Альфа-латрокрустотоксин: выделение, характеристика, взаимодействие с нейрональным рецептором тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ6 од

п |Ц Г, ^РЬ , и , российская академия наук

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ИНСТИТУТ ВИООРГАНИЧЕСКОЙ химии им. академиков М.М.ШЕМЯКИНА и В.А.ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

красноперов валерии геннадьевич

а-Латрокрустотоксин: выделение, характеристика, взаимодействие с нейрональным рецептором.

02.00.Ю Еиоорганическая химия. Автореферат

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВа - 1994

Работа выполнена в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Ордена Трудового Красного Знамени Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН

Научный руководитель - доктор химических наук, профессор Е.В.Гришин.

Официальные оппоненты:

1. чл.-кор. РАН, д.х.н. А.И.Мирошников

2. К.Х.Н. А.П.Сухих

Ведущая организация - Институт бежа, РАН

Защита состоится 15 июня 1994 года в ю часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии РАН по адресу: И7871 ГСП Москва В—437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН

Автореферат разослан " " мая 1994 года.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

Актуальность. природные нейротоксины растительного, животного или микробного происхождения служат своего рода "молекулярными инструментами" для исследования структурно-функциональной организации компонентов мембраны нервной ткани. Благодаря высокой специфичности взаимодействия с мембранными рецепторными комплексами нейротоксины получили огромное распространение в молекулярной нейробиологии.

Анализ информации, полученной с помощью таких нейротоксинов, как тетродотоксин, сакситоксин, батрахотоксин, аконитин, вератри-дин, нейротоксинов скорпионов и актиний, позволил сформулировать фундаментальные представления о структуре и механизме работы по-тенциалзависимых натриевых каналов. Яды змей оказались незаменимыми инструментами в исследовании молекулярной организации пост-синаптической мембраны. При использовании ботулинического и столбнячного токсинов, а-латротоксина паука каракурта и р-нейро-токсинов змей получены важные сведения об отдельных этапах синтеза, хранения и секреции нейромедиаторов.

На сегодняшний день дальнейший успех в изучении молекулярных структур, обуславливающих процессы генерации, проведения и передачи нервного импульса, во многом предопределяется арсеналом новых нейротоксинов, способных селективно модифицировать определенную функцию нейрона.

В большей степени вышесказанное относится к нейротоксинам, специфичным к нервной ткани беспозвоночных животных, так как до недавнего времени ей уделялось мало внимания. Здесь, помимо сравнительно-функционального исследования нервной системы беспозвоночных, поиск токсинов может обеспечить нас новыми, высокоэффективными, экологически чистыми инсетицидными препаратами.

Большинство пауков обездвиживает попавшую в паутину жертву, впрыскивая ей яд, обладаний нейропаралитическим эффектом. Таким образом, ядовитые железы паукообразных можно рассматривать как один из основных природных источников нейротоксинов, воздействующих на беспозвоночных. С нашей точки зрения, весьма перспективным является ЯД каракурта (Ьа1гос1ес1:из та^апэ 1гес1ес1.тди^а1:цз). Согласно литературным данным, он обладает сильным пресинаптичес-ким воздействием на нейромышечных препаратах раков и насекомых.

Цель работы. Основной целью настоящей работы являлось: х.Идентификция, выделение и характеристика новых токсинов из яда Паука Ьа-Ьгос1есЬиЕ тас^апэ ^е<1ес1.тди«а1:из, специфично ВОЗДеЙСТ-вувдих на насекомых и ракообразных. 2. На примере крустотоксина (токсина, специфичного к ракообразным) осуществлен комплекс работ по анализу мембраносвязанного рецептора нервной ткани ракообразных и сравнению полученных характеристических параметров с ранее идентифицированным рецептором а-латротоксина (а-ЛТ) из мозга быка.

Научная новизна и практическое значение работы. В ходе исследований было показано, что в яде каракурта помимо хорошо известного а-ЛТ, содержится по крайней мере 5 инсекто- и один крусто-специфичный нейротоксин. Предложен метод их препаративного выделения с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием системы грьс. Доказано, что выделенные токсины являются индивидуальными белками. Проведен комплекс работ по их биохимической характеристике: определено содержание в яде, показана видовая специфичность, установлены летальные дозы, аминокислотный состав и и-концевая последовательность. Определена первичная структура пептидов, полученных после ферментативного расщепления а-латрокрустотоксина (а-ЛКГ) и з-латроинсектотоксина (а-ЛИТ).

Изучен механизм действия выделенных нейротоксинов. Показано, что крустотоксин и по крайней мере 2 инсектотоксина обладают явной пресинаптической активностью на нейромышечном препарате ракообразных и насекомых соответственно.

Предложен метод получения радиоактивного производного а-ЛКТ, позволяющий сохранить его биологическую активность. Используя [1251]-а-ЛКТ в качестве зонда, осуществлена сравнительная характеристика мембранного рецептора нервной ткани ракообразных с ранее идентифицированным рецептором а-ЛТ из мозга быка.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, посвященного белковым нейро-токсинам пауков, главы, в которой приведены полученные результаты и их обсувдение, экспериментальной части и выводов. Диссертация изложена на 14о машинописных страницах. Список цитированной лите-ратуры включает 135 наименований.

Содержание работы.

