Двудоменные токсины ядов пауков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Сачкова, Мария Юрьевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2014
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
Сачкова Мария Юрьевна
Двудоменные токсины ядов пауков
Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
I .л',1
2214
005548424
Москва-2014
005548424
Работа выполнена в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Научный руководитель:
кандидат химических наук Василевский Александр Александрович Официальные оппоненты:
Сергиев Петр Владимирович, доктор химических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, химический факультет, кафедра химии природных соединений.
Артамонова Ирена Игоревна, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, отдел вычислительной биологии, старший научный сотрудник.
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук (ИЭФБ РАН)
Защита состоится в 10 ч 25 июня 2014 г. на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН, а также на официальном сайте Института по адресу http://www.ibch.ru.
Автореферат разослан 20 мая 2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор физико-математических наук
В.А. Олейников
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Широко известно, что пауки продуцируют яд, состоящий из смеси мощных и селективных токсинов, каждый из которых может иметь свою специфическую биологическую активность. С одной стороны, яд пауков - фактор, несомненно, сыгравший одну из ключевых ролей в эволюции этих беспозвоночных, с другой - он является источником веществ, имеющих важное прикладное значение в качестве возможных лекарственных препаратов или инструментов изучения нервной системы. Эти аргументы обуславливают актуальность исследования разнообразия токсинов пауков. Однако лишь несколько видов, представляющих собой небольшую долю известного биоразнообразия, были изучены подробно, поэтому наше представление о репертуаре токсинов из яда пауков очень ограничено.
Пептидная составляющая наиболее представлена в яде всех изученных видов. Пептиды могут быть двух типов. (А) Нейротоксины обычно богаты дисульфидными связями и в пространстве формируют структуру «цистинового узла» (ICK - от англ. inhibitory cystine knot). По-другому такие токсины называют ноттинами (от англ. knottin). (Б) Цитотоксины обычно являются линейными пептидами, приобретающими а-спиральную конформацию при взаимодействии с липидными мембранами. Их также часто называют антимикробными пептидами (AMP, от англ. antimicrobial peptide) в связи с тем, что они активны против микроорганизмов.
Разнообразие компонентов яда является эволюционным преимуществом пауков, поэтому они «стремятся» его повышать. Это приводит к формированию так называемых «комбинаторных библиотек» токсинов: яд содержит группы гомологичных пептидов, аминокислотные последовательности которых вариабельны, а общие структурные мотивы консервативны. Однако известны и другие механизмы повышения разнообразия пептидных компонентов яда. Например, существуют дисульфид-богатые токсины с другими типами пространственной укладки. Относительно недавно в яде нескольких пауков были найдены токсины, состоящие из двух модулей (или доменов), каждый из которых соответствует «обычному» токсину. К началу работы над этой диссертацией были известны следующие комбинации доменов: (а) два ICK домена в составе одного токсина, (б) ICK домен с линейным С-концевым модулем, обладающим мембраной активностью, (в) два коротких линейных AMP, объединенные в одну молекулу. В принципе, возможен и четвертый вариант комбинации доменов - N-концевой домен типа AMP и С-концевой домен типа ICK. Двудоменные токсины изучены недостаточно. Так с одной стороны, неизвестны функциональные роли отдельных модулей большинства токсинов, а с другой, механизмы их молекулярной эволюции.
Цель и задачи работы
Целью данной работы было изучение разнообразия двудоменных (модульных) токсинов пауков. Были поставлены следующие задачи:
1. Поиск новых двудоменных токсинов пауков.
2. Изучение структуры и биологической активности модульных токсинов.
3. Определение структуры генов, кодирующих двудоменные токсины пауков.
4. Выяснение механизмов молекулярной эволюции модульных токсинов.
Научная новизна работы
Впервые обнаружен новый класс двудоменных токсинов пауков, состоящих из линейного и ноттинового доменов — спайдеринов. Они были выделены из яда Охуорея ¡акоЫи.ч, а затем обнаружены также и у Охуорев НпеаЫа (семейство Охуор'к1ае). Всего было установлено 20 аминокислотных последовательностей спайдеринов, подразделяемых на две группы. Эти токсины обладают мощной цитолитической, антимикробной и инсектицидной активностью, обусловленной линейным доменом.
В яде паука Ске1гасап1Ыит рипсГопит (семейство Мки^с1ае) было обнаружено широкое разнообразие модульных токсинов, построенных из двух ноттиновых доменов (СрТх-подобные токсины). Они подразделяются на четыре группы на основании сходства первичной структуры. Полные аминокислотные последовательности были определены для 12 полипептидов. СрТх-подобные токсины обладают высокой инсектицидной активностью.
Были проведены структурно-фунциональные исследования цитоинсектотоксина 1а из яда паука Ьаскезапа ¡агаЬаехч, состоящего из двух модулей, каждый из которых склонен к формированию амфипатической а-спирапи. Показано, что действие каждого из модулей в отдельности значительно слабее, чем у полноразмерного полипептида. Предположено, что при взаимодействии с бактериальными мембранами С-концевой домен выступает в роли «энхансера» для 1Ч-концевого, причем для активности полноразмерного токсина необходим ковалентный комплекс его модулей. В случае с мембранами насекомых важна длина полипептида.
Впервые исследована структура генов двудоменных токсинов. Установлено, что у пауков О. ИпеаХт и С. рипс1огшт они не содержат интронов. Анализ возможных механизмов молекулярной эволюции модульных токсинов показал, что на них воздействует отрицательный отбор. В ходе эволюции гены модульных токсинов образовались из генов однодомен-ных токсинов. Спайдерины, скорее всего, появились в результате «вставки» линейного И-концевого домена в «предковый» дисульфид-богатый токсин между пропептидом и зрелым пептидом. Возможно, линейный домен появился благодаря превращению интрона, располагавшегося в гене однодоменного токсина, в кодирующую последовательность. СрТх-
подобные токсины являются результатом «объединения» двух ноттиновых токсинов, последовательности которых проявляют умеренное сходство друг с другом.
Практическая ценность работы
Исследуемые в работе спайдерины и цитоинсектотоксины обладают мощной антимикробной активностью, что делает их потенциальными антибиотиками. Все рассматриваемые токсины являются инсектицидными веществами, поэтому возможно их применение в сельском хозяйстве для борьбы с вредителями. Была разработана система получения реком-бинантных спайдеринов, что позволяет начать разработку биотехнологических методов их производства. Двудоменные токсины построены по принципу комбинирования функциональных модулей. Изучение механизмов их активности позволит использовать этот принцип для конструирования новых биологически активных молекул.
Апробация работы
Основные материалы диссертации были представлены на XXIII, XXIV и XXVI Зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011, 2012 и 2014, соответственно), Гордоновской научной конференции «Антимикробные пептиды» (Лукка, Италия, 2011), V и VI Российских симпозиумах «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011 и Уфа, 2013, соответственно), 37 и 38 конгрессах Федерации Европейских биохимических обществ (Севилья, Испания, 2012 и Санкт-Петербург, 2013, соответственно) и V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012).
Публикации
По теме диссертации опубликовано три статьи в международных научных журналах.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 116 страницах, содержит 19 рисунков и 15 таблиц, имеет традиционную структуру и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 238 источников.
Содержание работы
Объекты и стратегия исследований
Объектами исследований являлись двудоменные токсины, которые выделяли из яда пауков Охуорез 1акоЫи$ (семейство Охуор1(1ае) и СИеггасапМит рипМогшт (семейство М1-Ш^с1ае) хроматографическими методами, а также двудоменные токсины паука ЬасИеяапа 1агаЬаеу1 (семейство гос)агпс1ае), охарактеризованные ранее. Биологическую активность изучали как на токсинах из природных источников, так и с использованием синтетических полипептидов. Структуры генов двудоменных токсинов исследовали путем амплификации фрагментов геномной ДНК пауков Охуорев ИпеаГш и С. рипс1огшт. Молекулярную эволюцию двудоменных токсинов анализировали, используя полученные ранее библиотеки кДНК из ядовитых желез пауков О. 1акоЫи$ и С. рипЫогтт, последовательности кДНК токсинов из открытых банков данных и набор компьютерных программ для биоинформатических исследований.
Результаты
Выделение токсинов нового класса - двудоменных токсинов спайдеринов
Выделение токсинов с антимикробными и инсектицидными свойствами из цельного яда О. ¡акоЫиз проводилось по двустадийной схеме - сначала яд подвергали гель-фильтрации, а затем обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). В результате были обнаружены полипептиды СНТх 1 (12030 Да) и СНТх 2 (12415 Да), получившие название спайдерины (рис. 1).
Рисунок 1. Выделение ОГТх из яда О. /акоЪ'ч«. (А) Разделение цельного яда О. ¡акоЫш методом гель-фильтрации. (Б) ОФ-ВЭЖХ доминирующей фракции. (В) Второе разделение ОФ-ВЭЖХ фракции, содержащей ОПх. На (Б) и (В) градиент концентрации ацетонит-рила показан линией. На (А) и (Б) фракции, содержащие 01Тх, закрашены.
