Идентификация и выделение нейронального белка со свойствами латротоксина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

российская академия наук

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАШЧЕСКОЙ ХИМИИ км. М.М.ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

цыганкова оксана михайловна идентификация и выделение нейрокального белка со свойствами латротоксина

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1992

Работа выношена в лаборатории кейрсрецепторов и нейрорегуляторов Ордена Трудового Красного Знамени Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина РАН.

Научный руководитель - профессор,

доктор химических наук Е.В.Гришин.

Официальные оппонента: доктор биологических наук Р.Г.Василов, кандидат химических наук Т.М.Шуваева.

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда РАН..

Защита состоится "_" _ 1992 года в__часов

на заседании специализированного совета Д 002.35.01

при Институте биооргаяическо? гныии им. М.М. Шемякина РАН

по адресу: 117871 ГСП-7, Москиа В-437, ул. Миклухо-Маклая, 1в/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической им. М.М.Шемякина РАН.

Автореферат разослан "_" _ 1992 года.

Ученый секретарь спецяллзироЕанкого совета кандидат химических наук

В.А.Несмеянов

...Атуалъность проблемы. Выяснение молекулярной организации и п кшцшов функционирования компонентов нервной системы является гациж, даой из основных проблем современной биологии. Особый интерес представляет изучение процесса передачи нервного импульса. В последнее время в этой области был достигнут значительный прогресс за счет применения генно-инженерных методов и использования нейротоксинов.

Природные нейротоксины обладают высокоспецифячным механизмом действия: они с больной эффективностью связывавтся с различными компонента;®! нервных клеток и тем самым влияют на строго определенные стадии проведения нервного импульса. Селективность действия нейротоксинов позволяет использовать их в качестве инструмента обнаружения и выделения рецепторннх центров, играющих ключевую роль в функционировании нервных клеток. Одним из таких широко применяемых токсинов является сг-латротоксин (ЛТ) из яда паука каракурта Ьа'Ьгойео'Ьиа та<^апз Лгейесцпци.'Ь^а'Ьиз, Еысокоаффинное связывание которого с нейронгЛькыми мембранами стимулирует в различных синапсах позвоночных активный поток ионов Са2+ внутрь клетки и усиленный выброс нейромедиаторов. Предварительно было показано, что участки связывания (рецепторы) ЛТ экспрессированы на пресинаптической мембране практически гсех синапсов. В настоящее время установлено, что рецептор ЛТ является многокомпонентным полипептидным комплексом, состоящим, по крайней • мере, из шести белков, взаимодействие которых с токсином приводит к образованию в мембранах селективных для катионов каналов и к активации фосфоинозитольной системы. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что рецептор ЛТ представляет собой отдельный тип физиологических рецепторов. В последних работах была продемонстрирована способность данного рецептора специфично связываться с мембранным белком синаптических везикул синаптотагмином к регулировать его фосфорилирование. Однако, несмотря на существенный прогресс в исследовании рецептора ЛТ, его функциональная роль остается до конца .невыясненной. На основе изучения взаимодействия ЛТ с его рецептором нами было выдвинуто предположение о том, что ЛТ, по-видимому, является природным аналогом нейронального белка, имеющего определенное структурное сходство с токсином. На этом основании для поиска гипотетического эндогенного аналога ЛТ мы использовали иммунахимические методы

т

исследования с применением антител- против ЛТ. В этой связи хотелось' бы отметить, что недавно в нервной ткани были идентифицированы эндогенные аналоги таких нейротсксинов, как тетродотоксин и апамин, а также сарафотоксинов. Цель рабсш. Настоящая работа является частью комплексных исследований, проводимых в Институте биоорганической »алии им. М.М.Шемякина РАН, по изучению структуры и функции* синапткческих рецепторов и нейрорегуляторов. Данная работа посвящена разработке методов идентификации и препаративного выделения из мозга быка белка, обладающего сходными с Л? антигенными детерминантами, а такг;е фузогенными и ханал-формирующими свойствами. Научная нобизна и практическая ценность работы. Сформулирована гипотеза о существовании эндогенного аналога ЛТ, имеющего некоторое структурное сходство с токсином (ЛТ-подобный белок, Л-белок). Предложена эффективные методы идентификации искомого белка с помощью кроличьих полжлональных моноспецифических антител против ЛТ, а так1.е метод его выделения из цятоплазматической фракции коры головного мозга быка. Установлено, что специфично взаимодействующий с антителами' против ЛТ нейрональнный лолипептид является кислим белком с кол. массой около SO кДа. Определен аминокислота состав Л-бзлка и получена частичная информация о его первичней структуре. С помощью встраивания очищенного Л-белка в бислойные липцдные кзмбраны (БЛМ) проведено сравнение ионопроводящих и фузогепных свойств данного белка и ЛТ. Показано, что Л-белок при встраивании в БЛМ образует структуры типа потенциалзависимых кальциевых каналов и по ряду характеристик напоминает переориентированный з БЛМ ЛТ.

Апробация рабощ и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работа. Результаты исследований докладывались на Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1958), на IV Советско-Германском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Москва, 1991).

Объём работ. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит кз введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включазцегс 148 ссылок. Работа содержит рисунков и

2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ивектфиноция неНронсиъного белка, обладающего схсдншги с мхпротоксинол: скпигетьияи детеряияанпшт

Выдвигая гипотезу о существования эндогенного аналога ЛТ (Л-белна), ш исходили из предположения о том, что эти белки, по-видимому, ш.'.евт некоторое структурное сходство друг с другом. На этом основании для поиска Л-о'елка мы использовали кроличьи поликлональные антитела против ЛТ (крАТ-ЛТ).

Для получения высокоспацифичных крАТ-ЛТ бнда применена специальная схема иммунизации нвйротоксином. 3 результате еженедельных иммунизации кроликов малыш дозами ЛТ (10-20 мкг) с адъювантом Орейвда титр кроличьей сыворотки, определенный иммунофэрментанм анализом (И8А), достигал 1:107. ВысокэспецифячЕые антитела очищали с помощью аффинной .хроматографии па синтезированном иммуносоро'енге ЛТ-Сефароза 4В. В результате из 30 мл сыворотки обычно удавалось получать 11-12 мг очищенных крАТ-ЛТ. Поиск эндогенных компонентов с антигенными свойствами ЛТ проводили о помощью непрямого твердофазного ИФА. а также яммуноблоттинга и иммунодота. В качестве отрицательного контроля применяли нормальные кроличьи иммуноглобулины (в одинаковых концентрациях с крАТ-ЛТ).

Первоначально в качестве объекта для поиска эндогенного лиганда рецептора ЛТ была выбрала кора голоеного мезга быка, представляющая собой наиболее доступный и обогащенный источник рецепторов ЛТ. По данным, полученным в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов, абсолятпоз содержание этих рецепторов составляет 0,3-0,5 пмоль/мг мембранного балка, и в 2С0 г коры головного мозга быка теоретическое содержанке достигает 3 нмоль.

Нами было проведено тестирование с помоаьв твердофазного ИФА и иммуноблоттинга белковых фракций, полученных из гомсгената коры

•головного мозга быка с помощью ступенчатого центрифугирования (Рис. 1). Наибольшее значение ЛТ-подобной иммунореактивности было зарегистрировано с помощью ИФА в цитозольной фракции коры головного мозга (супернатант II). По данным иммуноблота, эта иммунохимическая активность соответствовала белку с мол. массой около 90 кДа. Полученные результаты послужили основой для разработки метода выделения Л-белка из супернатанта II.

Выделение Л-белка.

Для дальнейшей очистки искомого белка нами была выбрана ионообменная хроматография цитоплазматической фракции. При анализе результатов хроматографии на алионообменнике DEAE-Toyopearf. 650М и катионообменнике СУ-Toyopearl 650М (Toyo Soda, Япония) было установлено, что Л-белок связкзается с анионообменным носителем, то есть является кислым по своей природе. В аналитическом Еарпанте хроматографии цитоплазматической фракции на DEAE-Toyopearl 650м при элюции линейным градиентом концентрации KCl иммунохимическую активность, определенную методом ИФА, идентифицировали в диапазоне от 0,2 до 0,4 .4 соли (Рис. 2). В дальнейшем, в целях препаративного выделения Л-белка мы применяли метод элющш ступенчатым градиентом KCl: 4 л супернатанта II (I ыг белка/мл) наносили на колонку с анионоебмешшком (объемом 200 мл), уравноЕешанную 50 мМ трис-KCl, pH 7,5. После промывки буфером с 0,2 М KCl проводили элзоцню 50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,4 м KCl. В элшрованной 0,4 М KCl фракции (0,4М-фракиия) содержалось з среднем 50 мг белка, то есть немного более 1% от общего количества наносимого белка. Л-белок идентифицировали в 0,4М-фракции " с помощью иммуноблеттинга (Рис.3).

В процессе проведения предварительных экспериментов с использованием различных хроматографических операций удалось установить, что в препаративном варианте наиболее эффективной по дальнейшей очистке Л-белка является гидрофобная хроматография на Butyl-Toyopearl 650М (Toyo Soda, Япония) со ступенчатым градиентом KCl (Рис. 4). Для этого 0,4М-фракцию, содержащую 0,7 М KCl, наносила на колошу с Butyl-Toyopearl 650М (объемом 60 мл). Элюцию

КОРА ГОЛОВНОГО МОЗГА БЫКА

0,32 М сахароза, 50 мМ трис-НС1, рН 7,5

ГОМОГЕНАТ КОРЫ

8000§, 60*

СУПЕРНАТАНТ I

СУПЕРНАТАНГ II

ОСАДОК I

50 мМ тркс-НС1, рН 7,5 100000, 4-0'

ОСАДОК II

ИОНООБМЕННАЯ ХРСМАТОГРАСЖН (РЕАЕ-ТСУОР&ЩЬ &50М) О,4М-ФРАКЦИЯ

ГИДР050БНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ВиГПг-ТОУОРЕАЯЬ 650М) 0,05М-фракция

ВЭлОС (ТЗК 04000357) (2 кМ рМЕ, 2% ББ5)

Рис.1. Схема выделения Л-бежа з индивидуальном виде.

А280 [КСП.М

Рлс. 2. Профиль элщии (-AggO^ и ^492^ фракций хроматографии супернатаята II на DEAH-Toyopearl 65ОН. Элюция буфером 50 мМ трис-HCi, pH 7,5 с градиентом концентрации KCl (0-1 M). Черным прямоугольником отмечена фракция, элшруемая в диапазоне 0,2-0,4 M KCl (0,4М-фракция). Поглощение: -при 280 нм;---при 492 нм.

проводили последовательно : 0,3; 0,15; 0,05 и 0,0 M KCl. Наличие Л-белка определяли шлмуноблоттингом, а .его примерное содержание оценивали методом электрофореза в. 9%-ном ПААГ. Максимальное количество 'Л-белка обнаруживали во фракции, элзсируемой 0,05 M KCl (0,05М-фракция) (Рис. 5), в которой содержалось в среднем 5 ыг белка (примерно 0,1% от количества белка цитоплазматической фракции). Содержание Л-белка в 0,05М-фракции, определенное с помощью злектрофореткческого анализа, составляло 2-5% (в среднем 200 мкг) от суммарного белка фракции. Основным компонентом 0,05М-фракции, как было показано с помощью определения н-концевой

кДз

1068049,532,527518-

! : ¿а

j - - -,-»>

i ' I&

Ч

s

■мп*

12 3 4

Рис.3. Электрофоретичсский анализ С,4М-фракции и ЛТ в 9%-ном ПААГ с окрашиванием Кумасси R250 (а) и иммуноблоттинг с крАТ-ЛТ (б): I, 3- ЛТ; 2, 4- 0, 4М-фракция- Приведеш позиции белков-маркеров. А260

И мае

Рис.4. Гидрофобная хроматография 0,4М-фракции на Butyi-Tyopearl 650М: нанесение проводили'а 0,7 М KCl, 50 мМ трис-HOl, pH 7,5, элюирование - ступенчатым градиентом (указано стрелкам:). Скорость 50 мл/ч.

• • г б

кЛо

106— «з> О

80—

49,5—-

32,5 —

1 2 3 L

Рис. 5. Электрофоратический анализ ЛТ и 0,05М-фракции в. 9%-ном ПААГ с окрашиванием Кумасси R250 (а) я иммуноблоттинг с крА'Г-Л!' (0): I, 3- ЛТ; 2, 4- 0,05М-фракция. Приведены позиции белков-маркеров .

аминокислотной последовательности, яелялся тубулин (мол. масса 55 кДа).

В качестве следующей стадии очистки з нативных. условиях Л-белка нами было использовано несколько хроматографических методов. Попытки разделить бэлки 0,05М-фракции с помощью рехроматогргфии на гидрофобных носителях Butyl-Toyopearl 650М или Phenyl-Superose, а также с помощью ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе PII или анкоките' MonoQ не привели к качественному улучшению результатов. Наиболее оптимальным по очистке Л-белка в натквных условиях оказался аналитический вариант гзль-фильтрацяи белков 0,05М-фракции на колонке (1x150 см) с Bio-Gel А 0,5т, сопровождавшийся, однако, значительными потерями бежа, что делало этот метод непригодным для препаративного выделения.

Гель-фильтрацию проводили в буфере 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 0,15 М Nací. Перед хроматографией 0,05М-фракцию концентрировали с помощью ультрафильтрации нэ мембране ХМ-50 (Araicon, США). В результате гель-фильтрации была достигнута примерно 90Ж-ная очистка Л-белка. Итоговый препарат Л-белка (в среднем 10-20 мкг), содержащий примесь белка с мол. массой 55 кДа (Рис. 6),г использовали в экспериментах на искусственных липидных мембранах.

Рис.6. Электрофоретический анализ в ЭЖ-ном ПАЛГ образца, полученного после разделения 0,05М-фракции на Bio-Gel А 0,5т в буфере 50 мМ трис-KCl, рН 7,5, 0,J5 M NaCl: I - Л-белох (~S0 кДэ); 2 - белки с мол. массой 55 кДа. Приведены позиции белков-маркеров.

Использование аффинной хроматографии на иммуносорбентах с иммобилизованными антителами против ЛТ или тубулина оказалось такке неэффективным для препаративного выделения вследствие значительных потерь Л-Селка в процессе выделения.

Таким образок, в целях получения высокоочищеннсго препарата Л-белка для дальнейшего структурного анализа нам было необходимо изменить условия выделения искомого белка.

Получение Л-белт 6 индивидуальная виде и установление его частичной а.кино1сислстной последовательности

Осуществить ыщеление Л-белка в индивидуальном виде удалось только в денатурирующих условиях с помощью ВЭЖХ. Первоначальные варианты высокоэффективной гель-фильтрации 0,05М-фрэкции в 0,1 M трис-ацетат, рН 7,0 без детергента или с 0,1-1,0% SES на двух последовательно соединенных колонках 5ВК G2000SW и тж G4000SS7 (каждая 7,5x60 см) нэ привели к полному разделению белковой смеси. Однако, обработка хроматографичесхого образца избытком восстанавливающего агента (ДТТ, PME) и добавление его в буфер (0,1 M трис-ацетат, рН 7,0, 0,1% SDS) до концентрации 2 мМ позволили полутать Л-бэлок в практически чистом виде. Наиболее эффективным сказался вариант ВЗЖХ с использованием р-меркаптоэтанола (обработка 0,05М-фракщт 2%-ным раствором рМЗ с 1Ж-ным SDS), проводимый на двух колонках TSK G4000SÏÏ (каждая 7,5x60 см) (Рис. 7).

В результате полупрепаративкой ВЗЖХ было получено около одного емоля Еысокоочщекного препарата Л-белка, проявляющего иммунохимическую активность с антителами против ЛТ (Рис. 7, фракция II). Анализ этого препарата с помощью капиллярного микроэлектрсфорэзз доказал гомогенность Л-белка. Бысокоочищенные белковые препараты были использованы для определения аминокислотного состава (Табл. I) и N-концевой последовательности Л-белка. N-концеву» аминокислотную последовательность определяли на газофазном секвенаторе после переноса белка на поливинилидендифторидную (FVD?) мембрану, а также после его осаждения из хрсыатографических фракций. В обоих случаях

А280 0.02-}

IV

3 5

I ПИШУ

кОа

94-* 67-» А5

ГГ:1Л

Рис. 7. я) разделение белков 0,05М-фракцз!и ка двух последовательно соединенных колонках Т5К С40003Р в буфере 0,1 М трис-ацетат, рН 7,0, 0,1% бвэ, 2 мМ ; б) электрофоретический анализ в 9&-ном ПААГ фракций ВЭНХ с окрашиванием Кумасси И250: I, II, III, 1У, у -номера фракций. Стрелками обозначены позиции бзлков-маркероз.

к-концевые аминокислотные остатки определить не удалось, поэтому наш был сделан вывод о возможном блокировании н-концеЕого амжокислотного остатка Л-белка. ,

Анализ аминокислотного состава Л-белка подтверждает его кислый характер: количество кислых аминокислотных остатков много выше, чем основных. Отношение количества полярных аминокислот к гидрофобным (1,19) позволяет отнести Л-белок к кемембранным белкам.

ТАБЛИЦА I. Аминокислотный состав Л-белка

Аминокислота Мольные %

Азх 10,95

Ш1г 6,01

Бег 6,28

13,74

Рго 5,49

Иу 7,92

А1а 7,27

Сув не опр.

Уа1 6,44

2,04

Не 5,01

Ьеи 10,87

Рпе 4,Н

Туг 2.26

Н1В 2,09

Ъуз 5,9В

Агв 3,56

Тгр не опр.

Необходимым этапом изучения полипептидов является определение их первичной структуры. В этих целях был использован метод электрофоретического переноса белков на нитроцеллюлозу с последующим расщеплением трипсином. В качестве исходного препарата была взята суммарная 0,05М-фракция, в которой содержалось около одного нмоля Л-белка. Белки, содержащиеся в О.ОбМ-фракции, разделяли с помощью препаративного электрофореза в 9£-ном ПААГ. После электрофоретического переноса белков на нитроцеллюлозпую мембрану и идентификации их на мембране с помощью красителя белковые полосы вырезали, обесцвечивали и помещали в буфер 0,1 М трис-НС1, рН 8,2 с трипсином в соотношении фермент:субстрат=1:20 на сутки при 37°С. После элюции пептидов с мембраны 0,3%-ной ТФУ их разделяли с помощью обратнофазной ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила

(0-505) в 0,1% ТФУ, в результате которой было получено более 70 пептидных фракций (Рис. 8). Определение аминокислотной последовательности пептидов проводили на газофазном секвенаторе. Структура некоторых пептидов приведена в таблице 2. При сравнении структуры полученных пептидов с банком аминокислотных последовательностей известных белков была установлена их уникальность.

Таблица 2. Аминокислотные последовательности пептидов, полученных в результате триятического гидролиза Л-белка.

19н Tyr-Ile-Asp-Gln-Ile-His-irp

19с Met-Glu-Thr-Leu-Leu-Lys-Lys-Gln-Asn

29с Glu-Ieu-ieu-Gly-bys-Gln-X-Met-Thr-leu-His-Glu

лоо Pro-Glu-Gln-Leu-Asn-Ala-Thr-Leu-Thr-Asn-Lsu

Рис. 8. Фракционирование трлптического гидролизата Л-белка ВЗКХ с обращенной фазой на колонке Yydak Protein С4 (4,6x125 мм) в градиенте ацетонитрила (0-50%) в 0,1% ТФУ. Скорость элгащш 0,5 ?лл/мин.

Анализ первичной структуры ЛТ показал, что центральный домен молекулы токсина содержит 18 гомологичных фрагментов, состоящих из 33 аминокислотных остатков. Аналогичные 33-членные поЕторы были обнаружены в структуре л-концевого домена анкиринов (мол. масса 220 кДа). Анкирины являются внутриклеточными структурными белками, широко распространенными б тканях млекопитающих,' в том числе и в мозге. Гомология структур ЛТ и данных белков в области повторов составляет 26,7%. Исходя из этого, можно было предположить, что антитела против ЛТ способны взаимодействовать с анкиринами мозга и/или их фрагментами, а Л-белок, соответственно, является фрагментом анкирина. Однако, сравнение структур полученных нами пептидов Л-белка и анкиринов продемонстрировало отсутствие мевду ними гомологии. Для подтверждения этих результатов нами были проведены иммунохиыические экспериметы по изучению тканеспецифичности Л-белка.

Изучение пнанеспецифичносш Л-Оелт

Важным этапом в изучении биологических свойств новых белков является установление их функциональной роли и тканевой специфичности. С этой целью нами были проведены специальные структурно-функциональные исследования с использованием моноспецифической антисыворогки против Л-белка.

С целью получения Л-белка для иммунизации животных был использован метод элзоции из препаративного ПААГ. Суммарную 0,05М-фракцию разделяли в 9%-ном ПААГ, белки окрашивали I М KCl на холоду, нужную полосу вырезали и помещали в элюирующий буфер: 20 мМ трис-HOl,. pH 7,5, I мМ СаС12, 0,01% SDS. Из 10 мг белка суммарной фракции получали 30-50 мкг Л-белка, которым иммунизировали кроликов: после 4-5 иммунизаций титр сыворотки, по результатам иммуноблоттинга, был равен 1:3000.

Тканеспецкфичность Л-белка изучали с помощью иммуноблоттинга. После электрофоретического разделения и переноса на нитроцеллюлозу супернатангов и мембранных фракций, полученных из различных органов быка, проводили иммунохимическое окрашивание сывороткой

против Л-белка. С помощью этого метода удалось доказать мозговую специфичность Л-белка (Рис. 9), так как полностью отсутствовало специфическое взаимодействие антиснворотки с бежевыми компонентами из других органов.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о нейрональной локализации Л-белка, что, в свою очередь, подтвэрздает различие данного белка с анкирлнаш, поскольку последние широко представлены нэ только в мозге, но и в других тканях. В целом наш данные поззоляют считать Л-Оелок новым мозгоспецифичным полипептидом.

кДа

10680-

¿9,532,527,5-

г! tolj-

шЬ

• .-г. ГУ> | «тг-Г J

t.'ísq'j: f

84 ?= Шш

2 3 i

1 2 3 Л 5 6

Рис.9. Исследование тканеспецифичности Л-Оелка:

а)электрофоретический анализ белковых фракций в 9Ж-ном ЕААГ с окрашиванием Кумасси R250; б)иммуноблоттинг белковых фракций: нитроцеллюлоза обработана моноспецифической сывороткой против Л-белка. I- супернатант и 2- мембраны из сердца; 3-супернатант и 4- мембраны.из легких; 5- супернатант и 6- мембраны из мозга.

Сравнение свойств Л-Оглка и ЛТ на модельных мембранных систеязх

Ранее были продемонстрированы каналоформирующие к фузогенные свойства ЛТ, поэтому нами были предприняты попытки сравнить свойства Л-белка и ЛТ на модельных мембранных системах : бислойных липидных мембранах (БЛМ) и липосомах. При встраивании очищенного на Bio-Gel A 0,5m Л-Селка в БЛМ наблюдалось скачкообразное увеличение трансмембранного тока,'характерное для образования в БЛА! структур типа ионных каналов, формируемых ЛТ (Рис. 10). Причем, как и ЛТ, Л-белок встраивался в БЛМ значительно медленнее в растворах одновалентных катионов, чем в растворе хлорида кальция. Существенное злияние на встраивание Л-белка в плоский бислой также оказывал приложенный потенциал: отрицательный потенциал в большей мерз активировал этот .процесс, чем положительный. Встраивание же ЛТ в аналогичных условиях в большей степени активировалось положительным потенциалом.

На основе вольт-амперных характеристик, модифицированной Л-белком мембраны, был сделан вывод о том, что встраивание этого белка в БЛМ является потзнциал-зависимым и направленным, причем,

100PSL_

505

100

,sL

50 S

il

Г

Рис. 10. Одиночные каналы, образующиеся в БЛМ в 10 мМ СаС12 (а) к 100 мМ КС1 (б) при добавлении с цис-стороны мембраны: I. Л-белка (0,01 мкг/мл); 2. 5 мМ СаС12.

Л-Сэлок ведет себя в БЛМ подобно переориентированному ЛТ. Образованные Л-белком каналы проявляют селективность для двухвалентных ионов, при этом они проводят катимы е предпочтительной последовательности : Ba'i+>Ca2+>Zn2+>K',\ Эти данные согласуются с результатами, полученными для JIT и кальциевых каналов возбудимых мембран.

Ка больших однослойных везикулах, состоящих из смеси фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и холестерина в молярном отношении 2:3:5, было проведено изучение фузогенных свойств Л-белка с помощью измерения флуоресценции, возникающей при взаимодействии тербия и дшшколиноеой кислоты. Все измерения проводили па флуоресцентном спектрофотометре Hitachi 650-105 (Япония). После добавления Л-бзлка происходило слияние двух популяций липосом, содержащих тербий и дапиколиновую кислоту, призом скорость их слияния была сопоставима с таковой в случае добавления ЛТ в аналогичных условиях (Рис. II).

з ZT X

0J

zr и

U) О.

о

•сс

9-

о о

3 и

р

о £

2 £ 6 мин.

Время noc/ie добавления А-бёлка

Рис.II. Временная зависимость индуцированного Л-белком слияния липосом. За максимальную принималась флуоресценция при 100%-ном слиянии липосом при их обработки 0,5"-ным холатом Ка. Добавление к смеси липосом: е- Л-белка (50 мкг/мл), о- ЛТ (50 ?.кг/мл).

Таким образом, нами было показано, что Л-бемок способен встраиваться в БЛМ, где он образует структуры типа потенциал-зависимых кальциевых каналов. По ряду характеристик этот процесс напоминает встраивание переориентированного ЛТ. Установлено также сходство фузогенных свойств ЛТ и Л-белка.

вывода

1. Сформулирована гипотеза о существовании эндогенного аналога ЛТ, имеющего некоторое структурное сходство с токсином. Предложены эффективные методы идентификации искомого белка с помощью кроличьих поликлональшх моноспэцифических антител против ЛТ, а также метод его выделения из цитоплазматической фракции коры головного мозга быка. Установлено, что нейрональный полипептид, специфично взаимодействующий с антителами против ЛТ (Л-белок), является кислым белком с мол. массой около 90 кДа.

2. Установлено, что ii-концевой аминокислотный остаток Л-белка блокирован. Определен аминокислотный состав4- Л-белка и получена частичная информация о его первичной структуре. С помощью иммунохпмических экспериментов с моноспецифической сывороткой показано, что Л-белок является новым мозгоспецифичным полипептидом.

3. Продемонстрировано, что Л-белок встраивается в искусственные

лишдные мембраны, где образует структуры типа потенциал-зависимых кальциевых каналов и по ряду характеристик напоминает переориентированный латротоксин. Установлено сходстзо фузогенных свойств между ним и латротоксином.

Основные результаты диссертации изложены в следующих печатных работах:

1. V.A.Zhukareva, O.Ya.Shatursky, Y.K.Lishko, fl.K.Malysheva, Ya.T.Terletskaya, O.M.Tsygankova, E.V.Grishin. Latrotoxin-like properties of a protein from brain. FIBS Letters, 1992, v. , p.

2. Кукзрева В.А., Шатурскиий O.A., Терлецяая Ю.Т., Малышева М.К., Цыганкова О.М., Грипян Е.Б. Существование в мозге быка белка с латротоксин-подобными свойствами. Материалы IV СоЕетско-Германского симпозиума "Рецепторы и ионные каналы", 1Э91, с. 23-24. -

3. Шгапксза О.М., Третьяков Л.А., Гришш . S.B. Идентификация на Зонального белка с антигенннми свойствами латротонснна. Еиооргакнческзя химия, 1988, т. 14, с. 1570-1572.

4. Цыганкова О.М., Третьяков Л.А., Гранин Е.В. Белок из мозга Скка, проявляющей антигенные свойства латротоксина. Материалы Всесоюзной конференции "Генная и клеточная иняэнерия в реетении фундаментальных проблем биотехполошн". Тарту, 1988,.с. 40-44.