 1С5о/ГМСС5о = 20.3, наиболее слабый - деметилоксиааптамин (2) с 1с5о/гысс5о=4.1, для остальных алкалоидов значение 1с5о/1мсс5о было около 10. Эти результаты свидетельствовали о достаточно высоком потенциале ааптаминовых алкалоидов в качестве потенциальных средств профилактики опухолевых заболеваний.

Таблица 2. Значения 1С50, ШСС50 и 1С50/ШСС50 для алкалоидов 1-6 по отношению к 1В6 Р+ С141 клеткам

Для выявления возможных механизмов канцерпревентивного действия ааптаминовых алкалоидов провели исследование влияния веществ на процессы активирования и ингибирования митоген-активируемых протеинкиназ ЕМСз, которые, как известно, играют важную роль в процессе ЕвЕ-индуцируемой опухолевой трансформации ДВб Р+ С141 клеток, а ингибиторы фосфорилирования ЕШСз считаются потенциальными противоопухолевыми веществами. Однако в наших экспериментах не было зафиксировано ингибирования ЕОЕ-индуцируемого фосфорилирования ЕМСб в ходе предварительной обработки в течение 12 ч 1В6 Р+ С141 клеток ааптамином (1), деметилоксиааптамином (2) или изоааптамином (3). Напротив, через 1 ч обработки алкалоидами 1, 2 или 3 было зафиксировано повышение внутриклеточного уровня фосфорилированых ЕЫСз, причем в неактивированных с помощью ЕОБ 1В6 Р+ С141 клетках и только в цитотоксических концентрациях. Это свидетельствует о том, что ЕЯКб, вероятно, играют важную роль в клеточном ответе на воздействие цитотоксических концентраций исследуемь1х алкалоидов, но, скорее всего, не опосредуют канцерпревентивный эффект, демонстрируемый алкалоидами 1, 2 и 3.

Мы исследовали также влияние выделенных ааптаминовых алкалоидов на транскрипционную активность ядерных факторов АР-1, №кВ и р53. Было показано, что после 24 ч инкубирования с клетками, вещества 1, 2 и 3 активировали транскрипционную активность АР-1 в концентрациях 400, 10 и 10 мкМ, соответственно. Для соединений 4, 5, 6 и 7 в пределах всех исследованных концентраций (до 100-200 мкМ) через 24 ч инкубирования с

Вещество 1 2 3 4 5 6

1С.о, мкМ 42.6 2.9 18.8 151.8 57.8 107.6

11ЧСС!Л, мкМ 2.1 0.7 2.1 15.7 5.7 10.6

1С5П/ШСС„ 20.3 4.1 9.0 9.7 10.1 10.2

клетками наблюдалось ингйбирование АР-1 транскрипционной активности. Таким образом, изученные алкалоиды дифференцированно влияют на активность ядерного фактора транскрипции АР-1.

Также дифференцировано действовали исследуемые алкалоиды и на транскрипционную активность ядерного фактора №кВ. Вещества 1, 2, 3, 5 и 6 через 24 ч инкубирования с клетками, активировали ОТкВ-зависимую транскрипционную активность. С другой стороны, алкалоиды 4 и 7 также через 24 часа, напротив, ингибировали транскрипционную активность ядерного фактора №кВ.

При исследовании влияния алкалоидов 1-7 на транскрипционную активность белка-супрессора опухолей р53 было показано, что ааптамин (1) в концентрации 400 мкМ, через 24 ч инкубирования с клетками активировал транскрипционную активность белка р53. Все остальные соединения 2-7 в диапазоне всех исследованных концентраций ингибировали транскрипционную активность р53 после 24 ч воздействия на клетки.

2.3. Исследование влияния ааптамина на способность к пролиферации и жизнеспособность МТ2 опухолевых клеток человека

С помощью трипанового синего установили, что при обработке ]^Т2 клеток ааптамином в концентрации 50 мкМ в течение 48 часор происходит ингибирование скорости клеточного роста (снижение общего количества клеток до 40.9±9.9%, по сравнению с контролем). При этом не наблюдалось значительного снижения жизнеспособности клеток (85.8±20.8% живых клеток по сравнению с контролем). Определённое МТЗ-методом значение 1С50 для ааптамина по отношению к ЫТ2 клеткам составило 54.5 мкМ, что хорошо согласуется с результатом, полученным методом трипанового синего.

Вестерн-блоттинг показал, что ааптамин (1) в концентрациях от 1 до 50 мкМ не активирует в ЫТ2 клетках про-апоптотические бедки РА11Р и каспазу-3, которые в активированном виде являются маркерами апоптоза. С помощью метода проточной цитометрии и двойного окрашивания клеток красителями аннексин-У-БЬиОЗ и пропидий йодидом (рис. 3 А) или анализа фрагментации ДНК с использованием окрашивания пропидий-йодидом (рис. 3 Б) также было показано, что ааптамин даже в концентрациях до 100 мкМ включительно не вызывает значительного увеличения количества апоптотических ЫТ2 клеток по сравнению с контролем.

Таким образом, с помощью методов трипанового синего, Вестерн-блоттинга и проточной цитометрии было показано, что ааптамин в концентрациях по крайней мере до 50 мкМ включительно проявляет антипролиферативные, но не цитотоксические свойства.

зимексин-V-FLUOS

..(...........I .....i- .............,........i

LI î i I

JL, ; . , 1» __I

a 20

I~1 контроль ■I ааптамин, 50 мкМ

p < 0.05 p < 0.05

ïli

G1 S G2/M

Рисунок 3. Результаты экспериментов по Рисунок 4. Диаграмма

исследовананию способности ааптамина индуциро- распределения обрабо-

вать апоптоз NT2 клеток. Использовали метод танных ааптамином NT2

проточной цитометрии с использованием двойного клеток по фазам

окрашивания аннексином-V-FLUOS и PI (А) и клеточного цикла окрашивание ДНКс помощью PI (Б)

Анализ распределения по фазам клеточного цикла NT2 клеток, обработанных 50 мкМ ааптамина в течение 48 ч, выявил остановку клеточного цикла в фазе G2/M, то есть на стадии подготовки к митозу/стадии митоза (рис. 4). Это согласуется с ранее опубликованными двумя независимыми группами исследователей данными, в которых была показана остановка клеточного цикла MG63 клеток в G2/M фазе и ап-регуляция белка р21 - ингибитора циклин-зависимой киназы CDK4, при обработке клеток ааптамином. Однако, выполненный нами Вестерн-блотгинг и ПЦР анализ для NT2 клеток выявили только едва уловимое увеличение экспрессии белка р21 и кодирующей его мРНК под действием на клетки ааптамина. Можно предположить, что разные клеточные линии неодинаково реагируют на воздействие ааптамином.

2.4. Исследование белков, регулируемых при действии нецитотоксических концентраций ааптамина на NT2 клетки

Следующей нашей целью было выявление белков-мишеней ааптамина в NT2 клетках. NT2 клетки были обработаны ааптамином в нецитотоксической концентрации 50 мкМ в течение 48 ч. Полученный с помощью 2D-PAGE двумерный гель, представляющий картину экспрессии различных белков в виде окрашенных кумасси бриллиантовым синим G-250 белковых пятен (рис. 5), отсканировали и сравнили с картиной экспрессии белков в необработанных веществом клетках. Сравнение и анализ проводили с помощью программы Delta 2D.

21)0

119::

ü«

1»

66 " .——rí

" ' *-......

/«JV? V ífc,, '4 ACTL6A«, '„JT # „' * 4

* i-,ívv.;.«

I*»

14.5 .

7 TPT1 " < : 1 EIF5A -

6 PEA15"

* % Г*

* A» *•: »« ff.. "i

■-•»i* 8CTSD

5 SRSF3' * * 10CFL1-,

Рисунок 5. 2П<-электрофореграмма экстракта NT2 клеток, обработанных ааптамином. На 2D-rene отмечены регулируемые белки, представлены названия соответствующих им генов

Всего было выявлено 909 белковых пятен, интенсивность окраски 10 из которых изменилась в 2 раза и более при обработке клеток ааптамином. Интенсивность окраски пяти пятен 1-5, при обработке клеток веществом уменьшалась, других пяти пятен 6-10 увеличивалась (табл. 3). Все 10 белковых пятен вырезали из геля, и обработали трипсином с целью получения набора пептидов, которые далее проанализировали с помощью тандемной масс-спектрометрии. Содержащиеся в вырезанных пятнах белки были идентифицированы на основании сравнения полученных масс-спектров образующихся из них пептидов с информацией из баз данных. В результате выяснили, что ап-регулируемые под действием ааптамина пятна на 2D-PAGE геле соответствовали белкам, кодируемым генами РЕА15, ТРТ1, CTSD CRABP2 и CFL1, даун-регулируемые пятна - белкам, кодируемым генами EIF5A, ENOl, CSDE1, ACL6A и SRSF3 (табл. 3). Пятно 11 на рисунке 5 соответствует одной из изоформ белка eIF5A (гипузинированная изоформа), что было выяснено в ходе дальнейших экспериментов.

Далее более подробно исследовали изменения, происходящие с четырьмя белками, наиболее существенно регулируемыми при действии ааптамина на NT2 клетки согласно результатам 2D-PAGE. Ими были: даун-регулируемые эукариотический фактор инициации трансляции 5А-1 (eIF5A) и альфа-энолаза, а также ап-регулируемые кофилин-1 и клеточный ретиноевая кислота-связывающий белок 2 (CRABP2) (табл. 3).

Таблица 3. Белки, регулируемые в N12 клетках под действием ааптамина.

Номера белков соответствуют номерам пятен на рисунке 5 _

Номер пятня

Название гена

ACL6A

Название белка

Эукарнотический фактор инициации трансляции 5А-1 (elFSA)____

Апьфа-энолаза

Белок Е1, содержащий домен холодового шока

Актин-подобный белок 6А

Аргиннн/серин-обогащенный фактор сплайсннга 3

Фосфопротеин астроцнтов PEA-15

CRABP2

Трансляционно-контролируемый опухолевый белок

Катепсин D

Клеточный ретиноевая кислота-связывающнй белок 2 (CRABP2)

Кофилин-1

Номер в базе Swiss-

Pro*

Р63241

Q15121

Теор. Mw (кДа)

Теор. pi

Относительное

изменение интенсивности окраски пятна

0.16

Функция белка

Биосинтез белка

Связывание ДНК, Регуляция транскрипции и метаболизм углеводов

Регуляция трансляции (связывание РНК)_

Регуляция трансляции (процессннг РНК)

Передача сигналов

Цитоскелет и клеточное движение

Метаболизм (внутриклеточное разрушение белков)

Передача сигналов/ дифференциация

Цитоскелет и клеточное движение

Регуляция интенсивости белкового пятна на 2Б-РАСЕ геле, а, следовательно, и общего внутриклеточного уровня соответствующего белка или одной из его изоформ, может быть вызвана изменением концентрации кодирующей белок соответствующей мРНК (транскрипционный уровень), изменением уровня экспрессии белка (трансляционный уровень), посттрансляционной модификацией белка (в случае изменения интенсивности пятна, соответствующей одной из изоформ белка), а также деградацией белка, либо одной из его изоформ. Для того чтобы понять, какие процессы стали причиной наблюдаемой регуляции внутриклеточных уровней четырёх вышеупомянутых белков, применили метод полимеразио-цепной реакции в реальном времени с обратной транскриптазой (ПЦР-РВ). Результаты ПЦР-РВ выявили ап-регуляцию уровня мРНК, соответствующей двум из четырёх белков - СИАВР2 и кофилину-1 (рис. 6). Для белка С11АВР2 была выявлена ап-регуляция мРНК на 400% по сравнению с контролем. Увеличение количества мРНК, кодирующей кофилин-1, было не столь велико - около 50% (рис. 6).

Рисунок 6. Диаграмма уровней экспрессий мРНК, кодирующих четыре белка, наиболее сильно регулируемых под действием ааптамина на NT2 клетки (согласно рузельтатам ID-PAGE). Данные получены с помощью ПЦР-РВ. н.д.: не достоверно (статистически недостоверное отличие значений друг от друга, р > 0.05, t-тест Стьюдента)

Затем изменения, происходящие с белками е№5А, альфа-энолаза, кофилин-1 и СЯАВР2, были исследованы с помощью Вестерн-блоттинга и 20-Вестерн-блоттинга, который позволяет разделять белки не только по их молекулярной массе, но и по изоэлектрической точке (р1, рис. 7). Различия в р1 часто бывают вызваны посттрансляционными модификациями белка, такими как фосфорилирование или ацетилирование.

В результате для белка еШ5А было показано его гипузинирование под действием ааптамина на N12 клетки (рис. 7 А). Процесс гипузинирования представляет собой присоединение остатка спермидина к лизину50 с образованием гипузина (рис. 8). Этот процесс приводит к активации е1Р5А. Содержание негипузинированной модификации белка (р1 = 5.0) уменьшалось в обработанных ааптамином N12 клетках (рис. 7 А), в то время как определённое методом Вестерн-блоттинга общее количество белка оставалось неизменным. Этот факт хорошо коррелировал с данными ПЦР-РВ (рис. б) и свидетельствовал о накоплении гипузинированной формы еШ5А (р1 = 5.2, рис. 7 А), то есть активации белка.

2Б-Вестерн-блоттинг выявил несколько пятен, соответствующих нескольким изоформам белка альфа-энолаза. Было показано увеличение внутриклеточных уровней одних изоформ альфа-энолазы с одновременным уменьшением других (рис. 7 Б) по сравнению в контролем. В то же время Вестерн-блоттинг не выявил никаких существенных изменений в общем количестве альфа-энолазы (рис. 7 Б), что согласуется с данными ПЦР-РВ (рис.

р < 0.001

ip f- J>

p < 0.01

ааптамин, 50 мкМ

17 кДа -42 кДа -

........р1 = 5.0

£0. | [р!-1« 17 кДа - #

42 кДа - \Ш»и. '""<»

.......р! = 5.3

е1Р5А бета-актин

рН7 е!Р5А

Вестерн* блоттинг

20-Восторн-блоттинг

47 кДа -37 кДа -

альфа-энолаза

Вестерн-блоттинг

льфа* нолаза

20-Вестерн-блоттинг

ааптамин, 50 мкМ

рН4 15 кДа -42 кДа -

•- р! = 5.3

,.......р! = 5.5 рН7

I..

— СИАВР1 —--бета-актин

20-Вестери-блоттинг

Вестерн-блоттинг

Рисунок 7. Результаты анализа методом Вестерн-блоттинга и 2Б-Вестерн-блоттинга изменений, происходящих с белками е1Р5А (А), альфа-энолазой (Б), С11АВР2 (В) и кофилином-1 (Г) под действием ааптамина на ЫТ2 клетки

Для белка СЯАВР2 с помощью 2В-Вестерн-блоттинга было выявлено 2 пятна с М\у = 16 кДа, но с разными значениями р1 (р1 = 5.3 и р! = 5.5, рис. 7 В). Дальнейшие исследования показали, что пятно, находящееся в более кислой области значений р1 (р1 = 5.3), принадлежит белку С11АВР1 и было распознано поликлональными антителами против СЯАРВ2 вследствие их перекрёстной реактивности. В результате пятно с р1 = 5.5, интенсивность которого увеличивается после обработки КГГ2 клеток ааптамином, было идентифицировано как С11АРВ2 (рис. 7 В). Поскольку ПЦР-РВ анализ также показал значительное увеличение уровня соответствующей белку С11АРВ2 мРНК (рис. 6), то очевидно, что ап-регуляция белка СКАВР2 в ЫТ2 клетках под действием ааптамина происходит на транскрипционном уровне.

Для кофилина-1 2В-Вестерн-блоттинг показал наличие двух пятен с р1 = 6.7 и р1 = 7.0 (рис. 7 Г). Известно, что кофилин-1 способен претерпевать такую посттрансляционную модификацию, как фосфорилирование. Ранее пятно, располагающееся в более кислой области р1 (р1 = 6.7), было описано как фосфорилированная (неактивная) форма кофилина-1, а в менее кислой области (р1 = 7.0) - как нефосфорилированная (активная) форма. Таким образом, наблюдаемое увеличение интенсивности окраски пятна с р1 = 6.7 свидетельствует 6 стимулировании фосфорилирования, то есть о накоплении

неактивной формы кофилина-1 вследствие обработки N12 клеток ааптамином (рис. 7 Г).

2.5. Исследование процесса гипузинирования белка е№5А при действии ааптамина на 1ЧТ2 клетки

Известно, что е1Р5А способен претерпевать уникальный процесс гипузинирования - включения в структуру белка (по положению лизин50) остатка спермидина с дальнейшим гидроксилированием последнего. Описанные выше процессы контролируются ферментами деоксигипузин синтазой (БГО) и деоксигипузин гидроксилазой (БОНН), соответственно. Лимитирующей стадией процесса является катализируемое БНЭ присоединение остатка спермидина. Схема процесса гипузинирования представлена на рисунке 8. Гипузинирование необходимо для активирования белка еШ5А и дальнейшего его участия в процессах клеточной пролиферации и дифференциации.

Спермидин

NH3* NH3+ NH3>

Рисунок 8. Процесс гипузинирования белка eIF5A (Meier et al., 2010)

Нами был исследован процесс гипузинирования белка eIF5A под действием ааптамина в концентрации 50 мкМ на NT2 клетки. С помощью масс-спектров продуктов расщепления белков, содержащихся в пятнах 1 (негипузинированная форма eIF5A) и 11 (гипузинированная форма eIF5A, см. рис. 5), было показано наличие остатка гипузина в белке, содержащемся в пятне 11 и его отсутствие в пятне 1. Для подтверждения факта увеличения гипузинирования eIF5A под действием ааптамина на NT2 клетки провели эксперимент, основанный на уникальном свойстве белка eIF5A включать в свою молекулу остаток спермидина в процессе гипузинирования как in vitro, так и in vivo. В полном соответствии с результатами 20-Вестерн-блоттинга, а также масс-спектрометрического анализа, обработка NT2 клеток ааптамином в концентрациях 1-50 мкМ в присутствии 3Н-сперминдина в течение 48 ч привела к доза-зависимому повышению уровня радиоактивности общего белкового экстракта, что свидетельствовало о повышении уровня потребления

спермидина, а, следовательно, и о накоплении гипузинированной (активной) формы белка eIF5A. С целью выяснения причины происходящего увеличения гипузинирования белка eIF5A, нами было исследовано влияние ааптамина в NT2 клетках на уровни экспрессии DHS и DOHH - ключевых ферментов процесса гипузинирования, а также на активность in vitro выделенного в чистом виде DHS - фермента, катализирующего лимитирующую стадию процесса гипузинирования (рис. 8). Однако Вестерн-блотгинг не показал существенных изменений в уровнях экспрессии ферментов DHS и DOHH в NT2 клетках под действием ааптамина в концентрации до 50 мкМ. Кроме того, не было выявлено изменения уровня in vitro ферментативной активности DHS в присутствии ааптамина. В то же время, не исключено, что ааптамин является модулятором активности DHS в живых клетках NT2, действуя на какие-то иные факторы, отсутствующие в нашем эксперименте по исследованию in vitro ферментативной активности очищенного DHS.

Кроме того, активирование процесса гипузинирования под действием ааптамина на клетки NT2 может быть связано с протеасом-ингибирующей активностью ааптамина, сообщение о которой было опубликовано недавно. В самом деле, нами было показано, что известный ингибитор протеасом MG-132 при воздействии на NT2 клетки вызывал похожие изменения в соотношении изоформ белка eIF5A. Однако это наблюдение ожидает дополнительной проверки.

Следовательно, активирование процесса гипузинирования eIF5A при действии ааптамина на NT2 клетки - это первый случай активирования гипузинирования, зафиксированный для низкомолекулярного соединения. Для того чтобы понять вклад активации белка eIF5A в производимый ааптамином антипролиферативный эффект, мы исследовали скорость пролиферации NT2 клеток со сверхэкспрессированным DHS. Сверхэкспрессия фермента DHS ожидаемо вызвала повышение уровня гипузинированого (активного) eIF5A на -20%, однако это не привело ни к активированию пролиферации NT2 клеток, ни к ее ингибированию. Таким образом, активирование eIF5A не обуславливает антипролиферативные свойства ааптамина в NT2 клетках.

2.6. Возможные механизмы противоопухолевого действия ааптамина

Согласно результатам проведенных экспериментов по воздействию ааптамина на трансформированные JB6 С141 и опухолевые NT2 клетки можно предложить механизм его канцерпревентивной, цитостатической и цитотоксической активностей. Ааптамин проявляет канцерпревентивную и цитостатическую активность в нецитотоксических концентрациях. Механизм такого действия ааптамина на трансформируемые или опухолевые клетки связан с проявлением ааптамином антипролиферативного действия, выражающегося в аресте клеточного цикла в фазе 02/М, а также с регулированием внутриклеточных уровней и активности белков eIF5A, альфа-энолаза, кофилин-1 и CRABP2. Эти белки участвуют в таких процессах, как регулирование клеточного роста (eIF5A и альфа-энолаза), апоптоз,

дифференциация, и пролиферация (кофилин-1 и СЯАВР2). Механизм канцерпревентивного действия ааптамина не связан с ингибированием фосфорилирования ЕМСв.

Цитотоксический эффект ааптамина, скорее всего, реализуется через активирование фосфорилирования ЕМСв, с последующим увеличением транскрипционной активности АР-1 и ОТ-кВ ядерных факторов, активированием белка-суппрессора опухолей р53 и дальнейшей индукцией апоптоза.

2.7. Исследование воздействия ааптамина, деметнлоксиааптамина и изоааптамина на лекарственно-устойчивые N12-И клетки тестикулярной

карциномы человека

По сравнению с «нормальными» N12 клетками клетки N12-11 проявляют высокую устойчивость к противоопухолевому препарату цисплатину, применяемому для лечения тестикулярной карциномы человека. С помощью МТБ-метода было показано, что алкалоиды 1, 2 и 3, в отличие от цисплатина, проявляют одинаковую цитотоксическую и/или антипролиферативную активность по отношению к клеткам ИТ2 и N12-11. С использованием метода трипанового синего определили, что ааптамин (1), деметилоксиааптамин (2) и изоааптамин (3) уменьшают количество жизнеспособных (трипановый синий-отрицательных) N12-11 клеток на 50% через 48 ч обработки в концентрациях 50 мкМ, 4.5 мкМ и 12.5 мкМ соответственно. Далее исследовали действие алкалоидов 1, 2 и 3 на N12-11 клетки в этих концентрациях.

контроль анизомицин, 1 мкМ ааптамин, 50 мкМ деметилоксиааптамин, 4.5 мкМ изоааптамин, 12.5 мкМ

Щ Ь » й К

а т о Ш 1 * «¡Ш £ .......Г

Рисунок 9. Результаты экспериментов по исследованию способности алкалоидов 1, 2 и 3 индуцировать апоптоз N12-Я клеток. Применяли метод проточной цитометрии с использованием двойного окрашивания аннексином-У-РИГОБ и Р1 (А) и окрашивания ДНК с помощью Р1 (Б)

С помощью проточной цитометрии была показана способность деметилоксиааптамина и изоааптамина индуцировать апоптоз в ЫТ2-Я клетках в концентрациях 4.5 мкМ. и 12.5 мкМ, соответственно (рис. 9 А, Б). Ааптамин в концентрации 50 мкМ практически не индуцировал апоптоз в N12-11 клетках (рис. 9) и, следовательно, его воздействие на N12-11 клетки в этой концентрации также, как и на Ш"2 клетки, является антипролиферативным, но не апоптоз-индуцирующим или не цитотоксическим.

Индукция апоптоза в КП-Я клетках под действием деметилоксиааптамина и изоааптамина была подтверждена Вестерн-блоттингом, который выявил активацию РАР.Р и каспазы-3 под действием соединений 2 и 3 в указанных концентрациях (рис. 10)

На основании результатов изучения антипролиферативного и апоптоз-индуцирующего воздействия алкалоидов 1, 2 и 3 на N72-11 клетки можно сделать вывод о перспективности их дальнейшего изучения как потенциальных средств терапии лекарственно-устойчивых типов опухолей.

Рисунок 10. Результат анализа методом Вестерн-блоттинга способности алкалоидов 1, 2 и 3 индуцировать апоптоз N12-11 клеток

Далее нами были проанализированы изменения в протеоме устойчивой к цисплатину линии клеток, обработанных алкалоидами 1, 2 или 3 в

концентрациях 50 мкМ, 4.5 мкМ и 12.5 мкМ, соответственно, в течение 48 ч. Анализ проводили так же, как описано для ааптамина в п. 2.4.

При анализе методами протеомики экстракта N12-11 клеток после воздействия на них ааптамина на гелях было выявлено 22 белковых пятна с изменённой в 2 и более раза интенсивностью окраски. Интенсивность семи соответствующих пятен в обработанных клетках увеличивалась, пятнадцати -уменьшалась. С помощью Вестерн-блоттинга и 2Б-Вестерн-блоттинга было показано, что при действии ааптамина (1) на ЫТ2-Я клетки, аналогично ЭТ2 клеткам, происходит гипузинирование белка е1Р5А, а также фосфорилирование кофилина-1 (рис. 11 А). Кроме того, нами показано происходящее под действием ааптамина дефосфорилирование виментина (рис. 11 А). Известно, что подобный процесс наблюдается при регулировании стадии митоза клеток и связан с дезассемблированием и реорганизацией виментиновых филаментов.

А'

/// / / ///

■ ШШШ - РАИР

- активированая РАРР

- активированная каспаза-3

При анализе методами протеомики экстракта N12-11 клеток после воздействия на них деметилоксиааптамина (2) на гелях было выявлено 16 белковых пятен с изменённой в 2 и более раза интенсивностью окраски. Интенсивность шести пятен в обработанных клетках увеличивалась, десяти -уменьшалась. С помощью Вестерн-блоттинга и 2В-Вестерн-блоттинга было показано, что при действии деметилоксиааптамина на N12-11 клетки происходит увеличение общего количества шаперона Нзр70, который, взаимодействуя с другими шаперонами, стабилизирует белки, предохраняет их от агрегации и обеспечивает правильное сворачивание (фолдинг) вновь синтезируемых белков (рис. 11 Б). Кроме того, было показано изменение соотношение изоформ альфа-энолазы в >1X2-11 клетках при обработке клеток деметилоксиааптамином (рис. 11 Б). Интересно, что в отличие от ааптамина, обработка N12-11 клеток деметилоксиааптамином не приводила к гипузинированию белка е]Р5А.

При анализе методами протеомики экстракта N12-11 клеток после воздействия на них изоааптамина (3) на гелях было выявлено 17 белковых пятен с изменённой в 2 и более раз интенсивностью окраски. Интенсивность тринадцати пятен в обработанных клетках увеличивалась, четырёх -уменьшалась. С помощью Вестерн-блоттинга и 2В-Вестерн-блоттинга было показано, что при действии изоааптамина на N12-11 клетки происходит увеличение интенсивности сигнала одной из изоформ нуклеолина (указана стрелкой на рис. 11 В) с М\у 100 кДа. 20-Вестерн-блоггинг выявил З'величение количества изоформы нуклеолина со значением р1 = 5.4 (рис. 11 В, изоформа указана стрелкой). Нуклеолин обычно находится в виде комплекса с основными белками (такими как гистон Н1) и РНК-содержащими структурами. Основное количество нуклеолина, как было показано с помощью 2Е>-Вестерн-блоттинга, имело М\у = 110 кДа и значение р! > 7.0. Появление регулируемой изоформы нуклеолина (пятна с р1 = 5.4), по всей видимости, свидетельствует о разрушении вышеупомянутого комплекса при действии изоааптамина на клетки. Также как и в случае деметилоксиааптамина, обработка клеток изоааптамином не приводила к гипузинированию белка е1Р5А.

По результатам анализа воздействия ааптамина, деметилоксиааптамина и изоааптамина на протеом N12-11 клеток не было выявлено ни одного одинакового белка, который бы регулировался всеми тремя исследуемыми алкалоидами 1, 2 и 3.

17кДа-18 кДа-

52 кДа -47кДа-

ааптамин, 50 мкМ

elF5A кофилин-1

... pl = 5.0

,......pl = 5.1

— р| в 5.2

рН7 Щ elF5A

_pl = 6.7 ,— pl i 7

ч т

, кофилин-1

-- pl = 4.0

••......pl = 5.1

I ,— pl = 5.2

70 кДа -47 кДа -кДа -42 кДа ■

etF 5А бата-ан

рН4 17 кДа-

pl = 5.0 — pl = 5.1 ,— р| = 5.2

рН7 щтф «IF5A

иооааптамин, 12.5 мкМ

17 кДа -42 кДа -

PHI j

"«я»-

42 и Да - ф-

I 110 «Да-100 кДа -

(■IF5A бпта-ак

рН? elFSA

110 кЦэ -■ 00 кДа -

4?кДа-37 кДа -

Рисунок 11. Результаты анализа методом Вестерн-блоттинга и 2В-Вестерн-блоттинга изменений, происходящих с некоторыми белками в №"2-11 клетках, при действии алкалоидов 1 (А), 2 (Б) или 3 (В)

С помощью классификационной системы PANTHER нами был проведён функциональный анализ белков, регулируемых в NT2-R клетках при действии исследуемых алкалоидов. Примечательно, что при практически полном отсутствии совпадений в белках, регулируемых при действии на клетки соединений 1, 2 или 3, наблюдается значительное сходство в профилях распределения этих белков по молекулярным функциям и участию в биологических процессах. Установлено, что большинство регулируемых белков обладает каталитической, а также ДНК- и белок-связывающей активностями и

принимает участие в таких биологических процессах, как метаболизм белков и нуклеиновых кислот, а также организация клеточных компонентов.

Анализ взаимодействий белков, регулируемых под действием алкалоидов 1, 2 и 3 в NT2-R клетках, а также белков, предположительно участвующих в клеточном ответе на воздействие исследуемых веществ, был произведён с помощью программы IPA. В центре построенной гипотетической сети взаимодействий в случае ааптамина находятся прото-онкоген MYC и белок-супрессор опухолей р53 (ТР53). В случае деметилоксиааптамина центральную позицию занимает фактор некроза опухолей TNF, а в случае изоааптамина - все три мишени, MYC, ТР53 и TNF, одновременно. Таким образом, предположительно, механизмы действия ааптамина (1), деметилоксиааптамина (2) и изоааптамина (3) могут быть до определённой степени сходными.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ выделения из морской губки Aaplos sp. индивидуальных алкалоидов ааптаминового ряда.

2. Из спиртовых экстрактов губки Aaptos sp. выделены 4 новых и 5 ранее известных ааптаминовых алкалоидов. Строение новых соединений установлено как З-СА'-морфолинилЗ-деметилоксиааптамин, З-(метиламино)-деметилоксиааптамин, 2,3-дигидро-2,3-диоксоааптамин и б-^-морфолинил)-4,5-дигидро-5-оксо-деметилоксиааптамин.

3. Показано, что выделенные алкалоиды обладают канцерпревентивной, а также цитотоксической противоопухолевой активностью. Ааптамин, деметилоксиааптамин и изоааптамин преодолевают лекарственную устойчивость NT2-R клеток тестикулярной карциномы человека, действуя на них в тех же концентрациях, которые явдяются активными по отношению к лекарственно-чувствительным NT2 опухолевым клеткам.

4. Установлено, что механизм канцерпревентивного и цитостатического действия ааптамина может включать арест клеточного цикла в фазе G;/M, а также регулирование внутриклеточных уровней и активности белков eIF5A, альфа-энолазы, кофилина-1 и CRABP2.

5. Показано, что механизм цитотоксического действия ааптамина может включать активирование фосфорилирования ERKs, транскрипционной активности АР-1, NFxB и р53 ядерных факторов, а также индукцию апоптоза опухолевых клеток.

6. Показано, что ааптамин является первым низкомолекулярным активатором процесса гипузинирования эукариотического фактора инициации трансляции 5А-1 (eIF5A).

7. Установлено, что исследованные нами ааптаминовые алкалоиды имеют определенный потенциал для дальнейшего изучения возможности их применения в качестве хемопревентивных противоопухолевых препаратов, а также компонентов терапии лекарственно-устойчивых типов опухолей.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Dyslilovoy S.A., Naeth I., Venz S., Preukschas M., Sievert H., Jacobsen C., Shubina L.K., Gesell Salazar M., Scharf C., Walther R., Krepstakies M., Priyadarshini P., Hauber J., Fedorov S.N., Bokemeyer C., Stonik V.A., Balabanov S., Honecker F. Proteomic profiling of germ cell cancer cells treated with aaptamine, a marine alkaloid with antiproliferative activity // Journal of Proteome Research. 2012. V. 11,N4. P. 2316-2330.

2. Dvshlovov S.A... Naeth I, Venz S., Shubina L.K., Fedorov S.N., Stonik V.A., S. Balabanov, F. Honecker. P2.28 Proteomic-based screening of protein targets of aaptamine, a marine alkaloid with antiproliferative activity // Annals of Oncology. 2012. V. 23, Supp. 1. P. i32. DOI: 10.1093/annonc/mds018

3. Dvshlovov S., Fedorov S., Shubina L., Honecker F., Stonik V. Anticancer activity of aaptamine and its derivatives isolated from marine Vietnamese sponge Aaptos sp. // Annals of Oncology. 2011. V. 22. P. 33-33.

4. Дышловой C.A., Шубина JI.К., Федоров С.Н, Кузьмич А.С., Радченко О.С., Красохин В.Б., Стопик В.А. Средство, предотвращающее трансформацию нормальных клеток млекопитающих в опухолевые // Патент РФ на изобретение № 2429840 (RU 2429840 С1). Заявка № 2010102268. Приоритет изобретения 22.01.2010. Зарегистрировано 27.09.2011. Срок действия до 22.01.2030.

5. Shubina L.K., Makarieva T.N., Dvshlovov S.A., Fedorov S.N., Dmitrenok P.S., Stonik V.A. Three new aaptamines from the marine sponge Actptos sp. and their proapoptotic properties // Natural Product Communications. 2010. V. 5, N 12. P. 1881-1884.

6. Dvshlovov S.A., Fedorov S.N., Shubina L.K., Stonik V.A. Anticarcinogenic activity of aaptamine and its derivatives isolated from the marine Vietnamese sponge Aaptos sp. // Intern, workshop on marine living resources of Vietnam, Hanoi, Vietnam, May 29th - 31th, 2010: abstr. - Hanoi, 2010.

7. Shubina L.K., ICalinovsky A.I., Fedorov S.N., Radchenko O.S., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Dvshlovov S.A., Krasokhin V.B., Stonik V.A. Aaptamine alkaloids from the Vietnamese sponge Aaptos sp. // Natural Product Communications. 2009. V. 4, N 8. P. 1085-1088.

Соискатель

Дышловой С.A.

Дышловой Сергей Анатольевич

Выделение, установление структуры и изучение биологической активности ааптаминовых алкялоидов из губки АарШ ер.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 26.04.2012 Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,39 Уч-изд. 1,29 Тираж 120 экз. Заказ 308 Отпечатано в Типографии ИД ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Дышловой, Сергей Анатольевич, Владивосток

61 12-2/534

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г. Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук

На правах рукописи

Дышловой Сергей Анатольевич

Выделение, установление структуры и изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов из губки АарШ $р.

02.00.10 - биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: Кандидат химических наук Старший научный сотрудник Фёдоров С. Н.

Владивосток - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................7

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР...................................................................................15

Морской алкалоид ааптамин и его аналоги. Особенности их химического строения, биологическая активность. Клеточные культуры и некоторые методы, примененные для изучения биологической активности......................15

2.1. Химическая структура и биологическая активность ранее выделенных аналогов ааптамина.............................................................................................15

2.1.1. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из природных источников ...........................................................................................................................15

2.1.2. Попытки использовать ааптамин в качестве таксономического маркера губок семейства виЬегШёае..........................................................18

2.1.3. Возможное бактериальное происхождение ааптаминовых алкалоидов......................................................................................................19

2.1.4. Биологическая активность ааптаминовых алкалоидов.................19

2.1.4.1. Влияние на активность ферментов...........................................19

2.1.4.2. Противовирусная активность...................................................20

2.1.4.3. Противомикробная активность................................................21

2.1.4.4. Цитотоксическая активность....................................................23

2.1.4.5. Антагонистическая по отношению к а-адренорецепторам и гипотензивная активности.....................................................................28

2.1.4.6. Противообрастательная активность........................................29

2.1.4.7. Мутагенная активность..............................................................29

2.1.4.8. Ингибирование КМБА-рецептора............................................30

2.1.4.9. Ингибирование активности протеасом....................................30

2.1.4.10. Антидепрессантная активность..............................................31

2.1.4.11. Антиоксидантная активность..................................................31

2.2. Клеточные культуры и некоторые методы, применённые для изучения биологической активности ааптаминовых алкалоидов................................31

2.2.1. ХВ6 Р+ С141 клетки как модель для изучения канцерпревентивных веществ............................................................................................................31

2.2.2. Опухолевые половые клетки..............................................................33

2.2.2.1. Аберрантное развитие и опухоли половых клеток.................33

2.2.2.2. Клеточные линии 1ЧТ2 и 1ЧТ2-Ы.................................................34

2.2.2.3. Лечение тестикулярной карциномы на основе применения цисплатина................................................................................................34

2.2.3. Протеомика и методы, в ней применяемые.....................................35

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ........................................................................37

3.1. Выделение и установление химического строения ааптаминовых алкалоидов............................................................................................................37

3.2. Изучение биологической активности выделенных алкалоидов ааптаминового ряда.............................................................................................44

3.2.1. Цитотоксическая активность.............................................................44

3.2.2. Канцерпревентивная активность ааптаминовых алкалоидов......45

3.2.3. Влияние исследуемых алкалоидов на фосфорилирование МАРК ЕМСв.................................................................................................................47

3.2.4. Исследование влияния алкалоидов ааптаминового ряда на АР-1-, ^кВ- и р53-зависимую транскрипционную активность........................48

3.2.5. Исследование влияния ааптамина на ]ЧТ2 опухолевые клетки человека...........................................................................................................54

3.2.5.1. Влияние ааптамина на способность к пролиферации и жизнеспособность ]ЧТ2 опухолевых клеток человека.........................54

3.2.5.2. Исследование про-апоптотической активности ааптамина.. 55

3.2.5.3. Исследование влияния ааптамина на клеточный цикл в 1ЧТ2 клетках.......................................................................................................57

3.2.5.4. Выявление белков, регулируемых под действием нецитотоксических концентраций ааптамина в ]\Т2 клетках..........58

3.2.5.5. Исследование белков, регулируемых под действием ааптамина в ]\Т2 клетках.......................................................................60

3.2.5.5.1. Анализ экспрессии соответствующих генов...................60

3.2.5.5.2. Анализ экспрессии белков методами Вестерн-блоттинга и 2Б-Вестерн-блоттинга....................................................................64

3.2.5.5.3. Исследование изменений, происходящих с белком eIF5A ...............................................................................................................67

3.2.5.5.3.1. Доказательство увеличения экспрессии гипузинированной формы белка eIF5A под действием ааптамина на NT2 клетки...........................................................67

3.2.5.5.3.2. Эксперимент по включению 3Н-спермидина.........70

3.2.5.5.3.3. Исследование влияния ааптамина на уровень содержания ферментов DHS и DOHH в NT2 клетках.............71

3.2.5.5.3.4. Исследование влияния ааптамина на активность фермента DHS in vitro...................................................................72

3.2.5.5.3.5. Исследование влияния сверхэкспрессии деоксигипузин синтазы (DHS) на скорость роста NT2 клеток73

3.2.5.5.3.6. Исследование эффекта ингибитора протеасом MG-132 на процесс гипузинирования белка eIF5A в NT2 клетках75

3.2.5.6. Обсуждение результатов исследования белков, регулируемых под действием ааптамина в NT2 клетках.............................................77

3.2.6. Механизмы канцерпревентивного и цитотоксического действия ааптамина........................................................................................................79

3.2.7. Исследование действия ааптаминовых алкалоидов на цисплатин-устойчивые опухолевые клетки (NT2-R)....................................................80

3.2.7.1. Сравнение действия ааптаминовых алкалоидов на чувствительные (NT2) и цисплатин-устойчивые опухолевые клетки (NT2-R).......................................................................................................80

3.2.7.2. Изучение индукции апоптоза ааптамином, деметилоксиааптамином и изоааптамином в NT2-R клетках...........82

3.2.7.3. Выявление белков, регулируемых в NT2-R клетках под действием ааптамина...............................................................................84

3.2.7.4. Выявление белков, регулируемых в NT2-R клетках под действием деметилоксиааптамина........................................................88

3.2.7.5. Белки, регулируемые в 1ЧТ2-К клетках под действием изоааптамина............................................................................................92

3.2.7.6. Обсуждение результатов экспериментов по действию ааптаминовых алкалоидов на чувствительные (1ЧТ2) и цисплатин-устойчивые опухолевые клетки (№Г2-К)..............................................96

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..................................................................100

4.1. Приборы и материалы...............................................................................100

4.1.1. Приборы...............................................................................................100

4.1.2. Реагенты..............................................................................................101

4.1.3. Клеточные культуры.........................................................................103

4.1.4. Биологический материал..................................................................104

4.2. Стандартные методики для определения биологической активности веществ................................................................................................................104

4.2.1. Определение цитотоксической активности веществ (МТ8!-метод) .........................................................................................................................104

4.2.2. Определение способности веществ влиять на пролиферацию клеток (метод трипанового синего)...........................................................106

4.2.3. Определение канцерпревентивной активности веществ.............106

4.2.4. Люциферазный метод определения АР-1-, ОТкВ- и р53-зависимой транскрипционной активности..................................................................107

4.2.5. Приготовление белковых экстрактов для Вестерн-блоттинга, 2ТУ-Вестерн-блоттинга и 2Б-РАСЕ..................................................................108

4.2.6. Определение концентрации белка в экстрактах (метод Бредфорда) .........................................................................................................................109

4.2.7. Вестерн-блоттинг................................................................................109

4.2.8. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2Б-РАСЕ)111

4.2.9. Анализ рисунков 2Б-гелей................................................................112

4.2.10. Идентификация белков методом масс-спектрометрии...............113

4.2.11. Двумерный Вестерн-блоттинг (2В-Вестерн-блоттинг)...............113

4.2.12. Метод полимеразно-цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).......................................................................................................115

4.2.12.1. Выделение РНК........................................................................115

4.2.12.2. Обратная транскрипция (приготовление кДНК)...............115

4.2.12.3. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР)....................................116

4.2.13. Электрофорез ДНК в агарозном геле............................................116

4.2.14. Полимеразно-цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ).. 117

4.2.15. Метод проточной цитометрии для исследования способности веществ индуцировать апоптоз..................................................................118

4.2.16. Метод проточной цитометрии для исследования влияния веществ на клеточный цикл......................................................................................118

4.2.17. Эксперимент по включению 3Н-спермидина...............................119

4.2.18. Исследование влияния вещества на активность фермента DHS in vitro.................................................................................................................120

4.2.18.1. Выделение фермента DHS и белка eIF5A.............................120

4.2.18.2. Измерение уровня активности фермента DHS in vitro.......120

4.2.19. Сверхэкспрессия деоксигипузин синтазы (DHS).........................121

4.2.20. Построение карт белок-белковых взаимодействий.....................122

4.2.21. Статистическая обработка полученных результатов.................122

4.3. Поиск и выделение ааптамина и его производных................................123

4.3.1. Скрининг губок..................................................................................123

4.3.2. Выделение ааптаминовых алкалоидов...........................................125

4.3.2.1. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из губки Aaptos sp.l ...................................................................................................................125

4.3.2.2. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из губки Aaptos sp.2 ...................................................................................................................127

4.4. Восстановление 3-(Л^-морфолинил)-9-деметилоксиааптамина (44).....128

5. ВЫВОДЫ..............................................................................................................129

6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ....................................................130

I. ВВЕДЕНИЕ

Известно, что около 50% всех имеющихся лекарственных препаратов было создано на основе природных соединений. Это связано с тем, что природные биологически-активные соединения нередко являются очень активными и малотоксичными. Следует отметить, биологически активные природные соединения были эволюционно отобраны и являются хорошими моделями для дальнейших синтетических модификаций. Как правило, биологически-активные природные соединения являются низкомолекулярными веществами, которые в большинстве своём относятся к так называемым вторичным метаболитам. Вторичные метаболиты образуются из таких широко распространённых предшественников, участвующих в первичном метаболизме, как глюкоза, аминокислоты, уксусная кислота, часто эти метаболиты являются специфичными для отдельных таксонов, а иногда и для отдельных видов или штаммов. Вторичные метаболиты разнообразны как по своему химическому строению, так и по их биологической функции.

Известно, что биохимия вторичного обмена морских организмов существенно отличается от процессов, происходящих в наземных организмах. За последние 25 лет из морских гидробионтов были выделены около 20000 морских природных соединений, несколько десятков из них находятся на различных стадиях клинических испытаний в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов. Первыми из этих соединений, введёнными в клиническую практику, стали противоопухолевые препараты «ara-A» или «видарабин» и «ara-С» или «цитарабин», разработанные на основе необычных, содержащих арабинозу

нуклеозидных метаболитов из губки Cryptotethia crypta. В 2007 году для лечения некоторых видов опухолей был разрешён препарат «трабектидин» (джонделис), разработанный на основе алкалоида эктеинасцидина-743 (ЕТ-743), выделенного из асцидии Ecteinascidia turbinata. Недавно еще один противоопухолевый препарат нового поколения «эребулин мезилат» на основе макролидов морских губок был разрешен к производству и применению в США и странах Европы. В настоящее время на различных стадиях клинических испытаний находятся противоопухолевые препараты, созданные на основе таких морских природных соединений как халихондрины, бриостатины, гемиастерлин, дискодермолид, спонгистатин, аплидин, салиноспорамид А и др.

Наиболее богатым источником морских биологически активных соединений продолжают оставаться морские губки. Данный факт связывают с «неподвижным» образом жизни этих животных и, как следствие, необходимостью вырабатывать защитные химические вещества, которые могут не только играть определённую экологическую и физиологическую роль, но и выполнять различные другие биологические функции. Губки и асцидии являются богатым источником азот-содержащих соединений, морских алкалоидов. Эти соединения способны влиять на клеточный цикл, взаимодействовать с ферментами и другими мишенями, и являются перспективными в качестве антибактериальных, антикоагулянтных, противовирусных, противогрибковых, противовоспалительных, а также противоопухолевых агентов.

Таким образом, поиск и выделение вторичных метаболитов морских губок, исследование Pix химических структур, а также молекулярных механизмов биологического действия является актуальным с точки зрения получения новых веществ с уникальной активностью, в том числе противоопухолевой.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было выделение, установление структуры, а также изучение противоопухолевой активности и некоторых аспектов молекулярного механизма действия ааптаминовых алкалоидов из морской губки Aaptos sp. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать схемы и провести выделение в индивидуальном виде ааптаминовых алкалоидов, ответственных за противоопухолевую активность экстракта губки Aaptos sp.;

2. Установить строение выделенных соединений;

4. С помощью методов протеомики и молекулярной биологии исследовать влияние выделенных алкалоидов на протеом опухолевых клеток человека и экспрессию некоторых генов;

Научная новизна и практическая ценность работы. Из губки Aaptos sp. выделено 4 новых алкалоида ааптаминового ряда. Изучены ЯМР- и масс-спектры новых соединений, а также их некоторые химические свойства. Впервые выявлена сильная канцерпревентивная активность соединений этого ряда. Получены новые ценные данные о противоопухолевой активности ааптаминовых алкалоидов in vitro, в частности, их про-апоптотической активности, влиянии на клеточный цикл и транскрипционную активность некоторых ядерных факторов. Исследование протеома клеток, обработанных аапаминовыми алкалоидами, выявило некоторые уникальные изменения в белковом составе этих клеток. В частности, в обработанных ааптамином NT2 и NT2-R клетках была зафиксирована активация эукариотического фактора инициации трансляции 5А-1 (eIF5A), подобный эффект никогда ранее не наблюдался при действии низкомолекулярных веществ на клетки. Впервые были охарактеризованы некоторые особенности механизма действия ааптаминовых алкалоидов. Всё это создаёт основу для дальнейших исследований веществ этого типа как потенциальных хемопревентивных и терапевтических противоопухолевых препаратов.

Публикация результатов исследования. Основные результаты данной работы опубликованы в журналах «Journal of Proteome Research», «Annals of Oncology», «Natural Products Communications». По результатам исследования получен патент РФ. Результаты работы представлены на международных

симпозиумах «Targeted Anticancer Therapies-2012» в 2012 г., Амстердам, Нидерланды, и «Targeted Anticancer Therapies-2011» в 2011 г., Париж, Франция; на Второй международной российско-корейской конференции «Current issues of natural products chemistry and biotechnology» в 2010 г., Новосибирск, Россия; на Международном симпозиуме по морским биоресурсам Вьетнама, 2010 г., Ханой, Вьетнам; на XII Всероссийской молодёжной школе конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 2009 г., Владивосто