С помощью N-концевой деградации по Эдману была определена частичная аминокислотная последовательность выделенных токсинов: KFKWGKLFSTAKKLYKKGKKLS KNKNFKKALKFGK (OtTx 1) и KFKLPKINWGKLASKAKDVYKKGQKLAKNKNVKKA LK (OtTx 2). Сравнивая частичные последовательности с библиотекой кДНК из ядовитых желез паука О. takobius, транслированной in silico, были установлены полные последовательности токсинов OtTx 1 и OtTx 2 и их белков-предшественников, а также их близких гомологов (рис. 2) (номера в GenBank JX134894 -JX134897). Изоформы токсинов, обнаруженные в яде, были обозначены как OtTx la и OtTx 2а, а гомологичные им последовательности как OtTx Ib и OtTx 2b. Во всех обнаруженных токсинах содержится по 10 остатков цистеина, участвующих в образовании 5 внутримолекулярных дисульфидных связей.
Последовательности OtTx 1 (108 аминокислотных остатков, а. о.) и OtTx 2 (113 а. о.) совпадают на -80% (рис. 2). Каждая из молекул состоит из двух частей (модулей) или доменов. N-Концевая часть не содержит остатков цистеина, в то время как С-концевой домен является цистеин-богатым. Короткая линкерная последовательность, соединяющая два модуля (ЕЕНЕР у OtTx 1 и EVHEP у OtTx 2) напоминает мотив процессинга PQM (в предшественниках OtTx PQM = EEAR), содержащий мутацию - замену аргинина на пролин.
Сигнальный пептид
Пропептид
Линейный домен (АМР)
potTx la pOtTx Ib potTx 2a potTx 2b
Ноттиновый домен (iCK)
Линкер
112
Рисунок 2. Сравнение последовательностей белков-предшественников токсинов OtTx. Отрицательно заряженные остатки выделены курсивом, положительно заряженные - жирным шрифтом, остатки цистеина в зрелой цени показаны на темно-сером фоне, идентичные остатки - на светлосером. Области, соответствующие сигнальному пептиду, пропептиду и фрагментам зрелого токсина, отмечены стрелками над последовательностями. Сайт процессинга пропептида показан жирной стрелкой, мотив PQM - звездочками. Дисульфидные связи, участвующие в образовании канонического мотива 1СК, обозначены горизонтальными скобками над последовательностями, дополнительные дисульфиды - скобками под последовательностями.
Последовательность С-концевого домена проявляет значительное сходство с окси-токсинами ОхуТх 1 и ОхуТх 2, антагонистами потенциал-зависимых кальциевых каналов из яда Oxyopes (см. сравнение последовательностей на рис. 3.). Окситоксины и С-концевой домен OtTx характеризуются общим мотивом расположения остатков цистеина
(С1ХбС2ХзС3ХС4С5Х4СбХС7ХтС8ХС9ХпС10), поэтому их пространственные структуры тоже, скорее всего, сходны. В дополнение к трем дисульфидам С1 - С5, С2 - С6, С4 - С9, формирующим мотив ICK, они содержат две дополнительные S-S связи С3 - С10 и С7 - С8.
В открытых базах данных не было обнаружено последовательностей, гомологичных линейному домену OtTx. Он положительно заряжен (заряд +16 и +13 при pH 7 для OtTx 1 и OtTx 2, соответственно; pl ~11) и, согласно расчетам, проявляет склонность к формированию а-спирапи. Положительно заряженные и гидрофобные остатки расположены таким образом, что при спирализации полипептидной цепи они образуют кластеры. Такие свойства характерны для мембрано-активных и антимикробных пептидов из ядов различных пауков, в том числе О. takobius. Таким образом, OtTx образуют новый класс токсинов пауков, спайдери-нов, объединяющих N-концевой линейный и С-концевой ICK домены.
CITX1a-NN , 129 I
Oxyopinin 2а Рвав-mvfuH.rs i/Jb?»:;vgkvr»o iwtas.'«mo-Ж 32
§§ш шштжтшшштшяшшшшшштж и
Рисунок 3. Сравнение последовательностей OtTx la с другими пептидами из яда пауков. Вверху N-концевой модуль OtTx la (OtTx la-N) показан в сравнении с N-концевым фрагментом цитоинсек-тотоксина la (CIT la-N) и оксиопинином 2а. Внизу: С-концевой модуль токсина (OtTx la-С) в сравнении с окситоксинами 1 и 2. Положительно заряженные остатки выделены жирным шрифтом. Идентичные а. о. отмечены светло-серым фоном, консервативные остатки цистеина- темно-серым. Доля остатков, идентичных OtTx la, показана справа (здесь и далее использовалась программа Vector NTI).
Как и другие токсины пауков, OtTx синтезируются в составе белков-предшественников, состоящих из трех фрагментов: N-концевого сигнального (пре-) пептида, пропептида и зрелого токсина. Пропоследовательность имеет кислый характер (при рН 7 ее заряд равен -14, pl ~3). Вероятно, взаимодействуя с положительно заряженным N-концевым линейным доменом зрелой цепи, она ингибирует его цитолитическую активность.
Получение полноразмерного OtTx la и его фрагментов
Мы разработали систему получения рекомбинантного токсина OtTx la в культуре Escherichia coli (штаммы BL, Origami В). Токсин синтезировался в виде химеры с белком-помощником тиоредоксином (Trx-OtTx la). В состав гибридного белка были введены природный пропептид из белкового предшественника OtTx la, последовательность из 6 остатков гистидина для очистки гибридного белка аффинной хроматографией и остаток метионина для специфичного расщепления BrCN (рис. 4, А). После расщепления гибридного белка целевой полипептид выделяли с помощью ОФ-ВЭЖХ (рис. 4, Б), выход составил 0,5 мг/л культуры. Совпадение молекулярных масс, хроматографической подвижности и инсектицидной
активности рекомбинантного и нативного токсинов свидетельствует в пользу их идентичности.
Для изучения функциональной роли каждого из модулей OtTx la мы получили его производные OtTx la-AMP и OtTx la-ICK, соответствующие его отдельным доменам. Пептид OtTx la-AMP соответствует N-концевому домену OtTx la (а. о. 1 - 41). OtTx la-AMP был получен методом твердофазного химического синтеза в лаборатории протеомики ИБХ РАН.
Рисунок 4. Структура гибридного белка Trx-OtTx la (А) и очистка методом ОФ-ВЭЖХ рекомбинантного токсина OtTx lu после расщепления Trx-OtTx la BrCN (Б). Функциональные элементы Trx-OtTx la показаны схематично прямоугольниками. Тгх — домен тио-редоксина; Hist - олигогистидиновая последовательность; M - остаток метионина, введенный непосредственно перед зрелым полипептидом OtTx la. Числа над схемой соответствуют номерам а. о. химерного белка. (Б) Фракция, содержащая OtTx la, отмечена звездочкой.
Полипептид OtTx la-ICK соответствует С-концевому домену OtTx la (а. о. 50 - 108). Способ получения OtTx la-ICK аналогичен примененному ранее для OtTx la, за исключением того, что в состав гибридного белка Trx-OtTx la-ICK не вводилась последовательность пропептида. Только в штамме Е. coli Origami В был высокий выход рекомбинантного полипептида, однако правильного образования дисульфидов не происходило, и наблюдалось несколько конформаций. Для получения OtTx la-ICK в нативной конформации гибридный белок подвергали процедуре рефолдинга, во время которой тиольные группы окислялись кислородом воздуха. Затем Trx-OtTx la-ICK расщепляли BrCN и анализировали методом ОФ-ВЭЖХ. О получении единственной конформации полипептида и однозначного замыкания дисульфидных мостиков судили по форме хроматографического профиля. Молекулярная масса полученного таким образом OtTx la-ICK точно соответствовала расчетной массе. Выход продукта составил 5 мг/л культуры, что значительно превышает выход полноразмерного рекомбинантного токсина.
Вторичная структура OtTx la
Алгоритмы предсказания вторичной структуры и спектры кругового дихроизма, полученные для полноразмерного токсина и его производных, показывают, что OtTx la состоит из двух доменов. N-Концевой фрагмент в окружении, имитирующем мембранное, склонен формировать a-спираль (рис. 5). Для С-концевого фрагмента характерна высокая склонность
А
117 154 194 302 _.... _I I_I_
ira Нн, l'ro M OtTx la
к формированию Р-тяжей и р-изгибов, что согласуется с предположением о том, что для него характерен ноттиновый фолд. В окружении, имитирующем мембранное (50% трифторэтанол (ТФЭ), 20 мМ додецилсульфат натрия (ДСН)), вторичная структура СИТх 1а-1СК меняется крайне незначительно.
190 200 210 220 230 240 250 А, нм
Рисунок 5. (А) Спектры кругового дихроизма и (Б) проекция спиральной сети пептида OtTx 1а-АМР. (А) Кривая 1 - спектр пептида в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,2), кривая 2 — спектр пептида в 50% ТФЭ, кривая 3 - в 20 мМ ДСН. (Б) Положительно заряженные остатки обозначены белыми кругами, гидрофобные остатки - черными, остатки глицина - темно-серыми, гидрофильные незаряженные остатки - светло-серыми. Гидрофобные кластеры обведены пунктирными линиями.
Биологическая активность OtTx la и его производных
Токсин OtTx la проявляет инсектицидную и цитолитическую активности. В тестах на личинках мясной мухи Sarcophaga carnaria полулетальная доза (ЛД5о) составила 75 мкг/г (6,3 нмоль/г), а значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) роста бактериальных культур находятся в диапазоне 1 - 10 мкМ (табл. 1). Для того чтобы выяснить, какая часть токсина является функционально важной, мы протестировали активность OtTx 1а-АМР и OtTx la-ICK.