. Давно известно, что цельный яд паука каракурта обладает токсичностью не только к позвоночным, но и к беспозвоночным животным. Причем, электрофизиологическими методами установлено, что экстракт ядовитых желез оказывает сходные эффекты на нейромышеч-ных препаратах саранчи и омара - увеличение частоты и амплитуды вызванных потенциалов концевой пластинки, за чем следует полная блокада проводимости синапса. При этом, картина воздействия на препарате беспозвоночных очень похожа на ту, которую вызывает известный а-ЛТ на синапсах позвоночных животных.

. Попытки идентифицировать эти компоненты предпринимались по крайней мере с 1964 года. Однако на сегодняшний день в работах, посвященных исследованию яда паука L. mactans tredecimguttatus, не приводится ни каких данных ни по выделению, ни по идентификации этих токсинов.

Мы поставили перед собой задачу выделить их в индивидуальном состоянии, определить видовую направленность, летальные дозы, т.е. провести весь комплекс исследований, связанный с характеристикой новых белков.

Для проведения такого рода работ необходимо иметь либо наличие электрофизиологической базы, либо проводить скрининг токсич-ностей непосредственно на животных. Второй вариант представляется нам более приемлемым, поскольку позволяет анализировать большое количество исследуемых образцов и для его проведения не требуется дорогостоящее оборудование. В качестве объектов для тестирования были выбраны ЛИЧИНКИ большой ВОЩИННОЙ МОЛИ Gallería mellonella, однолетние особи речного рака procambarus cubensis и лабораторные МЫШИ ЛИНИИ BALB/C.

Выделение нейротоксинов

Первым шагом для идентификации и выделения токсинов из яда паука было определение токсичности его ядовитых желез.

Навеску лиофилизованных желез экстрагировали в 20 мМ трис-нс1 буфере рн 8.о и центрифугировали для удаления нерастворимых частиц. В полученном супернатанте определено общее содержание бежа и количественное содержание летальных доз к различным животным.

Таблица i.

Схема выделения токсинов.

Супернатант (20 ooog) экстракта яда в 20 мМ трис-нс1 pH 8.о

MONO Q pH 8.0

ФРАКЦИЯ А

0.09-0.14 M NaCl

Токсичная только для ракообразных

MONO-S pH 7.5

Фракцш 0.12-0.1< А—2 M NaCl

ФРАКЦИЯ В

0.16-0.28 M NaCl

Токсичная только для насекомых

Phenyl-Superose

MONO-Q pH 6.0

Фракция B-2 0.07-0.25 M NaCl

Mono S, pH 6.2

r-Латроинсек-тотоксин

(0.20 M NaCl) И

•-Латроинсек-тотоксин

(0.26 M NaCl)

ФРАКЦИЯ С

0.30-0.37 M NaCl

Токсичная для насекомых и позвоночных

MONO-Q pH 6.0

Фракция С—2 0.27-0.30 M NaCl

ГАП, pH 7.5

а-Латротоксин

(0.05 M Na2HP04)

и

«-Латроинсек-тотоксин

(0.12 M N^ HPCJj )

а-Латроинсектотоксин (О.З M (NH4)2S04)

Phenyl-Superose ß-ЛЭТрОИНСеКТОТОКСИН (0.0 M (NH4)2S04)

Используя серив разведений установлено, что летальные дозы, вызывающие гибель у 50% животных (ДД50) равны о.б, зо и о.9 мкг растворимой белковой фракции на грамм веса насекомых, ракообразных и мышей соответственно.

В качестве первой стадии выделения токсинов использовали высокоэффективную ионообменную хроматографию на колонке Mono q hr 5/5 в трис-нс1 буфере с рН 8.о (рис.1). Сорбированные белки элюи-ровали линейно повышающейся концентрацией Nací от 20 до íooo мМ.

номер фракции

Рис.1. Хроматография экстракта 4о мг лиофилиззванных ядовитых желез паука каракурта на колонке Mono q hr 5/5 в 20 мМ трис-HCi буферной системе, pH s.o. Элюция проводилась градиентом концентрации Nací при скорости i мл/мин. Объем фракций - i мл. Внутри рисунка номерами обозначены: i- поглощение элюата при а=28о нм; 2- концентрация Nací, распределение токсических активностей: з-для ракобразных, 4- для насекомых и 5- для позвоночных животных. "А", "В", "С", - объединенные согласно тестам на токсичность фракции для последующих очисток.

Площади изображенных на рисунке пиков токсических активностей, пропорциональны количеству летальных доз (ЛД50) в рассчете на единицу веса тела, использованных в экспериментах животных.

Анализ на токсичность полученных фракций показал, что в области 90-140 мМ Nací (фракция "А") с носителя десорбируется смесь белков, которые проявляют активность только цротив ракообразных.

Токсические для насекомых компоненты элюировалась в виде двух отдельных, неперекрыващихся пиков при концентрациях 160-280 мМ (фракция "В") и 300-360 мМ Nací (фракция"С"). При этом, второй пик существенно (более чем на эо#) перекрывался с фракцией, токсичной для позвоночных, которая элюировалась в виде одного пика

при 320-370 MM NaCl.

Фракции белка, не сорбирующиеся в данных условиях на колонку, не содержали токсических активностей ни для одной из групп тестируемых животных.

Очистка а-латрокрустотоксина

Общая схема выделения всех токсинов из ядовитых желез паука L. mactans tredecimguttatus приведена В Таблице 1.

