Структурное изучение стеринов и некоторых сопутствующих токсинов морских губок тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Сантялова Елена Анатольевна

СТРУКТУРНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СТЕРИНОВ И НЕКОТОРЫХ СОПУТСТВУЮЩИХ ТОКСИНОВ МОРСКИХ ГУБОК

02.00.10 - биоорганическая х"имия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2005 г.

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, старший научный сотрудник Макарьева Т. Н.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор Каминский В.А.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Уткина U.K.

Ведущая организация:

Институт биологии моря ДВО РАН

Защита состоится «21» апреля 2005 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 005.05.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232)31-40-50; e-mail: science@piboc.dvo.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (Владивосток-22, пр. 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

старший научный сотрудник

Прокопенко Г.И.

2-00Г-4

4 9Э4А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Губки (тип РопГега) - одна из древнейших групп животных, которая имеет самый разнообразный набор стеринов. Их стерины включают как обычные для эукариотических организмов мембранные компоненты (холестерин и его распространенные производные), так и соединения с необычными структурными чертами, функциональная роль которых остается неясной. Исследование функций необычных стеринов морских губок является актуальным направлением в изучении этих соединений.

Полученные ранее результаты параллельного изучения мембранотропных вторичных метаболитов и стериновых фракций из одних и тех же морских беспозвоночных (голотурий, морских звезд, губок) позволили предположить, что, по крайней мере, в ряде случаев замена обычных стеринов на редкие представляет собой механизм защиты мембран токсин-продуцирующих видов от воздействия собственных токсинов. Функционально обусловленное присутствие в одном организме необычных мембранных компонентов (например, редких стеринов) и токсичных вторичных метаболитов (мембранолитиков) было предложено называть «биохимической координацией». Среди губок это явление изучено недостаточно. К тому же разнообразные токсины этих беспозвоночных давно рассматриваются в качестве потенциальных лекарственных средств. Если механизм их цитотоксического действия связан со стериновыми составляющими мембран, то изучение стеринов соответствующих продуцентов перспективно с точки зрения создания комбинированных препаратов с пониженной токсичностью.

Задачами настоящей работы являлись: 1) выделение, установление структуры свободных стеринов губок и сопутствующих им гемолитиков и цитотоксинов; 2) выявление закономерностей совместного присутствия двух различных по своим биологическим функциям групп соединений (стеринов и токсинов) в организмах губок; 3) хемотаксономическое изучение распределения свободных стеринов в представителях РопГега.

Научная новизна и практическая ценность работы. Данная работа является первым систематическим изучением биохимической координации в губках. Всего было идентифицировано 73 стерина и 7 Д4-3-кетостероидов из 35-ти сборов губок, относящихся, за исключением одного образца класса Са1сагеа, к классу

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА X. Петербург

«•У*

Бетозрог^ае. Стерины 11 -ти видов губок изучены впервые. Показано, что отдельные комбинации стеринов определенных структурных типов могут характеризовать некоторые роды и семейства РолГега. Из этанольных экстрактов семи губок, показавших наибольшую гемолитическую активность, были выделены гемолитические и (или) цитотоксические агенты разной химической природы. Среди них идентифицированы 17 свободных жирных кислот, 3 тритерпеновых гликозида, 3 азотсодержащих производных терпеноидов, бромпиррольный и полициклический гуанидиновый алкалоиды. Также установлены структуры двенадцати новых природных соединений: четырех сестертерпеноидов, двух тритерпеновых гликозидов и шести 2,3-се/со-стероидных кислот, причем последние относятся к неизвестной ранее группе природных окисленных стероидов.

Положения, выносимые на защиту: 1. Результаты идентификации стеринов губок и их хемотаксономическое значение. 2. Данные по идентификации и установлению структур гемолитиков и цитотоксинов некоторых губок. 3. Результаты исследования предполагаемой взаимосвязи между присутствием стеринов и токсинов в ряде губок.

Апробация результатов. Материалы работы были представлены на 2-ом международном симпозиуме «Химия и химическое образование», Владивосток,

2000 г.; Научной конференции «Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока» ТИБОХ ДВО РАН,

2001 г.; Научной конференции студентов и аспирантов ДВГУ, Владивосток, 2001 г.; Конференции студентов, аспирантов и молодых ученых НОЦ ДВГУ «Морская биота», Владивосток, 2002 г.; международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений», Алматы, 2003 г.; региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 2004 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, двух частей, где приведены литературные данные и обсуждены результаты работы отдельно для стеринов и токсинов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 3 схемы, 47 таблиц и 1В рисунков. Список литературы включает 176 цитируемых работ.

Используемые сокращения. ТСХ - тонкослойная хроматография; ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография; ГЖХ - газо-жидкостная хроматография; СК ЯМР 'Н и 13С - спектроскопия ядерного магнитного резонанса на протонах и ядрах углерода; КССВ - константа спин-спинового взаимодействия; ХС - химический сдвиг; МС - масс-спеюрометрия; HRFABMS - масс-спектрометрия высокого разрешения с ионизацией быстрыми атомами; MALDI-TOF - масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией; ГЖХ-МС - хромато-масс-спектрометрия; DEPT - ЯМР-эксперимент с неискаженным усилением сигнала с помощью переноса поляризации с протона на ядро углерода; NOESY - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера; ID NOE - одномерный ЯМР-эксперимент ядерного эффекта Оверхаузера; COSY - корреляционная спектроскопия; TOCSY - полная корреляционная спектроскопия; HSQC - ЯМР-эксперимент гетероядерной одноквантовой корреляции; НМВС - ЯМР-эксперимент гетероядерной корреляции через несколько связей.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю Макарьевой Т.Н., а также академику Стонику В.А. за чуткость и всяческую поддержку, к.х.н. Денисенко В.А., к.х.н. Дмитренку А.С, н.с. Дмитренку П.С., Моисеенко О.П., к.б.н. Прокофьевой Н.Г., к.х.н. Пономаренко Л.П. за съемку ЯМР-и масс-спектров, проведение биотестирования и ГЖХ-анализа, за абсолютно бескорыстную помощь в работе, ценные идеи и критические замечания.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Стерикы губок 1.1. Выделение фракций свободных стеринов губок и их разделение

Стериновые фракции выделяли из этанольных экстрактов губок в основном с помощью препаративной ТСХ и колоночной хроматографии на силикагеле. Разделение некоторых стериновых сумм проводили методами «аргентационной» хроматографии на силикагеле, ВЭЖХ на прямой и обращенной фазах. Выделенные фракции, подфракции и индивидуальные стерины анализировали в виде ацетатов с помощью капиллярной ГЖХ, ГЖХ-МС и СК ЯМР 'Н и ,3С. Всего идентифицировано 73 известных стерина, имеющих тетрациклические ядра и боковые цепи, представленные на схемах 1 и 2.

1.2. Стерины губок рода Xestospongia (отряд Haplosclerida, сем-во Petrosiidae)

Стерины X. testudinaria 1. Идентифицировано 16 С27-С2д-стеринов, в основном Д5-типа (77,5%). Станолов найдено 20,4%, Д7-стеринов - 1,8%. Преобладают изофукостерин (А24), 24-метиленхолестерин (А10), 24£-метилхолеста-5,22Е-диен-Зр-ол (А8), холестанол (В4) и 24^-этилхолест-5-ен-3(3-ол (А19).

Стерины X testudinaria 2. Найдено 12 С27-С3о-стеринов, в том числе Д5-соединений - 86,3%, станолов - 13,3%. Основной стерин - ксестостерин (А27).

Схема 1. Тетрациклические фрагменты стеринов (А-Н), кетостероидов (I) и их буквенные обозначения

но1

но- Тй

Схема 1. Боковые цепи стеринов, кетостероидов и их цифровые обозначения

26

26

Стерины X. sp. Идентифицировано 18 С27-С?0-стеринов: из них на долю Д5-стеринов приходится 55,7%, станолов - 38,5%, Д7-стеринов - 5,2%. Основные компоненты фракции 24-метиленхолестанол (BIO) и фукостерин (А21).

Очевидно, X. testudinaria 1 и X. testudinaria 2 являются хемотипами одного вида. В целом, для губок рода Xestospongia характерно высокое содержание Д5-стеринов, имеющих как обычные, так и добавочно алкилированные боковые цепи.

1.3. Стерины и другие стероиды губок рода Haliclona (отряд Haplosclerida, сем-

во Chalinidae)

Стерины Я. sp. 1. Идентифицировано 11 С2б-С29-стеринов: станолов - 97,9%, Д7-стеринов - 1,29%, Д5-стеринов - 0,79%. Главный компонент - холестанол (В4).

Стерины Я. sp. 2. Идентифицировано 14 С2б-С29-стеринов: 39,9% станолов, 54,5% Д5-стеринов и 5,6% Д7-стеринов. Преобладает холестанол (В4).

Стерины Я. sp. 3. Идентифицировано 16 С2б-С30-стеринов, в том числе Д5-стеринов 95,9%, станолов - 0,87%. Основной компонент холестерин (A4).

Стерины Я. sp. 4. Идентифицировано 13 Д^-Сгт-Сзо-стеринов. Основной -редкий 24-этилхолеста-5,24(28),28-триен-ЗР-ол (А22).

Стероиды Я. sp. 5. Найден только холестерин в следовых количествах. Кроме того, обнаружены известные Д4-3-кетостероиды (Jl, J3, J4, J8, J10, J19, J24) и эфиры обычных Д5-стеринов. Вероятно, ферментативные системы Я. sp. 5 почти нацело превращают свободные стерины в другие стероидные производные.

В целом в исследованных губках Я. spp. 1-4 содержание как станолов, так и Д5-стеринов значительно варьирует (соответствует литературным данным).

1.4. Стерины губки Callyspongia sp. (отряд Haplosclerida, сем-во Callyspongiidae)

Идентифицировано 10 Д^-Сгб-Сгч-стеринов и один станол (в следах). Основные компоненты холестерин (A4) и 24-этилхолестерин (А19). Особенности стеринового состава С. sp. соответствуют общим признакам стериновых сумм губок этого рода.

1.5. Стерины губок рода Amphimedon (отряд Haplosclerida, сем-во Niphatidae)

Стерины A. sp. 1. Идентифицировано 13 Сгт-Сгв-соединений: Д5-стеринов -49,9%, станолов - 47,0%, Д7-стеринов - 3,0%. Основной стерин холестанол (В4).

Стерины A. sp. 2. Идентифицировано 18 С2б-С3о-стеринов: Д5-стеринов -41,3%, станолов - 47,5%, Д7-стеринов -11,16%. Преобладает холестанол (В4).

В целом стериновые составы A. sp. 1, A. sp. 2 и ранее изученной A. paraviridis близки, так как имеют сопоставимые количества Д5-стеринов и станолов.

1.6. Стерины губок рода Oceanapia (отряд Haplosclerida, сем-во Phloeodictyidae)

Стерины О sp. 1. Найдено 26 С26-С30-стеринов, станолов - 89,7% и Д5-стеринов - 7,1%- Главный компонент (24Я)-24,25-метилен-5а-холестан-Зр-ол (В12).

Стерины О sp. 2. Идентифицировано 6 С27-С29-станолов. Основной компонент фракции - 2411-метилхолестанол (B13R).

Стерины О sp. 3. Идентифицировано 7 С27-С29-стеринов, в том числе 87,7% станолов, 7,5% Д5-стеринов. Основной стерин - 24Я-метилхолестанол (B13R).

Стерины О toxophila. Идентифицировано 15 С27-С29-соединений, включая станолы (57,8%) и Д5-стерины (37,4%) Основной 24-метиленхолестанол (BIO).

Стерины О sp. 4. Найдено 5 С27-С29-стеринов. Преобладают Д5-соединения (90,3%), а в их числе холестерин (A4) и 24-этилхолестерин (А19). Станолов = 4,2%.

Стерины О. sp. 5. Идентифицировано 12 С27-С29-соединений, из них Д5-стеринов 67,3%, станолов 32,7%. Главный стерин 24-этилхолестерин (А 19)

Стерины О sp. 6. Идентифицировано 15 С26-С3о-соединений, в том числе Д5-стеринов 90,1%, станолов 9,8%. Основной стерин 24-метиленхолестерин (А10).

По стериновому составу изученные губки рода Oceanapia можно разделить на две группы: среди стероидных спиртов представителей одной преобладают станолы, а другой - Д5-стерины. Единственная ранее изученная родственная губка Rhizochalina(=Oceanapia) incrustata по набору стеринов близка к O.sp. 1.

1.7. Стерины губки Lissodendoryx behringi (отряд Poecilosclerida, сем-во

Coelosphaeridae)

Обнаружено 16 С27-С29-стеринов: Д5-сгеринов - 90,2%, станолов - 9,8%. Основной компонент 24-метиленхолестерин (A4). Высокое содержание Д5-стеринов было характерно и для ранее исследованных губок рода Lissodendoryx. 1.8. Стерины губки Clathria major (отряд Poecilosclerida, сем-во Microcionidae)

Идентифицировано 14 С26-С29-стеринов: Д5-стеринов - 98,3%, станолов -0,85%. Основной компонент - клионастерин (A19s). Стериновый состав С. major отличается от стеринового состава прежде изученной губки С. sp.

1.9. Стерины губки Monanchora clathrata (отряд Poecilosclerida, сем-во

Crambeidae)

Идентифицирован 21 С27-С29-стерин: Д7-соединений - 82,5%, станолов -12,8%, Д5-стеринов - 6,06% и 4а-метил-стерины в следовых количествах. Основной латостерин (С4). По набору стеринов данная губка близка к ранее исследованной Crambe crambe из того же семейства.

1.10. Стерины двух губок Geodinella robusta (отряд Astrophorida, сем-во

Geodiidae)

Стерины мелководной G. robusta: идентифицировано 18 С26-С29-стеринов, Д5-соединений - 86,0%, станолов - 10,4%.

Стерины глубоководной G. robusta: идентифицировано 15 Сг6-С29-соединений, Д5-стеринов - 93,3%, станолов - 4,6%.

В обоих сборах преобладает 24-метиленхолестерин (А 10), и в целом их стериновые составы близки. Ранее стерины губок этого рода не изучались.

1.11. Стерины Erylus formosus (отряд Astrophorida, сем-во Geodiidae)

Идентифицировано 13 С2б-С30-стеринов: 95,0% Д5-стеринов и 2,6% станолов. Основные компоненты фукостерин (А21) и 24-метиленхолестерин (А10). По литературным данным стериновый состав другой Е. formosus подобен изученному нами.

1.12. Стерины Melophlus sarasinorunt (отряд Astrophorida, сем-во Ancorinidae)

Идентифицировано 9 С27-С29-стеринов: Д5-стеринов 98,2% и станолов 1,8%. Основной Компонент 24-метиленхолестерин (А10). В ранее изученном сборе Asteropus (=Melophlus) sarasinorum также доминируют Д5-соединения.

1.13. Стерины Agelas mauritiana (отряд Agelasida, сем-во Agelasiidae)

Идентифицирован 21 С27-С29-стерип: станолов 42,2%, Д7-стеринов 34,0% и Д5-

стеринов 2,2%. Основные холестанол (В4) и 22,23-дигидрохондрилластерин (C19s). Для рода Agelas характерно то, что в стериновой сумме преобладают станолы и Д7-соединения, а Д5-стерины находятся в небольших количествах, либо отсутствуют.

1.14. Стерины Danvinella australiensis (отряд Dcndroceratida, сем-во

Darwineilidae)

Идентифицировано 23 С27-С29-стероидных спирта, включая 39,7% Д7-, 32,8% Д5-, 10,5% Д5'7-стеринов и станолы в следовых количествах. Не идентифицировано 11,9% стеринов с тремя двойными связями в стероидном ядре. Основной компонент латостерин (С4). Стериновый состав D. australiensis отличается от состава ранее изученных сумм стеринов из губок D. oxeata и D. gardinerí, но по качественному набору стеринов D. oxeata напоминает изученную нами губку.

D. australiensis имеет низкое содержание свободных стеринов - 0,10% от сухого веса. Это, возможно, связано с функционированием в ее организме, как и в других Dendroceratida, альтернативных путей биосинтеза изопреноидов: в D. australiensis были обнаружены сестертерпеноиды ( 1,48% от сухого веса губки).

1.15. Стерины Scalarispongia sp. (отряд Dictyoceratida, сем-во Thorectidae)

Идентифицировано 7 С26-С29-стеринов: 94% Д5-стеринов и 6% станолов. Основной холестерин (А4). Возможно, необычно низкое содержание свободных стеринов в S. sp. (==0,004% от сухого веса губки) связано с их окислительной трансформацией в полигидроксилированные стероиды (0,01% от сухого веса). Ранее стерины губок рода Scalarispongia не изучались.

1.16. Стерины губки Phakellia elegans (отряд Halichondrida, сем-во Axinellidae)

Идентифицировано 23 С26-С30-стероидных спирта, преимущественно Д5-

стерина. Станолы присутствуют в следовых количествах. Основные компоненты

фракции 248-метилхолеста-5,22Е-диен-ЗР-ол (A8s) и 24Я-мегилхолеста-5,22Е-

диен-ЗР-ол (A8R). В ранее изученной P. sp., как ив Р elegans, были найдены

стерины только Д5-типа, но не обнаружены стерины с редкими боковыми цепями

А5, А6, А9, All, А16, А18, А22, А24.

1.17. Стерины губки Teichaxinella labiríntica (отряд Halichondrida, сем-во

Axinellidae)

Идентифицировано И С2б-С29-А-нор-стероидных спиртов и 14 обычных С27-

•С29-стеринов. Содержание А-нор-стеринов 96,5%, а Д5-стеринов - 3,5%. Основной

ЗР-гидроксиметил-24^-метил-А-нор-5а-холест-22Е-ен (G8). Губка Т. labiríntica по

стериновому составу близка к ранее изученной Т. morchella. Большинство губок,

имеющих стерины с модифицированным кольцом А, принадлежит к Axinellidae.

1.18. Стерины неидентифицированной губки сем-ва Axinellidae (отряд

Halichondrida)

Обнаружено 11 С26-С29-стеринов: станолов - 95,7%, Д5-стеринов - 3,88%, Д7-стеринов - 0,38%. Основной холестанол (В4). Хотя преобладание станолов среди стероидных спиртов характерно для ряда губок Axinellidae, из данных по стеринам это семейство представляет собой крайне разнородную группу.

1.19. Стерины Didiscus aceratas (отряд Halichondrida, сем-во Desmoxyidae) Идентифицирован 21 С26-С3о-стерин. Д5-Стеринов 97%, в том числе

клионастерина (A19s) 60,4%. Станолы присутствуют в минорных количествах. В литературе не обнаружено данных, касающихся стеринов губок рода Didiscus.

1.20. Стерины Topsentia sp. (отряд Halichondrida, сем-во Halichondriidae) Обнаружено 11, а идентифицировано 6 С2(,-С\гстеринов. Преобладают Д5'7-

соединения (61,5%). Д5-Стеринов - 6,3%, Д7-стеринов - 4,7%. Не

идентифицировано 24,5% стеринов, главным образом, с триеновыми стероидными ядрами. Основным компонентом фракции является эргостерин (D8). По набору стеринов T. sp. отличается от ранее исследованной T. ophiraphidites. Кроме того, в полициклических ядрах изученных ранее разнообразных стероидов Topsentia также не обнаруживали диеновых или триеновых систем.

1.21. Стерины Axynissa aplysinoides (отряд Halichondrida, сем-во Halichondriidae)

Обнаружено 19, идентифицировано 14 С2б-Сзо-стеринов, в основном Д5'7-соединений (68,8%). Д\ Д7-Стерины и станолы присутствуют в следовых количествах, 27,5% три-, тетра- и пентаненасыщенных стероидных спиртов идентифицировать не удалось. Преобладает 2411-метилхолеста-5,7,22Е,25-тетраен-зр-ол (D9R). Сведений о стеринах рода Axynissa мы не нашли в литературе. В то же время из губки Axynissa sp. ранее было выделено 5,8-эпидиокси-производное (перекись) стерина D9R, обнаруженное нами ив A. aplysinoides.

1.22. Стерины неидеитифицированиой известковой губки (класс Calcarea)

Идентифицировано 17 С2б-Сз0-стеринов, включая Д5-стерины (85,3%), станолы (6,9%) и Д7-стерины (0,13%). Доминирует холестерин (A4). Литературные данные также свидетельствуют о том, что известковые губки содержат в основном Д5-стерины и холестерин в качестве основного стеринового компонента.

1.23. Некоторые заключения из сравнительного анализа стеринов изученных

губок

Фракции стероидных спиртов более половины исследованных нами беспозвоночных содержат, в основном, Д^-стерины. Менее характерно для губок высокое содержание станолов, как в стериновых суммах из Amphimedon spp. 1 и 2, Haliclona spp. 1 и 2, Agelas mauritiana, Xestospongia sp., неидентифицированной губки семейства Axinellidae, Oceanapia spp. 1, 3, 5, Oceanapia toxophila. Только три губки (Darwinella australiens is, Agelas mauritiana и Monanchora clathrata) имеют значительные количества Д7-стеринов. Также нехарактерно для Porifera преобладание в стериновых композициях Д5,7-компонентов, как в Axynissa aplysinoides и Topsentia sp. Из Teichaxinella labirintica выделены редкие А-нор-станолы.

При сравнении состава из)ченны\ стериновых композиций губок с составом стериновых сумм таксономически близких видов (литературные данные) отмечены

случаи как существенных различий, так и соответствий. Что касается последнего, то по типам ненасыщенности и структурным особенностям компонентов стериновые смеси из представителей Xestospongia, Haliclona, Callyspongia, Amphimedon, Oceanapia, Teichaxinella, Lissodendoryx, Monanchora, Erylus, Melophlus, Agelas и Calcarea близки к стериновым суммам ранее изученных губок тех же таксонов (в основном родов и семейств). Некоторые из обнаруженных нами редких стеринов (Е4, Е8, Е14, F8, F13, А5, А6, All, А18) присутствуют в губках, далеких друг от друга в таксономическом отношении, а другие характерны для губок определенных таксонов: А29 - для рода Xestospongia, А12 - для рода Oceanapia (Rhízochalina), А16, А9, D9 - для семейств Axinellidae и Halichondriidae. Таким образом, отдельные комбинации стеринов определенных структурных типов, очевидно, могут характеризовать некоторые роды и семейства Porifera.

2. Токсины, сопутствующие изученным стеринам 2.1. Гемолитическая активность этанольных экстрактов исследованных

губок

Исследована гемолитическая активность этанольных экстрактов тридцати образцов губок из тридцати пяти, выбранных для установления стеринового состава. Из экстрактов губок, обладавших наибольшей активностью, были выделены и изучены гемолитики и цитотоксины различной химической природы.

2.2. Свободные жирные кислоты из Amphimedon sp. 1

Фракция свободных жирных кислот была выделена из этанольного экстракта

губки A. sp. 1 с помощью хроматографии на силикагеле. Методом хромато-масс-спектрометрии в виде пирролидидов идентифицировано 17 жирных кислот. Во фракции присутствуют две основные демоспонгиевые кислоты - 29:3 (21,87%) и 30:3 (23,07%), но показано, что высокая гемолитическая активность (2 мкг/мл) спиртового экстракта губки A. sp. 1 обусловлена в основном распространенными насыщенными и ненасыщенными более короткими жирными кислотами.

2.3. Сестертерпеноиды из губки Darwinella australiensis

Новые халисульфаты 8 (28), 9 (29), 10 (30) и несульфатированное соединение 31 выделены из этанольного экстракта D amtraliensis с использованием гель-фильтрации, многократной колоночной хроматографии на Si02 и ВЭЖХ на обращенной фазе. Строение и относительная конфигурация терпеноидов были

установлены с помощью HRFABMS, МС прямого ввода, ИК- и УФ-спектроскопии, СК ЯМР пС, 'Н, включая эксперименты DEPT, COSY, NOESY, TOCSY, HSQC, НМВС, спин-декаплинг. Все соединения относятся к редкой группе сестертерпеноидов с Д|(10'-декалиновым фрагментом, имеют в структуре фурановый фрагмент или его окисленные варианты.

Согласно данным НЯРАВМв и СК ЯМР 13С для соединения 28 была предложена молекулярная формула С25Н370б8Ыа. В |3С ЯМР-спектре имелись сигналы карбонильного углерода при 8 203,3, три- и тетразамещенных олефиновых углеродов при 5 122,0 и 178,3 соответственно. В дополнение к этому в ИК-спектре присутствовала полоса поглощения при утах 1660 см'1, что в совокупности указывало на наличие в соединении 28 нового для халисульфатов элемента структуры бициклического фрагмента - а,Р-ненасыщенного кетона. Сигналы четырех олефиновых углеродов при 8С 143,9 (СН-19), 140,1 (СН-25), 126,3 (С-17), 111,9 (СН-18) и протонов при 5Н 6,30 (уш. е., СН-18), 7,26 (уш. е., СН-25), 7,37 (д.д., .1=2,0; 1,5 Гц, СН-19) соответствовали сигналам 3-алкилфуранового фрагмента. В ИК-спектре соединения также присутствовали интенсивные полосы поглощения при 1260 и 1220 см"1, характерные для сульфатной группы. НМВС-Корреляции сигналов протонов гидроксиметиленовой группы при 5Н 3,98 (д.д., 1=9,3; 4,9 Гц) и 3,89 (д.д., 1=9,3; 5,9 Гц) с сигналами при 8С 39,7 (СН-13), 32,3 (СН2-14) и 26,5 (СН2-

12) указывали на локализацию сульфата при С-24 боковой цепи. Наличие циклогексенонового кольца, конденсированного с циклогексановым, фуранового фрагмента, положения четырех метальных заместителей, а также связь между фурановой и бициклической системами через углеводородную цепь были определены с помощью экспериментов COSY, TOCSY, HSQC, НМВС.

Относительная стереохимия 5R*, 8S*, 9S* асимметрических центров в бициклической системе халисульфата 8 (28) установлена методами ROESY, 1DNOE (рис. 1) и спин-декаплинга. Последний эксперимент подтвердил трансориентацию метальных групп СН3-

Рис. 1. Ключевые ИОЕ-корреляции для соответствующий аксиальному Н-бициклического фрагмента соединения 28 ^

Два других сульфатированных сестертерпеноида 29 и 30 отличались от ранее известных халисульфатов в первую очередь наличием вместо алкилфуранового кольца его окисленных вариантов. Так, исходя из данных НИРАВМЗ и СК ЯМР 13С, для соединения 29 полярной фракции была предложена молекулярная формула С2чН3дОб5Ыа. В его 13С ЯМР-спектре по сравнению со спектром 28 изменились положения сигналов фуранового фрагмента: они находились при 8 177,2 (С-19), 174,6 (С-17), 115,4 (СН-18) и 75,0 (СНГ25). Соответствующие различия наблюдали и в спектре 'Н ЯМР, в котором появились новые сигналы при 5 5,89 (1Н, т., .1=1,5 Гц) и 4,90 (2Н, уш. е.). Спектр НМВС содержал кросс-пики между сигналами при 8С 174,6 (С-17), 115,4 (СН-18) и 75,0 (СНГ25) и триплетом аллильного Н-16 при 8Н 2,48 Сигнал при 8С 177,2 (С-19) коррелировал с сигналами протонов при 8Н 5,89 и 4,90. Кроме того, в ИК-спектре наблюдали полосу поглощения при 1740 см'1. Эти данные указывали на присутствие в халисульфате 9 (29) фрагмента а,|3-ненасыщенного у-лактона.

Согласно данным НКРАВМЯ и СК |3С ЯМР сульфатированному сестертерпеноиду 30 соответствует молекулярная формула С25Н;(>068Ыа. В спектрах ЯМР 'Н и ,3С соединений 29 и 30 имелись различия в области сигналов у-

22 и СН3-23: при облучении протонов СН3-22 мультиплет Н-8 (8Н 1,38) трансформировался в дублет дублетов (J=12,7; 3,9 Гц),

лактонного кольца. Появился добавочный сигнал метоксильной группы: 8Н 3,52 (ЗН, е.), 8С 56,8 (СН3). Полоса поглощения карбонильной группы в ИК-спектре находилась при 1770 см"1. В спектре НМВС из сигналов четырех углеродов лактонного кольца сигналы трех при 5С 173,6 (С), 144,8 (СН) и 134,0 (С) коррелировали с сигналом соседних протонов при С-16 (5Н 2,28). Сигнал при 8С 104,4 (СН) давал кросс-пики с сигналами олефинового и метоксильного протонов соответственно при 8Н 7,01 и 3,52. В совокупности с результатами эксперимента COSY эти данные позволили сделать вывод о том, что в халисульфате 10 (30) карбонильная группа находится при С-25 а,р-ненасыщенного метокси-у-лактонного фрагмента.

Последний сестертерпеноид, выделенный из D. australiensis, менее полярен, чем халисульфаты 8-10. По данным МС прямого ввода и СК ЯМР |3С ему соответствует формула С25Н40О2. С помощью DEPT, COSY, HSQC и НМВС было показано, что это соединение имеет такой же декалиновый фрагмент, как сестертерпеноиды 29 и 30, и фурановый фрагмент, как в 28. Однако к С-24 присоединена гидроксильная, а не сульфатная группа: сигналы Н-24 и С-24 смещены в более сильное поле - 8ц 3,51 (2Н, м.), 8С 66,2 (СН2). В дополнение к этому в ИК-спектре присутствует широкая полоса поглощения при 3620 см"1.

Из этой же губки, D auitralieniis, нашими коллегами был ранее выделен известный халисульфат 7. Халисульфаты 7 и 10 (30) показали высокую гемолитическую активность (ГКюо 10 и 5 мкг/мл, соответственно), а соединение 31 (нативное десульфатированное производное халисульфата 7) было неактивным. Соединения 30, 31 и халисульфат 7 были цитотоксичны для развивающихся эмбрионов морского ежа Strong)'locentrotus intermedins (ЭД50 35, 80 и 15 мкг/мл соответственно). Вероятно, за гемолитические свойства экстракта губки D. australiensis ответственны сульфатированные сестертерпеноиды.

3.4. Тритерпеновые гликозиды из губки Melophlus sarasinorum

Пять тритерпеновых олигогликозидов 32-36 (35 и 36 новые) выделены из этанольного экстракта австралийской губки М sarasinorum с использованием гель-фильтрации, колоночной хроматографии на Si02 и ВЭЖХ на обращенной фазе. Все обнаруженные соединения - компоненты фракции сарасинозидов А (одно пятно при ТСХ на силикагеле). Сарасинозиды А, (32), А2 (33) и А3 (34)

идентифицировали сравнением данных СК ЯМР *Н, 13С, УФ, MALDI-TOF, [a]D с литературными характеристиками.

«..Ж,

29 28

32

(сарасинозид А,)

33

(сарасинозид кг)

34

(сарасинозид А з)

На основании анализа МА1ЛЭ1-ТОР и |3С ЯМР-спектров сделан вывод, что одному из неизвестных сарасинозидов 35 соответствует молекулярная формула С62Н98Ы2027- На присутствие енолового эфира (8,9-оксидофрагмента) в агликоне гликозида указывали значения ХС сигналов протонов двойных связей в слабом поле при 8ц 4,62 (м., Н-7) и 4,91 (д.д., ^5,5; 8,5 Гц, Н-11) и сигналов олефиновых углеродов при 8С 109,4 (СН-7), 107,4 (СН-11), 156,0 (С-8) и 169,2 (С-9). Характерный низкопольный сдвиг дублета дублетов Н-5 (5н 2,67, 1=2,5; 12,6 Гц)

свидетельствовал о том, что эфирный кислород и Н-5 находятся по одну сторону от плоскости тетрациклической системы. СОБУ-Спектр обнаружил присутствие спиновых систем СН(5)-СН2(6)-СН(7) и СН(11)-СН2(12). На рис. 2

Рис. 2. НМВС-корреляции для агликона соединения 35

показаны ключевые НМВС-корреляции для агликона сарасинозида 35 (Я -углеводная цепь). Значения 5Н ангулярных метальных групп СН3-18 и СН3-19 в |3С ЯМР-спектре, а также вицинальных КССВ Н-3, Н-5, Н-14 и данные КОЕ ЗУ-спектра (рис. 3) свидетельствовали о том, что агликон 35 имеет такую же относительную конфигурацию, что и агликоны других сарасинозидов.

Рис. 3. Ключевые NOESY-корреляции для агликона соединения 35.

Соединение 35 содержит пять моносахаридных остатков, идентификация каждого из которых была проведена на основании данных спектров ЯМР 'Н и |3С, включая DEPT, COSY, HSQC, НМВС. Значения КССВ аномерных протонов (7,58,5 Гц), 8С сигналов аномерных С-Г - С-Г" (102,5-107,4 м.д.) и С-5" - С-5.....(=78-79

м.д.) свидетельствовали о том, что все моносахаридные остатки были связаны р-гликозидными связями. Последовательность их в углеводной цепи установлена с помощью экспериментов НМВС. Так как ранее известные сарасинозиды имели остатки Сахаров только D-ряда, то моносахаридным остаткам нового сарасинозида также приписана D-конфигурация. Таким образом была установлена структура Зр-0-[Р-0-глюкопиранозил-( 1 —>2)-р-0-глюкопиранозил-( 1 —»6)-P-D-N-aueran-2-амино-глюкопиранозил-( 1 —>2)-р-0-ксилопиранозил-(4—> 1 )-р-0-М-ацетил-2-амино-галактопиранозил]-30-нор-8а,9а-оксидо-8,9-сек'о-ланоста-7,9( 11 ),24-триен-23-она (35), являющегося первым морским гликозидом, имеющим редкий сега-агликон.

Менее гидрофобный новый гликозид 36 тоже имеет молекулярную формулу C62H98N2027. К его агликону присоединена такая же олигосахаридная цепь, как у всех сарасинозидов типа А. Из данных спектров 'Н, |3С ЯМР, включая DEPT, HSQC, COSY, НМВС (рис. 5), следовало, что в агликоне присутствует Д8<|4|-15-кето-фрагмент: кроме сигналов, соответствующих еноновому фрагменту боковой цепи, в |3С ЯМР-спектре наблюдали сигналы при 8 208,3 карбонильного углерода (С-15) и двух тетразамещенных олефиновых углеродов при 5 139,4 (С-14) и 152,2

(С-8). СОБУ-Корреляции выявили спиновые системы СН(5)-СН2(6)-СН2(7), СН(9)-СН2(11)-СН2(12) и СН2(16)-СН(17). В УФ-спектре гликозида имелась полоса с Х.,пах при 248 нм, вероятно, образовавшаяся из-за суммирования полос с близкими максимумами поглощения, принадлежащих еноновым хромофорам боковой цепи и циклической системы. Значения 5С сигналов СНГ18. СН3-19 и вицинальных КССВ Н-3, Н-5, Н-9, Н-17 свидетельствовали о том, что агликон гликозида 36 обладает той же относительной конфигурацией, что и агликоны известных сарасинозидов. Таким образом, данное соединение имеет структуру Зр-0-[Р-В-глюкопиранозил-(1—*2)-Р-0-глюкопиранозил-( 1 —>6)-Р-0-!Ч-ацетил-2-амино-глюкопиранозил-( 1 — ксилопиранозил-(4—>1)-Р-В-Ы-ацетил-2-амино-галактопиранозил]-30-нор-ланоста-8(14),24-диен-15,23-диона (36). Интересной характеристикой этой структуры является большая разница ХС сигналов двух протонов при С-7 (8н 1,58 и 4,11), что, вероятно, является результатом влияния на один из Н-7 анизотропии магнитной восприимчивости связи >С=0 енонового фрагмента в полициклической системе. Общая фракция сарасинозидов имела высокое значение ГКюо 2 мкг/мл.

2.5. 2,3-Секо-стероидные кислоты из губки НаНЫопа «р. 5 Из этанольного экстракта антарктической губки Н. ер. 5 с помощью

колоночной хроматографии на силикагеле была выделена сумма неизвестных ранее 2,3-ст>-стероидных кислот, для которых предложены структуры (37-42).

Анализ отдельных компонентов проведен без разделения общей фракции из-за ее недостаточного количества. ЯМР-Спектры суммы содержали сигналы общего

Рис. 5. Ключевые

НМВС-корреляции

для агликона соединения 36

для всех компонентов фракции стероидного ядра. Так, в 'Н ЯМР-спектре наблюдали синглетные сигналы ангулярных метильных фупп СН3-18 (0,69 и 0,70 м.д., два сигнала свидетельствовали о присутствии разных боковых цепей основных соединений) и СН3-19 (1,21 м.д.), а также сигналы при 8 2,57 (д., J=15,2 Гц, Н-1а), 3,55 (д., J=15,2 Гц, Н-16), 6,89 (узк. м„ Н-6), 1,35 (т., J=7,2 Гц, СН3-2'), 4,30 (д.д., J=l,9; 7,2 Гц, СН2-1а'), 4,35 (д.д„ J=l,9; 7,2 Гц, СН2-1б'). После метилирования смеси появился синглет СН30-группы (3,58 м.д., СН3-1"). В |3С ЯМР-спектре фракции присутствовали сигналы углеродов стероидного ядра при 8 172,0 (С-2), 188,8 (С-4), 164,7 (С-3), 150,2 (СН-6), 141,1 (С-5), 61,8 (СН2-Г), 51,5 (СН3-1"), 21,8 (СН3-19), 14,2 (СН3-2'), 12,0 (СН3-18) и другие. Данные экспериментов HSQC, COSY и НМВС позволили выявить фрагмент структуры, показанный на рис. 6. В УФ-спектре суммы стероидов присутствовала полоса

спектров метиловых эфиров соединений 37-42 приведены в таблице 1. Масс-спектр каждого компонента имел малоинтенсивный пик М+ с m/z, большей на 104 единицы значения m/z М+ соответствующих Д4-3-кетостероидов, выделенных нами из этой же губки. Последовательность выхода с колонки при ГЖХ-анализе метиловых эфиров обнаруженных кислот совпадала с последовательностью элюирования соответствующих Д4-3-кетостероидов.

Интенсивный пик в масс-спектрах метиловых эфиров соединений 37, 38 и 40 при m/z 261 указывал на наличие в стероидах 22(23)-двойной связи. В масс-спектре метилового эфира секо-стероида 41 наблюдали пик при m/z 343 (сигнал аллильного разрыва в 24(28)-ненасыщенной боковой цепи), а в 'Н ЯМР-спектре - сигналы

R

поглощения енонового фрагмента с Я,„ах при 239 нм. В ИК-спектре наблюдали полосу поглощения соответствующей карбонильной группы при 1675 см"1, а также интенсивную полосу при 1731 см"1 (vCo сложноэфирных групп). ГЖХ-МС-Анализ метиловых эфиров компонентов фракции показал наличие в смеси шести основных соединений с однотипной фрагментацией. Основные данные масс-

протонов 24-экзо-метиленовой боковой цепи данного соединения в при § 4,66 и 4,72 (два уш.с, СНГ28), 1,02 (д., 3=6,8 Гц, СН3-26) и 1,03 (д., Л=6,8 Гц, СН3-27).

Таблица 1. Характеристичные пики в масс-спектрах метиловых эфиров 2,3-секо-стероидн ых кислот

Метиловый эфир соединения Характеристичные сигналы в масс-спектрах, m/z

37 472 (М+), 441 (М+- СН30), 399 (М+- СООСН2СН3 или М+-СН2СООСН3, 100%), 357 (М+- СООСН2СН3 -42), 261 (М+-СН2СООСН3 - 42 - боковая цепь, 33%)

38 486 (М+), 455 (М+- СН30), 413 (М+- СН2СООСН3, 100%), 371 (М+-СН2СООСН3 - 42), 261 (М+- СН2СООСН3 - 42 - боковая цепь, 38%)

39 488 (М+), 457 (М+- СН30), 415 (М+- СН2СООСН3, 100%), 373 (М+-СН2СООСН3 - 42), 261 (3%), 247

40 500 (М+), 469 (М+- СНэО), 427 (М+- СН2СООСН3, 100%), 385 (М+-СН2СООСН3 - 42), 261 (М+- СН2СООСН3 - 42 - боковая цепь, 38%)

41 500 (М+), 469 (М+- СНэО), 427 (М+- СН2СООСН3, 100%), 385 (М+-СН2СООСН3 - 42), 343 (М+- СН2СООСН3 - 84), 261 (3%)

42 516 (М+), 485 (М+- СН30), 443 (М+- СН2СООСН3, 100%), 401 (М+-СН2СООСН3 - 42), 261 (2%)

Выделенные моноэтиловые эфиры дикарбоновых кислот 37-42 являются, по-видимому, артефактными продуктами, образовавшимися при реакции с ЕЮН. Эта фракция показала гемолитическую активность с ГКюо 1,5 мкг/мл.

2.6. Дитерпеноиды с 9-метиладениновмм фрагментом и бромсодержаший алкалоид из губки Agelas mauritiana

Из этанольного экстракта австралийской губки А. mauritiana с помощью колоночной хроматографии на силикагеле и кристаллизации была выделена и идентифицирована методами СК ЯМР |3С, 'Н, МС прямого он ввода известная 4-бром-пиррол-2-карбоновая кислота (43), обнаруженная ранее в губке A. dispar. Соединение 43 имеет ГКюо 100 мкг/мл. Вероятно, за гемолитическую активность этанольного экстракта губки (ГКюо 30 мкг/мл) в основном отвечает смесь двух изомерных пуринотерпеноидов -агелазина В и эпиагелазина С (ГКюо Ю мкг/мл), полученная после градиентной колоночной хроматографии на силикагеле, а также ВЭЖХ на обращенной фазе. Данных 'Н, |3С ЯМР-спектров, экспериментов НМВС, DEPT и МС прямого ввода

оказалось достаточно, чтобы идентифицировать их без предварительного разделения. Агелазин В (44) был выделен ранее из губки А. ер., а эпиагелазин С (45) - из губки А таигШапа

NH,

Г Г '

ш

W

сг

СН,

44 * * 45

2.7. Производное сесквитерпеноида из губки Axynissa aplysinoides

Из этанольного экстракта австралийской губки А. aplysinoides после колоночной хроматографии на силикагеле и кристаллизации выделена известная N,N'-бис[(6К,78)-7,8-дигидро-а-бисаболен-7-ил]мочевина (46). Идентификация проведена с помощью СК ЯМР 'Н, |3С, включая эксперименты DEPT, HSQC, НМВС, COSY, а также сравнением масс-спектров и [a]D с соответствующими данными, приведенной в литературе 46 для соединения 46 из губки Halichondria sp. Установлено, что 46 обладает цитотоксическими (ЕДзо 17 мкг/мл) и гемолитическими свойствами (ГК50 50 мкг/мл). Экстракт губки A aplysinoides показал умеренную гемолитическую активность с ГКюо 30 мкг/мл. Возможно, в нем присутствовали другие, более активные, лабильные азотсодержащие производные бисаболенов. 3.10. Полициклический гуанидиновый алкалоид из губки Monanchora

clathrata

С помощью гель-фильтрации, колоночной хроматографии на силикагеле и ВЭЖХ на обращенной фазе из австралийской губки М. clathrata выделен полициклический гуанидиновый алкалоид крамбесцидин 359 (47). Идентификацию провели с помощью методов СК ЯМР 'Н и |3С, включая DEPT, HSQC, НМВС, COSY, NOESY. Соединение 47 было выделено прежде из губки М

Сх;

ОГ>Ч

unguiculata. Крамбесцидин 359 не вызывает гемолиза, но цитотоксичен по отношению к мышиным опухолевым клеткам карциномы Эрлиха с ИК50 20 мкг/мл.

2.11. Результаты параллельного исследования разных групп вторичных

метаболитов губок

Из губки Amphimedon sp. 1 выделена сумма жирных кислот, обладающих гемолитическими свойствами. Не исключено, что эти жирные кислоты являются продуктами гидролиза фосфолипидов мембран, который, возможно, имел место при экстракции и хранении губки. Поэтому их присутствие может быть не связано со структурными изменениями в мембранах, в частности в составе стеринов.

Из Darwinella australiensis были выделены сестертерпеноиды, выработка которых, вероятно, вызвала «количественный» метаболический сдвиг в сторону уменьшения биосинтеза свободных стеринов этого беспозвоночного (содержание терпеноидов 1,48%, а свободных стеринов 0,10% от сухого веса). Губка содержит в основном Д7- и Д5-стерины с преобладанием Д7-компонентов.

Из губок Melophlus sarasinorum и Erylus formosus были выделены суммы тритерпеновых гликозидов (из Е. formosus - сотрудниками по лаборатории). Стериновые фракции этих двух губок содержат распространенные стерины и близки по составу. Похожий набор стеринов имеет также губка Geodinella robusta, которая не содержит гликозиды и принадлежит к тому же семейству, что и Е. formosus. Очевидно, литическое воздействие своих гликозидов на мембраны клеток губок блокируется иным путем, чем в голотуриях и морских звездах, то есть без значительной структурной перестройки стериновых компонентов мембран.

В губке Haliclona sp. 5 обнаружен только холестерин в следовых количествах. Из ее экстракта выделены стероидные кетоны, эфиры обычных Д5-стеринов, а также гемолитики - 2,3-секо-стероидные кислоты. Возможно, в губке протекают интенсивные реакции окисления стеринов, результатом чего стало практически полное отсутствие последних соединений. Так что наличие окисленных стероидов может быть следствием необычности стеринового состава.

Из губки Agelas mauritiana выделены гемолитики агелазины и стериновая фракция, состоящая в основном из станолов и Д7-стеринов. Аналогичные стериновые композиции из других изученных нами губок выделены не были. Как стерины, так и агелазины из A mauritiana характерны для губок данного рода.

Вторичные метаболиты, выделенные из губки Осеапщпа Бр. 1, включают сумму стеринов, состоящую практически только из станолов (основной компонент редкий циклопропансодержащий стерин В12), и гемолитик липидной природы ризохалин (выделен сотрудниками лаборатории). Из семи исследованных образцов губок рода Осеапар/а только в одном был обнаружен необычный стерин В12, и только из него был выделен чрезвычайно редкий ризохалин.

Из вторичных метаболитов губки Ахутзза ар!ух1по1с1е$ идентифицированы производное сесквитерпеноида бисаболенового ряда и сумма Д5'7-стеринов. Причинами малого количества стеринов в губке (0,12% от сухого веса) может быть как окисление их до перекисей, так и функционирование конкурентного пути изопреноидного метаболизма («количественный» метаболический сдвиг). Д5-7-Стерины нехарактерны для губок, но, видимо, характерны для представителей рода Ахутээа также, как и азотсодержащие сесквитерпеноиды.

Из губки Мопапскога сШкгаШ выделена стериновая смесь с преобладанием Д7-стеринов и алкалоид крамбесцидин. В этом случае также присутствует значительное изменение стериновой фракции. Обе группы изученных вторичных метаболитов характерны для рода МопапсИога.

Таким образом, пары стерины-токсины в шести из девяти исследованных губок (£>. Н. ер. 5, А. таигШапа, О. ер. 1, А. ар1ухто1с!е$, М. сШИШа)

можно рассматривать в качестве примеров, которые потенциально могли бы иллюстрировать явление биохимической координации. В трех губках из шести нами отмечены низкое содержание стеринов и наличие значительного количества терпеноидов или стероидов, обладающих гемолитическими свойствами. В этих случаях биохимическая связь между двумя группами вторичных метаболитов может реализовываться через влияние друг на друга путей их биосинтеза (конкуренция за предшественник). Пониженное содержание свободных стеринов может являться приспособительным механизмом, обеспечивающим резистентность мембран к литическому воздействию эндотоксинов. Возможно, в некоторых губках функционируют пути модификации стеринов (например, биосинтез Д7-стеринов) для адаптации к присутствию собственных токсинов: три губки из шести содержат значительные количества Д7-стеринов, причем подобные стериновые смеси не были обнаружены нами в экстрактах, не показавших гемолитического эффекта.

Очевидно, что исключительное химическое разнообразие токсинов губок требует различных способов защиты клеточных мембран от их воздействия. Наличие в губках эндотоксинов той или иной природы может либо не отражаться на биосинтезе стеринов, либо вызывать различные изменения в строении стеринов, либо приводить к уменьшению их содержания и замене на другие соединения. Неоднозначность данных способов защиты может вносить свой вклад в беспрецедентное разнообразие стеринов Porifera.

4. ВЫВОДЫ

1. Изучен стериновый состав 35-ти образцов морских губок, принадлежащих (за исключением одной губки класса Calcarea) к 7-ми отрядам, 16-ти семействам, 19-ти родам и 14-ти видам класса Demospongiae. Стерины губок Lissodendoryx behringi, Clathria major, Monanchora clathrala, Geodinella robusta, Darwinella australienses, Phakellia elegam, Axynissa aplysinoides, Teichaxinella labirintica, Didiscus aceratus, Oceanapia toxophila, а также губки рода Scalarispongia изучены впервые. С помощью ГЖХ, ГЖХ-МС и 'Н, ,3С ЯМР-спектроскопии всего идентифицировано 73 стерина, включая большое число редких соединений, и 7 Л4-3-кетостероидов.

2. Показано, что отдельные комбинации стеринов определенных структурных типов могут характеризовать некоторые роды и семейства Porifera.

3. Изучены гемолитики и цитотоксины семи губок, в том числе идентифицированы 17 жирных кислот из губки рода Amphimedon, сарасинозиды А,, А2 и А3 из Melophlus ¡arasinorum, агелазин В, эпиагелазин С и 4-бром-пиррол-2-карбоновая кислота из Agelas mauritiana, N,N'-6nc-[(6R,7S)-7,8-flviriiflpo-a-6nca6o.neH-7-wi]-мочевина из Axynissa aplysinoides, крамбесцидин 359 из Monanchora clathrata.

4. Установлены структуры четырех новых сестертерпеноидов из губки Darwinella australiensis - халисульфатов 8, 9, 10 и десульфатированного производного халисульфата 7.

5. Установлены структуры двух новых тритерпеновых гликозидов из губки Melophlus sarasinorum: ЗР-0-[|3-0-глюкопиранозил-( 1 —>2)-р-0-глгокопираночил-(1 —>6)-Р-0-Ы-ацетил-2-амино-глюкопиранозил-(1 —>2)-Р-В-ксилопиранозил-(4—► 1 )-Р-0-Ы-ацетил-2-амнно-галактопиранозил]-30-нор-8а,9а-оксидо-8,9-секо-ланоста-7,9(11),24-триен-23-она и ЗР-0-[Р-В-глюкопиранозил-(1—>2)-р-В-глюкопиранозил-(1 —>6)-Р-0-Ы-ацетил-2-амино-глюкопиранозил-( 1 —►2)-Р-0-ксилопиранозил-(4—»1)-

р-0-^ацетил-2-амино-галактопиранозил]-30-нор-ланоста-8(14),24-диен-15,23-диона.

6. Установлено строение шести новых 2,3-секо-стероидных кислот из губки рода Haliclona, относящихся к неизвестной ранее группе природных окисленных стероидов.

7. На основании полученных данных выдвинуты следующие предположения о взаимосвязи между присутствием разных групп вторичных метаболитов в губках: 1) интенсификация в организмах некоторых губок конкурентных путей биосинтеза терпеноидов или стероидов может вызывать количественный метаболический сдвиг в биосинтезе свободных стеринов, что проявляется в низком содержании последних; 2) высокое содержание Д7-стеринов, а также уменьшение количества свободных стеринов у ряда губок являются приспособительными механизмами защиты от собственных токсинов; 3) в отличие от токсичных голотурий и морских звезд, у губок, продуцентов тритерпеновых гликозидов, литическое воздействие этих соединений на мембраны клеток блокируется с помощью защитного механизма, который не связан со значительными структурными изменениями стеринов.

Основные публикации по теме диссертации

1. Makarieva T.N., Santalova Е.А., Gorshkova I.A., Dmitrenok A.S., Guzii A.G., Gorbach V.l., Svetashev V.l., Stonik V.A. A new cytotoxic fatty acid (5Z,9Z)-22-methyl-5,9-tetracosadienoic acid and sterols from the Far Eastern sponge Geodinella robusta II Lipids. 2002. Vol. 37, № 1. P. 75-80.

2. Santalova E.A., Makarieva T.N., Gorshkova I.A., Dmitrenok A.S., Krasokhin V.B., Stonik V.A. Sterols from the Toxic Marine Sponges // Biochem. Syst. Ecol. 2004. Vol. 32, №2. P. 153-167.

3. Makarieva T.N., Rho J.-R., Lee H.-S., Santalova E.A., Stonik V.A., Shin J. New sesterterpene sulfates from the sponge Darwinella australiensis H J. Nat. Prod. 2003. Vol. 66, №7. P. 1010-1012.

4. Санталова E.A., Макарьева Т.Н., Гузий А.Г., Горшкова И.А., Стоник В.А. Стерины токсичных морских губок // Химия и химическое образование: II Междунар. симп , 26-30 сент. 2000 г., Владивосток: [тезисы]. - Владивосток: Изд. ДВГУ, 2000.-260 с.

5. Макарьева Т.Н., Санталова Е.А., Горшкова И.А., Дмитренок A.C., Гузий А.Г., Горбач В.И., Стоник В.А. Выделение и установление строения демоспонгиевых кислот и анализ стериновой фракции дальневосточной губки Geodinella robusta // Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока: научная конференция ТИБОХ ДВО РАН, 2001 г., Владивосток: [тезисы]. - Владивосток: Дальнаука, 2001. - 242 с.

6. Санталова Е.А., Макарьева Т.Н., Дмитренок A.C. Новый сестертерпеноид из губки Darwinella australiensis: выделение, установление химического строения и относительной конфигурации // Фундаментальные исследования морской биоты. Биология, химия и биотехнология: конференция студентов, аспирантов и молодых ученых НОЦ ДВГУ "Морская биота", 1-2 окт. 2002 г., Владивосток: [тезисы]. -Владивосток: Изд. ДВГУ, 2002. - 120 с.

7. Гузий А.Г., Санталова Е.А. 8-Оксоаденин и сгерины из дальневосточной губки Aplysinopsis sp. // Научная конференция студентов и аспирантов ДВГУ, 2001 г., Владивосток: [тезисы]. - Владивосток: Изд. ДВГУ, 2001. - 161 с.

8. Макарьева Т.Н., Санталова Е.А., Гузий А.Г., Стоник В.А. Почему токсичные морские беспозвоночные накапливают необычные стерины? // Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений: Междунар. конференция, 8-11 окт. 2003 г., Алматы: [тезисы]. - Алматы: Казахский национальный университет им. Аль-Фараби, 2003. - 211 с.

9. Санталова Е.А., Макарьева Т.Н., Денисенко В.А., Дмитренок A.C., Красохин В.Б., Стоник В.А. Сравнительный анализ стеринов морских губок // Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии: региональная научная конференция, посвящ. 40-летию ТИБОХ ДВО РАН, 16-18 ноябр. 2004 г., Владивосток: [тезисы]. - Владивосток: ДВО РАН, 2004. - 140 с.

Соискатель

Санталова Е.А.

Санталова Елена Анатольевна

СТРУКТУРНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СТЕРИНОВ И СОПУТСТВУЮЩИХ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ МОРСКИХ ГУБОК

Автореферат

ЗАО «Фартоп» г. Владивосток, ул. Алеутская, 28 Тираж 100 экз. Изготовлено с машинописных листов Отпечатано 16 марта 2005 г.

02,00 РНБ Русский фонд

2005-4 40944

21 MAP 2005 х ^ "

( j! \1г

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. СТЕРИНЫ ГУБОК.

2.1. Литературный обзор.

2.1.1. Общие сведения о стеринах.

2.1.2. Методы исследования стеринов.

2.1.2.1. Хроматографическое выделение и разделение стеринов.

2.1.2.2. Газо-жидкостная хроматография.

2.1.2.3. Масс-спектрометрия.

2.1.2.4. СпектроскопияЯМР 'Н и 13С.

2.1.3. Некоторые литературные данные о губках и их стеринах.

2.2. Обсуаедение результатов.

2.2.1. Выделение фракций свободных стеринов губок и их разделение.

2.2.2. Стерины трех губок рода Xestospongia (отряд Haplosclerida, семейство Petrosiidae).

2.2.3. Стерины и другие стероидные соединения пяти губок рода Haliclona (отряд Haplosclerida, семейство Chalinidae).,.

2.2.4. Стерины Callyspongia sp. (отряд Haplosclerida, семейство Callyspongiidae).

2.2.5. Стерины двух губок рода Amphimedon (отряд Haplosclerida, семейство Niphatidae).

2.2.6. Стерины семи губок рода Oceanapia (отряд Haplosclerida, семейство Phloeodictyidae).

2.2.7. Стерины Lissodendoryx behringi (отряд Poecilosclerida, семейство Coelosphaeridae).

2.2.8. Стерины Clathria major (отряд Poecilosclerida, семейство Microcionidae).

2.2.9. Стерины Monanchora clathrata (отряд Poecilosclerida, семейство Crambeidae).

2.2.10. Стерины двух образцов губки Geodinella robusta (отряд Astrophorida, семейство Geodiidae).

2.2.11. Стерины Erylus formosus (отряд Astrophorida, семейство Geodiidae).

2,2.12. Стерины Melophlus sarasinorum (отряд Astrophorida, семейство

Ancorinidae).

2.2.13. Стерины Agelas mauritiana (отряд Agelasida, семейство Agelasiidae).

2.2.14. Стерины Darwinella australiensis (отряд Dendroceratida, семейство Darwinellidae).

2.2.15. Стерины Scalarispongia sp. (отряд Dictyoceratida, семейство Thorectidae).

2.2.16. Стерины губки Phakellia elegans (отряд Halichondrida, семейство Axinellidae).

2.2.17. Стерины губки Teichaxinella labirintica (отряд Halichondrida, семейство Axinellidae).

2.2.18. Стерины неидентифицированной губки сем. Axinellidae (отряд Halichondrida).

2.2.19. Стерины Didiscus aceratus (отряд Halichondrida, семейство Desmoxyidae).

2.2.20. Стерины Topsentia sp. (отряд Halichondrida, семейство Halichondriidae).

2.2.21. Стерины Axynissa aplysinoides (отряд Halichondrida, семейство Halichondriidae).

2.2.22. Стерины неидентифицированной известковой губки (класс Calcarea).

2.2.23. Некоторые заключения из сравнительного анализа стеринов изученных губок.

2.3. О функциях стеринов губок.

3. ТОКСИНЫ, СОПУТСТВУЮЩИЕ ИЗУЧЕННЫМ СТЕРИНАМ.

3.1. Гемолитическая активность спиртовых экстрактов исследованных губок.

3.2. Свободные жирные кислоты из Amphimedon sp. 1:.

3.3. Сестертерпеноиды из губки Darwinella australiensis.

3.4. Тритерпеновые гликозиды из губки Melophlus sarasinorum.

3.5. Тритерпеновые гликозиды из губки Erylus formosus.

3.6. 2,3-Секо-стероидные кислоты из губки Haliclona sp. 5.

3.7. Дитерпеноиды с 9-метиладениновым фрагментом и бромсодержащий алкалоид из губки Agelas mauritiana.

3.8. Биполярный сфингозиноподобный липид из губки Oceanapia sp. 1.

3.9. Производное сесквитерпеноида из губки Axinyssa aplysinoides.

3.10. Полициклический гуанидиновый алкалоид из губки Monanchora clathrata.

3.11. Результаты параллельного исследования разных групп вторичных метаболитов губок.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

5. ВЫВОДЫ.

Губки (тип Porifera) принадлежат к одной из самых древних групп животных и имеют самый разнообразный набор стеринов среди представителей животного царства. Стерины губок включают как обычные для эукариотических организмов мембранные компоненты (холестерин и его распространенные производные), так и соединения с необычными структурными чертами, функциональная роль которых остается неясной [13]. Исследование функций необычных стеринов морских губок до сих пор является актуальным направлением в изучении этих соединений.

Полученные ранее результаты параллельного изучения цитотоксичных вторичных метаболитов и стериновых фракций из одних и тех же морских беспозвоночных (голотурий, морских звезд, губок) позволили предположить, что, по крайней мере, в ряде случаев замена обычных стеринов на редкие представляет собой механизм защиты мембран токсин-продуцирующих видов от воздействия собственных токсинов. Наличие такой функциональной взаимосвязи («биохимической координации») в голотуриях и морских звездах между Д7-стеринами и станолами, с одной стороны, и токсичными гликозидами, с другой стороны, было обосновано ранее [4]. Была высказана гипотеза, что и в губках наличие разных необычных стеринов может быть связано с присутствием различных сопутствующих мембранолитических токсинов [5, 6].

Мембранотропные вторичные метаболиты губок давно рассматриваются в качестве потенциальных лекарственных средств. Если механизм их цитотоксического воздействия связан со стериновыми составляющими мембран, то изучение стеринов соответствующих продуцентов перспективно с точки зрения создания комбинированных препаратов с пониженной токсичностью.

Данная работа является первым систематическим изучением биохимической координации среди губок. Целью настоящего исследования являлись выделение, установление структуры свободных стеринов и сопутствующих им гемолитиков и цитотоксинов губок, а также выявление некоторых закономерностей совместного присутствия этих двух различных по своим биологическим функциям групп соединений (стеринов и токсинов) в организме животного. В дополнение к этому представляло интерес изучение распределения свободных стеринов в представителях различных таксонов Porifera, что могло дать новую хемотаксономическую информацию.

В данной работе мембранолитическая активность этанольных экстрактов, фракций и индивидуальных соединений была определена на мышиных эритроцитах. Как известно, эритроциты животных имеют высокое содержание холестерина (25-30%) и являются традиционной моделью для изучения функционального состояния мембран. В случае гемолиза визуально наблюдается непосредственный результат действия различных веществ на мембрану эритроцитов.

В качестве объектов исследования были выбраны тридцать пять образцов губок, относящихся, за исключением одной известковой губки (класс Calcarea) к классу Demospongiae. Мы изучили стерины данных беспозвоночных, а также гемолитическую активность этанольных экстрактов большинства губок. Этанольные экстракты из тридцати видов показали различную степень гемолитической активности, вплоть до ее отсутствия. Из экстрактов семи губок, показавших наибольшую активность, нами были выделены гемолитические агенты разной химической природы (жирные кислоты, терпеноиды, гликозиды, стероидные кислоты, алкалоиды).

В диссертации использованы следующие сокращения:

ТСХ — тонкослойная хроматография; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления; ГЖХ - газо-жидкостная хроматография; ОВУ -относительное время удерживания;

СК ЯМР и 13С — спектроскопия ядерного магнитного резонанса на протонах и ядрах углерода; КССВ — константа спин-спинового взаимодействия; ХС — химический сдвиг; DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) - ЯМР-эксперимент с неискаженным усилением сигнала с помощью переноса поляризации с протона на ядро углерода; 1D NOE (Nuclear Overhauser Effect) — одномерный ЯМР-эксперимент ядерного эффекта Оверхаузера; NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера; COSY (Correlation Spectroscopy) - корреляционная спектроскопия; TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) - полная корреляционная спектроскопия; HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) - ЯМР-эксперимент гетероядерной одноквантовой корреляции; НМВС (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation) - ЯМР-эксперимент гетероядерной корреляции через несколько связей;

МС - масс-спектрометрия; HRFABMS (High Resolution Fast Atom Bombardment Mass-spectrometry) — масс-спектрометрия высокого разрешения с ионизацией быстрыми атомами; MALDI-TOF (Matrix Assistant Laser Desorbtion/Ionization Time-of-Flight Mass-spectrometry) - масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией; ГЖХ-МС - хромато-масс-спектрометрия; CAD (Collision Activation Dissociation) - вид масс-спектрометрии с диссоциацией, активированной столкновениями.

Нам представлялось удобным использовать для стероидных соединений часто употребляемую для них нумерацию, при которой стероидные ядра обозначаются буквами, а боковые цепи - цифрами. Таким образом, каждому стерину (стероиду) дается обозначение, состоящее из одной буквы и одной цифры. Например, холестерин будет иметь при этом номер А4. Соединения нестероидного характера пронумерованы обычным способом. Ниже приводятся структуры и буквенные обозначения тетрациклических ядер стероидов (схема 1) и их боковых цепей (схема 2). Среди стероидов, представленных на схемах 1 и 2, присутствуют как соединения, идентифицированные в данной работе, так и те, которые упоминаются при обсуждении результатов.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю Макарьевой Т.Н., а также академику Стонику В.А. за чуткость и всяческую поддержку, к.х.н. Денисенко В.А., к.х.н. Дмитренку А.С, н.с. Дмитренку П.С., Моисеенко О.П., к.б.н. Прокофьевой Н.Г., к.х.н. Пономаренко Л.П. за съемку ЯМР- и масс-спектров, проведение биотестирования и ГЖХ-анализа, за абсолютно бескорыстную помощь в работе, ценные идеи и критические замечания.

Схема 1. Тетрациклические фрагменты стеринов (А-Н), кетостероидов (J), перекисей стеринов (K,L) и их буквенные обозначения

5. ВЫВОДЫ

1. Изучен стериновый состав 35-ти образцов морских губок, принадлежащих (за исключением одной губки класса Calcarea) к 7-ми отрядам, 16-ти семействам, 19-ти родам и 14-ти видам класса Demospongiae. Стерины губок Lissodendoryx behringi, Clathria major, Monanchora clathrata, Geodinella robusta, Darwinella australiensis, Phakellia elegans, Axynissa aplysinoides, Teichaxinella labirintica, Didiscus aceratus, Oceanapia toxophila, a также неидентифицированной губки рода Scalarispongia изучены впервые. С помощью ГЖХ, ГЖХ-МС и 'Н, 13С ЯМР -спектроскопии всего идентифицировано 73 стерина, включая большое число редких соединений, и 7 Д4-3-кетостероидов.

2. Показано, что отдельные комбинации стеринов определенных структурных типов могут характеризовать некоторые роды и семейства Porifera.

3. Изучены гемолитики и цитотоксины семи губок, в том числе идентифицированы 17 свободных жирных кислот из губки рода Amphimedon, сарасинозиды А\, А2 и Аз из Melophlus sarasinorum, агелазин В, эпиагелазин С и 4-бром-пиррол-2-карбоновая кислота из Agelas mauritiana, М,М'-бис-[(611,78)-7,8-дигидро-а-бисаболен-7-ил]-мочевина из Axinyssa aplysinoides, крамбесцидин 359 из Monanchora clathrata.

3. Установлены структуры четырех новых сестертерпеноидов из губки Darwinella australiensis — халисульфатов 8, 9, 10 и нативного десульфатированного производного халисульфата 7.

4. Установлены структуры двух новых тритерпеновых гликозидов из губки Melophlus sarasinorum: Зр-0-[р-Б-глюкопиранозил-(1—»-2)-р-0-глюкопиранозил-(1—»6)-р-В-М-ацетил-2-амино-глюкопиранозил-( 1 —»2)-Р-Б-ксилопиранозил-(4—* 1 )-Р-В-Ы-ацетил-2-амино-галактопиранозил]-30-нор-8а,9а-оксидо-8,9-секо-ланоста-7,9(11),24-триен-23-она и Зр-0-[Р"В-глюкопиранозил-(1->2)-Р-В-глюкопиранозил-(1—>6)-Р-0-М-ацетил-2-амино-глюкопиранозил-( 1 —>2)-Р-0-ксилопиранозил-(4—► 1 )-Р-Б-М-ацетил-2-амино-галактопира-нозил] -3 0-нор-ланоста-8( 14),24-диен-15,23-диона.

5. Установлено строение шести новых 2,3-секо-стероидных кислот из губки рода Haliclona, относящихся к неизвестной ранее группе окисленных стероидов.

6. На основании полученных данных выдвинуты следующие предположения о взаимосвязи между присутствием разных групп вторичных метаболитов в губках:

1) интенсификация в организмах некоторых губок конкурентных путей биосинтеза терпеноидов или стероидов, может вызывать количественный метаболический сдвиг в биосинтезе свободных стеринов, что проявляется в низком содержании последних;

2) высокое содержание Д -стеринов, а также уменьшение количества свободных стеринов у ряда губок являются приспособительными механизмами защиты от собственных токсинов; 3) в отличие от токсичных голотурий и морских звезд, у губок, продуцентов тритерпеновых гликозидов, литическое воздействие этих соединений на мембраны клеток блокируется с помощью защитного механизма, который не связан со значительными структурными изменениями стеринов.

1. Baker В.J., Kerr R.G. Biosynthesis of Marine Sterols in Marine Natural Products Diversity and Biosynthesis // Marine Natural Products Diversity and Biosynthesis / Scheuer, P.J. (Ed.).-Berlin: Springer-Verlag, 1993. Vol. 10. P.l-32.

2. Еляков Г.Б., Стоник B.A. Стероиды морских организмов. М.: Наука, 1988. — 208 с.

3. Djerassi С., Silva C.J. Sponge sterols: origin and biosynthesis // Acc. Chem. Res. 1991. Vol. 24. P. 371-378.

4. Калинин В.И., Левин B.C., Стоник B.A. Химическая морфология: тритерпеновые гликозиды голотурий. Владивосток: Дальнаука, 1994.-284 с.

5. Макарьева Т.Н. Вторичные метаболиты из морских беспозвоночных: структура, свойства. Биохимическая координация: автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук. Владивосток: Дальнаука, 1997. - 51 с.

6. Стоник В.А. Морские полярные стероиды // Успехи химии. 2001. Т. 70, № 8. С. 774-817.

7. Bergquist P.R., Hofheinz W., Oesterhelt G. Sterol composition and the classification of the Demospongiae // Biochem. Syst. Ecol. 1980. Vol. 8. P. 423-435.

8. Idler D.R., Safe L.M. Separation of steryl acetates by silver ion chromotography // Steroids. 1972. Vol. 19. P. 315-318.

9. Heftmann E., Lin T. Steroid analysis by high-perfomance liquid chromatography // J. Liquid Chromatogr. 1982. Vol. 5. P. 121-173.

10. Djerassi C. Recent advances in mass-spectrometry of steroids // Pure and Appl. Chem. 1978. Vol. 50. P. 171-184.

11. Вульфсон H.C., Заикин В.Г. Масс-спектрометрический метод определения положения двойных связей в непредельных стероидах // Успехи химии. 1973. Т. 42, № 8. С. 1379-1414.

12. Rubinstein I., Goad L.J., Clague A.D.H., Mulheirn L.J. The 220 MHz NMR spectra of phytosterols // Phytochemistry. 1976. Vol. 15. P. 195-200.

13. Дмитренок A.C. Применение спектральных методов для структурных исследований некоторых вторичных метаболитов: автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. Владивосток: Дальнаука, 1998. - 23 с.

14. De Simone F., Dini A., Minale L., Riccio R., Zollo F. The sterols of the asteroid Echinaster sepositus И Сотр. Biochem. Physiol. 1980. Vol. 66B. P. 351-357.

15. Itoh Т., Sica D., Djerassi C. Minor and trace sterols in marine invertebrates. Part 35. Isolation and structure elucidation of seventy-four sterols from the sponge Axinella cannabina II J. Chem. Soc. Perkin Trans. Part I. 1983. P. 147-153.

16. Nes W.R., Krevitz K., Behzadan S. Configuration at C-24 of 24-methyl and 24-ethyl-cholesterol in tracheophytes // Lipids. 1976. Vol. 11. P. 118-126.

17. Wright J.L.C., Mclnnes A.G., Shimizu S. et al. Identification of C-24 alkyl epimers of marine sterols by C-13 Nuclear magnetic resonance spectroscopy // Canad. J. Chem. 1978. Vol. 56. P. 1898-1903.в

18. Koizumi N., Fujimoto Y., Takeshita Т., Ikekawa N. Carbon-13 nuclear magnetic resonance of 24-substituted steroids // Chem. and Pharm. Bull. 1979. Vol. 27. P. 38-42.

19. Koizumi N., Morisaki M., Ikekawa N. et al. Absolute configuration of 24-hydroxycholesterol and related compounds // Tetrahedron Lett. 1975. P. 2203-2206. .

20. Itoh Т., Yoshida K., Tamura Т., Matsumoto T. Co-occurrence of C-24 epimeric 24-ethyl-A7-sterols in the roots of Trichosanthes japonica II Phytochemistry. 1982. Vol. 21. P. 727730.

21. Матвеев B.C., ред. Курс зоологии. Т. I. М.:Высшая школа, 1966. - 552 с.

22. Колтун В.М. Четырехлучевые губки северных и дальневосточных морей СССР. -Л.: Наука, 1966.-112 с.

23. De Rosa М., Minale L., Sodano G. Metabolism in Porifera. II. Distribution of sterols // Сотр. Biochem. and Physiol. 1973. Vol. 46B. P. 823-837.

24. Kanasawa A., Teshima S., Hyodo S. Sterols of the sponges (Porifera, Demospongiae) // Сотр. Biochem. and Physiol. 1979. Vol. 62B. P. 521-525.

25. Bergquist P.R., Lavis A., Cambie R.C. Sterol composition and classification of the Porifera//Biochem. Syst. Ecol. 1986. Vol. 14. P. 105-112.

26. Bergquist P.R., Karuso P., Cambie R.C., Smith D.J. Sterol composition and classification of the Porifera // Biochem. Syst. Ecol. 1991.Vol. 19. P. 17-24.

27. De Rosa M., Minale M., Sodano G. Metabolism in Porifera. I. Some studies on the biosynthesis of fatty acids, sterols and bromocompounds by the sponge Verongia aerophoba И Сотр. Biochem. and Physiol. B. 1973. Vol. 45. P. 883-893.

28. De Rosa M., Minale L., Sodano G. Metabolism in Porifera. V. Biosynthesis of 19-nor-stanols; conversion of cholesterol into 19-nor-cholestanols by the sponge Axinella polypoides H Experientia. 1975. Vol. 31. P. 758-759.

29. De Rosa M., Minale L., Sodano G. Metabolism in Porifera. VI. Biosynthesis of 3p-Hydroxymethyl-A-nor-5a-steranes from cholesterol by Axinella verrucosa // Ibid. 1975. Vol. 31. P. 408-409.

30. Bibolino L., Minale L., Sodano G. Investigations on the ring contraction step in the biosynthesis of A-nor-stanols by the marine sponge Axinella verrucosa // Chem. Commun. 1978. № 13. P. 524-525.

31. Minale L., Riccio R., Scalona O. et al. Metabolism in Porifera. VII. Conversion of 7,7-3H2.-fucosterol into calysterol by the sponge Calyx nicaensis II Experientia. 1977. Vol. 33. P. 1550-1551.

32. Fromont J., Kerr S., Kerr R., Riddle M., Murphy P. Chemotaxonomic relationships within, and comparisons between, the orders Haplosclerida and Petrosida (Porifera: Demospongiae) using sterol complements // Biochem. Syst. Ecol. 1994. Vol. 22. P. 735-752.

33. Castellanos L., Zea S., Osorno O., Duque C. Phylogenetic analysis of the order Halichondrida (Porifera, Demospongiae), using 3P-hydroxysterols as chemical characters // Biochem. Syst. Ecol. 2003.Vol. 31. P. 1163-1183.

34. Заренков H.A. Теоретическая биология. M.: Изд-во Моск. ун-та, 1988. - 213 с.

35. Kokke W.C.M.C., Tarchini С., Stierle D.B., Djerassi С. Isolation, structure elucidation, and partial synthesis of xestosterol, a biosynthetically significant sterol from the sponge Xestospongia muta И J. Org. Chem. 1979. Vol. 44. P. 3385-3388.

36. De Luca P., De Rosa M., Minale L., Sodano G. Marine sterols with a new pattern of side-chain alkylation from the sponge Aplysina (=Verongia) aerophoba II J. Chem. Soc. Perkin Trans. Pt I. 1972. № 17. P. 2132-2135.

37. Kerr R.G., Kerr S.L., Djerassi C. Biosynthetic studies of marine lipids. 26. Elucidation Ф of the biosynthesis of mutasterol, a sponge sterol with a quaternary carbon in its side chain // J.

38. Org. Chem. 1991. Vol. 56. P. 63-66.

39. Giner J.-L., Gunasekera S.P., Pomponi Sh.A. Sterols of the marine sponge Petrosia weinbergi: implications for the absolute configurations of the antiviral orthoesterols and weinbersterols // Steroids. 1999. Vol. 64. P. 820-824.

40. Sica D., Zollo F. Petrosterol, major sterol with a cyclopropane side chain in sponge Petrosia ficiformis II Tetrahedron Lett. 1978. № 9. P. 837-838.

41. Khalil M.W., Djeracci C., Sica D. Minor and trace in marine invertebrates. IVII. (24R)-24,26-Dimethylcholesta-5,26-dien-3p-ol, a new sterol from the sponge Petrosia ficiformis // Steroids. 1980. Vol. 35. P. 707-719.

42. Theobadl N., Shoolery J.N., Djerassi C. et al. Minor and trace sterols in marine invertebrates. 7. 24-Ethyl-A5,24(28),28-cholestatrien-3P-ol a naturally occurring allenic marine sterol // J. Amer. Chem. Soc. 1978. Vol. 100. P. 5574-5575.

43. Sheikh Y.M., Djerassi C. Steroids from sponges // Tetrahedron. 1974. Vol. 30. P. 40954103.

44. Migliuolo A., Piccialli V., Sica D. Steroidal ketones from the sponge Geodia ж cydonium И J. Nat. Prod. 1990. Vol. 53. P. 1262-1266.

45. Brown F.J., Djerassi C. Elucidation of the course of the electron impact induced fragmentation of a,P-unsaturated 3-ketosteroids // J. Amer. Chem. Soc. 1980. Vol. 102. P. 807.

46. Frost D.J., Ward J.P. Stereochemistry of 7, 24(28)-stigmastadien-3p-ol and the fucosterols // Tetrahedron Lett. 1968. № 34. P. 3779-3782.

47. Itoh Т., Sakurai S., Tamura Т., Matsumoto T. Occurence of 24(E)-Etylidene sterols in two Solanaceae seed oils and rice bran oil. // Lipids. 1979. Vol. 15. P. 22-25.

48. Seides A.M., Rovirosa J., San Martin A., Gros E.G. A new sterol from the sponge Haliclona chilensis (Thiele) // Experientia. 1985. Vol. 41. P. 34-35.

49. Erdmann T.R., Scheuer P.J. 28-Isofucosterol: major sterol of a marine sponge // Lloydia. 1975. Vol. 38. P. 359-360.

50. Makarieva T.N., Stonik V.A., Ponomarenko L.P., Kalinovsky A.I. Isolation of (24R)-24,25-methylene-5a-cholestan-3P-ol, a new cyclopropane-containing sponge sterol // J. Chem. Research (S). 1996. № 10, P. 468-469.

51. Пономаренко Л.П. Стерины и стериноподобные соединения из некоторых морских беспозвоночных: автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. Владивосток: Дальнаука, 2001- 26 с.

52. Silva Ch., Djerassi С. Isolation, stereochemistry, and biosynthesis of sormosterol, a novel cyclopropane-containing sponge sterol // Collect Czech. Chem. Commun. 1991. Vol. 56. P. 1093-1105.

53. Elenkov I.J., Stefanov K.L., Andreev S.N., Popov S.S., Christie W.W., Robertson G.W., Shepherd T. Sterol composition of the Black Sea sponge Lissodendoryx variisclera II Сотр. Biochem. Physiol. 1996. Vol. 115B. P. 287-289.

54. Silva C.J., Djerassi C. Biosynthetic studies of marine lipids. 36. The origin of common sterol side chains in eleven sponges using 3-3H.-squalene // Сотр. Biochem. Physiol. 1992. Vol. 101B. P. 255-268.

55. Knapp F.F., Schroepfer G.J. Chemical synthesis, spectral properties and chromatography of 4a-methyl and 4p-methyl isomers of 24R-24-ethyl-5a-cholestan-3P-ol and 24S-24-ethyl-cholesta-5,22-dien-3P-ol // Steroids. 1975. Vol. 26. P. 339-357.

56. Hill M.S. Symbiotic zooxantellae enhance boring and growth rate of the tropical sponge Anthosigmella varians forma varians II Mar. Biol. 1996. Vol. 125. P. 649-654.

57. Cafleri F., Ciminiello P., D'Auria M.V., Santacroce C. Sterol composition of the marine sponge Crambe crambe II Biochem. Syst. Ecol. Vol. 12. P. 203-204.

58. Braekman J.C., Daloze D., Tavares R., Hajdu E., Van Soest R.W.M. Novel polycyclic guanidine alkaloids from two marine sponges of the genus Monanchora II J. Nat. Prod. 2000. Vol. 63. P. 193-196.

59. Carballeira N.M., Negron V. Identification and characterization of two new methylicosadienoic acids from Erylus formosus II Ibid. 1991. Vol. 54. P. 305-309.

60. Bohlin L., Gehrken H.P., Scheuer P.J., Djerassi C. Minor and trace sterols in marine invertebrates. XVI. 3£-hydroxymethyl-A-nor-5a-gorgostane, a novel sponge sterol // Steroids. 1980. Vol. 35. P. 295-304.

61. Di Giacomo G., Dini A., Falco В., Marino A., Sica D. Sterols from the sponge Agelas oroides И Сотр. Biochem. Physiol. 1983. Vol. 74B. P. 499-501.

62. Duque C., Cepeda N., Martinez A. The steryl ester and phospholipid fatty acids of the sponge Agelas conifera from the Colombian Caribbean// Lipids. 1993. Vol. 28. P. 767-769.

63. Catalan C.A.N., Lakshmi V., Schmitz F.J., Djerassi C. Minor and trace sterols in marine invertebrates. 39. 24^,25^-24,26-Cyclocholest-5-en-3|3-ol, a novel cyclopropyl sterol // Steroids. 1982. Vol. 40. P. 455-463.

64. Kolesnikova I.A., Makarieva T.N., Stonik V.A. Natural products from the lake Baikal organisms II. Sterols from the sponge Lubomirskia baicalensis II Сотр. Biochem. Physiol. 1992. Vol. 103B.P. 501-503.

65. Rubinstein I., Goad L.J. Sterols of the siphonous marine alga Codium fragile И Phytochemistry. 1974. Vol. 13. P. 481-484.

66. Kokke W.C.M.C., Fenical W.H., Рак C.S., Djerassi C. Minor and trace sterols in marine invertebrates. IX. Verongulasterol a marine sterol with a novel side chain alkylation pattern // Tetrahedron Lett. 1978. № 45. P. 4373-4376.

67. Minale L., Sodano G. Marine sterols: unique Зр-hydroxymethyl-A-nor-steranes from the sponge Axinella verrucosa //J. Chem. Soc. Perkin Trans. Pt. I. 1974. № 20. P. 2380-2384.

68. Eggersdorfer M.L., Kokke W.C.M.C., Crandell C.W. et al. Sterols in marine invertebrates. 32. Isolation of 3P-(hydroxymethyl)-A-nor-5a-cholest-15-ene, the first naturally occurring sterol with 15-16 double bond//Ibid. 1982. Vol. 47. P. 5304-5309.

69. Bohlin L., Gehrken H.P., Scheuer P.J., Djerassi C. Minor and trace sterols in marine invertebrates. 16. 3p-Hydroxymethyl-A-nor-5a-gorgostane, a novel sponge sterol // Steroids. 1980. Vol. 35. P. 295-304.

70. De Nanteuil G., Ahond A., Poupat C., Potier P. Isolement et identification de onze sterols de type hydroxymethyI-3p nor-A cholestane du spongiaire, Pseudaxinyssa cantharella II Teetrahedron. 1985. Vol. 41. P. 6035-6039.

71. Gunasekera S.P., Sennet S.H., Kelly-Borges M. Ophirapstanol trisulfate, a new biologically active steroid sulfate from the deep water marine sponge Topsentia ophiraphidites И J. Nat. Prod. 1994. Vol. 57. P. 1751-1754.

72. Fusetani N., Takahashi M., Matsunaga Sh. Topsentiasterol sulfates, antimicrobial sterol sulfates possessing novel side chains, from a marine sponge, Topsentia sp. // Tetrahedron. 1994. Vol. 50. P. 7765-7770.

73. McKee Т.С., Cardellina J.H., TischlerM., Snader K.M., Boyd M.R. Ibisterol sulfate, a novel HIV-inhibitory sulfated sterol from the deep water sponge Topsentia sp. // Tetrahedron Lett. 1993. Vol. 34. P. 389-392.

74. Ishibashi M., Yamagishi E., Kobayashi J. Topsentinols A-J, new sterols with highly branched side chains from marine sponge Topsentia sp. // Chem. Pharm. Bull. 1997. Vol. 45. P. 1435-1438.

75. Iguchi K., Shimura H., Yang Zh., Yamada Y. A new 5a,8a-epidioxy sterol from the Okinawan marine sponge of the Axinyssa genus // Steroids. 1993. Vol. 58. P. 410-413.

76. Iwashima M., Terada I., Iguchi K., Yamori T. New biologically active marine sesquiterpenoid and steroid from the Okinawan sponge of the genus Axinyssa // Chem. Pharm. Bull. 2002. Vol. 50. P. 1286-1289.

77. Catalan C.A.N., Thompson J.E., Kokke W.C.M.C., Djerassi C. Biosynthetic studies of marine lipids 3. Experimental demonstration of the course of side chain extension in marine sterols//Tetrahedron. 1985. Vol. 41. P. 1073-1084.

78. Stoilov I.L., Thompson J.E., Djerassi C. Biosynthetic studies of marine lipids. 10. Double side chain extension in the triply alkylated sponge sterol xestosterol // Tetrahedron Lett. 1986. Vol.27. P. 4821-4824.

79. Lawson M.P., Stoilov I.L., Thompson J.E., Djerassi C. Cell membrane localization of sterols with conventional and unusual side chains in two marine Demosponges // Lipids. 1988. Vol. 23. P. 750-754.

80. Djerassi C. Recent studies in the marine sterol field // Pure and Appl. Chem. 1981. Vol. 53. P.873-890.

81. Carballeira N., Thompson J.E., Ayanoglu E., Djerassi C. Biosynthetic studies ofmarine lipids. 5. The biosynthesis of long-chain branched fatty acids in marine sponges // Ibid. 1986. Vol. 51. P. 2751-2756.

82. Hahn S., Lam W.-K., Wu I., Silva C.J., Djerassi C. Unusual pattern of fatty acid biosynthesis. Evidence for C-19 desaturase activity in freshwater sponges //J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 21043-21046.

83. Lam W.-K., Hahn S., Ayanoglu E., Djerassi C. Phospholipid studies of marine organisms. 22. Structure and biosynthesis of a novel brominated fatty acid from a Hymeniacidonid sponge // J. Org, Chem. 1989. Vol. 54. P. 3428-3432.

84. Kerr R.G., Baker R.J. Marine sterols //Nat. Prod. Rep. 1991. Vol. 8. P. 465-497.

85. Lawson M.P., Thompson J.E., Djerassi C. Cell membrane localization of long chain C24-C30 fatty acids in two marine Demosponges // Lipids. 1988. Vol. 23. P. 741-749.

86. Stonik V.A., Elyakov G.B. Secondary metabolites from Echinoderms as chemotaxonomic markers // Bioorganic Marine Chemistry. Berlin: Springer-Verlag, 1988.Vol. 2. P. 43-86.

87. Stonik V.A., Ponomarenko L.P., Makarieva T. N., Boguslavsky V.M., Dmitrenok A.S., Fedorov S.N., Strobikin S. A. Free sterol compositions from the sea cucumbersV

88. Pseudostichopus trachus, Holothuria (Microtele) nobilis, Holothuria scabra, Trochostoma orientale and Bathyplotes natans II Сотр. Biochem. Physiol. 1998. Vol. 120B. P. 337-347.

89. Anisimov M.M., Shentsova E.B., Scheglov V.V. et. al. Mechanism of cytotoxic action of some triterpene glycosides // Toxicon. 1978. Vol. 16. P. 207-218.

90. Makarieva T.N., Denisenko V.A., Stonik V.A., Milgrom Yu.M., Rashkes Ya.W. Rizochalin, a novel secondary metabolite of mixed biosynthesis from the sponge Rizochalina

91. Л incrustata II Tetrahedron Lett. 1989. Vol. 30. P. 6581-6584.

92. Makarieva T.N., Stonik V.A., Dmitrenok A.S., Krasokhin V.B., Svetashev V.I., Vysotskii M.V. New polar steroids from the sponges Trachyopsis halichondroides and Cymbastela coralliophila II Steroids. 1995. Vol. 60. P. 316-320.

93. Stonik V.A., Makarieva T.N., Dmitrenok A.S. Sarcochromenol sulfates A-C and sarcohydroquinone sulfates A-C, new natural products from the sponge Sarcotragus spinulosus (Schmidt) // J. Nat. Prod. 1992. Vol. 55. P. 1256-1260.

94. Пономаренко Л.П., Макарьева Т.Н., Стоник В.А. Новый нортритерпеноид из глубоководной губки Sarcotragus spinulosus II Изв. Академии наук. Сер. химич. 1998. Т. 10. С. 2072-2074.

95. Неопубликованные данные Макарьевой Т.Н.

96. Bergquist P.R., Lawson М.Р., Lavis A., Cambie R.C. Fatty acid composition and the classification of the Porifera//Biochem. Syst. Ecol. 1984. Vol. 12. P. 63-84.

97. Дембицкий B.M., Челомин В.П. Липиды губок // Изв. АН СССР. Сер. биологич. 1985. № 1.С. 53-60.

98. Дембицкий В.М., Небылицин Б.Д. Липиды морского происхождения. II. Сравнительное исследование фосфолипидного и жирнокислотного состава морских губок Японского моря//Биоорганическая химия. 1980. Т. 6, № 10. С. 1542-1548.

99. Djerassi С., Lam W.-K. Sponge phospholipids II Асс. Chem. Res. 1991. Vol. 24. P. 69-75.

100. Nemoto Т., Yoshino G., Ojika M., Sakagami Y. Amphimic acids and related long-chain fatty acids as DNA topoisomerase-I inhibitors from an Australian sponge, Amphimedon sp. //Tetrahedron. 1997. Vol. 53. P. 16699-16710.

101. Andersson B.A., Holman R.T. Pyrrolidides for mass spectrometric determination of the position of the double bond in monounsaturated fatty acids // Lipids. 1973. Vol. 9. P. 185190.

102. The Lipid Library. Mass spectrometry of fatty acid derivatives / W.W.Christie. Scottish Crop Research Institute. Электронные данные. - Интернет-сайт. -http://www.rmidlibrary.co.uk - яз. англ.

103. Carballeira N.M., Lopez M.R. On the isolation of 2-hydroxydocosanoic and 2-hydroxytricosanoic acids from the marine sponge Amphimedon compressa II Lipids. 1989. Vol. 24. P. 89-91.

104. Carballeira N.M., Negron V., Reyes E.D. Novel monounsaturated fatty acids from the sponges Amphimedon compressa and Mycale laevis II J. Nat. Prod. 1992. Vol. 55. P. 333-339.

105. Faulkner D.J. Marine natural products // J. Nat. Prod. Rep. 2002. Vol. 19. P. 1-66.

106. Семенов A.A. Очерк химии природных соединений. Новосибирск: Наука, 2000. - 664 с.

107. Kernan M.R., Faulkner D.J. Sesterterpene sulfates from a sponge of the family Halichondriidae // J. Org. Chem. 1988. Vol. 53. P. 4574-4578.

108. Fu X., Ferreira M.L.G., Schmitz F.J., Kelly M. Halisulfate 7, a new sesterterpenesulfate from a sponge, Coscinoderma sp. // J. Nat. Prod. 1999. Vol. 62. P. 1190-1191.

109. Phuwapraisirisan Pr., Matsunaga Sh., van Soest R.W.M., Fusetani N. Shinsonefuran, a cytotoxic furanosesterterpene with a novel carbon skeleton, from the deep-sea sponge Stoeba externa II Tetrahedron Lett. 2004. Vol. 45. P. 2125-2128.

110. Makarieva T.N., Rho J.-R., Lee H.-S., Santalova E.A., Stonik V.A., Shin J. New ^ sesterterpene sulfates from the sponge Darwinella australiensis II J. Nat. Prod. 2003. Vol. 66. P.1010-1012.

111. Espada A., Jin^nez C., Rodriguez J., Crews Ph., Riguera R. Sarasinosides D-G: four new triterpenoid saponins from the sponge Asteropus sarasinorum И Tetrahedron. 1992. Vol. 48. P. 8685-8696.

112. Lee H.-S., Seo Y., Cho K.W., Rho J.-R., Shin J., Paul V.J. New triterpenoid saponins from the sponge Melophlus isis И J. Nat. Prod. 2000. Vol. 63. P. 915-919.

113. Schmitz F.J., Ksebati M.B., Gunasekera S.P., Agarwal S. Sarasinoside Aj: a saponinVcontaining amino sugars isolated from a sponge // J. Org. Chem. 1988. Vol. 53. P. 5941-5947.

114. D'Auria M.V., Paloma L.G., Minale L., Riccio R. Jereisterol A and B: two 30-methoxy-secosteroids from the Pacific sponge Jereicopsis graphidiophora II Tetrahedron Lett. 1991. Vol. 32. P. 2149-2152.

115. Шашков A.C., Чижов O.C. Спектроскопия 13С-ЯМР в химии углеводов и родственных соединений // Биоорганическая химия. Т. 2, № 4. С. 437-504.-Л 139. Шашков А.С. Спектры ЯМР 13С родоначальных гексопираноз // Изв. АН СССР.

116. Сер. химии. 1983. № 6. С. 1328-1336.

117. Costantino V., Fattorusso E., Mangoni A., Aknin M., Gaydou E.M. Novel 3p-methoxysteroids from the Senegalese sponge Microscleroderma spirophora II Steroids. 1994. Vol. 59. P. 181-184.

118. Wu S.-H., Luo X.-D., Ma Y.B., Liu J.-K., Wu D.-G., Zhao В., Lu Y., Zheng Q.T. Two novel secoergosterols from fungus Tylopilus plumbeoviolaceus II J. Nat. Prod. Vol. 63. P. 534-536.

119. Schroepfer G.J., Parish E.J., Chen H.W., Kandutsch A.A. Inhibition of sterol biosynthesis in L cells and mouse liver cells by 15-oxygenated sterols // J. Biol. Chem. 1977. Vol. 252. P. 8975-8980.

120. Dunlap N.K., Sabol M.R., Bauer Ph.E., Watt D.S. Synthesis of biological markers in fossil fuels. 3. Degraded and rearranged Cn hopanes // J. Org. Chem. 1985. Vol. 50. P. 18261829.

121. Неопубликованные данные Антонова A.C.

122. Pika J., Andersen R.J., Blancasterol, a cytotoxic 9,11-secosteroid isolated from the Northeastern Pacific marine sponge Pleraplysilla sp. // Tetrahedron. 1993. Vol. 49. P. 87578760.

123. Jagodzinska B.M., Trimmer J.S., Fenical W., Djerassi C. Sterols in marine invertebrates. 51. Isolation and structure elucidation of C-18 functionalized sterols from the soft coral Simtlaria dissecta III. Org. Chem. 1985. Vol. 50. P. 2988-2992.

124. Kobayashi M., Haribaby В., Anjaneyulu V. Marine sterols. XXI. Isolation of (24S)-3p-hydroxyergost-5-en-21-oic acid from a Sclerophytum sp. of soft coral // Chem. Pharm. Bull. 1992. Vol.40. P. 233-234.

125. Carney J.R., Yoshida W.Y., Scheuer P.J. Kiheisterones, new cytotoxic steroids from a Maui sponge // J. Org. Chem. 1992. Vol. 57. P. 6637-6640.

126. Carney J.R., Scheuer P.J., Kelly-Borges M. Three unprecedented chloro steroids from the Maui sponge Strongylacidon sp.: kiheisterones C, D and E // J. Org. Chem. 1993. Vol. 58. P. 3460-3462.

127. Nakatsu Т., Walker R.P., Thompson J.E., Faulkner D.J. Biologically-active sterol sulfates from the marine sponge Toxadocia zumi И Experientia. 1983. Vol. 39. P. 759-761.

128. Masuno M.N., Pawlik J.R., Molinski T.F. Phorbasterones A-D, cytotoxic nor-ring A steroids from the sponge Phorbas amaranthus И J. Nat. Prod. 2004. Vol. 67. P. 731-733.

129. Будзикевич Г., Джерасси К., Уильяме Д. Интерпретация масс-спектров органических соединений. М.: Мир, 1966. - 324 с.

130. ФизерЛ., ФизерМ. Стероиды.-М.: Мир, 1964.-982 с.

131. Duan H., Takaishi Y., Momota H., Ohmoto Y., Taki Т., Tori M., Takaoka Sh., Jia Y., Li D. Immunosuppressive terpenoids from extracts of Tripterygium wilfordii II Tetrahedron. 2001. Vol. 57. P. 8413-8424.

132. Munkombwe N.M., Hughest N.A., Duri Z.J. Acid metabolites from Spirostachys africana И Phytochemistry. 1998. Vol. 47. P. 1653-1655.

133. Braekman J.-C., Daloze D., Stoller C., van Soest R.W.M. Chemotaxonomy of Agelas (Porifera: Demospongiae) // Biochem. Syst. Ecol. 1992. Vol. 20. P. 417-431.

134. Iwagawa Т., Kaneko M., Okamura H., Nakatani M., van Soest R.W.M. New alkaloids from the Papua New Guinean sponge Agelas nakamurai II J. Nat. Prod. 1998. Vol. 61. P. 13101312.

135. Hattori Т., Adachi K., Shizuri Y. New agelasine compound from the marine sponge Agelas mauritiana as an antifouling substance against macroalgae // J. Nat. Prod. 1997. Vol. 60. P. 411-413.

136. Cafieri F., Fattorusso E., Mangoni A., Taglialatela-Scafari O. Dispacamides, antihistamine alkaloids from Carribean Agelas sponges // Tetrahedron Lett. 1996. Vol. 37. P. 35873590.

137. Cafieri F., Fattorusso E., Mangoni A., Taglialatela-Scafari O. Clathramides, unique bromopyrrole alkaloids from the Carribean sponge Agelas clathrodes II Tetrahedron. 1996. Vol. 52. P. 13713-13720.

138. Cafieri F., Fattorusso E., Taglialatela-Scafari O. Novel bromopyrrole alkaloids from the sponge Agelas dispar // J. Nat. Prod. 1998. Vol. 61. P. 122-125.

139. Lindel Th., Hochgurtel M. The alkyne pathway to keramadine from the marine sponge Agelas sp. // Tetrahedron Lett. 1998. Vol. 39. P. 2541-2544.

140. Nakamura H., Kobayashi J., Ohizumi Y., Hirata Y. Novel bisabolene-type sesquiterpenoids with a conjugated diene isolated from the Okinawan sea sponge Theonella cf. swinhoei И Ibid. 1984. Vol. 25. P. 5401-5404.

141. Sullivan B.W., Faulkner D.J., Okamoto K.T., Chen M.H.M., Clardy J. (6R,7S)-7-Amino-7,8-dihydro-a-bisabolene, an antimicrobial metabolite from the marine sponge Halichondria sp. III. Org. Chem. 1986. Vol. 51. P. 5134-5136.

142. Gulavita N.K., de Silva E.D., Hagadone M.R., Karuso P., Scheuer P.J. Nitrogenous bisabolene sesquiterpenes from marine invertebrates // Ibid. 1986. Vol. 51. P. 5136-5139.

143. Jares-Erijman E.A., Sakai R., Rinehart K.L., Crambescidins: new antiviral and cytotoxic compounds from the sponge Crambe crambe И J. Org. Chem. 1991. Vol. 56. P. 57125715.

144. Garson M., Simpson J.S. Marine isocyanides and related natural products structure, biosynthesis and ecology //Nat. Prod. Rep. 2004. Vol. 21. P. 164-179.

145. Vetter W., Walter W. Preparation of pyrrolidides from fatty acids via trimethylsilyl esters for gas chromatographic-mass spectrometric analysis // J. Cromatogr. 1990. Vol. 513. P. 405-407.

146. Prokof eva N.G., Chaikina E.L., Kicha A.A., Ivanchina N.V. Biological activities of steroid glycosides from starfish// Сотр. Biochem. Physiol. 2003. Vol. 134B. P. 695-701.

147. Prokof eva N.G., Utkina N.K., Chaikina E.L., Makarchenko A.E. Biological activities of marine sesquiterpenoid quinines: structure-activity relationships in cytotoxic and hemolytic assays // Сотр. Biochem. Physiol. 2004. Vol. 139B. P. 169-173.