OtTx 1а-АМР обладает тем же действием, что и полноразмерный токсин: ЛД50 на личинках мясной мухи составила 50 мкг/г (11 нмоль/г), а значения МИК для разных видов бактерий были в том же диапазоне концентраций. OtTx 1а-АМР не только ингибирует бактериальный рост, но и обладает бактерицидной активностью. Для Staphylococcus aureus и Entero-coccus faecalis значения минимальной бактерицидной концентрации и МИК совпадают (табл. 1). Бактерицидное действие OtTx 1а-АМР связано с образованием дефектов в цитоплазмати-ческой мембране. Этот пептид способен индуцировать лизис эритроцитов (при концентрации -8 мкМ наблюдается 50%-ный выход гемоглобина) и вызывать гибель клеток А549 и HeLa (50%-ная гибель наблюдается при концентрациях ~20 мкМ и -15 мкМ, соответственно). Способность пептида OtTx la-AMP взаимодействовать с клеточными мембранами подтвердилась с помощью метода соосаждения с липосомами. OtTx 1а-АМР связывается с липо-сомами, имитирующими как бактериальные, так и эукариотические мембраны. OtTx la-ICK,
в отличие от полноразмерного токсина и его линейного фрагмента, не показал инсектицидной и антибактериальной активности.
Бактериальный штамм Пептиды
OtTx 1 а | OtTx la-AMP | OtTx la-ICK
МИК, мкМ
Arthrobacter globiformis ВКМ Ac-1112 0,6-1,25 0,6 - 1,25 >25
Bacillus subtilis ВКМ В-501 0,12-0,25 0,12-0,25 >25
Е. faecalis ВКМ В-871 - 5-10 -
Е. coli DH5 0,12-0,25 0,12-0,25 >25
Pseudomonas, aeruginosa РАО 1 6-12 0,37-0,75 >25
S. aureus 209P - 0,6-1,25 -
Таблица 1. Антимикробная активность OtTx 1а и его модулей.
Анализ кДНК двудоменных токсинов Охуорея
Всего в библиотеке кДНК из ядовитых желез О. /акоЫш было обнаружено 15 последовательностей, кодирующих спайдерины. С помощью амплификации кДНК из ядовитых желез были установлены 6 последовательностей, кодирующих спайдерины О. Нпеа1и.ч (01Тх, рис. 6) (номера в вепБапк КР766543 - КР766559, КР766561).
Рисунок 6. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения последовательностей предшественников спайдеринов. Масштабная линейка соответствует количеству нуклеотидных замен на один сайт вдоль ветви. Уровни поддержки указаны рядом с соответствующими ветвями. Стрелками указаны предшественники токсинов, выделенных из яда О. ТакоЫш, жирными точками - те, для которых также была установлена последовательность соответствующих фрагментов геномной ДНК.
Последовательности кДНК были транслированы т .чШсо, были определены последовательности сигнальных пептидов и пропептидов (рис. 7). В общей сложности были обнаружены 19 новых последовательностей токсинов, относящихся к семейству спайдеринов. Сигнальные пептиды и пропептиды идентичны друг другу, либо проявляют высокий уровень сходства, в то время как зрелые фрагменты более вариабельны. Зрелые пептиды можно объединить в два подсемейства, различающиеся по длине: Ох-1 (109 - 114 а. о.) и Ох-П (135 -142 а. о.). К подсемейству Ох-1 были отнесены 14 последовательностей: ОГГх 1а- 1е, ОЛ"х 2а - 2£ и 01Тх 1а - 1с. ОГГх За и ЗЬ и 01Тх 2а - 2с были помещены в подсемейство Ох-П. Разница в длинах между семействами Ох-1 и Ох-П обусловлена разницей в длинах ТМ-концевых
доменов зрелых полипептидов (рис. 8). Ноттиновые домены более консервативны (как минимум 59% идентичных а. о.), а у некоторых токсинов они даже идентичны (как на уровне белка, так и на уровне кДНК).
Структура генов спайдеринов
С помощью амплификации и секвенирования фрагментов геномной ДНК были определены последовательности генов, кодирующих токсины 01Тх 1а, 01Тх 1Ь и 01Тх 2а (рис. 7). Последовательность, кодирующая 01Тх (номер в ОепВапк КР766560) была найдена только на уровне геномной ДНК, но не кДНК. Как и большинство генов однодоменных токсинов, гены двудоменных токсинов О. Нпеаш оказались безинтронными.
ДНК aacatcgttttc*aaatgaagatcgctttggttttactaggcctctgtgccttgtacctggtacaagctaccggtgagca* белок Н- - К- -I- А- L- V- -Ь- L- С- L- -С- А- Ь- У- L- V- -Q- - А- Т- - О- Е- -Q-
Сигнальный пептид Пропвптид
ДНК gagacagaattagaagcgtcagaactgcaagaattggaagatgctctagacctcattgatgagaaatcttttgaatcactg белок -Е- Т- Е- -L- -Е- А- -S- Е- -Ь- -О" Е• -L- -Е- D- ■*• D- -I - -D • - Е -К' - S- F -Е - - S- Ь-
ДНК gaggaggaaatggagatagctaggaaaaaatcaaaatcccgaagaggtggaaaatctgga§j^P^I|^y||ä^|i||ggaaaa белок -Е- Е -Е - -М -Е- - I- А -R- К- К -S--К -S- R- -R- -в- в- К- -S -G- К--S- -G- К--3- S- -К-
Линейный домен
ДНК tctggaaaacccaaaggcttcatggacaaageaaaagatctctaccagaaaggagaaagaattgccaagaacaaggacgtg беЛОК S- G- К К-O-F- И- D- К-А -К- О- L "I- 8- К- О -Е- -R- ■!■■*• -К- -И-- К- D- V-
ДНК caggcggcggcaaaattcggcatgeagtttctcagtaacttagcgacaggtggtggatcacaccagccgggaactcccgtc белок Q • А' А А -К F- -G М- а -S- N-V А - G- G- G -S -Н- Q -Р - G- -Т- ■ Р V-
Домен ICK
ДНК ggcaacaacaagtgctgggccctcggtaccacctgcagcaatgactgcgactgctgtcccgagcaccactgccactgtcca белок G- к- Н- К -С- W -А- I.- G- Т- Т- С- S- Н D- С D- С- с- Р -Е- Н- - й- С- Н -С -Р-
ДНК gctaaaaactggfctgcccggtcttetcagatgctattgccatgacaacaaggaacattccaacaaggttaataagtgtcct беЛОК -А- К- Н• ■«• -Ь- P--G- L- -Ь- -R-'C- -К - -С- Н- D- -М- К- Е- Н- -S- И--К- V- Ы- К--С- Р-
ДНК ccegctgaggaacctgcggctgagtagact белок Р- -А- Е- Е- Р- А А- Е- •*•
Рисунок 7. Ген, кодирующий OlTx 2а. Сигнальный пептид, пропептид, линейный и ICK домены обозначены стрелками. Возможный донорный сайт сплайсинга выделен темно-серым цветом.
pOxyTx-1 pOxyTx-3 jpOtTx-la 'ípOlTx- la ¡pOtTx-3a || p01Tx-2a IpOlTx—2c
pOxyTx-1 pOxyTx-3 ipotTx-la MpOlTx-la tp0tTx-3a || p01Tx-2a |pOXTx-2c
pOxyTx-1 pOxyTx-3 ipOtTx-la 'IpolTx-la ipOtTx-3a || p01Tx-2a ¡p01Tx-2c
Рисунок 8. Сравнение белков-предшественников однодоменных нот типовых токсинов (ОхуТх 1 и ОхуТх 3) и спайдеринов, принадлежащих к подсемействам Ох-1 (01'Гх 1а и 01Тх 1а) и Ох-11 (О)Тх За, 01Тх2а и 01Тх2с). Идентичные остатки выделены светло-серым цветом, консервативные остатки цистеина зрелой цепи - темно-серым. Сайты процессинга Р()М отмечены курсивом и звездочками, линкерная последовательность между доменами - горизонтальной скобкой. «Дополнительная» последовательность обозначена точками, «базовая» последовательность - фрагмент между «дополнительной» и линкерной последовательностями. Повторы 0(у-1.ун-Нег помещены в прямоугольники.