Активную к ракообразным фракцию "А" (рис.1) диализовали против ю мМ натрий-фосфатного буфера рн 7.5 и хроматографировали на колонке с катионообменной смолой Mono s hr 5/5 (рис.2).

Сорбированные белки элюировали линейным градиентом концентрации Nací (10-1000 мМ). Токсическая активность к ракам присутствовала только во фракциях 18-22, и элюировалась единственным пиком В области 120-140 MM NaCl.

Электрофоретический анализ в sds-ПААГ показал, что в интере-сущей нас области присутствует только два бежа с молекулярными массами 40 и 120 кДа, причем токсичность против раков явно коррелировала с высокомолекулярным белком. Для дальнейшей работы токсичные фракции 18-22 объединили под общим названием "А-2". Количественное соотношение белков 40 и 120 кДа в объединенной фракции соответствовало примерно как 5/1.

Окончательную очистку специфичного для раков нейротоксина проводили с помощью гидрофобного сорбента (рис.з). С этой целью, фракцию "А-2" концентрировали, добавляли к ней сульфат аммония до конечной концентрации 20Я (от насыщения) и проводили хроматографию на колонке Phenyi-superose HR 5/5. Элюцшо осуществляли линейно понижающимся градиентом концентрации (nh ) so с 20% до о% в

натрий-фосфатном буфере. При этом, активный к ракообразным токсин содержался во фракциях 7-ю, десорбированных при 14% (лн4)2бо4. Как показал анализ в ю% зоб-ПААГ электрофорезе активные фракции характеризовались единственной белковой полосой в районе 120 кДа (рис.5.2), которая хорошо отделялась от полипептида 40 кДа. Токсину дали название а-латрокрустотоксин (а-ЛКТ).

ноиер фракции

Рис.2. Хроматография фракции "А" (рис.1), на колонке Mono s HR 5/5 в натрий-фосфатной буферной системе, рН 7.5. Элюция проводилась градиентом концентрации Nací при скорости i мл/мин. Объем фракций - i мл. Внутри рисунка цифрами обозначено: i- поглощение элюата при х=28о нм; г- концентрация Nací; з- распределение токсичной активности против раков. "А-г"- суша токсичных к ракам фракций, объединенная для дальнейшей работы.

Значение ЛД50 для а-ЛКТ составляет приблизительно юо нг/г веса тела как ДЛЯ Procambarus cubensia, так и для другого вида рака - Astacus astacus.

Кроме действия на эти виды речных раков а-ЛКТ оказывал нерв-

нопаралитический эффект на других представителей ракообразных -морских и пресноводных Сокоплавов, креветок, крабов, мокриц. В то же время а-ЛКТ не обладал активностью по отношению к личинкам вощинной моли и мышам в дозах свыше чем 5000 нг/г веса тела.

Принимая во внимание разнообразие видов ракообразных, чувствительных к действию а-ЛКТ, и учитывая отсутствие какого-либо эффекта на другие виды животных (насекомые и позвоночные), выделенный токсин можно рассматривать как универсальный, специфичный нейрокрустотоксин. Выход очищенного а-ЛКТ составляет приблизительно о.з% от веса белковой фракции экстракта исходного яда.

ноиер - фракции

Рис.з. Хроматография фракции "А-2" (рис.2) на колонке Phenyi-superose hr 5/5 в натрий-фосфатной буферной системе, рн 7.5. Элю-цию проводили линейно понижающимся градиентом концентрации (nh4)2so4 с 20% до о% цри скорости о.5 мл/мин. Объем фракций- о.5 мл. Внутри рисунка цифрами обозначено: i- поглощение элюата при а=280 -нм; 2- концентрация (nh4)2so4; з- распределение токсичной активности против раков.

Совместно с сотрудниками Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (Москва) проведены исследования по поиску "мишени" действия крустотоксина. Показано, что аппликация 5 нМ концентрации a-JIKT к нейромышечному препарату рака Astacus asta-cus, приводит к возрастанию частоты и амплитуды миниатюрных потенциалов концевой пластинки, за чем следует полная блокада проводимости синапса. Полученные результаты полностью воспроизводили картину отравления нейромышечного соединения рака цельным ядом. Таким образом, можно считать, что высокоспецифичный к ракообразным a-JIKT обладает явно выраженным пресинаптическим механизмом действия.

Выделение а- р- г- и латроинсектотоксинов

В качестве второй стадии разделения токсических компонентов фракции "В", содержащей исключительно инсектоспецифическую активность (рис.1), была выбрана хроматография на колонке Mono q hr 5/5 в го мМ 1-гистидин—нс1 буферной системе рн б.о. Сорбированные белки элюировали линейным градиентом (o.o-i.o M) концентрации Nací. Хотя, при данных условиях, токсическая активность к насекомым элюировалась в более широком диапазоне концентраций Nací (70-250 ММ), чем в случае трис-буферной системы (рис.1), снижение на этой стадии величины рН позволило отделить большую группу нетоксичных белков. Объединенную сумму токсических фракций (фракция "В—2") использовали для • дальнейшей работы. После диализа против ю мМ натрий-фосфатного буфера рН 6.2, "в-2" фракционировали на катионообменной колонке Mono s hr 5/5 (рис.4).

Сорбированные компоненты элюировали линейно повышающейся концентрацией Nací. Анализ токсичности полученных фракций показал, что основная инсектицидная активность регистрируется в несорбиро-ванной фракции ("В-з") а меньшая часть - в двух из нескольких пиков оптической плотности профиля элюции.

Токсические фракции, элюирувдиеся с сорбента в области 200 и 260 мМ Nací относятся (по количеству летальных доз) к "В-з" примерно как 1/200 и 3/200 и представлены в sds-ПААГ однородными белками с молекулярными массами 120 и но кДа (рис.5, дорожки б и

8 соответственно). При рехроматографиях этих белков на mono-q колонке они элшровались также гомогенным пиком.

Выделенные токсины были обозначены нами как г-латроинсекто-токсин и .-латроинсектотоксин (r-ЛИТ и .-ЛИТ). Они были охарактеризованы по видовой специфичности и величине летальных доз. Установлено, что при введении их мышам и ракам в дозах 5000 нг/г веса тела названные токсины не оказывают никакого эффекта.

Обращают на себя внимание достаточно низкие, по сравнению с «-JIT и а-ЛКТ, летальные дозы (ЛД50), которые для r-ЛИТ и .-ЛИТ составили значение .250 и юоо нг/г веса тела насекомых соответственно .

номер фракции

Рис.4. Хроматография инсектоспецифической фракции "В-2" на колонке Mono s HR 5/5 в io мМ натрий-фосфатной буферной системе, рН 6.2. Элюция сорбированных белков проводилась градиентом концентрации Nací при скорости i мл/мин. Объем фракций - 1 мл. Внутри рисунка номерами обозначены: i- поглощение элюата при л=2во нм; 2- концентрация Nací, з- распределение инсектотоксической активности. *- пик десорбции г-ЛИТ, **- пик десорбции «-ЛИТ.

Согласно электрофоретическому анализу в- sds-ПААГ фракция "В-з" состоит в основном из двух полипептидов с молекулярными массами 120 и 140 кДа. Для их разделения проводили хроматографию

на колонке Phenyl-Superose HR 5/5 В 20 мМ ТрИС-НС1 буфере рн 8.0, содержащем о.з M (nh4)2so4. Белок, несорбирующийся в этих условиях, представлял собой электрофоретически гомогенный инсектоспеци-фичный нейротоксин с молекулярной массой 120 кДа (рис.5). Он был назван а-латроисектотоксином (а-ЛИТ). Сорбированный на колонке белок был элюирован трис-нс1-буфером, не содержащим сульфат аммония. Его молекулярная масса составила 140 кДа (рис.5). Он получил название /з-латроисектотоксина (э-ЛЮ).

В опытах на мышах и раках данные токсины не оказывали ни какого эффекта в дозах sooo нг/г веса тела животных. ЛД50 на личинках большой ВОЩИННОЙ МОЛИ Gallería mellonella СОСТЭВИЛО Значение для а-лит и е-ЛИТ 15 и 25 нг/г соответственно.

1234567 89 КДа

—---=——, —- 150 П6 S1

"Т" S 7

« « - 43 39

— — - за

— — го

— ■ —

Рис.5. Электрофоретический анализ в ю% зоэ-ПААГ: лагроток-сина: а-ЛТ (1), а-латрокрустотоксина: а-ЛГСГ (2) и латроинсекто-токсинов: а- (з), р- (5), г- (6), а- (7), и (8). В каждую дорожку внесено по 2 мкг токсинов. Дорожки 4 и э - смесь стандартных белков.

Согласно предварительным данным, полученным совместно с сотрудниками Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. 'М. Сеченова (С.-Петербург), а-ЛИТ и э-ЛИТ оказывают сильный пре-синаптический эффект на нейромышечном препарате мясной мухи, полностью воспроизводя картину отравления синапса насекомых цельным ядом.

Содержание токсинов, в расчете на белковую фракцию исходного экстракта, - г% и о.2% соответственно. Таким образом, учитывая высокое значение летальной дозы (is нг/г), можно считать что а-ЛИТ является основным компонентом яда, ответственным за токсическую активность против насекомых..

Очистка а-латроинсектотоксина и а-латротоксина.

В качестве второй стадии выделения токсинов из фракции "С" (рис.1), активной к позвоночным животным и к насекомым (5% летальных доз от общей инсектотоксичности исходного экстракта), была выбрана хроматография на колонке Mono q hr 5/5 в более кислых условиях 1-гистидин—нс1 буферной системы, рН 6.о.

В этом случае компоненты, активные к насекомым и позвоночным, элюировались ОДНИМ ПИКОМ В области 270-ЗЮ MM NaCl (фракция "С-2"), хорошо отделяясь от основной части^нетоксичных белков с молекулярными массами 60-70 кДа. Анализ полипептидного состава фракции "С-2"показал, что она представляет собой смесь двух компонентов близких молекулярных масс. Один из них является хорошо известным а-латротоксином, активным к позвоночным (рис.5). Второй компонент назван нами «-латроинсектотоксином (e-лит) и является инсектотоксическим белком с молекулярной массой но кДа (рис.5). Отношение а-ЛТ/«-ЛИТ в этой фракции соответствовало 10/1.

Разделение токсинов фракции "С-2" до гомогенного вида проведено хроматографией на колонке с гидроксиапатитом (ГАП), уравновешенной ю мМ Na2HPo4, рН 7.5. Элюировали сорбированные токсины ю-зоо мМ градиентом концентрации натрий-фосфатного буфера рН 7.5. При 40 ММ концентрации буфера начиналась десорбция а-ЛТ с максимальным значением в области 70 мМ (фракция "С-з"). В районе 90 мМ вэлюате регистрировалась инсектотоксичность, которая достигала максимума при 120 мМ иа2нро4 (фракция "С-4", рис.6).

0.50 -Л

[Na^HPO^l, mM

г 300

0.00

0.25

- 100

-200

0

О

8

18

24

номер фракции

Рис.6. Хроматография смеси а-лт и з-лит на пщхжсиапатитной колонке (юхюо мм) в натрий-фосфатном буфере, рН 7.5. Элюцию сорбированных белков проводили линейным градиентом Na2HP04 при скорости го мл/час. Объем фракций - i мл. Внутри рисунка под номерами обозначено: i- поглощение элюата при х=2во нм; 2- концентрация Na2HP04. Распределение токсических активностей: з- для позвоночных животных и 4- для насекомых. "С-4", сумма объединенных. инсектотоксических фракций для последующих рехроматографий.

Используя этот вид хроматографии, удалось отделить основную часть а-лт от s-ЛИТ. После объединения фракций, обогащенных «-ЛТ, примесь инсектотоксина в препарате не превышала з-5#. Рехромато-графия фракций "С-з" («-ЛТ) и "С-4" (г-ЛИТ) в тех же условиях привела к получению электрофоретически, хроматографически и токсикологически гомогенных ш-ЛТ и г-ЛИТ.

В опытах на мышах и раках установлено, что а-ЛИТ не оказывает на них ни какого эффекта в дозах sooo нг/г веса тела животных. Значение ЛД50, этого токсина для насекомых составило во нг/г. Необходимо отметить, что а-ЛИТ обладает выраженной токсичностью не ТОЛЬКО к личинкам Galleria mellonella, НО И К Тараканам Peri-planeta americana И мухам Musca domestica.

Свойства всех выделенных токсинов приведены в таблице 2. Таблица 2.

Свойства а-латротоксина, а-латрокрустотоксина и латроинсектотоксинов из яда паука каракурта ь. ю.

ЛТ ЛКТ Латроинсектотоксины

Характерис-

тика а а а р 7 S е

М., кДа 120 120 120 140 120 110 110

ЛД50 нг/гр *** 20 ** 100 * 15 * 25 * 250 * 60 * 1000

Содержание 2 0.3 2 0.2 0.2 0.4 2

Молекулярная масса определена с помощью ю% sds-ПААГ электрофореза в присутствии стандартных белков.

ЛД«-П определены в опытах на личинках большой вощинной моли * **

Galleria mellonella , речных раках Frocambarus cubensis и ЛЗ-

бораторных мышах линии balb/c***.

Содержание каждого токсина приведено в процентах от веса белковой фракции экстракта ядовитых желез каракурта.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности токсинов.

По данным определения аминокислотного состава все выделенные токсины обладают достаточно большой степенью гомологии.

Секвенирование иммобилизованных на поливинилидендифторид (им-мобилон) белков (200-400 пмолей) проводили с помощью автоматической деградации в газофазном секвенаторе 470А (Appiided Biosystems). В результате анализа удалось определить N-концевые последовательности у всех токсинов. Число идентифицированных аминокислотных остатков в полипептидных цепях составило от 5 в случае .-ЛИГ до. 23 у а-лкт и a-ЛИТ. Как ввдно из таблицы з, все токсины на n - конце содержат глутаминовую кислоту. Исключение составляет «-ЛИТ, у которого N-концевой является аспаргиновая кислота.

Таблица з.

и-концевые последовательности токсинов:

1 10 20 27

- а-ЛТ* Е-О-Е-О-Ь-Е-Е-К-А-Е-1-Х-8-Е-Ь-Е-Ь-0-Х-У-У-П-1-А-8-Ы-1-а-ЛКТ Е-М-Б-К-А-О-д-С-Т-Г-Ь-Е-У-О-С-У-А-У-С-Т-Ь-С-А-а-ЛИТ Е-М-З-Е-А-О-д-Х-К-Ь-Ь-А-У-Т-А-У-Э-ЛИТ Е-Е-Т-З-Ь-Е-О-ТЧЭ-К-О-зг-ЛИТ Е-м-з-к-о-д-д-

в-ЛИТ П-Е-Е-0-С-Е-М-Т-Х-Е-Е-Н-0-А-д-С-К-А-1-Е-У-Х-Л-е-ЛИТ Е-М-З-К-Э-

*- последовательность а-ЛТ приведена согласно Волковой (1991).

Исследование продуктов ферментативного гидролиза а-ЛКТ и б-ЛИТ.

С целью получения дополнительной информации о структуре молекулы а-ЛКТ было предпринято изучение продуктов его ферментативного расщепления. Достичь желаемого результата удалось лишь в случае применения в качестве фермента химотрипсина. Причем, удовлетворительный гидролиз проходил только в том случае, если образец токсина (; з.5 нмолей), предварительно денатурировали 6 М мочевиной в присутствии дитиотреита.

К подготовленному таким образом и отдиализованному токсину для карбоксиметилирования -бн групп добавляли иодуксусную кислоту. Так как полученный образец белка был склонен к преципитации, ферментативный гидролиз проводили в присутствии 4 м мочевины. Для более глубокого расщепления пептидных связей протеиназу добавляли два раза с интервалом в 18 часов. Конечная нагрузка по фермененту составила 1/20. Протеолиз проводили при температуре 37°С.

По окончанию ферментативного гидролиза препарат сразу фракционировали ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке и^гароге ю>мс. В процессе хроматографии было получено свыше 140 фракций (рис.7).

Рехроматографшо полученных пептидных фракций проводили на колонке и^газр!1еге-ос1у1 в градиенте концентрации ацетонитрила. Таким образом выделено свыше зо гомогенных пептидов. У некоторых из них определены аминокислотные последовательности (Таблица 4).

В целом, в процессе исследования химотриптических пептидов а-ЛКТ определена полная или частичная аминокислотная последова-

тельность 22 фрагментов, содержащих в сумме 272 аминокислотных остатков. Выход пептидов составил около 100-130 пмолей.

минуты

Рис.7. Фракционирование химотриптического гидролизата СМ-а-ЛКТ методом ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке ultrapore юмс (4.6x250 мм, 5 (1М) в 0.1% трифторуксусной кислоте. Элюцию проводили градиентом концентрации ацетонитрила при скорости 1 мл/мин. Фракции отбирали согласно показаниям детектора при х=214 нм.

Параллельно со структурными исследованиями а-ЛГСГ, проводилась-работа по определению аминокислотной последовательности фрагментов 5-ЛИТ. Наряду с известной пресинаптической активностью яда на препаратах различных видов животных (позвоночных, ракообразных и насекомых), а-лит представляет собой токсин, "мишень" действия которого пока не известна. Во всяком случае, на нейромышечном препарате мясной мухи в-ЛИТ не проявляет активности, аналогичной а- и (З-ЛИТ.

В предварительных электрофизйологических экспериментах наблюдалось лишь достоверное падение мембранного потенциала на мембране мышечного волокна насекомых.

Таблица 4.

Структура химотриптических пептидов а-ЛКТ. Первая цифра соответствует номеру фракции (рис.7), из которой выделен пептид. Последующие цифры - номера фракций рехроматографических очисток.

51 -3

58 -3

59 -8

59 -9

59 -10

84 -4

89 -6

90 -7

96 -4

96 -6

98 -5

101 -5

101 -6

110 -3

112 -6

114 -7

118 -3

120 -4

120 -5

121 -5

122 -4

123 -3

1 10 20 28

0-Ь-А-Ы-Р-З-А-1!-0-1-Н-К-0-Ь-У-Н-Ь-А-Б-Н-О-Э-Х-М-1-С-С-Х-С-

Ь-У-0-К-С-А-П-У-К-А-К-С-Х-Е-Н-Ь-К-Р-1-Х-Ь-А-С-Е-К-Х-Х-А-Х-1-А-Э-Е-

р-у-<2-Е-Х-С-1-Ц-Р-Т-А-Е-

Н-1—А-Б-Е-К-К-К-И-О-Е-У-К—

А-1—Н-И—Р-И—Т-Б—

Т-А—А-Ы-А-Т-С-К-Б-0-1—

Ь-А-1-М-Н-Р-Л-Т-Е-Т-Р-0-Г-Ь-

А-Н-Ь-Х-Ь-У-К-У-Е-

С-Н-Е-К-Р-Х-1,-1-

1-А-1-У-Е-А-Р-0-Е-Р-У-К-Б~0-Ь-Х-И-

Н-Е-У-Н-К-К-Ь-О-К-С-А-Е-А-Ь-Е-Я-У-Т-Е-Ь-А-Е-К-Т-У-Х-Х-1-Н-0-Е-Ь-А-1-Р-Н-Н-А-А-0-Ы-Н-А-1-Х-А-Ь-Е-

Е-Е-Б-Б-З-У-Р-б-

Таким образом, а-ЛИТ можно отнести к новому классу содержащихся в яде паука инсектотоксинов, с пока еще неизвестным механизмом действия. В сравнении с другими, пресинаптически неактивными инсектотоксинами - г-ЛИТ и .-ЛИТ, г-ЛИТ выгодно отличается от них самой высокой летальной дозой - во нг/г веса тела насекомого (табл.2) и может оказаться перспективным в плане

поиска новых инсектицидных средств.

Хроматографически и электрофоретически чистый а-ЛИТ в количестве о.5 мг (около 4 нмолей) подвергали денатурации в 6 М мочевине с одновременным восстановленем дисульфидных связей дитио-треитолом. После этого, токсин карбоксиметилировали иодуксусной кислотой. Для ферментативного расщепления полипептидной цепи СМ-а-инсектотоксина использовали трипсин в соотношении 1/60. После инкубации токсина с протеиназой в течении суток при З7°с, образец лиофилизовали, перерастворяли в о.а трифторуксусной кислоте и фракционировали на колонке с обращенной фазой и^гаБреге-оэв (4.6x250 мм, 5 цм)в градиенте концентрации ацетонитрила. В процессе хроматографии удалось получить свыше 120 фракций, поглощающих при 214 нм пептидной материи.

Анализ л-концевых аминокислотных остатков показал, что все фракции нуждаются в дополнительной очистке. Рехроматография проводилась с использованием той не колонки в градиенте концентрации ацетонитрила в нейтральных условиях 0.1 м аммоний-ацетатной буферной системе, рН 5.7. Полученные после рехроматографии фракции пептидной материи были лиофилизованы и перенесены на иммобилон для последующего секвенирования. В целом, в процессе исследования триптических пептидов определена полная или частичная аминокислотная последовательность э фрагментов, содержащих в сумме 105 аминокислотных остатков. Выход пептидов составил около 120-150 пмолей. Результаты анализа последовательностей приведены в таблице 5.

Таблица 5.

Структура триптических пептидов СМ-а-ЛИТ.

1 Е-Ь-Ь-Х-Б-Р-К-Е-Х-Е-Е-

2 Х-Ь-Ь-К-

3 А-У-О-Е-А-Т-Т-Т-К-

4 А-а-х-ы-п-э-

5 Ь-Г-Ь-Е-К-О-Р-З-Ь-К-О-О-Е-Т-Е-Е-

6 Х-С-Е-С-У-Т-Б-Ь-Н-Ь-С-А-М-й-

7 в-.т-0-0-у-т-у-т-0-е-а-,1-х-н-

8 Х-Э-Е-И-Б-Е-Р-Г-Т-У-О-

9 Х-Ы-Е-К-Е-Ы-О-С-Р-Т-Р-Ь-Х-Т-А-У-М-О-Т-Х-

Получение радиоактивных производных а-ла трокру с то токсина

а-лкт может служить ценным инструментом для изучения функциональной и структурной организации системы секреции нейромедиато-ров. Низкое содержание рецепторов в плазматических мембранах клеток нервной ткани ракообразных предъявляет ряд требований к основным материалам, используемым для идентификации и выделения рецепторов. Надежная детекция последних возможна лишь при наличии радиоактивно меченного производного а-ЛКГ. Ввиду белковой природы токсина, наиболее удобным методом получения его является иодирование изотопом 125i. Наряду с другими, известными методами введения метки в белок, только модификация с помощью реактива Болтона-Хантера позволила получить нам биологически активное производное крустотоксина.

При этом, удельная радиоактивность препарата составила 160 Ки/ммоль, а доля модифицированного токсина, извлекаемая избытком плазматических мембран - 25-35% от общей радиоактивности. Биологическую активность радиоактивного производного токсина определяли также непосредственно на раках р. cubensis.

Характеристика мембраносвязаного рецептора а-латрокрустотоксина из нервной ткани краба Paralithodes camtshatica

Поскольку для выполнения работ по характеристике рецептора требуется значительное количество исходного сырья, вопрос об источнике нервной ткани ракообразных приобретает важное значение.

Одним из наиболее крупных представителей класса ракообразных является камчатский краб Paralithodes camtshatica. ИСТОЧНИКОМ нервной ткани служили подглоточные ганглии. С помощью дифференциального центрифугирования из гомогената ганглиев была выделена фракция плазматических мембран нервных клеток.

Опыты по равновесному связыванию токсина плазматическими мембранами проводили при температуре 4°с. К суспензии мембран, содержащей 0.3-0.5 мг мембранного бежа, добавляли меченый токсин до конечной концентрации 0.5-2.0 нМ. Для определения неспецифического связывания в контрольные образцы одновременно с меченым токсином вводили 50-кратный избыток немеченого.

Данные по влиянию различных веществ на рецепцию [1251]-а-ЛКТ представлены в таблице 6. еота в концентрации 5 мМ не изменял величину специфического связывания. Эта особенность рецептора плазматических мембран краба принципиально отличает его свойств рецептора а-ЛТ, где еота ингибировала включение [1251]-а-ЛТ в мембраны до 40%.

Ионы кальция в концентрации 2-5 мМ вызывали увеличение специфического связывания [1251]-а-ЛКТ приблизительно на 15-20% по сравнению с контролем. Влияние кальция на связывание [1251]-а-ЛКТ так же, как и в случае еота, менее выражено, чем на связывание а-ЛТ.

Ионы цинка в концентрации 2-5 мМ. подавляли связывание, в то время как ионы кобальта и кадмия не оказывали существенного влияния на специфическое связывание токсина.

Таблица 6.

Влияние различных веществ на специфическое связывание[1251]-а-ЛКТ мембранами нервной ткани краба.

Вещество Концентрация Специфическое связывание токсина, % *

- - 100

еота 2-5 ММ 100

СаС12 2-5 ММ 120

2пС12 2-5 ММ 60

СоС12 2-5 ММ 95

сас12 2-5 ММ 95

Лектин из заро-

дышей пшеницы 0,5 МКМ 100

Лектин из семян 0,5 МКМ 100

чечевицы

а-ЛИТ 100 НМ 80

а-ЛТ 100 нМ 80

*- Связывание [1251]-а-ЛКТ проводили в 25 мМ MEs-NaoH-буфере, рн 6,4,.содержащем 140 мМ Nací и i % bsa.

Лектины из зародышей пшеницы и семян .чечевицы в концентрациях о.5 мкМ не оказывали заметного воздействия на рецепцию [1251]-а-лкт. Это свойство плазматических мембран нервных клеток краба принципиально отличается от случая ингибирующего действия лектинов на рецепцию «-ЛТ мембранами из мозга позвоночных. Здесь же следует отметить, что уровень ингибирования специфического связывания немечеными а-ЛИТ и а-ЛТ в концентрации юо нМ не превышал 15-20$.

а рм в/г

Рис.8, а. Зависимость общего (1), неспецифического (2) и спе-

1 лс

цифического связывания (з) [ 1]-а-ЛКТ мембранами нервной ткани краба от концентрации токсина. В эксперименте использовали по 500 мкг мембранного белка. Связывание проводили при температуре 5°С в 25 мМ МЕз-наон-Оуфере, рн 6.4, содержащем 140 мМ ыас1, 1% ввА. Неспецид&ическое связывание определяли в присутствии 50 нМ натив-ного токсина. В. Анализ связывания в координатах Скэтчарда, где в - связанный иг- свободный [1251]-а-ЛКТ.

Зависимость связывания меченого токсина от его концентрации имела характер кривой насыщения (рис.8). Анализ полученной кривой в координатах Скэтчарда свидетельствует о существовании одного типа независимых участков связывания с константой диссоциации

(ка) равной зхю-10 м. Плотность рецептора в мембранах нервных клеток краба составляет примерно во фмоль/мг мембранного бежа.

Рецепция меченого токсина плазматическими мембранами из клеток других тканей краба представлена в таблице 7. Как видно, плотность рецепторов а-ЛКТ является максимальной в случае мембран из нервной ткани ганглиев. Плазматические мембраны других электровозбудимых тканей содержат гораздо меньшее количество рецепторов токсина, что может быть связано с меньшим количеством синап-тических контактов, расположенных на клетках этих тканей.

Полученные нами результаты свидетельствуют о высокой специфичности связывания а-латрокрустотоксина рецептором плазматических мембран нервных клеток краба. Они являются необходимой основой для проведения дальнейших исследований по солюбилизации рецептора и выделения его в индивидуальном виде.

Таблица 7. Рецепция с1251]-а-латрокрустотоксина

плазматическими мембранами из разных тканей краба

Рецепция токсина,

Источник мембран фмоль/мг бежа*

Ганглии 60

Аксоны ' 7.2

Сердечная мышца 6.0

Мышцы ходильных ног 6.0

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что яд паука каракурта содержит помимо а-латро-токсина один крусто- и по крайней мере пять инсектоспецифических нейротоксинов. Предложен высокоэффективный метод фракционирования яда, позволяющий выделять идентифицированные токсины в индивидуальном виде в препаративных количествах.

2. Исследована видовая специфичность всех выделенных токсинов, определены их летальные дозы, содержание в яде, аминокислотный состав и н-концевые аминокислотные последовательности; установлено строение фрагментов ферментативного гидролиза а-лКТ и з-ЛИТ.

3. Электрофизиологическими методами установлено, что крусто-токсин • и по крайней мере два инсектотоксина на нервно-мышечных препаратах соответствующих животных обладают четкой пресинапти-ческой активностью, по многим параметрам схожей с пресинаптичес-кой активностью а-латротоксина.

4. Предложен метод получения радиоактивного производного крустотоксина, сохраняющего биологическую" активность. С помощью [1251]-а-латрокрустотоксина охарактеризовав его мембраноассоциированный рецептор из ганглиев краба.

Основные результаты диссертации изложены в следующих статьях и материалах конференций:

1. Красноперов В.Г., Шамотиенко О.Г., Гришин Е.В. - Выделение и свойства инсектоспецифических нейротоксинов из яда паука каракурта Latrodectus mactans tredecimguttatus. - БИООрганИЧеСКЭЯ ХИМИЯ, 1990, Т.16, N 8, С. 1138-1140.

2. Красноперов В.Г., Шамотиенко О.Г., Гришин Е.В.- Специфичный для ракообразных нейротоксин из яда паука каракурта Latrodectus mactans tredecimguttatus.- БИООрганИЧеСКЭЯ ХИМИЯ, 1990, Т.16, N 11, С. 1567-1569.

3. Красноперов В.Г., Шамотиенко О.Г., Гришин Е.В. - Взаимодействие а-[125Х]латрокрустотоксина с плазматическими мембранами нервных клеток речного рака Astacus astacus.- Биоорганическая

ХИМИЯ, 1991, Т.17, N 5, С.716-718.

4. Красноперов В.Г., Шамотиенко О.Г., Гришин Е.В. - Характеристика мембраносвязанного рецептора а-латрокрустотоксина из нервной ткани краба Paralitodes camtshatica.- ЕИООргаНИЧескаЯ ХИМИЯ, 1991, т.17, N 10, С. 1329-1334.

5. Красноперов В.Г., Шамотиенко О.Г., Гришин Е.В.- Специфичный ДЛЯ ракообразных нейротоксин из яда паука Latrodectus mactans tredecimgutta'tus и его взаимодействие с рецепторами из нервной ткани краба Paralitodes camtshatica.- 1991, Первая всесоюзная токсикологическая конференция, Ашхабад, с. 28-29.

6. Krasnoperov V.G., Shamotienko O.G., Grishin E.V.- Isolation and properties of insect and crustacean-specific neurotoxins from the venom of the black widow spider (Latrodectus mactans tredecimguttatus). - 1992, J. Natural Toxins, V.l, N 1, pp.17-23.

7. Бурмистров D.M., Шуранова Ж.П., Шамотиенко О.Г., Красноперов В. Г., Гришин Е.В. - Изучение действия а-латрокрустотоксина на нервно-мышечную передачу у речного рака. - 1992, Биологические мембраны, т. 9, n 2, с. 236-239.

12.04.94 г. Зак.6067Р. Тир. 100 эта. Уа.-иэд.л. 1.0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН