Структурно-функциональный анализ полипептидного токсина Lsp-1 из яда паука Lycosa и токсиномика яда паука Agelena orientalis тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Классификация нейротоксинов пауков.

2.2. Особенности пространственной организации токсинов пауков, структура цистеинового узла.

2.3. нейротоксины пауков, действующие на калиевые каналы.

2.3.1 Нейротоксины из яда паука Grammostola spatulata.

2.3.2. Нейротоксины из яда паука Heteropoda venatoria.

2.3.3. Нейротоксины из яда паука Phrixotrichus auratus.

2.3.4. Нейротоксины из яда паука Heteroscodra maculata.

2.3.5. Нейротоксины из яда паука Stromatopelma calceata.

2.3.6. Нейротоксины из яда паука Scodra griseipes.

2.3.7. Нейротоксины из яда паука Phoneutria negriventer.

2.4. Нейротоксины пауков, действующие на натриевые каналы.

2.4.1. Нейротоксины из яда паука Atrax robust us.

2.4.2. Нейротоксины из ядов пауков рода Hadronyche.

2.4.3. Нейротоксины из яда паука Missulena bradleyi.

2.4.4. Нейротоксины из яда паука Agelenopsis aperta.

2.4.5. Нейротоксины из яда паука Hololena curta.

2.4.6. Нейротоксины из яда паука Paracoelotes luctiiosus.

2.4.7. Нейротоксины из яда паука Phoneutria nigriventer.

2.4.8. Нейротоксины из яда паука Selenocosmia huwena.

2.4.9. Нейротоксины из яда Selenocosmia hainana.

2.4.10. Нейротоксины из яда паука Thrixopelma pruriens.

2.5. Нейротоксины пауков, действующие на кальциевые каналы.

2.5.1. Нейротоксины из яда паука Agelenopsis aperta.

2.5.1.1. со-Агатоксины первой группы (co-Aga I).

2.5.1.2. со-Агатоксины второй группы (co-Aga-II).

2.5.1.3. со-Агатоксины третьей группы (co-Aga-III).

2.5.1.4. о-Агатоксины четвертой группы (co-Aga-IV).

2.5.2. Нейротоксины из ядов пауков родов Hadronyche и Atrax.

2.5.3. Нейротоксины из яда паука Phoneutria nigriventer.

2.5.4. Нейротоксины из яда паука Grammostola spatulata.

2.5.5. Нейротоксины из яда паука Hysterocrates gigas.

2.5.6. Нейротоксины из яда паука Segestria florentina.

2.5.7. Нейротоксины из яда паука Filistata hibernalis.

В настоящее время известно, по различным оценкам, порядка 40000 видов пауков, из них изучено всего лишь несколько десятков наиболее распространенных, а значит, и наиболее доступных для изучения видов.

Яды пауков, наряду с ядами других видов животных, являются богатейшим источником различных биологически активных компонентов, входящих в их состав. За последнее десятилетие сильно возрос интерес к ядам пауков с целью выделения нейротоксинов, специфически воздействующих на различные типы клеточных мишеней. В этом аспекте нейротоксины из ядов пауков представляют интерес в качестве точных инструментов исследования структурно-функциональных характеристик ионных каналов, интегральных мембранных гликопротеинов, образующих высокоселективные поры в клеточной мембране.

Существенным ограничением реализации данной задачи является то, что содержание нейротоксинов в ядах пауков обычно не превышает микромолярных количеств и не достаточно для проведения полного комплекса исследований. Поэтому очевидна актуальность применения генно-инженерных методов получения рекомбинантных токсинов, идентичных по своим структурно-функциональным характеристикам природным, и разработка, и применение альтернативных подходов к изучению ядов пауков. Примером такого подхода может служить анализ баз данных EST (Express Sequens Tag) последовательностей, созданных на основе ядовитых желез паука.

Цель настоящей работы заключалась в идентификации и выделении из яда паука Lycosa Gen.l. sp.l полипептидного токсина, обладающего активностью по отношению к Са2+ каналам Р-типа, определении аминокислотной последовательности, структуры гена и проведении функциональной экспрессии данного гена в бактериальной системе Escherichia coli, а также в анализе базы EST (Express Sequens Tag) последовательностей ядовитых желез паука Agelena orientalis с использованием структурных мотивов, характерных для токсинов блокаторов ионных каналов.

2. Литературный обзор

Яды пауков - это сложные природные системы, основными компонентами которых являются различные белковые, полипептидные и полиаминные нейротоксины, ферменты, свободные аминокислоты, нуклеиновые кислоты и неорганические соли [1].

Нейротоксины с высокой степенью селективности воздействуют на различные компоненты центральной и периферической нервной системы, такие, как ионные каналы (кальциевые (Са2+), натриевые (Na+) и калиевые (К+)), рецепторы и элементы пресинаптической мембраны, вовлеченные в передачу нервного импульса [2].

Выводы

1. Из яда паука Lycosa Gen.l. sp.l выделен новый полипептидный модулятор Lsp-1, вызывающий обратимое ингибирование Са2+ каналов Р-типа. Показано, что токсин Lsp-1 вызывает (в концентрации ЮнМ) понижение в четыре раза кинетики активации канала и частично снижает амплитуду Са2+ тока Р-типа в центральных нейронах млекопитающих. Показано, что модуляция Р-каналов вызванная Lsp-1 имеет сходство с модуляцией этих токов, вызванной G-белками, но не связана с ними. Определена полная аминокислотная последовательность токсина Lsp-1, установлено, что Lsp-1 является представителем новой структурной подгруппы блокаторов Са2+ каналов.

2. Проведено клонирование фрагмента гена Lsp-1, кодирующего зрелый белок в экспрессирующий вектор рЕТ-32в по сайтам Bglll и ВашШ в составе Т7-контролируемого оперона. Осуществлена функциональная экспрессия гена токсина Lsp-1 в клетках Е. coli.

3. Проведен анализ базы данных EST последовательностей A. orientalis, состоящей из 2166 последовательностей, двумя различными способам. Показано что 1218 структур являются аналогами блокатора Са2+ канала - агеленина (структурная гомология 81-100%), 185 последовательностей являются аналогами блокатора Ка+канала - р-агатоксина 2 (гомология 68-95%), 24 структуры - аналоги блокатора Са2+ канала - со-агатоксина IIIА (гомология 49-58%). Определены полные аминокислотные последовательности белков предшественников для 48 токсин - подобных структур. Проведено сравнение результатов, полученных двумя различными методами анализа баз EST, найдены их преимущества и недостатки.

Заключение

Все описанные в данном литературном обзоре нейротоксины, выделенные из ядов пауков, обнаруживают в различной степени структурное сходство первичных структур. Особенно высокий процент гомологии наблюдается среди токсинов, имеющих своими молекулярными мишенями ионные каналы одного типа.

Как было показано, наиболее консервативное положение характерно для остатков цистеина, формирующих внутримолекулярные дисульфидные связи, стабилизирующие активную конформацию молекул токсинов. Для ряда токсинов был определен порядок замыкания дисульфидных связей, стабилизирующих функциональную пространственную конформацию их полипептидных молекул. Оказалось, что этот порядок консервативен для подавляющего большинства полипептидных токсинов из ядов пауков, блокаторов ионных каналов. Он получил название цистинового узла, или «Ингибиторного цистинового узлового мотива» (ICK) [5]. Как было показано, в формировании цистинового узла принимают участие шесть остатков цистеина. Дисульфидные связи, образуемые первыми шестью остатками цистеина, замыкаются в порядке 1-4, 2-5, 3-6. В случае токсинов с большим количеством остатков цистеина, в формировании цистеинового узла принимают участие также шесть остатков, но порядок замыкания иной, а именно 1-4, 2-5 и 3-7. Первый порядок замыкания дисульфидных мостов обнаружен у ханатоксинов, гетераподатоксинов, гетероскодратоксинов, приксотоксинов [7-11]. Второй порядок замыкания был обнаружен, в частности, у со-агатоксинов четвертой группы, р-агатоксинов, у фонеутоксина Тх2-1, у 5-атракотоксина-Аг1 [12, 14, 49, 53]. Учитывая высокую степень структурного родства первичных структур всех перечисленных нейротоксинов, описанных выше, с токсинами, для которых был установлен порядок замыкания дисульфидных мостов, принимая во внимание сходства в механизмах действия описанных токсинов, с высокой долей вероятности можно предположить наличие цистинового узла у всех токсинов пауков ингибиторов или модуляторов ионных каналов. Это позволяет отнести их к суперсемейству структур, содержащих «ингибиторный цистиновый узловой мотив» (ICK) [5].

3. Результаты и обсуждения

3.1. Выделение нейротоксина Lsp-1 из яда паука Lycosa sp.

Для получения из цельного яда активных соединений с искомой биологической активностью нами была использована многостадийная стратегия выделения. Яд подвергался хроматографическому разделению, после чего каждая стадия фракционирования яда сопровождалась тестированием, получаемых фракций на наличие искомой биологической активности и в ряде случаев проводились масс-спектрометрические исследования [87]. Количество доступного для работы яда было ограничено, поэтому вся схема выделения была оптимизирована для снижения возможных потерь активных компонентов при выделении.

Цельный яд паука Lycosa Gen.l. sp.l тестировали на наличие функциональной активности к Са2+ каналам Р-типа на нейронах Пуркинье из мозга крысы. Цельный яд в концентрации ~7 мкг/мл уменьшал амплитуду Р-токов и резко снижал кинетику активации канала. Для выделения активных компонентов было использовано гель-фильтрационное разделение цельного яда на колонке TSK-2000 SW (рис. 17).

Фракции пиков I-VI были лиофилизованы и проанализированы на взаимодействие с Са2+ каналами Р-типа. Было установлено, что искомой активностью обладали фракции III-VI. Данные фракции выходили с хроматографической колонки, согласно профилю элюции, в объеме, превышающем свободный объем колонки, что говорит о плохом качестве разделения полипептидных компонентов в данной области. Поэтому фракции III-VI объединили и затем разделяли с помощью высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), на колонке с обращенной фазой (ОФ) Luna (Phenomenex) С18. Искомая активность, была обнаружена во фракции, соответствовавшей хорошо представленному на хроматографическом профиле пику LS (рис. 18). 1 0

АЕ

20 i

30

40

50

60

70

80

90

100

Время элюции (мин)

Рис. 17. Гель-фильтрационная хроматография цельного яда паука Lycosa sp.l на колонке (7.5x600 мм) TSK 2000 SW в 50 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 5.2), содержащем 150 мМ NaCl. Скорость элюции 0.5 мл/мин. УФ поглощение измерено при 280 нм. Отмечены фракции (I-VI) [87].

1 1

0.5

АЕ

60

70

7. tj НИ и so

90

95

Бремя злюции (мин)

Рис. 18. ВЭЖХ полипептидов фракций III-VI (рис. 17) на колонке с обращенной фазой Luna (Phenomenex) (2x150 мм, 3 рм) С is в линеином градиенте концентрации ацетонитрила в 0.1% трифторуксусной кислоте. Скорость элюции 0.15 мл/мин. УФ поглощение измерено при 280 нм. Отмечена активная фракция LS [87].

После ее рехроматографии на колонке Jupiter (Phenomenex) С5, был получен в индивидуальном состоянии активный полипептид Lsp-1 (рис. 19), индивидуальность которого подтверждена масс-спекгрометрически (молекулярная масса 5634 Да) [87]. Согласно УФ-спектральным характеристикам для аминокислотного состава Lsp-1 характерно наличие значительного количества остатков триптофана.

Время злющш (мин)

Рис. 19. Рехроматография полипептидов фракций LS (рис. 18) на колонке с обращенной фазой Jupiter (Phenomenex) (2x150 мм, 5 цм) С5 в линейном градиенте концентрации ацетонитрила в 0.1% трифторуксусной кислоте. Скорость элюции 0.3 мл/мин. УФ поглощение измерено при 280 нм. Отмечена фракция, содержащая токсин Lsp-1 [87].

3.2. Биологические свойства нейротоксина Lsp-1 из яда паука Lycosa sp.

Исследование механизма действия токсина Lsp-1 было проведено в совместной работе с сотрудниками лаборатории клеточной мембранологии Института физиологии им. А. А. Богомольца (Киев). На нейронах Пуркинье в наномолярных концентрациях Lsp-1 вызывал резкое снижение энергии активации канала и уменьшал амплитуду Р-токов. Максимальный эффект достигался при концентрации около 7 нМ, но блокирование всегда было неполным: около 71±6% пика амплитуды остаточного тока (рис. 20). Быстрое действие Lsp-1 на Р-токи (10 сек) было зафиксировано при высоких концентрациях токсина (>7 нМ), а при низких концентрациях наблюдается более медленное развитие эффекта (около 300 сек при 0.7 нМ) [87]. мВ

50 -40 -30 -20 -10 0 5 ■ «, ■ 1IIII■ « ■IIiiII

-о- Контроль

7 нм Lsp-1

Отмывка

Рис. 20. Модуляция Р-тока в нейронах Пуркинье, вызванная токсином Lsp-1. Типичные кривые тока и напряжения для выхода ионов Ва2+ через Са2+ каналы Р-типа, зафиксированные в условиях контроля (-О-), после нанесения Lsp-1 до насыщения (-•-) и последующей отмывки Lsp-1 (-□-). Работу с нейроном проводили при -70 мВ. Нейрон стимулировали каждые 5 сек продолжительностью в 50 мсек, увеличивая разность потенциалов с шагом в 5 мВ [87].

Некоторые из токсинов взаимодействуют с Са2+-каналами Р-типа потенциал зависимым способом, так что их блокирование может быть легко устранено с помощью мощной деполяризации [82, 88]. Модуляция Р-каналов с помощью Lsp-1 не была разрушена деполяризационным преимпульсом. В наших экспериментах деполяризация в +100 мВ не ускорила возврата к первоначальным значениям ни энергии активации, ни амплитуды тока после отмывки токсина (рис. 21) [87]. мВ

Контроль -о- одиночный импульс преимпульс +100 мВ

Lsp-1,10 нМ одиночный импульс преимпульс +100 мВ

-50 -40 -30 -20 -10 0 5 шЛшЛ г300 «fl-900

-1500 -2100 пА

Рис. 21. Модуляция Р-тока в нейронах Пуркинье, вызванная токсином Lsp-1 в условиях деполяризационного преимпульса. Типичные кривые тока и напряжения для выхода ионов Ва2+ через Са2+ каналы Р-типа. зафиксированные в условиях контроля (-□- и -О-) с и без наложения преимпульса, после нанесения Lsp-1 до насыщения и -•-) с и без наложения преимпульса. Работу с нейроном проводили при -70 мВ. Нейрон стимулировали каждые 5 сек продолжительностью в 50 мсек, увеличивая разность потенциалов с шагом в 5 мВ [87].

Снижение пропускных способностей Са2+ каналов может быть вызвано также ингибированием G-белками [89]. Нами проверено участие G-белков в модуляции Р-каналов с помощью Lsp-1. В этих экспериментах были использованы ГДФ и прямой односторонний активатор G-белков ГДФу5. Загрузка клетки 100 мкМ ГДФ или 2 мкМ ГДФуБ не препятствует влиянию токсина на энергию Р-токов. Эти данные показывают, что эффекты, вызванные Lsp-1. не связаны с действием G-белков (рис. 22) [87]. n=5 г—\ 600 S3 500

О СХ н 400- ш д о 300200 т-Н 1 О* 100 ^

5Л J н 0 л ч о а н д о в д о (J ^ л "S 1-х С* о Д О тН Е ^ о 2

S - т-1 1 а !П J а т-1 К L CJ & 1-н J

§

S S д

ГЦ о fs СЯ i

Ь е 1-Н 1 !Л

U Н-З

Рис. 22. Относительное снижение пропускной способности Са~+ каналов Р-типа относительно контроля, в присутствии 10 нМ Lsp-1? при наложении преимпульса (в условиях прединкубирования с 10 нМ Lsp-1). межклеточная перфузия со 100 мкМ ГДФ и 2 мкМ TTOyS (в условиях прединкубирования с 10 нМ Lsp-1) [87].

Потенциал зависимые Са2+ каналы P/Q-типа (Cav2.i) являются одними из наиболее критичных компонентов синаптической передачи в мозге млекопитающих [90-92]. Как известно, некоторые токсины, выделенные из ядов различных животных, непосредственно взаимодействуют с этими каналами [63, 66, 86, 88, 93, 94]. Полученные электрофизиологические данные показывают, что полипептидный токсин Lsp-1, в предельных концентрациях (7-10 нМ), частично (-30%) снижает амплитуду Са2+ тока Р-типа в центральных нейронах млекопитающих. Также было показано, что токсин Lsp-1 понижает в четыре раза кинетику активации Са2+ тока Р-типа в центральных нейронах млекопитающих (рис. 23) [87]. Такое влияние Lsp-1 на кинетику Р-токов значительно отличается от действия других известных токсинов [57, 63, 82, 86, 88, 95]. По сравнению как с co-CTx-MVIIC так и с co-PtxIIA, вызывающих полное блокирование Са2+ каналов Р-типа, Lsp-1 осуществляет только частичное, обратимое ингибирование этих каналов [63, 95]. Действие Lsp-1 на Са2+ каналы Р-тнпа сходно с действием на тот же тип каналов таких ингибиторов как со-Aga-IIIA и DW 13.3, обладающих неполным блокирующим действием [57, 86]. Как было показано выше, действие Lsp-1 на Са2+ каналы Р-типа не является потенциал зависимым и не меняется при наложении деполяризующего преимпульса, в отличие от co-Aga-IVA и co-GsTx-SIA, вызывающих потенциал зависимое ингибирование [82, 88]. Таким образом, механизм действия Lsp-1 пока не ясен, но уже сейчас он может быть предположен как инструмент исследования структуры и функции Са2+ каналов Р-типа. Принимая во внимание функциональную значимость этих каналов, нейротоксин Lsp-1 может сыграть важную роль в разработке новых лекарственных препаратов. f

3,51+0,<Р2 мсек ?10,16+0,05 мсек

ТСО„=2,17±0,01 мсек

Рис. 23. Влияние Lsp-1 на кинетику активации Р-токов с учетом временных констант тсо„=2.17±0.01 мсек в контроле (-0-),тюх=10.16±0.05 мсек в 7 нМ Lsp-1 (-•-) и iwash=3.51±0.02 мсек после отмывки Lsp-1 (-□-) [87].

3.3. Установление полной аминокислотной последовательности токсина Lsp-1

Частичная N-концевая аминокислотная последовательность Lsp-1, длиной в 27 аминокислотных остатков, была получена автоматическим секвенированием по методу Эдмана.

1 EKSCITWRNSCMHNDKGCCFPWSCVCW27

Затем было проведено ферментативное расщепление токсина по аспарагиновой кислоте, находящейся в 15 положении. Продукты гидролиза разделяли в условиях ОФ ВЭЖХ на колонке Jupiter (Phenomenex) С5. Были получены две фракции, одна из которых соответствовала 14-членному полипептиду EKSCITWRNSCMHN, что было доказано масс-спектрометрически. Автоматическим секвенированием второго полипептида получили частичную N-концевую последовательность в 32 аминокислотных остатка

1 DKGCCFPWSCVCWSQTVPRNSSRKEKKCQCRL32

Расчетная молекулярная масса полученного 46 членного полипептида не соответствовала полученной масс-спектрометрически (5634 Да), а отличалась от последней на 186 Да, что соответствует молекулярной массе остатка триптофана и доказывает наличие 47го аминокислотного остатка. Полная аминокислотная последовательность Lsp-1 представляет собой полипептид следующего состава

1 EKSCITWRNSCMHNDKGCCFPWSCVCWSQTVPRNSSRKEKKCQCRLW47 Таким образом, токсин Lsp-1 представляет собой одноцепочечный полипептид, содержащий 47 а.о., из которых 8 - остатки цистеина, что позволяет предположить наличие в молекуле токсина четырех дисульфидных связей. В аминокислотной последовательности токсина Lsp-1 были обнаружены четыре остатка триптофана, что хорошо согласуется со спектральными данными. Расчетное значение pi равное 8.7 и заряд +5.8 характерны для подавляющего большинства токсинов, выделенных из ядов пауков [87].

3.4. Поиск гомологии с известными токсинами блокаторами ионных каналов

Сравнение первичной структуры токсина Lsp-1 с известными блокаторами ионных каналов, выделенными из ядов пауков, выявляет его структурное сходство с семейством токсинов РпТх из яда паука P. nigriventer и со-агатоксином-IV из яда паука Л. aperta (рис. 24).

Максимальная гомология (42% идентичных аминокислотных остатков) первичной структуры наблюдается между Lsp-1 и токсином ТхЗ-5, выделенным из яда паука P. nigriventer, являющимся ингибитором Са2+ каналов. Следует отметить, что гомология между Lsp-1 и другими известными блокаторами Са2+ каналов составляет для со-агатоксина-IVA 21%, а для остальных нейротоксинов блокаторов Са2+ каналов еще меньше. Наибольшее сходство Lsp-1 со всеми перечисленными токсинами наблюдается в расположении остатков цистеина. Поэтому сходное расположение остатков цистеина в токсине Lsp-1 и всех известных токсинах блокаторах ионных каналов, позволяет сделать предположение об аналогичном замыкании дисульфидных мостов и схожей пространственной организации токсина. Учитывая чрезвычайно низкую гомологию Lsp-1 с известными токсинами пауков, его нельзя отнести ни к одной из ранее описанных подгрупп токсинов пауков. Вследствие этого Lsp-1 является представителем новой структурной подгруппы блокаторов Са2+ каналов, обладающих структурой цистинового узла. vprnHsrkekkB ;@qpe§dvw™B iSQTVPRN| ike|

P-gGElHTpfflcE-® GCDNQ----SYSPPGSSLGIFK-----gSgAHANKYFCNRKKEKCKKA

5yngyk* tkd-f«hocdrdnaf-f! jl3£ GXNWK. jVIF^YKTN-; IMGTN

CPRLIMEGLGLA

Lsp-1 ЕКЯ*ПтиШ1-ЕЯмншж[«

ТхЗ-5 Tx3-6 Tx3-3

Tx3-4 w-Aga-lVA kkkQJakdygr^kggQp^rgrg-----gig

Рис. 24. Сравнение аминокислотной последовательности токсина Lsp-1 с токсинами из яда паука P. nigriventer [72] и со-агатоксином-IV из яда паука A. aperta. [36]. Затенением выделены идентичные аминокислотные остатки.

3.5. Получение рекомбинантного белка Lsp-1

3.5.1. Конструирование вектора pET32b-Lsp-l и оптимизация условий экспрессии гибридного рекомбинантного белка Тгх-Lsp-l в клетках Е. coli

Последовательность ДНК, с оптимизированным триплетным составом, для экспрессии рекомбинантного токсина в клетках Е. coli, кодирующая Lsp-1, была разработана на основании первичной структуры природного токсина и получена в виде синтетического олигонуклеотида.

Необходимость формирования четырех дисульфидных связей в рекомбинантном белке представлялась основным препятствием для биосинтеза нативной формы токсина в бактериальной клетке, ввиду чего при выборе системы экспрессии было отдано предпочтение вектору рЕТ, который, наряду с высокой продуктивностью, позволяет обеспечить правильную укладку рекомбинантного белка. Экспрессию Lsp-1 проводили в клетках штамма OrigamiB, мутантного по генам глутатион редуктазы и тиоредоксин редуктазы, в составе гибридного белка, содержащего последовательность тиоредоксина в N-концевой области целевого полипептида. Как было показано, для гибридных белков вероятность корректного замыкания дисульфидных связей и образования биологически активной растворимой формы целевого соединения в таком векторе возрастет на порядок [96]. На базе вектора pET32b была получена генно-инженерная конструкция, содержащая вставку гена Lsp-1 по сайтам рестрикции Bglll и BamHI (рис. 25).

В результате экспрессии вектора pET32b-Lsp-l синтезировался гибридный белок Тгх-Lsp-l с молекулярной массой 22530.5 Да и pi 6.84, N-концевой фрагмент которого соответствовал тиоредоксину, а С-конецевая область - полноразмерному токсину. Гибридный рекомбинантный белок включал последовательность His6, аффинно хелатирующую Со2+-содержащую смолу, и сайт энтерокиназы DDDDK, непосредственно ограничивавший целевой полипептид.

Ava I Xho I Eag I Not I Hind III Sal I Sac I EcoR I BamH I EcoR V Nco I Kpn I Bgl II

Рис. 25. А: рестриктная карта плазмиды pET32b; Б: схема замещенного участка полилинкера pET32d-Lsp-l: Т71ас - фаговый промотор, ТгхА - последовательность, кодирующая тиоредоксин.

В серии экспериментов (табл. 1), проведенных с целью проверки экспрессирующей способности вектора pET32b-Lsp-l в клетках Е. coli, в зависимости от концентрации индуктора и температуры инкубации, было показано (рис. 26), что, во-первых, имеет место ИПТГ-индуцируемая экспрессия. Во-вторых, размер продукта, оцениваемый по электрофоретическому разделению в ДСН-ПААГ, соответствовал ожидаемому. В-третьих, концентрация индуктора не влияла на уровень экспрессии, а понижение температуры инкубации культуры с 37°С до 30°С позволило достичь большего выхода растворимого белка, что согласуется с опубликованными данными [97].

В качестве контроля индукции экспрессии брали систему OrigamiB(DE3)-pET32b, которая в стандартных условиях 0.4 мМ индуктора и температуре инкубации 37°С продуцирует полноразмерный тиоредоксин.

Таким образом, была доказана способность системы OrigamiB-pET32b-Lsp-l продуцировать гибридный белок Тгх-Lsp-l в растворимом виде и подобраны оптимальные условия для его экспрессии. Оптимальными условиями являются: концентрация индуктора 0.1 мМ и инкубация системы при температуре 30°С в течение 16 часов.

1. Jackson Н., Parks T.N. Spider toxins: Recent applications in neurobiology // Ann. Rev. Neurosci. 1989. Vol. 12. P. 405-414.

2. Rash L.D., Hodson W.C. Pharmacology and biochemistry of spider venoms // Toxicon. 2002. Vol. 40. P. 225-254.

3. Gorzo G., Escoubas P. Pharmacologically active spider peptide toxins // Cell. Mol. Life Sci. 2003. Vol. 60. P. 2409-2426.

4. Gray W.R., Olivera B.M., Cruz L.J. Peptide toxins from venomous conus snails // Annu. Rev. Biochem. 1988. Vol. 57. P. 665-700.

5. Craik D.J., Daly N.L., Waine C. The cystine knot in toxins and implications for drug design // Toxicon. 2001. Vol. 39. P. 43-60.

6. Grishin E. Polypeptide neurotoxins from spider venoms // Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 264. P. 276-280.

7. Swartz K.J., MacKinnon R. An inhibitor of the Kv2.1 potassium channel isolated from the venom of a Chilean tarantula // Neuron. 1995. Vol. 15. P. 941-949.

8. Sanguinetti M.C., Johnson J.H., Hammerland L.G., Kelbaugh P.R., Volkmann R.A., Saccomano N.A., Mueller A.L. Heteropodatoxins: peptides isolated from spider venom that block Kv4.2 potassium channels // Mol. Pharmacol. 1997. Vol. 51. P. 491-498.

9. Diochot S., Drici M.D., Moinier D., Fink M., Lazdunski M. Effects of phrixotoxins on the Kv4 family of potassium channels and implications for the role of Itol in cardiac electrogenesis // Br. J. Pharmacol. 1999. Vol. 126. P. 251-263.

10. Marvin L., De E., Cosette P., Gagnon J., Molle G., Lange C. Isolation, amino acid sequence and functional assays of SGTxl. The first toxin purified from the venom of the spider Scodra griseipes // Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 265. P. 572-579.

11. Pallaghy P.K., Alewood D., Alewood P.F., Norton R.S. Solution structure of robustoxin, the lethal neurotoxin from the funnel-web spider Atrax robustus // FEBS Lett. 1997. Vol. 419. P. 191-196.

12. Sidach S.S., Mintz I.M. Low-affinity blockade of neuronal N-type Ca2+ channels by the spider toxin omega-agatoxin-IVA // J. Neurosci. 2000 Vol. 20 P. 7174-7182.

13. Xiao Y., Liang S. Inhibition of neuronal tetrodotoxin-sensitive Na+ channels by two spider toxins: hainantoxin-III and hainantoxin-IV // Eur. J. Pharmacol. 2003. Vol. 477. P. 1-7.

14. Wang X.H., Smith R., Fletcher J.I., Wilson H., Wood C.J., Howden M.E.H., King G.F. Structure-function studies of (o-atracotoxin, a potent antagonist of insect voltage-gated calcium channels // Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 264. P. 488-494.

15. Nishio H., Kumagaye K.Y., Kubo S., Chen Y.N., Momiyama A., Takahashi Т., Kimura Т., Sakakibara S. Synthesis of omega-agatoxin IVA and its related peptides // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. Vol. 196. P. 1447-1453.

16. Newcomb R., Palma A., Fox J., Gaur S., Lau K., Chung D., Cong R., Bell J.R., Home В., Nadasdi L., Ramachandran J. SNX-325, a novel calcium antagonist from the spider Segestria florentina // Biochemistry. 1995. Vol. 34. P. 8341-8347.

17. Bourinet E., Stotz S.C., Spaetgens R.L., Dayanithi G., Lemos J., Nargeot J., Zamponi G.W. Interaction of SNX482 with domains III and IV inhibits activation gating of alpha(lE) (Ca(V)2.3) calcium channels // Biophys. J. 2001. Vol. 81. P. 79-88.

18. Takahashi H., Kim J.I., Min H.J., Sato K., Swartz K.J., Shimada I. Solution structure of hanatoxinl, a gating modifier of voltage-dependent K+ channels: common surface features of gating modifier toxins // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 297. P. 771-780.

19. Swartz K.J., MacKinnon R. Hanatoxin modifies the gating of a voltage-dependent K+ channel through multiple binding sites // Neuron. 1997. Vol. 18. P. 665-673.

20. Escoubas P., Diochot S., Celerier M.L., Nakajima Т., Lazdunski M. Novel tarantula toxins for subtypes of voltage-dependent potassium channels in the KV2 and KV4 subfamilies // Mol. Pharmacol. 2002. Vol. 62. P. 48-57.

21. Lopreato G.F., Lu Y., Southwell A., Atkinson N.S., Hillis D.M., Wilcox T.P., Zakon H.H. Evolution and divergence of sodium channel genes in vertebrates // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. P. 7588-7592.

22. Waxman S.G., Gumminis T.R., Black J.A., Dib-Hillis D.M. Divers functions and dynamic expression of neuronal sodium channels // Novartis Found. Symp. 2002. Vol. 241. P. 34-51.

23. Novakovic S.D., Eglen R.M., Hunter J.C. Regulation of Na+ channel distribution in the nervous system//Trends Neurosci. 2001. Vol. 24. P. 473-478.

24. Sheumack D.D., Claassens R., Witeley N.M., Howden M.E.H. Complete amino acid sequence of a new type of lethal neurotoxin from the venom of the funnel-web spider Atrax robususll FEBS Lett. 1985. Vol. 181. P. 154-156.

25. Nicholson G.M., Little M.J., Birinyi-Strachan L.C. Structure and function of 8-atracotoxins: lethal neurotoxins targeting the voltage-gated sodium channel // Toxicon. 2004. Vol. 43. P. 587-599.

26. Brown M.R., Sheumack D.D., Tyler M.I., Howden M.E. Amino acid sequence of versutoxin, a lethal neurotoxin from the venom of the funnel-web spider Atrax versutus // Biochem. J. 1989. Vol. 250. P. 401-405.

27. Gunning S.J., Chong Y., Khalife A.A., Hains P.G., Broady K.W., Nicholson G.M. Isolation 8-atracotoxin-Mbla, the major vertebrate-active spider 8-toxin from thevenom of Missulena bradleyi (Actinopodidae) I I FEBS Lett. 2003. Vol. 554. P. 211218.

28. Szeto Т.Н., Birinyi-Strachan L.C., Smith R., Connor M., Christie M.J., King G.F., Nicholson G.M. Isolation and pharmacological characterization of 8-atracotoxin-Hvlb // FEBS Lett. 2000. Vol. 470. P. 293-299.

29. Nicholson G.M., Willow M., Howden M.E., Narahashi T. Modification of sodium channel gating and kinetics by versutoxin from the Australian funnel-web spider Hadronyche versuta // Pfliiger Arch.-Eur. J. Physiol. 1994. Vol. 428. P. 400-409.

30. Adams M.E. Agatoxins: ion channel specific toxins from the American funnel web spider, Agelenopsis aperta // Toxicon. 2004. Vol. 43. P. 509-525.

31. Skinner W.S., Adams M.E., Quistad G.B., Kataoka H., Cesarin B.J., Enderlin F.E., Schooley D.A. Purification and characterization of two classes of neurotoxins from the funnel web spider, Agelenopsis aperta // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 21502155.

32. Omecinsky D.O., Holub K.E., Adams M.E., Reily M.D. Three-dimensional structure analysis of p-agatoxins: further evidence for common motifs among neurotoxins with diverse ion channel specificities // Biochemistry. 1996. Vol. 35. P. 2836-2844.

33. Araujo D.A.M., Cordeiro M.N., Diniz C.R., Beirao S.P. Effects of a toxic fraction, PhTx2, from the spider Phoneutria nigriventer on the sodium current // Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1993. Vol. 347. P. 205-208.

34. Liang S. An overview of peptide toxins from the venom of the Chinese bird spider Selenocomia huwena Wang = Ornithoctonus huwena (Wang). // Toxicon. 2004. Vol. 43. P. 575-585.

35. Peng K., Shu Q., Liu Z., Liang S. Function and solution structure of huwentoxin-IV, a potent neuronal tetrodtoxin (TTX)-sensitive sodium channel antagonist from Chinese bird spider Selenocomia huwena // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 4756447571.

36. Xiao Y., Liang S. Purification and characterization of Hainantoxin-V, a tetrodotoxin-sensitive sodium channels inhibitor from the venom of the spider Selenocosmia hainana // Toxicon. 2003. Vol. 41. P. 643-650.

37. Mitterdorfer J., Grabner M., Kraus R.L., Hering S., Prinz H., Glossmann H., Striessnig J. Molecular basis of drug interaction with L-type Ca2+ channels // J. Bioenerg. Biomembr. 1998. Vol. 30. P. 319-334.

38. Adams M.E., Bindokas V.P., Hasegawa L., Venema V.J. ш-Agatoxins: novel calcium channel antagonists of two subtypes from funnel web spider {Agelenopsis aperta) venom//J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 861-867.

39. Bindokas V.P., Adams M.E. со-Aga-I: a presynaptic calcium channel antagonist from the venom of the funnel web spider, Agelenopsis aperta // J. Neurobiol. 1989. Vol. 20. P. 171-188.

40. Scott R.H., Dolphin A.C., Bindokas V.P., Adams M.E. Inhibition of neuronal Ca2+ channels current by the funnel web spider toxin co-Aga-IA // Mol. Pharmacol. 1990. Vol. 38. P. 711-718.

41. Venema V.J., Swiderek K.M., Lee T.D., Hathaway G.M., Adams M.E. Antagonism of synaptosomal calcium channels by subtypes of co-agatoxins // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 2610-2615.

42. Ertel E.A., Waren V.A., Adams M.E., Griffin P.R., Cohen C.J., Smith M.M. Type-Ill co-agatoxins: A family of probes for similar binding sites on L- and N-type calcium channels // Biochemistry. 1994. Vol. 33. P. 5098-5108.

43. Mintz I.M., Venema V.J., Adams M.E., Bean B.P. Inhibition of N- and L-type Ca2+ channels by the spider venom toxin co-Aga-IIIA // Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. Vol. 88. P. 6628-6631.

44. Mintz I.M. Block of Ca2+ channels in rat central neurons by the spider toxin omega-Aga-IIIA // J. Neurosci. 1994. Vol. 14. P. 2844-2853.

45. Yan L., Adams M.E. The spider toxin co-Aga-IIIA defines a high affinity site on neuronal high voltage-activated calcium channels // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 21309-21316.

46. Bindokas V.P., Venema V.J., Adams M.E. Differential antagonism of transmitter release by subtypes of oo-agatoxins // J. Neurophysiol. 1991. Vol. 66. P. 590-601.

47. Adams M.E., Mintz I.M., Reily M.D., Thanabal V., Bean B.P. Structure and properties of co-Aga-IVB, a new antagonist of P-type calcium channels // Mol. Pharm. 1993. Vol. 44. P. 681-688.

48. Adams M.E., Myers R.A., Imperial J.S., Olivera B.M. Toxityping rat brain calcium channels with co-toxins from spider and cone snail venoms // Biochemistry. 1993. Vol. 32. P. 12566-12570.

49. McDonough S.I., Boland L.M., Mintz I.M., Bean B.P. Interaction among toxins that inhibit N-type and P-type calcium channels // J. Gen. Physiol. 2002. Vol. 119. P. 313-328.

50. Ertel E.A., Smith M.M., Leibowitz M.D., Cohen C.J. Isolation of myocardial L-type calcium channel gating currents with the spider toxin omega-Aga-IIIA // J. Gen. Physiol. 1994. Vol. 103. P. 731-753.

51. Olivera B.M., Miljanich G.P., Ramachandran J., Adams M.E. Calcium channel diversity and neurotransmitter release: the omega-conotoxins and omega-agatoxins // Annu. Rev. Biochem. 1994. Vol. 63. P. 823-867.

52. Mintz I.M., Venema V.J., Swiderek IC.M., Lee T.D., Bean B.P., Adams M.E.-P-type calcium channels blocked by the spider toxin omega-Aga IVA // Nature. 1992. Vol. 355. P. 827-829.о м

53. Sidach S.S., Mintz I.M. Low-affinity blockade of neuronal N-type Ca channels by the spider toxin w-agatoxin-IVA // J. Neurosci. 2000. Vol. 20. P. 7174-7182.

54. Sather W.A., Tanabe Т., Zhang J.F., Tsien R.W. Biophysical and pharmacological characterization of a class A calcium channel // Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1994 Vol. 747. P. 294-301.

55. Rezende Jr.L., Cordeiro M.N., Oliveira E.B., Diniz C.R. Isolation of neurotoxic peptides from the venom of the armed spider Phoneutria nigriventer // Toxicon. 1991. Vol. 29. P. 1225-1233.

56. Miranda D.M., Romano-Silva M.A., Kalapothakis E., Diniz C.R., Cordeiro M.N., Maraes-Santos T.M., Prado M.A.M., Gomez M.V. Phoneutria nigriventer toxin block tityustoxin-induced calcium influx in synaptosomes // Neuroreport. 1998. Vol. 9. P. 1371-1373.

57. Miranda D.M., Romano-Silva M.A., Kalapothakis E., Diniz C.R., Cordeiro M.N., Maraes-Santos T.M., De Marco L.A., Prado M.A.M., Gomez M.V. Spider neurotoxin block the beta cortical synaptosomes // Brain. Res. Bull. 2001. Vol. 54. P. 533-536.

58. Leao R.M., Cruz J.S., Diniz C.R., Cordeiro M.N., Beirao P.S.L. Inhibition of neuronal high-voltage activated calcium channels by the omega-phoneutria nigriventer Tx3-3 peptide toxin // Neuropharmacology. 2000. Vol. 39. P. 1756-1767.

59. Leao R.M., Cruz J.S., Diniz C.R., Cordeiro M.N., Beirao P.S.L. Calcium channel bloking toxins in the venom of Phoneutria nigriventer // J. Venom. Anim. Toxins. 1997. Vol. 3. P. 223.

60. Takeuchi K., Park E., Lee C., Kim J., Takahashi H., Swartz K., Shimada I. Solution structure of omega-grammotoxin SIA, a gating modifier of P/Q and N-type Ca2+ channel //J. Mol. Biol. 2002. Vol. 321. P. 517-526.

61. McDonough S.I., Lampe R.A., Keith R.A., Bean B.P. Voltage-dependent inhibition of N- and p-type calcium channels by the peptide toxin co-grammtoxin-SIA // Mol. Pharmacol. 1997. Vol. 52. P. 1095-1104.

62. Bourinet E., Stotz S.C., Spaetgens R.L., Dayanithi G., Lemos J., Nargeot J., Zamponi G.W. Interaction of SNX482 with domains III and IV inhibits activation gating of alpha (IE) Cav2.3 calcium channels // Biophys. J. 2001. Vol. 81. P. 79-88.

63. Piser T.M., Lampe R.A., Keith R.A., Thayer S.A. co-Grammotoxin SIA blocks multiple, voltage-gated, Ca2+ channel subtypes in cultured rat hippocampal neurons // Mol. Pharmacol. 1995. Vol. 48. P. 131-139.

64. Sutton K.G., Siok C., Stea A., Zamponi G.W., Heck S.D., Volkmann R.A., Ahlijanian K., Snutch T.P. Inhibition of neuronal calcium channels by a novel peptide spider toxin, DW 13.3 // Mol. Pharmacol. 1998. Vol. 54. P. 407-418.

65. Fisyunov A., Pluzhnikov K., Molyavka A., Grishin E., Lozovaya N., Krishtal O. Novel spider toxin slows down the activation kinetics of P-type Ca2+ channels in Purkinje neurons of rat //Toxicology. 2005. Vol. 207. P. 129-136.

66. McDonough S.I., Mintz I.M., Bean B.P. Alteration of P-type calcium channel gating by the spider toxin omega-Aga-IVA // Biophys. J. 1997. Vol. 72. P. 2117-2128.

67. Mintz I.M., Bean B.P. GABAB receptor inhibition of P-type Ca2+ channels in central neurons // Neuron. 1993. Vol. 10. P. 889-898.

68. Llinas R., Sugimori M., Hillman D.E., Cherksey B. Distribution and functional significance of the P-type, voltage-dependent Ca2+ channels in the mammalian central nervous system //Trends. Neurosci. 1992. Vol. 15. P. 351-355.

69. Wheeler D.B., Randall A., Sather W.A., Tsien R.W. Neuronal calcium channels encoded by the alpha IA subunit and their contribution to excitatory synaptic transmission in the CNS // Prog. Brain Res. 1995. Vol. 105. P. 65-78.

70. Wu L.G., Westenbroek R.E., Borst J.G., Catterall W.A., Sakmann B. Calcium channel types with distinct presynaptic localization couple differentially to transmitter release in single calyx-type synapses //J. Neurosci. 1999. Vol. 19. P. 726736.

71. Hillyard D.R., Monje V.D., Mintz I.M., Bean B.P., Nadasdi L., Ramachandran J., Miljanich G., Azimi-Zoonooz A., Mcintosh J.M., Cruz L.J. A new Conus peptide ligand for mammalian presynaptic Ca2+ channels // Neuron. 1992. Vol. 9. P. 69-77.

72. Leao R.M., Cruz J.S., Diniz C.R., Cordeiro M.N., Beirao P.S. Inhibition of neuronal high-voltage activated calcium channels by the omega-phoneutria nigriventer Tx3-3 peptide toxin//Neuropharmacology. 2000. Vol. 39. P. 1756-1767.

73. Prinz W.A., Aslund F., Holmgren A., Beckwith J. The role of the thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing protein disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm//J. Biol. Chem. 1997. Vol.272. P. 15661-15667.

74. Cao Z., Xiao F., Peng F., Jiang D., Мао X., Liu H., Li W., Hu D., Wang T. Expression, purification and functional characterization of a recombinant scorpion venom peptide BmTXKp // Peptides. 2003. Vol. 24. P.187-192.

75. Молявка A.A., Козлов C.A., Гришин E.B. Структурный анализ полипептидных токсинов из яда пауков // Российский симпозиум по химии и биологии пептидов: Сб. тез. докл. Москва. 2003. С. 35.

76. Kozlov S., Molyavka A., McCutchen В., Lu A., Schepers E., Herrmann R., Grishin E. A novel strategy for the identification of toxinlike structures in spider venom // Proteins. 2005. Vol. 59. P. 131-140.

77. Inui Т., Hagiwara K., Nakajima K, Kimura Т., Nakajima Т., Sakakibara S. Synthesis and disulfide structure determination of agelenin: identification of the carboxy-terminus as an amide form // Pept. Res. 1992. Vol. 5. P. 140-144.

78. Huang X., Madan A. CAP3: a DNA sequence assembly program // Genome Res. 1999. Vol. 9. P. 868-877.

79. Norton R.S., Pallaghy P.K. The cystine knot structure of ion channel toxins and related polypeptides // Toxicon. 1998. Vol. 36. P. 1573-1583.

80. Hagiwara K., Sakai Т., Miwa A., Kawai N., Nakajima T. Complete amino acid sequence of a new type of neurotoxin from the venom of the spider, Agelena opulenta // Biomed. Res. 1990. Vol. 11. P. 181-186.

81. Skinner W.S., Dennis P.A., Li J.P., Quistad G.B. Identification of insecticidal peptides from venom of the trap-door spider, Aptostichus schlingeri (Ctenizidae) I I Toxicon. 1992. Vol. 30. P. 1043-1050.

82. Kuhn-Nentwig L., Schaller J., Nentwig W. Purification of toxic peptides and the amino acid sequence of CSTX-1 from the multicomponent venom of Cupiennius salei (Araneae:Ctenidae) // Toxicon. 1994. Vol. 32. P. 287-302.

83. Krapcho K.J., KralR.M.J., Vanwagenen B.C., Eppler K.G., Morgan Т.К. Characterization and cloning of insecticidal peptides from the primitive weaving spider Diguetia canities II Insect Biochem. Mol. Biol. 1995. Vol. 25. P. 991-1000.

84. Oswald R.E., Suchyna T.M., McFeeters R., Gottlieb P., Sachs F. Solution structure of peptide toxins that block mechanosensitive ion channels // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 34443-34450.

85. Quistad G.B., Skinner W.S. Isolation and sequencing of insecticidal peptides from the primitive hunting spider, Plectreurys tristis (Simon) // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 11098-11101.

86. Sheumack D.D., Claassens R., Whiteley N.M., Howden M.E. Complete amino acid sequence of a new type of lethal neurotoxin from the venom of the funnel-web spider Atrax robustus I I FEBS Lett. 1985. Vol. 181. P. 154-156.

87. Liang S.P, Zhang D.Y., Pan X., Chen Q., Zhou P.A. Properties and amino acid sequence of huwentoxin-I, a neurotoxin purified from the venom of the Chinese bird spider Selenocosmia huwena //Toxicon. 1993. Vol. 31. P. 969-978.

88. Ostrow K.L., Mammoser A., Suchyna Т., Sachs F., Oswald R., Kubo S., Chino N., Gottlieb P.A. cDNA sequence and in vitro folding of GsMTx4, a specific peptide inhibitor of mechanosensitive channels // Toxicon. 2003. Vol. 42. P. 263274.

89. Lundell N., Schreitmuller T. Sample preparation for peptide mapping — a pharmaceutical quality-control perspective // Anal. Biochem. 1999. Vol. 266. P. 3147.

90. Aviv H., Leder P. Purification of biologically active globin messenger RNA by chromatography on oligothymidylic acid-cellulose // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1972. Vol. 69. P. 1408-1413.

91. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning // A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1989.

92. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J. Mol. Biol. 1983. Vol. 166. P. 557-580.

93. Lowry O.H., Rosebrrough N.J., Fearr A.L. Protein measurement with folin phenol reagent //J. Biol. Chem. 1951. Vol. 192. P. 265-275.

94. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.