Анализ молекулярной эволюции двудоменных токсинов Oxyopes
Методом Нея-Годжобори с помощью программы MEGA 5 был проведен анализ скорости эволюции фрагментов генов, кодирующих сигнальные пептиды, пропептиды, а также линейные и ноттиновые домены спайдеринов (всего 20 последовательностей). Действие мощного отрицательного отбора было зафиксировано не только для сигнальных пептидов и пропептидов, но и для зрелых доменов (табл. 2). Попарное сравнение последовательностей выявило положительный отбор, действующий в парах OtTx 2а - OtTx 2е и OtTx 2b - OtTx 2е между их N-концевыми доменами. Последний вывод, однако, не проходит поправку Бонфер-рони для множественных сравнений, поэтому нельзя исключить, что этот результат является ложноположительным. Дальнейшее попарное сравнение мы проводили методом максимального правдоподобия в программе CODEML из пакета программ PAML, и он подтвердил наши наблюдения. Подавляющее большинство пар N-концевых доменов подвергается отрицательному отбору: со<0,3 для 45,2% пар, и 0,3<со<0,9 для 48,4% пар, где m=dN/ds. Однако для пар OtTx 2а - OtTx 2е и OtTx 2b - OtTx 2е значение со достигало 15,3, и оно было больше 2 для четырех других пар, что можно интерпретировать как признак положительного отбора. Аналогичный анализ, проведенный для С-концевых доменов и препро-последовательностей, показал тенденцию к отрицательному отбору без каких-либо указаний на положительный отбор. Таким образом, гены, кодирующие двудоменные токсины Oxyopes, консервативны,
Сигнальный пепт._Про пептид
L
однако положительный отбор может действовать на N-концевой домен. Это было проверено и подтверждено тестами отношения правдоподобия (LRT, от англ. likelihood ratio test) (табл. 3). Оба теста показали, что последовательности, кодирующие зрелые пептиды, подвержены положительному отбору, хотя М7/М8 LRT был менее значим, чем М1а/М2а LRT. Модели М2а и М8, допускающие положительный отбор, показали, что только сайт Leu-14 (нумерация по последовательности OlTx la) подвержен положительному отбору (Р>95%), этот сайт относится к N-концевому домену.
Фрагменты белка-предшественника Р ds-dN Количество сайтов, использованных в анализе
Сигнальный пептид 0,039 1,783 18
Пропептид 0,017 2,149 39
Линейный домен 0,0001 3,951 46
Ноттиновый домен 0,001 3,216 58
Таблица 2. Результаты Z-mecma на отрицательный отбор для сигнальных пептидов, пропеп-тидов, линейных и ноттиновых доменов спайдеринов. с1$и с1ц- количество синонимичных и несинонимичных нуклеотидных замен на сайт, соответственно, р — вероятность того, что нулевая гипотеза о нейтральности (с1ц = с/$) будет отвергнута в пользу альтернативной гипотезы (с1ц < с1§). Значения р<0,05 считали значимыми.
Модель InL 2Д/ Уровень значимости Сайты под действием положительного отбора
М1а -1627,942613 6,361392 р<0,05 14 L
М2а -1624,761917
М7 -1624,685734 4,749764 р<0,1 14 L
М8 -1622,310852
Таблица 3. Результаты тестов отношения правдоподобия (LRT) для двудоменных токсинов Oxyopes. 2dl=2x(InL-lnL0), где Lo — модель, не допускающая положительного отбора (Mía и М7). Значения 2Al сравнивали с таблицей значений % для двух степеней свободы, р—уровень значимости.
Структура двудоменных спайдеринов выглядит мозаичной, поэтому мы провели поиск генов, гомологичных их возможным предкам. Мы не обнаружили значимого сходства между N-концевым линейным доменом спайдеринов и каким-либо другим известным белком. С-Концевой домен ICK, однако, проявляет значимое сходство с окситоксинами (-45% идентичных а. о.). В библиотеке кДНК из ядовитых желез О. takobius был проведен поиск последовательностей, гомологичных спайдеринам. Для этого мы извлекли из библиотеки последовательности, кодирующие предшественники токсинов (в том числе ОхуТх 1, зарегистрирован в GenBank под номером KF766562). Сравнение извлеченных белков и последовательностей N-концевого домена спайдеринов с помощью программы BLASTP не показало значимого сходства между ними. Однако последовательности препропептидов и С-концевых доменов двудоменных токсинов демонстрировали значимый уровень сходства с соответст-
вующими последовательностями однодоменных ноттиновых токсинов (около 40% сходства, рис. 8).
Выделение новых двудоменных токсинов из яда паука С. рипсШ'шт
В яде паука С. рипсЮгшт ранее тоже были обнаружены двудоменные токсины, которые, однако, относятся к другому структурному классу - они состоят из двух ноттиновых доменов (УаввПеузк! е? а!. 2010). Были найдены новые представители этого класса, получившие название СрТх-подобных токсинов.
Цельный яд С. рипсЮгшт фракционировали с помощью двустадийной хроматографии (гель-фильтрация и ОФ-ВЭЖХ). В результате профиль ОФ-ВЭЖХ содержал 4 пика (рис. 9). Ранее уже было опубликовано, что пик 3 соответствует токсину Ср'Гх 1. Полипептиды из пиков 1, 2 и 4 были названы СрТх 2а, СрТх За и СрТх 4а, соответственно. Сначала мы установили частичные 1Ч-концевые аминокислотные последовательности новых токсинов методом деградации по Эдману, а затем путем их сопоставления с последовательностями транслированных кДНК были получены полные последовательности (табл. 4). Токсины СрТх 2а, СрТх За и СрТх 4а обладают инсектицидной активностью.
№ пика Молекулярная масса 1Ч-Концевая последовательность Название токсина
1 14970 ОККС1ЕКМК.ЕСТЫОЯНССС11 СрТх 2а
2 14980 TCVPRDGDCTENRKACCR.SK СрТх За
3 15100 ОКТС1ЕКЫКЕСТНОЯНОССК СрТх 1а- 1с
4 15080 ASCTERKHDCTKDRHSCCRG СрТх 4а
Таблица 4. Токсины, идентифицированные в яде С. рипсШшт. Номера пиков соответствуют ну-
Токсин ЛД50, нмоль/г ПД50, нмоль/г
СрТх 2 >3,3__2,2-3,3
СрТх 3 2,2 - 3,3__1,7-2,2
СрТх 4 2,2 - 3,3 | 1,7-2,2
Таблица 5 (вверху). Результаты теста на ин-сектотоксичность СрТх на личинках мясной мухи S. сагпапа. ЛД50 - 50% летальная доза, ПД5„ — 50% паралитическая доза.
Рисунок 9 (слева). Разделение методом ОФ-ВЭЖХ фракции из яда С. рипс1опит, содержащей компоненты с массой 15 кДа. I -СрТх 2а, 2 — СрТх За, 3 — СрТх 1а-с и 4 СрТх 4а.
мерации на хроматограмме на рис. 9.
Последовательности кДНК, кодирующие двудоменные токсины С.рипсШшт
Ранее уже сообщалось о трех последовательностях кДНК, кодирующих токсины СрТх 1а, СрТх 1Ь и СрТх 1с. Мы нашли 12 новых последовательностей, проявляющих сходство с СрТх 1 - 3, обнаруженными в яде (номера в ОепВапк КГ 155268 - КГ 155271 и КТ155273 -КТ155280).
Для дальнейшего анализа полученные последовательности кДНК обрабатывались 1п .чШсо. На рис. 10 показана организация белков-предшественников СрТх 1а, СрТх 2а и СрТх За (рСрТх 1а, рСрТх2а и рСрТх За). Токсин СрТх 2а (расчетная молекулярная масса 14971 Да) амидирован на С-конце (так же, как СрТх 1а - 1с). У СрТх За отсутствует С-концевой остаток аргинина белка-предшественника (номера в иЫРпЛ С0Н.Ш4 и С0НГО5).
рСрТх 1а рСрТх2а рСрТх За
рСрТх 1а рСрТх 2а рСрТх За
рСрТх 1а рСрТх 2а рСрТх За
1 Сигнальный пептид 20
MKrst.rrbrvi.'rwivt,HACLs 100%
мкгЗьеВнйъШхВщм 80%
-ALYLLGLÉXFBYBBsS 35%
Пропептид
CpTx-N
СрТх-С
100% 82% 36%
100% 84% 46%
100% 62% 42%
Рисунок 10. Сравнение последовательностей белков-предшественников токсинов СрТх 1а, СрТх 2а и СрТх За. Идентичные остатки выделены серым фоном, остатки цистеина — темно-серым, сайты Р()М - курсивом и звездочками. Стрелкой отмечен сайт процессинга. Доли идентичных остатков относительно рСрТх 1а показаны отдельно для сигнальных пептидов, пропептидов и зрелых 1)епей.
Методом ближайшего соседа были построены филогенетические деревья для фрагментов кДНК, кодирующих препро-последовательности и зрелые цепи (рис. 11). Дерево «зрелых токсинов» состоит из трех ветвей, каждая из которых несет листья, соответствующие идентифицированным в яде соединениям (СрТх 1а - 1с, СрТх 2а, и СрТх За). Разница между последовательностями на каждой из ветвей заключается в нескольких точечных нук-леотидных заменах. Топология «препропептидного» дерева и дерева «зрелых токсинов» в значительной мере совпадает. Таким образом, на уровне последовательностей кДНК мы обнаружили три группы двудоменных токсинов С. рипаогшт'. СрТх 1, СрТх 2 и СрТх 3. Новые токсины получили названия СрТх 1(1 - 1 й, СрТх 2а, 2Ь и СрТх За - 31".
Дерево препропептидов
СрТх1 чз
н
60||2Ь *ЭТ-2а
60(|2Ь СрТхг'-га
СрТхЗ
1я
1С« М 1е 1а 1Ь 1(1
Дерево зрелых токсинов
г«
Не • -1(1
СрТх1 99^-1е
СрТх2 99
СрТхЗ
0,05
-1а
-1д -1Ь *■ -2а -2Ь ■за
I ЗЬ -ЭГ г За ■»-
• Зе
■ 3с
г за
I гз
Рисунок 11. Филогенетические деревья, построенные методом ближайшего соседа на основе сравнения фрагментов кДНК, кодирующих препро-последователыюсти и зрелые токсины СрТх.
Масштабные линейки соответствуют количеству нуклеотидных замен на сайт вдоль каждой ветви. Уровни поддержки для групп СрТх 1, СрТх 2 и СрТх 3 указаны над соответствующими ветвями. Стрелками указаны последовательности, кодирующие токсины, выделенные из яда С. рипсЮпит, жирными точками - те, для которых также была установлена последовательность соответствующих фрагментов геномной ДНК.
Молекулярная эволюция двудоменных токсинов С. рипсЮпит
Методом Нея-Годжобори была проанализирована скорость эволюции на различных участках генов, кодирующих фрагменты белков-предшественников (табл. 6).
Группа токсинов Сигнальный пептид Пропептид Зрелая цепь
Р Количество сайтов*** Р с15-с1м Количество сайтов*** Р Количество сайтов***
СрТх 1 Идентичные* Идентичные* 0,003 2,86 135
СрТх 2 Идентичные* Идентичные* 0,039 1,78 132
СрТх 3" Идентичные* Идентичные* 0,073 1,46 132
СрТх 1а -СрТх 2а 0,161 0,99 18 0,030 1,89 27 0,000 5,96 128
СрТх 1а -СрТх За 0,00В 2,47 0,001 2,39 0,000 3,44
СрТх2а -СрТх За 0,012 2,28 0,009 2,36 0,002 3,03
Таблица 6. Результаты ¿-теста на отрицательный отбор для фрагментов генов, кодирующих сигнальные пептиды, пропептиды и зрелые цепи белков-предшественников СрТх. с/}: и с1ц — количество синонимичных и несинонимичных нуклеотидных замен на сайт, соответственно, р - вероятность того, что нулевая гипотеза о нейтральности (с!ц = с!ц) будет отвергнута в пользу альтернативной гипотезы (с!ц < (1$). Значения р<0,05 считали значимыми. * Идентичные либо содержащие одну нуклеотидную замену последовательности. **В некоторых парах был зафиксирован положительный отбор (р<0,05, (1ц — ~ 2). *** Количество сайтов, использованных в анализе.
Отрицательный отбор действует как на препропептиды, так и на зрелые цепи. Внутри группы СрТх 3 в некоторых парах последовательностей (СрТх За - СрТх 3£ СрТх Зс -СрТх 31) наблюдается положительный отбор (р<0,05, однако не проходит поправку Бонфер-рони на множественное сравнение). Дальнейший филогенетический анализ методом макси-
мального правдоподобия также подтвердил наши наблюдения. Для зрелых последовательностей результаты обоих тестов ЬЯТ не были значимыми, поэтому нельзя предположить, что на них действует положительный отбор. Таким образом, ускоренная эволюция не свойственна двудоменным токсинам С. рипс1огшт, и отрицательный отбор действует на всех отрезках предшественников токсинов.
Структура двудоменных СрТх-подобных токсинов выглядит мозаичной. 14-Концевые домены (СрТх-1Ч) и С-концевые домены (СрТх-С) этих токсинов проявляют лишь умеренное сходство (16 - 23%). Скорее всего, появление СрТх-подобных токсинов связано с эволюционным слиянием отдаленно родственных ноттиновых пептидов. Среди известных последовательностей наибольшее сходство с фрагментами, кодирующими отдельные домены СрТх, проявляют кДНК ЬЭТХ из ядовитых желез паука Ьусоьа (рис. 12). В ходе эволюции в геноме С. рипс1огтт могла иметь место «миграция» последовательности, кодирующей зрелый пептид гипотетического гомолога Ь8ТХА1, в ген, кодирующий гипотетический гомолог ЬБТХС!.
Рисунок 12. Сравнение фрагментов белка-предшественника рСрТх2а с соответствующими фрагментами LSTXC1 и LSTXA1. Препропептиды обозначены как «-ргерго», зрелые цепи - «таг». Идентичные остатки показаны на сером фоне, остатки гцютеина в зрелых ¡¡епях - на темно-сером, сайты PQM - курсивом и обозначены звездочками. Справа указана доля идентичных остатков относительно рСрТх 2а.
Гены, кодирующие двудоменные токсины С. punctorium
С помощью специфических праймеров мы амплифицировапи и секвенировали фрагменты геномной ДНК паука С. punctorium, кодирующие двудоменные токсины. Были идентифицированы гены белков-предшественников СрТх 1с, СрТх За и СрТх 3g (номера в GenBank KF255415 - KF255417). Гены двудоменных токсинов С. punctorium не содержат нитронов.
Изучение активности модулей двудоменных токсинов паука L. tarubaevi
Цитоинсектотоксины (CIT) L. tarabaevi составлены из двух модулей, каждый из которых склонен к формированию амфипатической а-спирали и соответствует «обычному» цитотоксину из яда пауков (Vassilevski et al. 2008). В лаборатории протеомики ИБХ РАН были получены производные CIT 1а, соответствующие N-концевому (CIT la-N, а. о. 1 - 34) и С-концевому (CIT 1а-С, а. о. 39 - 69) модулям. В окружении, имитирующем мембранное (50%
ТФЭ, суспензии 1,2-диолеоил-глицеро-З-фосфохолиновых (ДОФХ) и 1,2-диолеоил-глицеро-З-фосфоглицерол/1,2-диолеоил-глицеро-З-фосфоэтаноламиновых (ДОФГ/ДОФЭ) липосом, 20% ДСН), фрагменты С1Т 1а приобретают а-спиральную конформацию, а в воде преобладает неупорядоченная структура (рис. 13).
Рисунок 13. Вторичная структура пептидов С1Т 1а-1У и С1Т 1а-С. (А) Спектры кругового дихроизма пептидов С1Т ¡а-И и С1Т 1а-С в разных растворителях: 1 - 50% ТФЭ, 2 - суспензия ДОФГ/ДОФЭ липосом, 3 - суспензия ДОФХ липосом, 4 - вода, 5-20 мМДСН. (Б) Проекции спиральной сети С1Т 1а-^ и С1Т 1а-С. Положительно заряженные остатки обозначены белыми кругами, гидрофобные остатки - черными, остатки глицина - темно-серыми, гидрофильные незаряженные остатки - светло-серыми, отрицательно заряженные остатки - белыми кругами с двойной линией по краю.
В тестах на антимикробную активность оказалось, что С1Т 1а-1М значительно активнее, чем С1Т 1 а-С, а полноразмерный пептид, в свою очередь, значительно активнее, чем каждый из его фрагментов или их эквимолярная смесь (табл. 7).
Бактериальный штамм Полипептид
С1Т 1а, по УаязНеуйк! е1 а!. 2008 С1Т 1а-Ы С1Т 1а-С Эквимолярная смесь
МИК, мкМ
Е. соИ ОН5<х 0,6 5-10 40-80 2,5-5
В. зиЫНи ВКМ В-501 0,9 1,3-2,5 20-40 1,3-2,5
Таблица 7. Минимальные ингибирующие концентрации С1Т 1а и его производных С1Т /«-/V и С1Т 1а-С.
Таким образом, в действии модулей наблюдается синергизм. В тестах на инсектицидную активность на личинках мясной мухи S. carnaria вплоть до дозы ~55 нмоль/г CIT la-N и CIT 1а-С оказались неактивны.
Обсуждение результатов
Получение рекомбинантных полипептидов
Линейные катионные пептиды с мембранолитической активностью являются цито-токсичными и легко подвергаются расщеплению внутриклеточными протеазами. Правильное сворачивание дисульфид-богатых пептидов в цитоплазме бактериальных клеток затруднено, так как в ней поддерживается восстановительный потенциал. Токсин OtTx la является гай-мерой» линейного и дисульфид-богатого пептидов, поэтому получение его рекомбинантного аналога в системе Е. coli сопровождалось трудностями, свойственными для каждого из типов пептидов.
Тиоредоксин оказался наиболее подходящим белком-помощником при получении токсина OtTx la, поскольку он способствует повышению растворимости рекомбинантных белков и формированию дисульфидных связей в цитоплазме штаммов, мутантных по генам тиоредоксин-редуктазы и глутатион-редуктазы (например, Origami В), а также маскированию мембранолитической активности антимикробных пептидов. Введение природного про-пептида OtTx la в состав гибридного белка Trx-OtTx la, с одной стороны, несколько снизило мембранолитическую активность линейного домена, а с другой - защитило сам линейный домен от внутриклеточных протеаз. Однако даже использование этих подходов позволило нам достичь выхода лишь 500 мкг/л, что в 10 раз ниже, чем в случае OtTx la-ICK, не имеющего цитолитического домена.
При получении полноразмерного токсина OtTx la происходило правильное замыкание дисульфидных мостиков, и токсин выделялся из клеток в нативной конформации, при этом его выход был низким. Вероятно, в случае OtTx la-ICK образование нескольких кон-формаций происходило в связи с накоплением Trx-OtTx la-ICK в цитоплазме клеток в слишком высокой концентрации. Кроме того, формированию правильной пространственной структуры могут способствовать пропептид и линейный домен OtTx la, которые отсутствуют в составе химерного белка Trx-OtTx la-ICK. Тиоредоксин, несомненно, способствовал однозначному замыканию дисульфидов, так как только в его присутствии процедура рефол-динга приводила к образованию одного продукта.
Спайдернны Oxyopes — новый класс двудоменных токсинов
В этой работе впервые описаны спайдерины, обладающие уникальной модульной архитектурой. N-Концевая часть OtTx (OtTx-AMP) соответствует однодоменным цитотокси-нам, лишенным остатков цистеина. Так, OtTx la-AMP несет высокий положительный заряд
(+16 при pH 7, 39% остатков лизина) и в окружении, имитирующем мембранное, склонен формировать структуру амфипатической а-спирали, что было предсказано расчетными методами, а затем подтверждено экспериментально. На поверхности а-спирали наблюдается четкое разделение гидрофильного и гидрофобного кластеров (рис. 5). Кроме того, с помощью соосаждения с липосомами было показано, что линейный домен связывается с мембранами. Более того, OtTx la-AMP способен разрушать мембраны, поэтому обладает сильной цитолитической активностью. Он эффективно убивает бактериальные и эукариотические клетки в микромолярных концентрациях, и его неизбирательная активность сравнима с токсичностью компонента из яда пчелы — мелиттина. По-видимому, N-концевой домен является главной функциональной частью OtTx la.
С-Концевая часть OtTx la (OtTx la-ICK) содержит типичный мотив ICK, наиболее распространенный среди нейротоксинов пауков. Более того, значимый уровень сходства наблюдается между OtTx la-ICK и однодоменными ноттиновыми токсинами из яда того же паука или близкородственных видов. Функциональная роль С-концевого домена в настоящее время не установлена.
Синергизм модулей цитоинсектотоксинов L. tarabaevi
Цитоинсектотоксины обладают антимикробной и, что необычно для линейных цито-литиков, высокой инсектицидной активностью. Для токсичности необходимы оба модуля, причем механизм действия CIT 1а основывается на их синергизме. Скорее всего, N-концевой модуль является ответственным за цитолитическую активность CIT la, а С-концевой играет роль «усилителя». Синергизм в действии фрагментов был ранее обнаружен, например, у модульного токсина CsTx-1 из яда Cupiennius salei.
Разнообразие двудоменных токсинов пауков
К настоящему времени описано 4 структурных класса модульных (или двудоменных) токсинов (табл. 8), выделенных из ядов пауков разных таксономических групп, зачастую находящихся лишь в отдаленном родстве. Интересно, что в яде скорпионов были найдены модульные токсины скорпины, построенные аналогично спайдеринам: они содержат N-концевой антимикробный модуль, за которым следует С-концевой дисульфид-богатый домен.
N-Концевой модуль С-Концевой модуль
АМР ICK
АМР АМР+АМР, цитоинсектотоксины из яда L. tarabaevi AMP+ICK, OtTx из яда О. takobius
ICK ICK+AMP, LtTx из яда L. tarabaevi, CsTx-1 из яда С. salei ICK+ICK, СрТх из яда С. punctorium, DkTx из яда Haplo-pelma schmidti
Таблица 8. Разнообразие модульных токсинов в ядах пауков.
В этой работе было рассмотрено разнообразие токсинов структурных типов AMP-ICK (спайдеринов) и ICK-ICK (СрТх-подобных токсинов). В обоих случаях компоненты яда образуют несколько групп, которые представляются результатом недавних дупликаций генов, поскольку последовательности в составе каждой различаются лишь небольшим количеством мутаций. Различия между группами более значительны.
Были установлены 20 аминокислотных последовательностей двудоменных токсинов пауков рода Oxyopes (13 у О. takobius и 7 у О. lineatus). Их можно разделить 2 группы (Ох-1 и Ох-11, рис. 6) благодаря вариабельности линейных доменов, которая значительно выше, чем у ICK-доменов (рис. 8). Аналогичная ситуация наблюдается среди латартоксинов L. tarabaevi, структура которых «инвертирована» относительно спайдеринов (ICK+AMP вместо AMP+ICK). Вероятно, более высокий уровень вариабельности линейных доменов обусловлен их мембрано-активной функцией. Для ее обеспечения достаточно определенного распределения заряженных и гидрофобных остатков, позволяющего формировать амфипати-ческую а-спирапь и не требующего закрепления специфичных а. о. в конкретных положениях. И наоборот, трехмерная структура ноттиновых доменов поддерживается цистеиновым мотивом, а взаимодействие со специфичной белковой мишенью требует более высокой консервативности последовательности.
Известно 15 полных аминокислотных последовательностей СрТх-подобных токсинов, образующих 3 группы (СрТх 1, СрТх 2 и СрТх 3), а на уровне фрагмента N-концевой аминокислотной последовательности зрелой цепи обнаружена четвертая группа СрТх 4. Зрелые последовательности групп СрТх 1 и СрТх 2 различаются в их С-концевых доменах больше, чем в N-концевых, что может свидетельствовать о функциональной важности последних. Ранее уже отмечалось, что CpTx-N более похожи на нейротоксичный энхансер CsTx-13 из С. salei, в то время как СрТх-С проявляют больше сходства с нейротоксинами CsTx-1 и CsTx-9 из того же яда. Вероятно, мы можем рассматривать токсины СрТх как химеры, обладающие «самоусиливающей» активностью.
Безинтронные гены двудоменных токсинов
Общим свойством генов двудоменных токсинов пауков, принадлежащих к родам Cheiracanthium и Oxyopes, является отсутствие интронов. Большинство изученных генов коротких пептидных токсинов пауков также не содержат интронов. Исключением является паук Diguetia canities, считающийся примитивным. Отсутствие интронов может способствовать поддержанию высокого уровня синтеза токсинов в ядовитых железах. Кроме того, оно может приводить к возрастанию частоты мутаций и, таким образом, к повышению разнообразия токсинов.
Молекулярная эволюция двудоменных токсинов пауков
Спайдерины (AMP+ICK), скорее всего, образовались в результате вставки линейного N-концевого домена в предковый ноттиновый токсин между пропептидом и зрелым пептидом. Возможно, линейный домен образовался из последовательности интрона, который располагался между экзонами, кодировавшими пропептид и зрелый пептид предкового токсина, или в результате инсерции фрагмента ДНК, кодирующего линейный фрагмент, в предковый ген однодоменного ноттинового пептида.
Можно предположить, что эволюционное появление СрТх-подобных токсинов связано с частичной дупликацией предкового гена, как это, скорее всего, произошло в случае с модульным токсином DkTx из яда Я. schmidti. Однако у СрТх-подобных токсинов сходство доменов лишь умеренное, поэтому они, по-видимому, кодируются химерными генами. Их предками могли послужить гены, гомологичные современным генам Istxal и Istxc паука L. singoriensis. Широко распространенный механизм образования химерных многодоменных белков - перетасовка экзонов, однако у генов модульных токсинов С. punctorium интроны не были обнаружены. Более вероятный эволюционный механизм в данном случае - транскрип-ционно-опосредованное слияние генов, описанное у млекопитающих.
Ускоренная эволюция не является ярко выраженной тенденцией среди двудоменных токсинов. В случае Oxyopes только линейные домены спайдеринов демонстрируют слабую склонность к положительному отбору, в то время как ноттиновые домены подвергаются отрицательному отбору. У паука С. punctorium зрелые двудоменные токсины тоже подвержены сильному отрицательному отбору. Такая тенденция поддерживает консервативность двудоменных токсинов и может свидетельствовать об их функциональной важности. Нельзя исключать, что невыраженность положительного отбора линейного домена спайдеринов и зрелой цепи СрТх-подобных токсинов может быть связана с их цитолитическими свойствами, аналогично другим неспецифичным токсинам.
Большинство коротких цистеин-богатых токсинов ядовитых моллюсков, змей и скорпионов эволюционируют ускоренно, однако такая тенденция у различных животных выражена в разной степени. Ядовитые моллюски Conus и змеи - относительно молодые таксоны, в которых под действием положительного отбора происходит «поиск» новых эффективных токсинов. Однако у более древних скорпионов, уже выработавших набор эффективных токсинов в начале своего эволюционного пути, токсины попали под давление отрицательного отбора. Скорее всего, у эволюционно древних пауков наблюдается аналогичная скорпионам ситуация.
Выводы
1. В яде паука Oxyopes takobius обнаружено новое семейство модульных полипептидных токсинов - спайдеринов. Установлены полные аминокислотные последовательности 4 токсинов, состоящих из 108 - 113 аминокислотных остатков. Спайдерины построены из N-концевого линейного и С-концевого дисульфид-богатого доменов. Они обладают мощной антимикробной, инсектицидной и цитолитической активностью, обусловленной линейным доменом.
2. Яд паука Cheiracanthium punctorium является уникальным по молекулярному составу с преобладанием модульных СрТх-подобных токсинов, состоящих из двух дисульфид-богатых доменов. Выделены 3 новых токсина с высокой инсектицидной активностью, для двух из которых определены полные аминокислотные последовательности из 131 аминокислотного остатка.
3. Исследована активность линейных модулей цитоинсектотоксина 1а из яда паука Lachesana tarabaevi. Для инсектицидной активности токсина необходимо присутствие обоих модулей, высокая антимикробная активность обеспечивается синергией двух фрагментов.
4. Анализ кДНК из ядовитых желез пауков О. takobius, Oxyopes lineatus и С. punctorium позволил идентифицировать 15 последовательностей спайдеринов и 12 последовательностей СрТх-подобных токсинов. Определены последовательности генов, кодирующих двудоменные токсины О. lineatus и С. punctorium. Показано, что они не содержат интронов.
5. Анализ механизмов молекулярной эволюции двудоменных токсинов Oxyopes и С. punctorium показало, что они подвержены действию отрицательного отбора. Предположено, что в ходе эволюции гены модульных токсинов образовались из генов од-нодомениых токсинов.
Список публикаций по теме диссертации
Статьи
1. Vassilevski А.А., Sachkova M.Y.. Ignatova A.A., Kozlov S.A., Feofanov A.V., Grishin E.V. Spider toxins comprising disulfide-rich and linear amphipathic domains: a new class of molecules identified in the lynx spider Oxyopes takobius. FEBS J. 2013, 280, 62476261.
2. Sachkova M.Y.. Siavokhotova A.A., Grishin E.V., Vassilevski A.A. Genes and evolution of two-domain toxins from lynx spider venom. FEBS Lett. 2014, 588, 740-745.
3. Sachkova. M.Y.. Siavokhotova, A.A., Grishin, E.V., Vassilevski A.A. Structure of the yellow sac spider Cheiracanthium punctorium genes provides clues to evolution of insecticidal two-domain knottin toxins. Insect Mol. Biol. 2014, doi: 10.111 l/imb.12097.
Тезисы докладов
1. Сачкова М.Ю.. Василевский А.А., Егорова Н.С., Гришин Е.В. Изучение активности нового модульного токсина SpdTx из яда паука Oxyopes takobius. ХХШ Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 7-10 февраля 2011, Москва, Россия.
2. Сачкова М.Ю.. Василевский А.А., Козлов С.А., Гришин Е.В. Новый модульный токсин OtTx из яда паука Oxyopes takobius. V Российский симпозиум «Белки и пептиды», 8-12 августа 2011, Петрозаводск, Россия.
3. Сачкова М.Ю.. Славохотова А.А., Василевский А .А., Гришин Е.В. Изучение организации генов двудоменных токсинов пауков рода Oxyopes. XXIV Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 7-9 февраля 2012, Москва, Россия.
4. Sachkova М.. Vassilevski A., Grishin Е. Spider toxin OtTx from Oxyopes takobius venom is the first member of a novel class of modular toxins. 37 конгресс Федерации Европейских биохимических обществ, 4-9 сентября 2012, Севилья, Испания.
5. Сачкова М.Ю.. Славохотова А.А., Василевский А.А., Гришин Е.В. Гены двудоменных токсинов пауков не содержат интронов. V Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома», 3-7 декабря 2012, Москва - Звенигород, Россия.
6. Сачкова М.Ю.. Ковальчук С.И., Василевский A.A., Гришин Е.В. Структурно-фунциональные исследования цитоинсектотоксинов из яда паука Lachesana tarabaevi, VI Российский симпозиум «Белки и пептиды», 11 - 15 июня 2013, Уфа, Россия.
7. Sachkova M.Y.. Slavokhotova A.A., Vassilevski A.A., Grishin E.V. Spider genes encoding two-domain toxins. 38 конгресс Федерации Европейских биохимических обществ, 6-11 июля 2013, Санкт-Петербург, Россия.
8. Сачкова М.Ю.. Славохотова A.A., Гришин Е.В., Василевский A.A. Гены и эволюция двудоменных пептидных токсинов пауков, XXVI Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 10-14 февраля 2014, Москва, Россия.
Заказ № 131-Р/04/2014 Подписано в печать 21.04.14 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2
ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 чч.' .,www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
04201458760 На ПРаваХ РУК0ПИСИ
Сачкова Мария Юрьевна
Двудоменные токсины ядов пауков
Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель к.х.н. Василевский А.А.
Москва-2014
Оглавление
Введение........................................................................................................................................5
Обзор литературы.......................................................................................................................7
1. Введение..............................................................................................................................7
2. Состав яда пауков...............................................................................................................7
2.1 Белковые компоненты яда..........................................................................................8
2.2 Пептидные компоненты яда.......................................................................................9
2.2.1 Однодоменные токсины......................................................................................9
2.2.2 Двудоменные токсины......................................................................................16
3. Организация белков-предшественников токсинов.......................................................21
4. Гены токсинов животных................................................................................................23
4.1 Гены токсинов пауков...............................................................................................23
4.1.1 Гены пептидных токсинов................................................................................23
4.1.2 Гены белковых токсинов...................................................................................24
4.2 Гены токсинов скорпионов......................................................................................24
4.3 Гены токсинов моллюсков конусов........................................................................29
4.4 Гены токсинов змей..................................................................................................30
4.5 Гены токсинов морских анемон...............................................................................32
5. Эволюция токсинов белковой/пептидной природы......................................................33
5.1 Откуда берутся токсины?.........................................................................................33
5.2 Молекулярные механизмы эволюции токсинов....................................................35
5.2.1 Конусы................................................................................................................36
5.2.2 Змеи.....................................................................................................................38
5.2.3 Скорпионы..........................................................................................................42
5.2.4 Пауки...................................................................................................................45
5.2.5 Морские анемоны..............................................................................................47
5.3 Заключение................................................................................................................48
Материалы и методы................................................................................................................49
1. Материалы.........................................................................................................................49
1.1 Неорганические вещества........................................................................................49
1.2 Органические вещества............................................................................................49
1.3 Реактивы для молекулярной биологии...................................................................49
1.4 Клеточные линии......................................................................................................49
1.5 Питательные среды и их составляющие.................................................................49
2. Методы..............................................................................................................................50
2.1 Получение двудоменных токсинов и их производных.........................................50
2.1.1 Выделение двудоменных токсинов из цельных ядов.....................................50
2.1.2 Химический синтез пептидов...........................................................................51
2.1.3 Получение рекомбинантных пептидов............................................................51
2.2 Аналитические методы.............................................................................................53
2.2.1 Определение первичной структуры пептидов................................................53
2.2.2 Исследование вторичной структуры пептидов методом спектроскопии кругового дихроизма........................................................................................................53
2.2.3 Определение концентрации пептидов.............................................................54
2.2.4 Масс-спектрометрия..........................................................................................54
2.2.5 Методы биоинформатики.................................................................................54
2.3 Изучение функциональной активности пептидов.................................................54
2.3.1 Взаимодействие с искусственными мембранами...........................................54
2.3.2 Биологическая активность................................................................................55
2.4 Работа с кДНК и геномной ДНК.............................................................................56
2.4.1 Библиотеки кДНК из ядовитых желез.............................................................56
2.4.2 Выделение ДНК и РНК из ядовитых желез пауков........................................57
2.4.3 Амплификация кДНК и фрагментов геномной ДНК и секвенирование......57
2.4.4 Анализ нуклеотидных последовательностей..................................................58
Результаты..................................................................................................................................60
1. Токсины пауков рода Oxyopes.........................................................................................60
1.1 Выделение двудоменных токсинов.........................................................................60
1.2 Определение последовательности OtTx.................................................................60
1.3 Анализ последовательности OtTx...........................................................................61
1.4 Структура белков-предшественников OtTx...........................................................64
1.5 Получение полноразмерного OtTx la и его фрагментов.......................................64
1.5.1 Получение OtTx 1 а.............................................................................................64
1.5.2 Получение OtTx la-AMP...................................................................................65
1.5.3 Получение OtTx la-ICK....................................................................................65
1.6 Вторичная структура OtTx la..................................................................................67
1.7 Биологическая активность OtTx 1 а и его производных........................................68
2. Гены двудоменных токсинов пауков рода Oxyopes......................................................69
3
2.1 Анализ последовательностей кДНК из ядовитых желез пауков Охуорез...........69
2.2 Структура генов спайдеринов..................................................................................71
2.3 Молекулярная эволюция двудоменных токсинов Охуорея...................................72
3. Выделение новых двудоменных токсинов из яда паука С. рипсШгтт......................75
4. Гены двудоменных токсинов С. рипсЮгшт..................................................................76
4.1 Анализ последовательностей кДНК из ядовитых желез паука С. рипМогтт ....76
4.2 Структура генов СрТх-подобных токсинов...........................................................78
4.3 Молекулярная эволюция двудоменных токсинов С. рипсШпит.........................78
5. Двудоменные токсины паука Ь. (агаЬаеУ1......................................................................81
Обсуяедение.................................................................................................................................84
1. Получение рекомбинантных полипептидов..................................................................84
2. СИТх-подобные токсины Охуорея - новый класс двудоменных токсинов.................86
2.1 Двудоменная структура токсинов СИТх..................................................................86
2.2 М-концевой модуль СНТх 1а — мощный цитолитический токсин.........................87
3. Синергизм в основе активности цитоинсектотоксинов Ь. ¡агаЬаеУ1...........................87
4. Разнообразие двудоменных токсинов............................................................................88
4.1 Двудоменные токсины Охуорез...............................................................................89
4.2 Двудоменные токсины С. рипсШгтт......................................................................90
5. Безинтронные гены двудоменных токсинов..................................................................90
6. Молекулярная эволюция двудоменных токсинов.........................................................92
6.1 Анализ типов отбора, действующего на двудоменные токсины..........................92
6.2 Возникновение токсинов типа АМР+1СК у Охуорез............................................93
6.3 Возникновение токсинов типа 1СК+1СК у СИе^асапМит..................................94
Выводы........................................................................................................................................97
Список литературы...................................................................................................................98
Благодарности..........................................................................................................................116
Введение
Широко известно, что пауки продуцируют яд, состоящий из смеси мощных и селективных токсинов, каждый из которых может иметь свою специфическую биологическую активность. С одной стороны, яд пауков - фактор, несомненно, сыгравший одну из ключевых ролей в эволюции этих беспозвоночных, с другой — он является источником веществ, имеющих важное прикладное значение в качестве возможных лекарственных препаратов или инструментов изучения нервной системы. Эти аргументы обуславливают актуальность исследования разнообразия токсинов пауков. Однако лишь несколько видов, представляющих собой небольшую долю известного биоразнообразия, были изучены подробно, поэтому наше представление о репертуаре токсинов из яда пауков очень ограничено.
Пептидная составляющая наиболее представлена в яде всех изученных видов. Пептиды могут быть двух типов. (А) Нейротоксины обычно богаты дисульфидными связями и в пространстве формируют структуру «цистинового узла» (ICK - от англ. inhibitory cystine knot). По-другому такие токсины называют ноттинами (от англ. knottin). (Б) Цитоток-сины обычно являются линейными пептидами, приобретающими u-спиральную конфор-мацию при взаимодействии с липидными мембранами. Их также часто называют антимикробными пептидами (AMP, от англ. antimicrobial peptide) в связи с тем, что они активны против микроорганизмов.
Разнообразие компонентов яда является эволюционным преимуществом пауков, поэтому они «стремятся» его повышать. Это приводит к формированию так называемых «комбинаторных библиотек» токсинов: яд содержит группы гомологичных пептидов, аминокислотные последовательности которых вариабельны, а общие структурные мотивы консервативны. Однако известны и другие механизмы повышения разнообразия пептидных компонентов яда. Например, существуют дисульфид-богатые токсины с другими типами пространственной укладки. Относительно недавно в яде нескольких пауков были найдены токсины, состоящие из двух модулей (или доменов), каждый из которых соответствует «обычному» токсину. К началу работы над этой диссертацией были известны следующие комбинации доменов: (а) два ICK домена в составе одного токсина, (б) ICK домен с линейным С-концевым модулем, обладающим мембранной активностью, (в) два коротких линейных AMP, объединенные в одну молекулу. В принципе, возможен и четвертый
вариант комбинации доменов - N-концевой домен типа AMP и С-концевой домен типа ICK. Двудоменные токсины изучены недостаточно. Так, с одной стороны, неизвестны функциональные роли отдельных модулей большинства токсинов, а с другой, механизмы их молекулярной эволюции.
Цель и задачи работы
Целью данной работы было изучение разнообразия двудоменных (модульных) токсинов пауков. Были поставлены следующие задачи:
1. Поиск новых двудоменных токсинов пауков.
2. Изучение структуры и биологической активности модульных токсинов.
3. Определение структуры генов, кодирующих двудоменные токсины пауков.
4. Выяснение механизмов молекулярной эволюции модульных токсинов.
Обзор литературы
1. Введение
Двудоменные токсины - интересное явление не только в мире токсинов пауков, но и вообще в мире животных токсинов. С одной стороны, они обладают интересными функциональными свойствами, обеспечивающимися неизученными механизмами, а с другой, представляют собой интересный эволюционный феномен. В «Обзоре литературы» будут рассмотрены те вопросы, которые необходимы для интерпретации результатов этой работы. Во многих случаях это не только информация, посвященная паукам, но и факты из биологии других ядовитых животных.
В главе «Состав яда пауков» описано известное разнообразие токсинов пауков с особым вниманием к белковым и пептидным токсинам (в т. ч. двудоменным). К настоящему моменту генетика пауков была изучена относительно плохо, поэтому имеется очень мало информации о структуре генов токсинов. Однако у некоторых других ядовитых животных этот вопрос исследован намного лучше. Учитывая сходство в механизмах формирования ядов разных животных, будет рассмотрена структура генов токсинов разных животных (глава «Гены токсинов животных»). Последняя глава обзора литературы посвящена молекулярной эволюции животных токсинов («Эволюция токсинов белковой/пептидной природы»),
2. Состав яда пауков
Пауки - обладатели мощного оружия нападения и защиты, ядов. К настоящему времени уже был опубликован обзор, достаточно полно описывающий состав яда пауков и разнообразие их токсинов [1], поэтому здесь приведен лишь краткий обзор на эту тему, необходимый для интерпретации экспериментальных данных.
Компоненты яда имеют разную химическую природу, и в зависимости от их молекулярной массы они подразделяются на низкомолекулярные (<1 кДа), пептиды (<10 кДа) и высокомолекулярные (>10 кДа) вещества — белки. Низкомолекулярные компоненты, входящие в состав яда пауков, относятся к разным группам химических веществ. Это соли, углеводы, аминокислоты, биогенные амины, ацилполиамины и другие [1,2]. Несмотря на высокое разнообразие, в яде каждого паука обычно преобладает определенная группа
компонентов. Так, у пауков семейства Araneidae основным компонентом яда являются низкомолекулярные вещества [3-7], а крупные белки преобладают в ядах пауков семейств Sicariidae [8-10] и Theridiidae [11-13]. Большинство изученных пауков вырабатывает яды с пептидным основным компонентом [1]. Далее будут подробно рассмотрены компоненты яда пауков, имеющие полипептидную природу, поскольку эта диссертация посвящена полипептидным токсинам.
2.1 Белковые компоненты яда
Белки в составе ядов могут выполнять следующие функции: оказывать прямое токсическое действие [14,15], а также, будучи ферментами, разрушающими тканевые структуры, способствовать распространению токсинов и, кроме того, участвовать в конечных стадиях созревания токсинов [16,86].
Пауки рода Latrodectus (пауки-вдовы) семейства Theridiidae вырабатывают яд, содержащий латротоксины, активные в отношении позвоночных (а-латротоксин a-LTX), ракообразных и насекомых [11,17,18]. Латротоксины блокируют проведение нервного импульса, провоцируя истощающий выброс всех известных типов нейромедиаторов из синаптических окончаний жертвы [17,19]. Связавшись с латрофилином или нейрексином la, a-LTX встраивается в мембрану и формирует поры, проницаемые для Са2+, и запускает выход нейротрансмиттеров путем экзоцитоза. С другой стороны, связывание a-LTX с G-белок сопряженным рецептором латрофилином приводит к запуску внутриклеточного каскада и выходу ионов кальция из пресинаптических депо [20].
На данный момент изучена первичная структура четырех латротоксинов [21-24]. Это крупные белки (длина более 1000 аминокислотных остатков, а. о.). a-LTX в активной форме представляет собой тетрамер с каналом и может встраиваться в липидные бислои. Мономер состоит из трех доменов (36 кДа, 76 кДа и 18 кДа), в среднем из которых находятся анкириновые повторы [25].
В состав яда пауков-отшельников семейства Sicariidae входят ферменты, например, фосфатазы, гиалуронидазы, фосфолипазы и протеазы. Главные компоненты - фосфолипа-зы D (или сфингомиелиназы) [26,27]. Сфингомиелиназы D катализируют гидролиз сфин-гомиелина по Mg -зависимому механизму. Изучена пространственная структура этого фермента из яда паука Loxosceles laeta, она относится к укладке типа «ТИМ-бочки» (от англ. TIM barrel). Остатки, ответственные за связывание ионов магния и входящие в состав каталитического сайта, высококонсервативны. Незначительные вариации последова-
тельности приводят к снижению активности на сфингомиелине, или даже полной ее потере [28].
2.2 Пептидные компоненты яда 2.2.1 Однодоменные токсины
2.2.1.1 Линейные токсины
Токсины, представляющие собой линейные пептиды, довольно широко распространены в ядах пауков [1,29]. У Ьаскеьапа [агаЬаехч (семейство 2ос1агпс1ае) они даже являются основным действующим компонентом яда [30,31]. В настоящее время из ядов нескольких видов пауков (наиболее изучены Hogna сагоИпеп$1И, Ьуашг Охуорея IакоЬшя, Сщяептт яаШ, Ь. 1агаЪае\ч) выделено несколько десятков цитолитических пептидов, объединяемых в ~10 — 15 групп.
Обычно линейные пептиды проявляют цитолитическую активность, вызывая некроз тканей жертвы. Эти токсины могут вызывать летальный эффект, однако он проявляется только в случае их высокого содержания в яде. Кроме того, известны случаи синергизма между цитолитическими и нейротоксическими компонентами ядов, когда цитолитики, «растворяя» ткани жертвы, делают мишени действия нейротоксинов более доступными [32]. Не стоит забывать об антимикробной активности цитолитических пептидов, превращающей их в «консерванты» для добычи пауков, как было показано для скорпионов [33].
Длина таких пептидов ограничивается -50 аминокислотными остатками, среди которых значительная доля положительно заряженных. Интересно, что частота встречаемости остатков лизина значительно преобладает над частотой встречаемости остатков аргинина. При рН 7 общий заряд пептида, как правило, попадает в интервал от +3 до +10 [29]. Линейные пептиды в водной среде обычно не упорядочены, однако при контакте с мембранами они приобретают структуру а-спирали, на поверхности которой находятся пространственно разделенные гидрофиль�
