Синтез и исследование структурных особенностей участков иммунного распознавания некоторых пресинаптических и постсинаптических нейротоксинов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ИНСТИТУТ ЕИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академика А. С. САДЫКОВА

На правах рукописи УДК 577.112.6.85

Бс^зод Зиёдбек ДОЛИМБЕК

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ УЧАСТКОВ ИММУННОГО РАСПОЗНАВАНИЯ НЕКОТОРЫХ ПРЕСИНАПТИЧЕСКИХ И ПОСТСИНАПТИЧЕСКИХ НЕИРОТОКСИНОВ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

- а -

; ; о и., / г ИПП г-

Ташкент — 1998

Работа выполнена в лаборатории химии белков и пептидов Института биоорганической химии им. академика А. С. Садыкова Академии Наук Узоекистана и в Департаменте биохимии Медицинского колледжа Бэйлор, Хьюстон, США.

Официальные оппоненты:

академик А. А. АБДУВАХАБОВ,

доктор биологических наук, профессор К. Д. ДАВРАНСЗ, доктор химических наук, профессор А. А. САДЫКОВ.

Ведущая организация — Институт химии растительных веществ АН РУ.

Защита диссертации состоится 1998 г.

в $ часов на заседании Специализированного Совета Д 015.21.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии имени академика А. С. Садыкова АН РУ по адресу: 700143, Ташкент, проспект X. Абдуллаева, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии имени академика А. С. Садыкова АН РУ.

Автореферат разослан « ^ » 1998 г.

Ученый секретарь "-1?—-

специализированного Совета

доктор химических наук, профессор ^ ^ Н. И. БАРАМ

Актуальность проблемы. Установление детального механизма иммунного ответа, направленного на белковую молекулу, требует знания о структурных особенностях антигенности на молекулярном уровне и может создать научную основу для целенаправленного регулирования иммунного ответа. Антигенность белка, наблюдающаяся при его специфическом взаимодействии с функциональными связывающими участками антител, определяется его детерминантными участками. Установление структуры антигенных участков приведет к глубокому пониманию молекулярных основ иммуногенности белковой молекулы, в частности нейро-токсинов белковой природы-

Известно, что действие нейротоксинов обусловлено их связыванием с элементами пресинаптической или постсинаптической мембраны нервных клеток. Токсины, связывающиеся с пресинаптической мембраной, подразделяются на три группы: направленные на каналы и нейромуску-лярные рецепторы; блокаторы процесса высвобождения нейромедиатора; и так называемые "чистые" пресинаптические токсины, которые воздействуют на плазматические мембраны нервных клеток. Постсинаптические нейротоксины связываются с никотиновым ацетилхолиновым рецептором (АХР), который играет принципиально важную роль в нервно-мышечной передаче, связываясь с ацетилхолином и регулируя ионные потоки через мембрану. Молекула рецептора, являющаяся пентамером, состоит из четырех видов {а2/ЗуЗ) субъединиц, структура которых установлена. Основная часть функциональных исследований АХР посвящена его а-субьединице, ответственной за связывание ацетилхолина, антирецептор-ных антител и-нейротоксинов. Так, известны молекулярные регионы молекул нейротоксинов и АХР, участвующие в непосредственном контактировании друг с другом. Известен также универсальный связывающий участок на АХР для коротких и длинных а-нейротоксинов. Очень интересным и принципиально важным является то, что этот универсальный регион (сегмент АЫ'^-Пе-РКе-Ьуз-Зег-Туг-Ыу-Ыи-Пе-Пе-Уа1-Ткг-Нй-Рке-Рго-РИе-Азр133 в человеческом АХР) содержит также ацетилхолин- й ан-титело-связывающую часть АХР. На основании этого, различие в аффинности нейротоксинов, антирецепторных антител и ацетилхолина по отношению к этому общему региону АХР определяется следующим рядом: нейротоксин » антитело » ацетилхолин, что позволяет объяснить высокоэффективное специфическое ингибирование связывания ацетилхолина или нейротоксина с АХР при помощи нейротоксинов и антирецепторных или антитоксических антител. Для детального выяснения молекулярного механизма конкурентного ингибирования связывания нейротоксинов с АХР, выражающегося сильной нейротоксичностью, а также для объяснения механизма молекулярных процессов, происходящих вокруг этого, чрезвычайно важным и основополагающим является установление структуры антигенных детерминантных участков молекул нейротоксинов, определяющих их иммунохимические свойства.

В связи с этим изучение, иммунохимических свойств пресинаптиче-ских нейротоксинов - а-латротоксина (a-JIT) яда паука Latrodectus mactans tredecimguttatus, ботулинового нейротоксина А (БНТ/А) из Clostridium botulinum и постсинаптических токсинов - нейротоксина II (НТ II) из яда кобры Naja naja oxiana, а-бунгаротоксина (а-БТ) из яда змеи Bungarus muläcinctus как взаимосвязанные к взаимодополняющие исследования имеют огромную теоретическую и практическую значимость. Установление структуры антигенных детерминантных участков этих нейротоксинов и сравнительный анализ с регионами, ответственными за их нейротоксичность, позволит объяснить структурно-функциональные основы антигенных и нейротоксических функций токсинов, что является одной из фундаментальных проблем биоорганической химии и физико-химической биологии.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование иммунохимических свойств основного токсического компонента яда паука Latrodectus tredecimguttatus - а-латротоксина, одного из основных токсинов яда Центральноазиатской кобры Naja naja oxiana - нейротоксина II, определение, с помощью синтетических пептидов, структуры участков иммунного распознавания региона ботулинового нейротоксина А продуцируемого бактериями Clostridium botulinum и а-бунгаротоксина из яда змеи Bungarus muläcinctus.

В ходе исследования решались следующие задачи:

- получение высокоспецифических антитоксических антител к а-ЛТ и НТ II;

- разработка условий одностадийного выделения а-ЛТ и НТ II из ядов Latrodectus tredecimguttatus и Naja naja oxiana, соответственно.

- исследование антителосвязывающих участков а-ЛТ;

- выделение триптических пептидов карбрксиметшшрованного НТ II и идентификация регионов нейротоксина, содержащих антигенные детерминанты НТ И;

- полный химический синтез панели из 31 пептида, отождествляющих весь Нс регион (т.е., аминокислотные остатки 855-1296) БНТ/А из Clostridium botulinum;

- получение разновидовых антитоксических антител к БНТ/А и определение участков антительного иммунного распознавания Я^региона БНТ/А;

- химический синтез восьми пептидов а-БТ, отображающих все кольцевые структуры и поверхностные участки молекулы нейротоксина;

- синтез трех контрольных пептидных аналогов а-БТ;

- получение разновидовых моноспецифических антител к а-БТ и его синтетическим пептидам;

Актуальность проблемы. Установление детального механизма иммунного ответа, направленного на белковую молекулу, требует знания о структурных особенностях антигенности на молекулярном уровне и может создать научную основу для целенаправленного регулирования иммунного ответа. Антигенность белка, наблюдающаяся при его специфическом взаимодействии с функциональными связывающими участками антител, определяется его детерминантными участками. Установление структуры антигенных участков приведет к глубокому пониманию молекулярных основ иммуногенности белковой молекулы, в частности нейро-токсинов белковой природы.

Известно, что действие нейротоксинов обусловлено их связыванием с элементами пресинаптической или постсинаптической мембраны нервных клеток. Токсины, связывающиеся с пресинаптической мембраной, подразделяются на три группы: направленные на каналы и нейромуску-лярные рецепторы; блокаторы процесса высвобождения нейромедиатора; и так называемые "чистые" пресинаптические токсины, которые воздействуют на плазматические мембраны нервных клеток. Постсинаптические нейротоксины связываются с никотиновым ацетилхолиновым рецептором (АХР), который играет принципиально важную роль в нервно-мышечной передаче, связываясь с ацетилхолином и регулируя ионные потоки через мембрану. Молекула рецептора, являющаяся яентамером, состоит из четырех ввдов (а,/?у<5) субъединиц, структура которых установлена. Основная часть функциональных исследований АХР посвящена его а-субъединице, ответственной за связывание ацетилхолина, антирецептор-ных антител и -нейротоксинов; Так, известны молекулярные регионы молекул нейротоксинов и АХР, участвующие в непосредственном контактировании друг с другом. Известен также универсальный связывающий участок на АХР для коротких и длинных а-нейротоксинов. Очень интересным и принципиально важным является то, что этот универсальный регион (сегмент А1а'22-11е-Рке-Ьух-8ег-Туг-С1у-С1и-11е-11е-Уа1-ТЪг-Ш.ч-Рке' Рго-Рке-Аяр13а в человеческом АХР) содержит также ацетилхолин- и ан-титело-связывающую часть АХР. На основании этого, различие в аффинности нейротоксинов, антирецепторных антител и ацетилхолина по отношению к этому общему региону АХР определяется следующим рядом: нейротоксин » антитело » ацетилхолин, что позволяет объяснить высокоэффективное специфическое ингабирование связывания ацетилхолина или нейротоксина с АХР при помощи нейротоксинов и антирецепторных или антитоксических антител. Для детального выяснения молекулярного механизма конкурентного ингибировання связывания нейротоксинов с АХР, выражающегося сильной нейротоксичностью, а также для объяснения механизма молекулярных процессов, происходящих вокруг этого, чрезвычайно важным иг основополагающим является установление структуры антигенных детерминантных участков молекул нейротоксинов, определяющих их иммунохимические свойства.

В связи с этим изучение иммунохимических свойств пресинаптиче-ских нейротоксинов - а-латротоксина (a-JIT) яда паука Latrodectus mactans tredecimguttatus, ботулиновош нейротоксина А (БНТ/А) из Clostridium botulinum и постсинаптических токсинов - нейротоксина II (НТ II) из яда кобры Naja naja oxiana, а-бунгаротоксина (а-БТ) из яда змеи Bungarus multicinctus как взаимосвязанные и- взаимодополняющие исследования имеют огромную теоретическую и практическую значимость. Установление структуры антигенных детерминантных участков этих нейротоксинов и сравнительный анализ с регионами, ответственными за их нейротоксичность, позволит объяснить структурно-функциональные основы антигенных и нейротоксических функций токсинов, что является одной из фундаментальных проблем биоорганической химии и физико-химической биологии.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование иммунохимических свойств основного токсического компонента яда паука Latrodectus tredecimguttatus - а-латротоксина, одного из основных токсинов яда Центральноазиатской кобры Nqja naja oxiana - нейротоксина II, определение, с помощью синтетических пептидов, структуры участков иммунного распознавания //^региона ботулиноваго нейротоксина А продуцируемого бактериями Clostridium botulinum и а-бунгаротоксина из яда змеи Bungarus multicinctus.

В ходе исследования решались следующие задачи:

- получение высокоспецифических антитоксических антител к а-ЛТ и НТ II;

- разработка условий одностадийного выделения а-ЛТ и НТ II из ядов Latrodectus tredecimguttatus и Naja naja oxiana, соответственно.

- исследование антителосвязывающих участков а-ЛТ;

- выделение триптических пептидов карбоксиметилированного НТ II и идентификация регионов нейротоксина, содержащих антигенные детерминанты НТ II;

- полный химический синтез панели из 31 пептида, отождествляющих весь Яр-регион (т.е., аминокислотные "остатки 855-1296) БНТ/А из Clostridium botulinum;

- получение разноввдовых антитоксических антител к БНТ/А и определение участков антительного иммунного распознавания Н^региона БНТ/А;

- химический синтез восьми пептидов а-БТ, отображающих все кольцевые структуры и поверхностные участки молекулы нейротоксина;

- синтез трех контрольных пептидных аналогов а-БТ;

- получение разновидовых моноспецифических антител к а-БТ и его синтетическим пептидам;

- определение регионов антительного и Г-клеточного иммунного распознавания а-БТ с помощью антител и Г-клеток против а-БТ и, наоборот, с помощью антител и Т-клеток к каждому синтезированному пептиду токсина;

- определение роли отдельных аминокислотных остатков непосредственно участвующих в нейротоксической активности а-БТ в антигенные свойства нейротоксина;

- определение регионов а-БТ, обладающих высокими защитными свойствами от сильного нейротохсичесхого воздействия а-БТ.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработаны условия одностадийного выделения a-JIT и НТ II иэ ядов Latrodectus tredecimguttatus и Naja naja oxiana соответственно, не требующий дорогостоящего оборудования, необходимого при использовании традиционных методов выделения белков и значительна сократившие время их выделения. Иммуносорбентным методом исследовано взаимодействие а-ЛТ с антитоксическими антителами и показана способность нейротоксина одновременно связываться с девятью молекулами антител.

Проведен триптический гидролиз восстановленного и карбоксиме-тилированного производного НТ II, получены триптические пептиды и исследованием их связывания с антитоксическими антителами определены регионы молекулы НТ И, содержащие антигенные детерминантные участки. Установлено, что антигенные детерминантные участки НТ II ответственные за связывание с активными центрами антитоксических антител, расположены в трех кольцевых структурных доменах и в глобулярной части молекулы токсина.

Всесторонней синтетической стратегией сконструированы набор из 31 пептида, охватывающий полную аминокислотную последовательность Яс-цепи (М.М. 50 kDä) БНТ/А. Эти девятнадцатичленные пептиды (С-концевой пептид является 22-х членным) синтезированы методом 9-флуоренилметоксикарбонильного (ФМОК) твердофазного пептидного синтеза. Все 31 пептиды отделены от твердой фазы и очищены до гомогенности методами гель-проникающей хроматографии и обращеннофазо-вой ВЭЖХ. Получены разновидовые антитела к БНТ/А, и проведен скрининг на распознавание антитоксическими антителами всех синтезированных пептидов БНТ/А. Впервые установлено, что Нс-регион БНТ/А содержит шесть основных иммунодоминантных антигенных участков.

Осуществлен химический, синтез,. с использованием ФМОК-защищенных производных ¿-аминокислот, восьми пептидов, отображающих все кольцевые и высокоэкспонированные регионы молекулы а-БТ. Синтезированы также три контрольных пептидных аналогов а-БТ. Впервые определены, с помощью антител и Т-лимфоиитов к нативной молекуле а-БТ и всем его синтетическим пептидам, иммунодоминантные антигенные участки молекулы а-БТ. Эти участки расположены в первой

(аминокислотные остатки 3-16), второй (остатки 26-41) кольцевых структурах и в С-концевой части (остатки 66-74) молекулы а-БТ. Впервые, на примере а-БТ, определена влияние высокой сегментной мобильности концевых участков полипептидных цепей белков на Г-клеточный иммунный ответ. В работе также определено непосредственное участие аминокислотных остатков, ответственных за нейротоксическую активность молекулы а-БТ, в связывании с активными центрами антитоксических антител. Установлена высокая защитная способность иммунодоми-нантных антигенных регионов Ы, Ь2 и СМаИ, от нейротоксического воздействия а-БТ, что выражалось увеличением защиты в три раза (протекционный индекс, Р/ = 2,5 - 3,2) по сравнении с контролем. Эти три синтезированные антигенные регионы вместе, проявили еще более высокую защитную активность (Р/ = 4,6). Впервые для а-нейротоксинов, применение химического конъюгата всех трех синтезированных иммуно-доминантных регионов с белковым носителем, позволило получить исключительно высокий защитный эффект от сильного нейротоксического действия а-БТ (Р/ = 18,1), что почти в два раза превышало, защитный эффект, полученный с помощью нативного а-БТ (Р/ = 9,7).

Полученные высокоспецифичные антитела, нейтрализующие токсические действия исследованных иейротоксинов и ядов, а также их применение для стимулирования активного и пассивного иммунитета для защиты от укусов соответствующими ядовитыми животными и против ботулизма, представляют значительную практическую значимость.

Настоящая работа выполнена в рамках дополнительных заданий Государственного комитета по науке и технике " Иммунохимически изучить рецепторы лимфоидных клеток, специфически реагирующих с токсинами ядов членистоногих Средней Азии" (номер Гос. регистрации 295) и "Разработать новые эффективные методы получения антисывороток к токсинам и ядам членистоногих Средней Азии и выдать ТашНИИВС рекомендации по практическому применению этих методов" (номер Гос. регистрации 01840007500); а также научных контрактов ОАМО 17-89-С-9061 и О А МО 17-93-С-3159 с Командованием медицинских исследований и развития Армии США (ТОАМ/ШС), Министерства обороны США и научного гранта N8-26280 из Национального института здоровья США.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на 3-м Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции",Ташкент, 1983; 1-ой конференции биохимиков Узбекистана, Ташкент, 1986; Международном симпозиуме "Структура, биосинтез и функция молекулярных элементов иммунной системы", Пущино, 1987; 7-Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов, Таллин, 1987; 14-Международном конгрессе по биохимии, Прага, 1988; 14-Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Ташкенх, 1989; 10-Международном конгрессе по животным, рас-

тителъным и микробным токсинам, Сингапур, 1991; Ежегодной научной конференции Департамента биохимии Медицинского колледжа Бэйлор, Huntsville, Texas, USA, 1993 - 1996; 10-Международном научном симпозиуме "Methods in Protein Structure Analysis", Snowbird, Utah, USA, 1994; 11-Международном научном симпозиуме "Methods in Protein Structure Analysis", Аннеси, Франция, 1996; 2-Республиканском научном коллоквиуме "Независимость Узбекистана - гарантия развития его науки и технологии", Ташкент, 1997.

Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 26 работ в научных журналах и сборниках, в том числе четыре статьи и одна обзорная статья в зарубежных периодических журналах и книге.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения собственных результатов, заключения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего в себя 307 наименований. Работа изложена на 218 страницах компьютерного текста и содержит 25 рисунков и 15 таблиц.

Автор выражает глубокую признательность за постоянное внимание при осуществлении данной работы своим научным консультантам, академику Ш.И.Салихову - заведующему лабораторией химии белков и пептидов Института биоорганической химии им. академика А.С.Садыкова АН Узбекистана и профессору М.З.Атасси - заведующему лабораторией в Департаменте биохимии Медицинского колледжа Бэйлор, Хьюстон, США.

I. Иммунохимпческне исследования пресхшаптических нейротоксинов

1.1. Иммунохимическпе свойства а-латротоксина из яда паука Latrodectus tredecimguttatus

Известно, что в начальной стадии иммунного ответа к белковому антигену, узнаются фрагменты его молекулы содержащие антигенные участки, образованные посредством антиген-презентирующих клеток, после "понимания" и лимитированного протеолиза молекулы антигена. Также установлено, что синтетические фрагменты белковой молекулы, содержащие антигенные детерминантные участки, могут действовать как нативный антиген при формировании как антительного так и Т-клеточного ответов, для специфического распознавания интактной молекулы белка {Atassi M.Z. et al., 1995). Впоследствии, рецепторы Т-лимфоцитов принимают специфический сигнал от антигенной детерминанты, находящаяся в комплексе с 1а молекулами. Это является начальным этапом при запуске иммунного ответа.

а-Латротоксин (М.М. околст 130 kDä) является основным нейро-токсическим компонентом яда паука Latrodectus tredecimguttatus и состоит из одной полипептидной цепи с пятью дисульфидными связами.

s

Изоэлектрическая точка pi 5,2 характеризует его как слабокислый белок. Токсин действует на плазматические мембраны нервных окончаний, способствуя генерации межконцевых сигналов, приводящих в итоге к стимуляции массового выброса нейромедиаторов. Эти свойства а-ЛТ характеризуют его как пресинаптический нейротокснв, обладающий весьма высокой токсичностью: минимальная летальная доза - 10 /д-/кг.

Свойства а-ЛТ как сильного антигена исследовали методами виро-иммунотеста и реакции пассивного розеткообразования. Известно что, метод вироиммунотеста, чувствительность которого в некоторых его разновидностях превосходит широкоприменяемые методы радиоиммунологического и иммуноферментного анализа. В качестве метки используется бактериофаг фх174, конъюгированный с антитоксическими антителами. При исследовании связывания а-ЛТ с его иммунным рецептором, нами в вироиммунотесте было показано, что мембраны лимфоцитов иммунных к а-ЛТ показали связывание на порядок больше (350-400 зон лизиса) по сравнении с контролем (30-40 зон лизиса).

Образование а-ЛТ-связывающих лимфоцитов, носящих специфические иммунные рецепторы а-ЛТ, в динамике исследовали методом пассивного розеткообразования. Результаты показаш, что после однократной иммунизации токсином максимум этих клеток выявляется на 14 сутки, что также свидетельствует о специфическом связывании а-ЛТ с образованными иммунными рецепторами а-ЛТ.

Учитывая- высокую нейротокснчность, моноспецифическую антисыворотку к а-ЛТ получали иммунизацией кроликов нативным токсином непосредственно в лимфатический узел. Антитела также получали, используя химический коньюгат а-ЛТ с полиэлектролитом NA-5, имеющим высокую Г-независимую иммуностимулирующую активность (Петров Р.В., Хаитов P.M., 1988). Для синтеза аффинного .сорбента с иммобилизованными антитоксическими антителами, антитела из антисьшороток выделяли с помощью синтезированного нами иммуносорбента а-ЛТ -целлюлоза.

В ходе экспериментов выяснилось, что антительный иммуносор-бент имеет сравнительно меньшую емкость по сравнению с антигенным иммуносорбентом. Это объясняется тем, что молекула IgG содержит две идентичных антигенсвязывающих участков, которые состоят-из шести высокоэкспонировнных в молекуле кольцевых структурных доменов с гипервариабельньши аминокислотными последовательностями.

С другой стороны, белковые антигены обычно содержат несколько антигенных детерминантных участков, расположенных на поверхностных регионах молекулы. Наши исследования показали, что 0,0077 /Ai а-ЛТ, иммобилизованный на целлюлозном носителе, может одновременно свя-

¡ываться с 0,043 - 0,071 /иМ антителами, что свидетельствует о связывали и до девяти молекул антител с одной молекулой а-ЛТ.

0 20 40 60 80

Объем элюции (мл>

* начало элюции показано стрелкой

Рис. 1. Аффинная хроматография а-латротоксина с использованием трех раз-шчных иммуносорбентов.

В результате иммобилизации антител к a-JIT на целлюлозной матрице только 20-25 % токсия-связывающих участков оставались активными, что свидетельствует о их беспорядочной посадке и довольно низкой ;оступности этих участков для связывания а-ЛТ.

Для увеличения эффективности связывания активных центров антител с а-ЛТ использовали белок А из Staphylococcus aureus как спейсер лежлу целлюлозным носителем и антитоксическими антителами. Извест-ю, что белок А из Staphylococcus aureus с достаточно высоким сродст-юм связывается с кристаллизующимися участками некоторых видов иммуноглобулинов, оставляя при этом активные центры антител свободными для связывания с а-ЛТ. Комплекс белок А - антитело стабнлизирова-ш глутаровым альдегидом-в концентрации 0,0075 %. Выделение а-ЛТ из цельного яда таким иммуносорбентом показало, что его емкость в 1,5 -1,0 раза выше, чем у иммуносорбента синтезированного традиционным тугем иммобилизации антител. Однако, при многократном использовании 18-20 раз) такого сорбента наблюдалось резкое снижение емкости сор-5ента из-за частичного элюирования антител. В связи с этим нами сдела-ia попытка синтезировать иммуносорбент, в котором пространственная юступность активных связывающих участков антител к а-ЛТ более вы-:окая.

Известно, что /•'„¿.-фрагменты антител включающие его активные центры, в свободной форме содержат сульфгидрильные группы, которые эасположены в противоположном домене от связывающих участков. Мы

применяли реакцию сульфгидрильной группы этого домена молекулы а! тител с ионом иода в конце спейсера на целлюлозном сорбенте. Пр этом антитоксические ^-фрагменты присоединялись к носителю строг

1,2 1 о» 0,6 0,4 0.2

0

1

О» 0.6 0,4 0,2 0

I !

I \

I I

-I_I_I_I—к

, У.

—I_1-■ ' '_и

-1_1—1_I_I-1_I_

■ I

J_I_I I, >—Ь., I_1__1_и

1

0,8 . В л ( > 1

0,6 ■ { V ■1 1 \ \

0<4 • ; \ 1 \ 1 \

0,2 ■ ... 1. V-.........

0

50 100 150 200

Объем злюции (мл)

250

б

Рис. 2. Стадии контроля очистки -фрагментов анти-а-ЛТ антител, а) про филъ геяь-хромагтографии антител к а-ЛТ на колонке (2,5 х 100 см) с ТЭК Н\У-50 уравновешенной 0,05М трис-НС1, рН 8,0; б) гель-хроматохрафия пепсинового гвдро лизата этих антител в тех же условиях; в) гель-хроматография ^д-фрашигго» вптя-а-ЛТ антител в аналогичных условиях.

ориентированно, оставляя активные участки свободными дня свазьшанш а-ЛТ. Выделение а-ЛТ этим иммуносорбентом показало, что практиче

ш все активные центры (90-95 %) /^¿-фрагментов антител, реагировали а-ЛТ. Профили выделения а-ЛТ аффинной хроматографией тремя интезированными иммуносорбентами сравнены на рис. 1. Как видно из исунка,- иммуносорбент с иммобилизованными Р^-фрагментами имеет амую высокую емкость по сравнению с сорбентами, где в качестве пейсера был использован белок А или с традиционной иммобилизацией нтител к твердой фазе.

В процессе синтеза F^-иммобилизованного иммуносорбента для здролиза антитоксических антител и очистки их активных фрагментов, существляли синтез биоспецифических сорбентов с помощью иммоби-изации пепсина и белка А на целлюлозный носитель. Контроль за хо-эм очистки /-^-фрагментов осуществляли гель-проникающей хромато-эафией, профили которых приведены на рис. 2. Как видно из рисунка, ятитокснческие антитела в количестве 0,133 /М элюируются в ввде од-ого шпса (рис. 2 а), тогда как пепсиновый гидролизат такого же коли-ества антител в идентичных условиях разделяется на три фракций, со-гветствуюгцие IgG, F(cbl2 и ^-фрагментам (рис. 2 б). Аффинная хрома-зграфия гидролизата на адсорбенте белок" А - целлюлоза позволила поучить активные F(eb)2 -фрагменты антитоксических антител в свободном зде, что было доказано дополнительной жидкостной, хроматографией )ис. 2 в). Аффинные сорбенты синтезированные с помощью иммобили-щии пепсина и белка A MOiyr быть многократно использованы, без су-[ественной потери активности. Они позволяют получать активные фраг-енты антител для синтеза высокоемкого иммуносорбента. Их можно жже применять с целью выделения других белковых антигенов односта-дйно, что существенно важно для экспериментатора.

1.2.1. Синтез пептидов Я^региона ботутлкшого нейротоксина А из Clostridium botulinum

Ботулиновые нейротоксины (БНТ) являются самыми высокоток-етными токсинами, известными до настоящего времени науке. Количе-гво молекул БНТ вызывающее летальный исход, в 50000 раз меньше ;м нейротоксин а-ЛТ. В настоящее время известны семь иммунологиче-еих разновидностей ботулиновых нейротоксинов (А, В, С, D, Е, F и G), эторые продуцируются бактериями Clostridium botulinum как единая по-тептидная цепь с молекулярной массой около 150 kDa. БНТ приобре-иот самую высокую нейротоксическую активность в результате гидроли-l протеолитическими ферментами одной пептидной связи полипептид-эй цепи молекулы, приводящей к образованию двух субъединиц - тяже-ж Я-цепи (М.М. около 100 kDa) и легкой L-цепи (М.М. около 50 Da). Н и L цепи остаются связанными между собой обычно одной ди-отьфидной связью. Хотя БНТ имеют высокую степень аналогии в периной структуре и по природе своего действия, как друг с другом, так и

с родственными столбнячным и дифтерийным токсинами, они остаются малохарактеризованными.

На основе нуклеотидной последовательности кодирующего гена была установлена полная первичная структура БНТ типа А (БНТ/А) {Thompson D.E. et al., 1990). С-концевая часть //-цепи (М.М. 50 kDa) БНТ, которая названа по современной номенклатуре как Нс (Aguilera J. et al., 1992), непосредственно связывается с рецептором токсина на мембране нервных клеток, тогда как N-концевая часть этой цепи {HN) ответственна за транслокацию JL-цепи в нервную клетку и в результате этого происходит блокирование выброса ацетилхолина, детальный механизм которого не установлен до настоящего времени.

Номер Позиция в после- Структура*

пептида довательности

В1 85S-873 К Y V D N Q R и L S Т F Т Е Y I К К X

В2 869-887 X X К N X I N т S' I L N L R X Е a N К

ВЗ 883-901 X Б 5 N н Ь I D L S R Y А S К INI G

В4 897-915 к I N I G S К V N F О Р I D к N01 Q

В5 911-929 к К Q I Q Ь F N L Е S S К I E VII. К

ве 925-943 Е V X г. К N А I V Y N S м Y E NFS T

В7 939-957 £ N т s т S F W I R X Р к Y F N S X s

В8 953-971 F N S X S ь N N Е Y Т I I N С MEN N

В9 967-985 С К В ы » S G W К V S LH Y G a. x x W

BIO 981-999 G Е X X W г L Q О Т 0 Е г К Q R V V F

В11 995-1013 а Я V V F к Y S Q М I N X S О YIN R

В12 1009-2027 - 0 Y X' н R W I F V Т I Т N N R X* N N S

В1Э 1023-1041 R X. м м S к I Y I N а R L I D Q X P X

В14 1037-1055 О Q к V X S N L G N X Н А S N N X M F

В15 1051-1069 К N X м ж к Í D G с R D т H R Y X W X

В16 1065-1083 К Т X w X к Y F N L F D к E X. NEK e

В17 1079-1097 Ъ Я Е к S I К D L Y D К Q S N sex X.

В18 1093-1111 н а G X X. к D F Н G D Y •ь Q Y DKP *

В19 1107-1125 * о к р 1 У М L N L Y D Р N К * V D V

В20 1121-1139" к * V D V N N V G I R G Y M * X. К в p

В21 1135-1153 г X. к в 9 R G S V М •г Т N X * X. N S s

В22 1149-1167 тс X. N в а L Y Я G т К F I I К К * A а

В23 1163-iiat-. к к * А а G N- -К- О N X V R N N DRV Y

В24 1177-1195 к D R V X I N V V V к К К E * R L A T

В25 1191-1209 * R X. А т N А S Q А G V Е К X X. S A X.

В26 1205-1223 X X. S А X. £ I р D V а N L S 0 V V V м

В27 1219-1237 О V V V м К S к N О 0 G I T к к с к м

В28 1233-1251 N к с К м N L а D N N G Н D X G Ж X G

В29 1247-1265 X G г X в F Я 0 F N N I А К х. VAS N .

ВЗО 1261-1279 X. V А S к н Y N R Q X Е R S в R I X, G

В31 1275-1296 S R т L G с S W Е F I Р V D D G Vi G Е R Р L

Рис. 3. Ковалентная структура синтетически* пептидов #,~-фрагмента (аминокислотные остатки 855-1296) БНТ/А, отождествляющие всю аминокислотную последовательность полипептидной цепи. Перекрывающиеся участки между соседними пептидами показаны жирным шрифтом.

» пептиды В9-В13, BIS, В16 синтезированы Макото Хая кари, В14.В I9JB20JB23-B2S - Гулноз Долимбек, В17.В 18321JB22.B26JB27 - Брус Витией м B2S-B31 - Минахо Ошнма под руководством автора.

В 1992 г. Schiavo G. с соавт. определили, что L-цепь БНТ, которая блокирует нормальное физиологическое высвобождение ацетилхолина, 1шеет также и протеазную активность. Исследования, проведенные три года тому назад (Middlebrook J.L., 1995) свидетельствуют, что рекомби-нантный //(--фрагмент БНТ/А способствует появлению определенного протекционного иммунитета от нейротоксического воздействия БНТ/А. На основании вышеизложенного и учитывая тот факт, что Н^фрагмент БНТ/А непосредственно связывается с рецептором нейротоксина на мембране нервной клетки, чрезвычайно важным является определение антигенных детерминантных участков именно Яс-региона БНТ/А. Это позволит целенаправленно блокировать сильнейшую нейротоксическую активность ботулиновых нейротоксинов.

Для этой цели, с использованием всесторонней пептидной стратегии (Atassi M.Z., 1975) нами сконструированы 31 пептид, которые отображают полную аминокислотную последовательность //.--региона, и еще пять аминокислотных остатков в направлении /V-конца полипептидной цепи, т.е. фрагмент состоящий из аминокислотных остатков 855-1296 БНТ/А. Пептиды являются девятпадцатичленными (кроме С-концевого пептида, который состоит из 22 аминокислотных остатков) и перекрываются с соседним пептидом пятью остатками, что является очень важным для получения- достоверных результатов по антигенной структуре //¿•-региона БНТ/А.

Для их синтеза использовали иара-бензилоксибензил-полистироль-ную смолу (смола Ванга) и /V-a-9-флуоренилметоксикарбонил-загцищенгше (ФМОК) производные. L-аминокислот. Боковые функциональные группы аминокислот, использованные при синтезе были защищены следующими химическими группировками: гуанидиновая боковая группировка аргинина - 4-метокси-2,3,6-триметилбензилсульфонил; свободные карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот -/ире/л-бутиловый эфир; амидные группы аспарагина и глутамина, а также имидазольный остаток гистидина и сульфгидрильная группа цистеина -трифенилметил; ^-аминогруппа лизина - трет-бутилоксикарбонил; гид-роксильные группы серина, треонина, тирозина и иидольное ядро триптофана - трет-бугип. Гомогенность каждой производной ФМОК-L-аминокислот определяли тонкослойной хроматографией или аналитической обращеннофазовой ВЭЖХ на колонке Vydac 218ТР54 (5 ц, Cls, 4,6 х 250 мм). Защитную ФМОК-грушгаровку удаляли 25%-раствором пиперидина в диметштформамиде. Реакцию образования пептидной связи, которую проводили в атмосфере азота, осуществляли 1,3-диизопропилкарбодиимидом и 1-гидроксибензтриазолом. На каждом этапе связывания очередного аминокислотного остатка в пептиде, для обеспечения завершенности реакции образования пептидной связи, применяли четырехкратный мольный избыток аминокислоты, 1,3-диизопропилкарбодиимида и 1-гидроксибензтриазола. При завершении

реакции связывания каждого аминокислотного остатка и после элиминации защитной группировки проводили нингидриновыи тест Кайзера на свободные аминогруппы. Во время синтеза каждого из пептидов нейро-токсинов отделяли из реактора аликвоты пептид - носитель и анализировали на аминокислотный состав. Синтез продолжили только при определении ожидаемого аминокислотного состава. Структуры синтезированных нами пептидов БНТ/А представлены на рис. 3.

Синтезированные пептиды отделяли от носителя реакционными системами с разными концентрациями трифторуксусной кислоты и агентов, восстанавливающих образующиеся при реакциях свободные радикалы. Пептиды затем обессоливали методом гель-фильтрации на сефадексе G-15 и доводили до гомогенного состояния методом обращеннофазовой ВЭЖХ на полупрепаративной колонке Vydac 218ТР510 в 0,1% ТФУ, используя различные градиенты ацетонитрила. Анализы аминокислотного состава синтезированных нами пептидов показали, что они полностью коррелируют со значениями, ожидаемыми из ковалентной структуры пептидов.

1.2.2. Определение антигенных участков Яс-регнона ботулинового ней-

ротоксииа А

Для определения регионов молекулы БНТ/А включающих антигенные участки, применяли лошадиные*, человеческие* и мышиные антитела к токсину. Распознавание антителами антигенных участков Нс-фрагмента БНТ/А исследовали методом твердофазного радиоиммунного анализа. Результаты этих исследований обобщены на рис. 4. Они свидетельствуют, что регионы токсина показали связывание с лошадиными антителами в следующей уменьшающей последовательности: пептид В31 (аминокислотные остатки 1275-1296), В1 (855-873) > ВЗО (1261-1279) > регион В25/В26 (1191-1209/1205-1223) > В7 (939-957) > регион В17/В18 (1079-1097/1093-1111) (рис. 4 а). Пептиды .ВЗ (883-901), В5 (911-929), В11 (995-1013), регион В13/В14 (1023-1041/1037-1055) и В22 (11491167) проявили относительно низкое, но существенное и воспроизводимое связывание с антителами.

Человеческие антитела исследовали в разведениях 1:1000 и.1:2000 (рис. 4 б). При этом регионы БНТ/А, входящие в состав пептидов В2 (остатки 869-887), В6 (925-943), BIO (981-999), В11 (995-1013), В15 (1051-1069) и В24 (1177-1195) показали высокую антителосвязывающую способность, тогда как относительно низкая связывающая способность была отмечена в регионах БНТ/А, представленных пептидами В5 (911929), В7 (939-957), В9 (967-985), участками В20/В21 (1121-1139/11351153) и В29/В30/В31 (1247*1265/1261-1279/1275-1296).

* эти антитела были получены в лаборатории проф, Джона Л. Мкддлбрука (VS Army Medical Research and Development Command, VS Department of Defence, Fort Detrick, MD, USA).

Мышиные антитела исследовали в разведениях 1:500 и 1:1000 и также наблюдали шесть основных антигенных участков (рис. 4 в). Эти регионы представлены пептидами В2/ВЗ (869-887/883-901), В7 (939-957), В11 (995-1013), В15 (1051-1069), В24 (1177-1195) и В31 (1275-1296). В пептидах В18 (1093-1110) и В20/В21 (1121-1139/1135-1153) обнаружили еще два слабые антигенные участки.

Таким образом, полученные нами результаты показывают, что все три исследованные нами разновидовые антитела специфически распознают идентичные и очень близкие структурные участки молекулы БНТ/А.

£

и

о

Z

W

Я

се

К а tn

es и О

Номер пептида

Рис. 4. Связывание лошадиных (а), человеческих (б) и мышиных (/СУ?) (я) антител с синтезированными пептидами БНТ/А и токсином. Связывание определяли твердофазным РИА, используя антисыворотки в указанных разведениях (у.ч', в 0,1% БСА/РВВ). Результаты корректированы к. нсспецифическому связыванию, определенному с нормальной сывороткой и БСА.

Человеческие и мышиные антитела распознавали антигенные участки, расположенные в пептидах В2 (первый антигенный участок), В15 (четвертый участок) и В24 (пятый участок). В случае лошадиных антител, первый и четвертый антигенные эпитопы сдвинулись влево в полипептидной цепи и обнаружены в пептидах В1 и В13/В14, тогда как пятый антигенный эпитоп сдвинут вправо и обнаружился в регионе В25/В26.

Второй антигенный участок, распознанный человеческими антителами в пептидах В5/В6/В7, при использовании мышиных и лошадиных антител опознавался только в пептиде В7. Человеческие и лошадиные антитела распознавали регион в пептидах В10/В11 (третья антигенная детерминанта). В случае мышиных антител этот антигенный участок узнавался только в пептиде В11. Шестой антигенный участок, будучи распознанным человеческими антителами в регионе В29/В30/В31, лошадиными антителами идентифицировался в регионе В30/В31, а мышиные антитела распознавали его только в пептиде В31.

Таким образом, с применением синтезированных пептидов, охватывающих всю полипептидную цепь Н^-региона БНТ/А, а также разновидо-вых антитоксических антител нами установлено, что Я^регион БНТ/А который при проявлении нейротоксичности БНТ/А непосредственно связывается с рецептором на нервной клетке, содержит'шесть основных иммунодоминантных антигенных детерминантных участков. Эти результаты могут служить основой для получения эффективной вакцины, что представляет определенную практическую ценность для защиты от очень высокого нейротоксического действия ботулиновых нейротоксинов.

П. Установление структур антигенных участков постсинаптических

нейротоксинов

П.1. Структура антигенных участков нейротоксина II из яда кобры

Naja naja oxiana

С целью объяснения взаимосвязи между структурными участками, ответственными за нейротоксичность, и регионами, определяющими антигенные свойства, целесообразно провести изучение структуры антигенных участков а-нейротоксинов.

Известно, что а-нейротоксины, выделенные из ядов змей семейства Elapidae и Hydrophiidae, классифицированные на короткие - с М.М. около 6500 Da и длинные - с М.М. около 8500 Da, обладают постсинап-тическим действием, связываясь с АХР. Установлено, что три основных региона принимают непосредственное участие в связывании с рецептором. Эти участки расположены в первой, второй и третьей кольцевых структурах молекулы.

Постсинаптический нейротоксин - токсин II (НТ II) (ММ 6786 Da), относящийся к классу коротких токсинов, является одним из основ-

ных токсинов б яде централыгаазиатской кобры Naja naja oxiana и блокирует действие холинергического лиганда ацетнлхолина, связываясь с АХР.

Ввиду того, что НТ II является сравнительно слабым антигеном чем а-ЛТ или БНТ/А (его молекулярная масса в девятнадцать раз меньше, чем a-JIT и в двадцать два раза меньше, чем БНТ/А), для увеличения иммуногенности и получения антитоксических антител его коныогирова-ли с целлюлозой в виде суспензии, окисленной л«ета-пернодатом натрия и полиэлектролитом М4-5, так как они оба обладают высокой иммуностимулирующей активностью по отношению полипептида в составе химического конъюгата. Содержание специфических антител к НТ II в антисыворотках, полученных с использованием таких конъюгатов по сравнению с антисывороткой, полученной после иммунизации с интактным токсином, было в 2,0 - 2,5 раза выше.

Антитела из антисывороток выделяли аффинной хроматографией на синтезированном нами сорбенте НТ II - целлюлоза и использовали для получения их ^¡.-фрагментов. С помощью полученных Fab-фрагментов осуществляли синтез ориентированно-иммобилизованного F^-иммуносорбента.

В связи с тем, что молекула НТ II содержит четыре внутримолекулярных дисульфидных связей, его восстановливали Д-меркаптоэтаиолом, карбоксиметалировали и подвергали гидролизу трипсином. Для завершения гидролиза и удаления трипсина, гидролизах хроматографировали се-фадексом G-25 F и изучали связывание триптических пептидов с антителами с последующем выделением пептидов, содержащих детерминантные участки токсина. Для этого использовали аффшшую хоматографию на нммуносорбенте с ориенгированно-иммобшпповаиными активными фрагментами антител к НТ II. Выделенные пептиды. идентифицировали определением аминокислотного состава и /V-концевой аминокислоты. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Результаты свидетельствуют о том, что аминокислотные остатки антигенных детерминантных участков НТ II расположены в первой кольцевой структуре молекулы (Leu'-Glu-Cys-His-Asn-Gln-Gln-Ser-Ser-Gln-Pro-Pro-Thr-Thr-Lys/5), в переходящей части между этой кольцевой структурой и вторым большим кольцевым доменом (Thr"5-Cys-Ser-Gly-Ght-Thr-Asn-Cys-Tyr-Lys2S) и в третьем кольцевом структурном домене (Glyrj-Cys-Gly-Cys-PrO'Lys44 и Va^'Lys^Pro'Gly-VaUAsp-Leu-Asn-Cys-Cys-Arg51) молекулы нейротоксина. Следует отметить, что связывание--относительно меньших количеств пептида Gly3}-Thr-Ile-Ile-Glu-Arg3S свидетельствует, что вторая кольцевая структура НТ II также содержит аминокислотные остатки, ответственные-за антигенность молекулы.

Эти результаты хорошо коррелирутотся с данными, полученными нами при исследовании связывания антитоксических антител с НТ II

иммуносорбентным методом, что указывало на возможность одновременного связывания до четырех молекул антител с НТ II.

Таблица 1. Аминокислотный и /"/-концевой анализ пептидов триптического гвдролизата КМ-нейротоксина II, содержащие антигенные детерминантные участки НТ П.

Амино- Результат ~ ~ ~ ^ ^ Всего кислота анализа

Asx 4,06 1 1

Thr" 4,78 2 2

Ser» 3,11 2 1

Glx 6,12 4 1

Pro 4,12 2

Gly 4,69 1

Cys® 6,39 . ..1 2

Val 1,63

Leu 1,60 1

lie 1,77

Tyr 1,00 1

Iiis 1,06 I

Lys 3,84 h 1

Arg 2,12

2 4

1 5

3

1 6

1 1 4

1 2 1 5

2 2 7

2 2

1 г.

2 2

I

1

h- í 4

1 1 2

15 10 6 6 11 48

iV-конец Leu Thr Gly Gly Val

' в связи с деструкцией во время гидролиза, полученные значения корректированы к нулевому времени щцролиза;

6 определено количество цистеиновой кислоты, после окисления надмуравьиной кислотой;

Таким-образом5 с помощью триптических пептидов карбоксимети-лированного НТ II и антитоксических антител нами установлено, что антигенные детерминанты НТ II расположены в трех кольцевых структурах и в глобулярном основании молекулы нейротоксина, что свидетельствует о том, чтсг участки, ответственные за нейротоксическую активность НТ II (т.е. вторая кольцевая структура) ответственны также за антигенные свойства токсина.

II.2.1. Синтез пептидов а-бунгаротоксина яда змеи Bungarus

mutócinctus

На основе полученных результатов представляло интерес более глубоко и детально изучить антигенные участки а-нейротоксияов. Поэтому в дальнейшем мы остановили свой выбор на молекуле а-бунгаротоксина (а-БТ) из яда змеи Bungarus multicinctus, состоящий из 74 аминокислотных остатков. Данные исследования проводили для идентификации регионов иммунного распознавания а-БТ, a не для абсолютно точного определения границ эпитопов, для чего используется другая стратегия исследований.

Исходя из конформационной структуры а-БТ, полученной на основе его рентгеноструктурного анализа и первичной структуры, нами, методом 9-флуоренилметоксикарбонильного пептидного синтеза осуществлен синтез восьми пептидов, мимицирующих (этот термин означает синтетический пептид, являющийся пространственным аналогом дискретного участка молекулы белка) все циклические и- экспонированные участки поверхности молекулы а-БТ.

Как известно, в молекуле а-БТ дисульфидные связи,, расположенные на одной из сторон молекулы, образуют глобулярный участок. Три кольцеобразные структуры, направленные на внешнюю сторону от этого региона, содержат функциональные участки токсина. По аналогии со всеми длинными а-нейротоксинами, молекула а-БТ содержит так называемый карбокситерминальный "хвост", состоящий из девяти аминокислотных остатков. Ковалентные структуры синтезированных нами пептидов представлены на рис. 5 а, а их расположение в пространственной структуре молекулы а-БТ показано- на рис. 6.

Пептид L1 содержит аминокислотные остатки 3-16 нейротоксина и имеет дисульфидную связь между концевыми остатками цистеина. Пептид Ll/N-tail, дополнительно к аминокислотным остаткам в составе пептида L1, содержит также N-концевые остатки Не' и Val1. В пептиде L2, состоящем из аминокислотных остатков 26-41, цксгеиновые замещения в обеих концах использованы для образования дисульфидной связи. В этом пептиде, для предотвращения образования дисульфидных полимеров во время циклизации синтетического пептида, проведено аланиновое и тре-ониновое замещение в положениях 29 и 33. Известно, что инвариантный остаток триптофана в положении 28 полипептидной цепи молекулы а-БТ участвует в непосредственном контактировании с АХР и является одним из основных остатков, определяющих токсичность нейротоксина. Поэтому представляло интерес более подробно проводить исследования вкладов отдельных аминокислотных остатков на токсичность и антиген-ность молекулы а-БТ. В связи с этим Trp2s в пептиде L2 заместили остатком пхицина [пептид L2(G)]. В пептиде L3 цистеиновые остатки в по-

ложениях 48 и 59 токсина связаны дисульфидной связью. В пептиде L3/Ext дополнительно к пептиду L3, в направлении Л?-конца присоединена последовательность Ala4S-Ala-Thr47'. Пептид L4/C-tail содержит четвертую кольцевую структуру а-БТ вместе с его карбокситерминальной частью. Пептид C-tail содержит С-концевые аминокислотные остатки 6674.

А.

LI:

г

Cys5-His-Thr-Thr-Ala-Thr-Ile-Pro-Ser-Scr-AU-Val-Thr-Cy5,<-<Gly)

Г

1

Ll/N-tail: I]cl-VaI-Cys,-His-Thr-Thr-Ala-Thx.IIe-Pro-Ser-Ser-Ala-Val-Thr^:ys"-(GIy)

L2:

L2(G) : L3 :

I i

Cys-Lys^-Mel-Trp^-Ala-Asp-AIa-Phe-Thr- Ser-Ser-Arg-Gly-Lys-Val-Val-Glu"-Cys-Gly Cys-Lys"-Met-G!y5,-Ala.Aip-AI^Phc-Thr-Ser-Ser-Ais-GJy.Lys-Val.Va)-Ciu'"-Cys-Gly

Cys"-Pro Scr-LysLys-Pro Tyr-G!u-Giu-Val-Thr-Cys"-(Gly)

Г

1

L3/Ext: Ala4!-Ala-Thr-Cys"-Pro Ser-Lys-Lys-Рто Tyr-Glu-Glu-Val-Thr-Cyj»*4Gly)

L4/C-taiI : C-tail :

Г

I

Cys™-Scr.Thr-Asp-Lys-Cys-Asn"*-His-Pro-Pro-Lys-Arg-Gln-Pro-Gly" Asn^-His-Pro-Pro-Lys-Arg-Gln-Pro-Gly74

Б.

RXl/N-tail: R.L2:

Г

~1

Thr- His - Cys - He- Thr - Val- Ala- Ser-Thr- Fro- He- Thr-Ser- Val- Ala- Cys-(Gly)

I-1

Cys- Trp- Val- Aïg- Asp- Thr- Ala- Met- Phe - Lys- Gly - Ala- Lys- Ser- Glu- Val- Ser- Cys-GJy

R.L3/Ext: Lys- Ser- Pro- Cys- Ala- Tyr- Lys- Glu:Pro- Glu-Thr-Thr- Va)-Ala-Cys-(Gly)

Рис. 5. Ковалентные структуры синтетических пептвдов а-БТ (а) и их контрольных аналогов с рандомизированными аминокислотными последовательностями (б).

Помимо этих пептидов, нами осуществлен синтез контрольных пептидов а-БТ (рис. 5 б). Аминокислотный состав этих пептидов сходны пептидами Ll/N-tail, L2 и L3/Ext, однако их аминокислотные последовательности рандомизировали компьютерной программой Quick Basic СMicrosoft).

Синтез всех пептидов осуществляли твердофазным методом, на па-ра-бензилоксибензил-полистирольной смоле, с помощью ФМОК-защи-щенных производных L-ам иноки слот. В ходе синтеза, при концентрации первой аминокислоты 0,6 отмоль/r смолы и выше, по мере возрастания полипептидной цепи наблюдали затруднение реакции конденсации из-за

стерических эффектов. Поэтому в дальнейшем учитывая длину синтезируемого пептида, концентрации аминокислот брали в интервале 0,38 -0,52 тмоль/г твердой фазы. Как и в случае пептидов БНТ/А, через каждые два-три шага синтеза определяли аминокислотный состав синтезируемого пептида и реакцию продолжали только тогда, когда состав синтезируемого пептида полностью коррелируется с известной структурой.

Ll/N-tail

•М/C-taU

C-taii

Рис. 6. Конформационные модели синтетических пептидов а-БТ и позиции каждого пептида в молекуле а-БТ.

По ходу синтеза пептидов и особенно в реакциях их отщепления от твердой фазы важное значение имеет природа защитных боковых группировок и реакционных систем для отщепления пептида от твердой фазы и полной депротекции боковых функциональных групп. Кроме того необходимо также" предотвратить модификацию аминокислотных остатков с боковыми функциональными группировками, таких, как триптофан, метионин, гастидин, являющихся "проблематичными" остатками i твердофазном пептидном синтезе.

Эти трудности заставили нас проводить подбор оптимальных уело вий для осуществления синтеза пептидов включающих в своем составе вышесказанные аминокислотные остатки. Пептиды LI, Ll/N-tail, R.L1/N-tail, L4/C-tai! и G-tail содержат по одному остатку гистидина, который вс время синтеза может создать две проблемы. Во первых, если для синтез? используется незащищенный гастидин, он может ацилироваться. Это мо

жет. также произойти, при нестабильности защитной группировки в среде реакции (например, в толуолсульфонил-гиствдине).

Табл. 2. Аминокислотный анализ синтетических пептидов и контрольных пептидных аналогов а-БТ*.

Аминокислота и ьи №ии 12 и(С) 13 1Шх1 С-ьи 1Л С-Ш1 клл/ N-««11 ЫЛ Ех(

Ляс - - 1.04 1.08 - . 0.90 2.14 - 1.09 -

(IV- (1) (1) (2) О)

ты6 3.82 3.92 0.91 1.10 0.88 1.86 - 1.05 4.05 1.01 1.90

(4) <4> (1) (1) (I) (2) (1) (4) (1) (2)

Бег* 2.04 - 2.12 2,10 - 1.91 0.96 0.92 . 1.09 2.10 1.90 1.00

(2) (2) (2) (2) (1) (1) (1) (2) (2) (1)

ей . . 1.00 1.07 2.11 2.01 0.92 1.13 . 0.93 2.12

(1) (1) (2) (2) (1) (1) (1) - " 12)

Рго 0.93 1.08 - . 2.15 2.04 2.77 2.79 1.00 . 2.06

(1) (1) (2) (2) (3) (3) (1) (2)

«у 0.91 1.02 2.11 2.94 1.09 0.92 1.10 1.07 1.00 1.92 1.11

0) Я) (2) (3) О) (1) (1) 0) (1) (2) (!)

\ц 2.10 1.94 1.90 2.11 - 2.15 . 1.90 2.04 2.21

(2) (2) (2) (2) (2) <2) (2) (2)

Суз» 1.88 1.90 1.91 1.87 1.86 1.92 - 1.91 1.94 1.88 1.85

(2) (2) (2) (2) (2) (2) (2) (2) (2) (2)

Уа1 1.01 1.99 2.04 1.93 1.11 1.12 1.83 2.00 1.11

И) (2) (2) (2) 0) 0) (2) (2) (1)

Мй . . 0.90 0.94 - - - . 0.92 -

0) ~ (П (I)

Не 1.10 2.10 - 2.07 _

(1) (2) (2)

Туг - 0.8&. 1.10 - - ----- . 0.95-

(1) (1) <п

РЬс - - 1.12 1.07 - - - ■ 1.07

(1> - (I)

Ш5 0.89 1.07 . - 1.00 0.91 1.10 . -

(1) (1) (1) (1) (1)

Ьуз - ■ 2.1! 2.01 2.08 2.12 0.92 2.14 - 2.20 2.10

(2) (2) (2) (2) (1) (2) (2) (2)

Тгрг - - 0.89 - - - - - - 0.87 -

(1) (I)

Агв - 1.09 1.04 1.07 0.91 - 1.07

0) 0) 0) (1) (1)

' ожидаемые значения приведены в скобках;

' в связи с деструкцией во время гидролиза, полученные результаты аппроксимированы к начальному гидролизному времени;

' определено количество цистеиновой кислота, после окисления надмуравьиной кислотой;

' определен после гидролиза р-толуолсульфоновой кислотой, содержащей 0,2 % 3-(2-аминоэтил)-кидол.

Во вторых, возможна рацемизация в связи с реакционной способностью его имидазольного ядра. Поэтому для синтеза вышеуказанных гистидинсодержащих пептидов нами применена методика использующая гистидин с трифеншхметильной защитной группой. Пептид Ь2 является единственным пептидом, содержащим остаток триптофана. С этим аминокислотным остатком также происходит два вида побочных реакций. Первая - его окисление во время реакции, вторая - алкилирование ин-дольного кольца карбанионами, образующимися во время реакции отщепления пептида от твердой фазы и депротекции от защитных группировок.

Исходя из этого во время синтеза пептидов Ь2 и Е1.Ь2 применяли трет-бутилоксикарбонил-защшценное производное триптофана. Во время реакции отщепления этих пептидов от носителя трифторуксусной кислотой образуется ^-карбоксильный интермедиат (га; = 24 ч), который защищает триптофан от сульфонирования или алкилирования. Следут также отметить, что помимо этого реакционные смеси использованные нами, содержащие 1,2-этандитиол, способствуют защите триптофана от модификаций. Для отщепления пептидов Ь2 и КЛЛ от твердой фазы применяли реакционную смесь следующего состава: трифторуксусная кислота -метилфенилсульфид - 1,2-этапдитиол - анизол (90 : 5 : 3 : 2). Свободный триптофан в составе пептидов Ь2 и Г1.Ь2 образуется во время очистки пептидов в водных буферных растворах. Эту же реакционную смесь применяли для предотвращения окисления в сильнокислой среде остатков метионина в составе вышеуказанных пептидов и в пептиде Ь2(0. После отделения от носителя, синтезированные пептиды обессоливали в соответствующих буферных растворах с использованием сефа-декса С-15. Окончательную очистку осуществляли обращеннофазовой ВЭЖХ и анализировали их аминокислотный состав; результаты приведены в табл.2.

В связи с тем, что все пептиды токсина, кроме пептида С-ГаН отображают кольцевые участки а-БТ, эти пептиды циклизовали с помощью концевых цистеиновых остатков. Завершение циклизации контролировали реакцией Эллмана с 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислотой. Мономерную фракцию отделяли от полимеров хроматографией на сефадексах С-25 или С-50, с последующей очисткой циклического мономера методом обращеннофазовой ВЭЖХ на колонке Ууйас 218ТР510 (5//, С18, 10 х 250 мм) с 0,1 % трифторуксусной кислотой в градиенте ацетонитрила. Выход мономера с циклической структурой составлял 2,3 -6,4 % от исходного количества пептида, взятой для циклизации.

II.2.2. Иммунное распознавание а-бунгаротоксява и его синтетических

пептидов.

11.2.2.1 Антительное и Г-клеточиое распознавание а-бунгаротоксина.

К исследованию антигенных детерминантных участков а-БТ мы подходили систематически, исходя из следующих соображений. Для того, чтобы синтетический пептид, отображающий дискретный регион молекулы токсина, мог стимулировать иммунные ответы, способные защищать от токсического действия, пептид должен представлять иммунодоминант-ную антигенную часть в молекуле, и при использовании данного пептида как иммуногена, стимулированный при этом иммунный ответ, распознавая молекулу нативнош токсина, должен специфически связываться с ним. Поставленная задача может быть решена только в том случае, если анти-пептидный иммунный ответ способен нейтрализовать токсин.

С другой стороны, определение способности иммунного ответа полученного против а-БТ, специфически узнавать и связывать синтетические пептиды токсина, позволит понять антигенную иммунодоминант-ность между регионами молекулы токсина. Исходя из этого определение участков иммунного распознавания а-БТ решили осуществить комплексным подходом.

1000

2000 3000 4000

Разбавление антител

5000 6000

Рис. 7. Связывание а-БТ и его синтетических пептидов с антителами к а-БТ в различных разведениях антитоксической сыворотки. Антисыворотка к а-БТ была разведена от 1:500 до 1:5000 и их титры определяли двойным антительным РИА, используя 50 /дГсуспензии адсорбентов (1:1, Результаты представляют средние значения из трех независимо проведенных экспериментов (варьирование не более ±1,7 %).

С одной стороны, синтезированные пептиды исследовали на специфическое узнавание антителами и Г-лимфоиитами специфичными к

интактной молекуле а-БТ. С другой стороны, наоборот, определяли способность антител и 7-лимфоцитов к синтезированным пептидам связыать пептид и распознавать соответствующий каждому пептиду конформаци-онный участок на нативной молекуле а-БТ.

Табл. 3. Связывание анти-а-БТ антител с токсином и его пептидами.

Связывание 125j - антител (СРМ):

Антигены C57BL/6 (H-2b) Balb/c (H-2d) SJL (H-2S)

а-БТ 42517 68898 52109

L1 18511 27605 23520

Ll/N-tail 15678 23673 16585

L2 6357 9937" 8016

L2(G) 3033 6344 6430

L3 3985 5191 2599

L3/Ext 4S67 7470. 5618

L4/C-tail 9774 14856 8426

C-tail 19321 2S472 22060

Негативный

контроль:

R.Ll/N-tail 2165 1958 2584

R.L2 1951 2195 2476

R.L3/Ext 2979 1422 2619

БСА 2250 901 600

* Результаты были получены радиоиммуносорбентным титрованием и представляют средние значения трех независимо проведенных экспериментов (± 1,8 %).

Связывание полученных кроличьих антител к а-БТ с токсином и распознавание этими антителами участков токсина представленных синтезированными пептидами исследовали методом радиоиммуносорбентного анализа. Двойной антительный РИА проводили при разведении антител от 1:500 до 1:5000. Результаты, представленные на рис. 7, свидетельствуют, что при разбавлении антител даже в пять тысяч раз пептиды Ll, С-tail, Ll/N-taíl и L2 показали значительное связывание с антитоксическими антителами.

Пептиды C-tail, Ll, Ll/N-tail L2 и L4/C-tail сильно связывались с этими же антителами, определенный в количественном методе РИА при неменяющемся разбавлении антител (1:3000) и меняющемся (от 25 до 200 /m) объеме пептидных и токсинового сорбентов (рис. не приведен). Остальные пептиды - L3/Ext, L2(G) и L3 показывали связывание немногим более высокое, чем контрольные пептиды токсина и БСА.

Включение аминокислотных остатков N-конца токсина - Ile1 и Val2 к пептиду L1 (т.е. пептид Ll/N-tail) было осуществлено с целью изуче-

*ия вклада этих гидрофобных остатков в антигелные свойства N-юнцевого участка а-БТ. Низкое связывание пептида Ll/N-tail с антитоксическими антителами по сравнению с пептидом L1 (см. рис. 7) позволя-:т сделать заключение, что гидрофобные аминокислотные остатки Не' и Val2 не входят в состав антигенных детерминант а-БТ.

Оценку антигенности С-концевого участка а-БТ осуществили на основе результатов связывания антитоксических антител с пептидами, представляющими этот регион, т.е. пептидов C-tail и L4/C-tail.

Включение в пептид C-tail четвертого кольцевого участка а-БТ, содержащего аминокислотные остатки 60-65 (т.е. пептид L4/C-tail) не давало никакого преимущества при связывании с антитоксическими антителами (рис. 7). Этот факт ограничивает эту антигенную детерминанту в С-концевой части молекулы токсина в пределах девяти аминокислотных остатков 66-74 а-БТ.

Определение взаимосвязи между антитеяосвязывающими участками а-БТ в генетических линиях мышей и регионами, стимулирующими Т-лимфоциты, позволит , глубже понять природу иммунного ответа к а-БТ. Для этого исследовали связывание антитоксических антител C57BU6 (Н-2Ь), Balb/c (H-2d) и SJL (Н-2') с токсином и его пептидами с помощью количественного метода РИА: Результаты исследования этих трех разно-видовых антител обобщены в табл. 3, из которой видно, что все три- раз-новвдовых антитела довольно сильно связываются с интактным токсином.

Пептиды C-tail, L1. и L2 проявляли иммунодоминантносте в отличие от друшх пептдцов токсина, сильно связываясь с антитоксическими антителами. Вклад остатка Тгр2а, одного из инвариантных аминокислотных остатков а-нейротоксинов, непосредственно участвующего в их ней-ротоксичности, в антигенность молекулы а-БТ оценивали сравнивая связывание пептидов L2 и L2(G) с антитоксическими антителами. Замещение только одного этого остатка триптофана в положении 28 пептида L2 остатком глицина [пептид L2(G)] существенно уменьшило связывание антитоксических антител с пептидом L2(G). Это позволяет сделать вывод о том, что остаток триптофана в положении 28 полипептидной цепи молекулы а-БТ является также неотъемлемой составной частью антигенного участка во второй циклической структуре токсина.

Для создания эффективной защиты от нейротоксического действия а-БТ, помимо определения антительных детершшантных участков, основополагающим является также определение профиля Г-клеточного распознавания. Эту важную часть исследований проводили в мышах линий СЗН/Не (Н-2к), CBA/JCr (Я.-2*)г Balb/c (Н-2*), CS7BU6 (Н-2Ь) и SJL (Н-2*). Для этого первоначально определили оптимальную концентрацию а-БТ и его пептидов к стимулированию Г-лимфоцитов, иммунных к а-БТ. Для

анализа применяли кратные концентрации пептидов и токсина от 0,75 до 100 /¿г/мл. Найденные оптимальные концентрации использовали в экспериментах при изучении стимулирующей активности токсина и пептидов.

Антиген

Рис. 8. Максимальные пролиферативные ответы антитоксических Г-клеток, (при оптимальной дозе антигена) к а-БТ и его синтетическим пептидам.

Результаты показали (рис. 8), что в независимых гаплотипах иммунодо-минантность регионов а-БТ варьировалась от вида гаплотипа. Полученные данные свидетельствовали о том, что распознавание генетическим контролем осуществляется на антигенном детерминантом уровне. Известно, что иммунный ответ к-белковому антигену контролируется Я-2 связанными генами (Krco C.J. and David C.S., 1981), и в иммунном ответе против мультидетерминантного антигена антительный и Г-клеточный ответы, направленные к каждому антигенному участку, находятся под контролем отдельного-ir гена (David C.S. and Atassi M.Z., 1982).

Сравнивание антительных и Г-клеточных ответов в одной линии показало, что иногда отдельный регион а-БТ был распознан и антитела-

ми и Г-клетками одновременно. В то же время были также обнаружены регионы токсина узнаваемые только антителами или только Г-клетками. Такие результаты очень часто наблюдались при использовании определенных линий животных, когда эпитопные участки белкового антигена распознанные антителами и 3™-клетками, идентифицировались в одном и том же регионе. В противоположность этому, хотя и не наблюдался Г-клеточный ответ к дискретному участку, было показано узнавание этого участка антителами или, наоборот, без антотельного ответа на регион, он узнавался только Г-клетками (Вгх1ег е1 а!., 1984; Агам/ М.2., 1984). Наши результаты с а-БТ находятся в согласии с этими результатами.

Н.2.2.2. Антительное и Г-клегочное распознавание синтетических пептидов а-бунгаротокснна.

Определение иммунодоминантных участков а-БТ, распознающихся антитоксическими антителами и Г-лимфоцитами является решением одной из сторон поставленной задачи, с другой стороны, исследование профилей распознавания антител и Г-клеток ко всем синтетическим пептидам и сравнительный анализ всех полученных данных позволит наиболее полно представить иммунохимические свойства а-БТ. Дня осуществления этой части наших исследований в начальных экспериментах изучали иммунный ответ к каждому пептиду в отдельности.

Для этого антитела Ва1ЬУс и Я1П против пептидов проверяли на связывание с иммунизирующим пептидом и на узнавание соответствующего конформационного участка на молекуле а-БТ. Результаты, полученные методом радиоиммуносорбенгного титрования обобщенные в табл. 4, являются средними значениями из трех независимо проведенных экспериментов. Как видно из таблицы, несмотря на стимулирование каждым пептидом сильного антительного ответа, узнавание токсина этими антителами варьировались. Антитела, узнающие регионы а-БТ в обеих линиях мышей, были получены только иммунизацией пептидами Ь2 и С-1аН. Способность антител к другим синтезированным пептидам связывать токсин зависела от-структуры пептида и источника антител.

Исходя из этого, можно сделать вывод, что применение для иммунизации синтетических пептидов токсина в свободном состоянии способствовало проявлению интенсивного иммунного ответа, несмотря на это, степень связывания этих антител с токсином варьировались. По всей вероятности, это происходило из-за различного расположения дискретных участков а-БТ, связывающихся с антителами в зависимости от степени пространственной доступности этих регионов молекулы. Пептиды Ь2 и С-гаИ в обоих линиях мышей сильно стимулировали биосинтез антител, которые проявили высокую узнавающую способность и для нативной молекулы токсина. Эти результаты в согласии с благоприятным пространственным расположением второго кольцевого участка и С-концевого ре-

шона молекулы а-БТ для-связывания с антителами {^тгсШщк ег а1, 1983).

Табл. 4. Связывание анти-пептидных антител с иммунизирующим пептдом и а-

БТ.

Связывание антител: (Ке1 СРМ)

Антитела ВаШс Антитела

Пептид Количество-мышеи Связывание к пептиду Связывание к а-БТ Количество мышей Связывание к пептиду Связывание к а-БТ

Ы 10 58942 16432 8 77639 2128

ЪУЮ 8 95793 8460 9 62183 1964

Ы 9 88619 12831 9 65676 10735

ьз 9 49601 6200 10 38654 1074

Х-ЪШХ 10 35217 1447 Э 43704 3361

Ь4/СТ 8 63909 4170 10 73795 3802

С^аИ 8 43306 5149 9 44393 6062

Антисыворотки ВаЗЫс и были получены к каждому пептиду »-представляют смесь эквивалентных объемов сывороток от 87-дня после начала иммунизации мышей. Для РИА антисыворотки разбавляли в 1:500. Полученные результаты корректированы относительно неспецифического связывания.

Использованием каждого из пептидов токсина для иммунизации в свободном виде, определяли- также Т-клеточные профили распознавания иммуногенного пептида и узнавание полученным иммунным ответом к синтетическим пептидам соответствующих регланов в пространственной конформации токсина.

Для этого Т-лимфоциты мышей линии Ва1Ь/с и ЯЛ, иммунизированных пептидами пролиферировали в присутствии иммунизирующего пептида и а-БТ. Полученные результаты в графическом виде представлены на рис. 9, из которого видно, что Ва1Ь/с проявил сильный ответ ко всем пептидам токсина, кроме Ы (рис. 9 а). Несмотря на это, способность клеток, иммунных кг пептидам, распознавать токсин была различной. Распознающая способность регионов токсина 7-лимфоцитами Ва1Ь/с расположились в следующей последовательности: ЬЗ/Ех! > Ь2 > Ь4/С-1аП

> ЬЗ > Ы/КчаЯ > Ы > СчаН (рис. 9 а), тогда как распознавание полученное в 5Л. оказались более очевидной и уменьшались в ряду: 1А!С-1т\

> 1Л > СчаП > Ь2 > фис. 9 б).

Антиген

Рис. 9. Пролиферативные ответы Г-клеток иммунных к синтетическим пептидам токсина по отношению к соответствующему пептиду и а-БТ. Balb/c, (а); SJL, (б).

Следует отметить, что в мышах линии Balb/c, пептид C-tail хотя вызвал самый сильный Г-клеточный ответ среди всех изученных пептидов к самому себе, узнавание этими же клетками С-концевого региона нативиой молекулы а-БТ проявилось довольно слабо. Это объясняется тем, что С-концевая часть полипептидной цепи молекулы а-БТ состоящий из девяти аминокислотных остатков, обладает более высокой сегментной мобильностью по сравнении с остальными регионами молекулы, что было также показано в исследованиях по структуре. а-БТ в растворе (Endo Т. et al., 1981; Inagaki F. et al., 1985) и в кристаллическом состоянии (Agard D.A, and Stroud R.M., 1982).

П.2.2.3. Протекция против а-бунгаротоксина с синтетическими

пептидами.

а-БТ обладает высокой токсичностью и в зависимости от пути его введения значения ЛД50 находится в интервале 0,11 - 0,41 /г/г. Для создания эффективной защиты от его токсического воздействия важным является изучение антительного и клеточного иммунных ответов к пепти-

дам, составляющим части молекулы токсина, и представление пептидами его иммунодоминантных участков. При использовании идентифицированных антигенных пептидов для иммунизации важно, чтобы полученные антитела узнавали токсин и нейтрализовали его токсическое действие.

Как было показано выше, регионы, расположенные в структурах LI, L2 и C-tail молекулы токсина проявили при иммунном ответе против токсина сильные узнающие способности. Эти регионы с разновидовыми антителами, также продемонстрировали антигенную иммунодоминант-ность. С другой стороны, в иммунном ответе к каждому из пептидов токсина антитела пептида L2 показали самую высокую распознающую способность соответствующего региона на молекуле а-БТ.

При связывании с токсином антител к другим пептидам резкого отличия в степени их связывания обнаружено не было. В связи с этим и тем, что различие антипептидных антител связывать токсин не было значительным, и это не обязательно коррелировалось. с антипептидным Т-иммунным ответом при узнавании токсина, нами проведено исследование способности каждого пептида создать протекцию от нейротоксического воздействия токсина.

Для этого мышей линии Balb/c и SJL иммунизировали вышеуказанными пептидами (60 мышей для каждого пептида) и сублетальным количеством а-БТ. Связывание антител в антисыворотках определяли методом твердофазного РИА. В ходе иммунизации, когда дальнейшего роста содержания антител не наблюдались, в каждую группу животных внутривенно вводили различные количества а-БТ. Использовали пять мышей для одной дозы .токсина в процент выживания от действия а-БТ выразили графически как функцию количества токсина. С помощью построенных графиков определяли значения ЛД5й. Соотношение значения ЛД50, определенного после иммунизации а-БТ или пептидами, к значению, определенному в контролях, обозначали как протекционный индекс (PI). Определили, что ЛД50 в неиммунизированных мышах имели следующие значения: в Balb/c, 0,128 /¡г/г; SJL, 0,156 /¿г/г.

Кривые выживания от действия токсина, для пептидов, в Balb/c представлены-на~ рис. 10 а, из которого видно, что пептиды С- tail, L2 и L1 проявляют наиболее высокие протекторные свойства среди , других пептидов токсина. В SJL эта активность наблюдается в следующей уменьшающейся последовательности: L2 > LI = C-tail > L4/C-tail > L3/Ext > L3 > LI/N-tail (рис. 10 б).

Протекционные параметры каждого из пептидов обобщены в табл. 5, из которой видно, что в обеих линиях каждый из пептидов проявляет определенную протекцию (PI = 2,18 - 3,21). Самую высокую защитную активность проявляли пеппзды L2, L1 и C-tail. Ни один из пептидов не показал протекторные свойства, при использовании а-БТ для иммунизации (PI: в Balb/c, 9,69; SJL, 7,36). Немаловажно отметить тот факт, что пептиды LI, L2 и C-tail, проявившие иммунодоминантные свойства в

связывании с антителами к нативному а-БТ (см. таб;.. 3), также проявили самую высокую способность к протекции от действия а-БТ.

Количество введенного- а-БТ (цг)

Рис. 10. Кривые выживания от нейротоксического воздействия а-БТ мышей Ва1Ыс (а) и 8Л, (б),, иммунизированных синтетическими пептидами а-БТ. Каждая точка кривой представляет процент выживания из пяти мышей для данного количества а-БТ.

Таким образом, среди изученных нами всех пептидов а-БТ пептиды Ы, Ь2 и СчаИ проявляют самые высокие протекторные свойства, увеличивая Р/ примерно в три раза по сравнению с контролем. Полученные результаты заставили нас проводить исследования протекторных свойств смеси трех антигенных пептидов при одновременной иммунизации.

Для иммунизации мышей Ва1Ь/с использовали эквимолярную смесь этих пептидов. Связывание антител с каждым из пептидов и а-БТ контролировали методом РИА. Протекционный индекс, полученный при та-

ком подходе, оказался 4,57 раза выше, чем у контроля. Полученные результаты наглядно показали, что антитела, направленные к трем этим регионам токсина, по сравнению с антителами к одному участку а-БТ, являются более эффективными для защиты от токсина. Протекторное свойство смеси пептидов было взаимосвязано с количеством антител, распознающих интактную молекулу а-БТ (рис. 11).

ТО 60

1 50

| 40

I -

£ 20

«в

4 ю о

О 20 40 60 GO 1С0 120

Связанные антитела к а-БТ (TMet СРМ х Ю-3) Рис. II. Зависимость между результатами отравления а-БТ и содержанием связавшихся с токсином ангтител, полученных в Balb/c, иммунизированных эквимоляркой смесью пептидов LI, L2 н C-tail или конъюгатом трех пептидов с овальбумином.

Однако способность этих антител связывать цельный токсин была средней и практически не увеличивалась по мере продолжения, иммунизации. Исходя из полученных результатов, для увеличения защитных способностей антител нами осуществлен синтез макромолекулярного конъю-гата иммунодоминантных пептидов а-БТ с овальбумином.

Пептиды конъюгировали с овальбумином 1-зтил-3-(3-диметил)-аминопропил-карбодиимидом. Состав конъюгата определяли аминокислотным анализом и его сравнением с составом овальбумина. Было установлено, что одна молекула носителя связалась с 2,12 моль L1, 11,34 моль L2 и 8,85 моль C-tail, т.е. получили конъюгат имеющий состав 1Л2 L2nC-tail9 - овальбумин. Это связано с тем, что пептиды LI, L2 и C-tail имеют разную степень реакционной способности с белковым носителем овальбумином.

Радиоиммунный анализ полученных антисывороток после иммунизации с конъюгатом показал, что эти антитела связываются с а-БТ с чрезвычайно высокой аффинностью. На рис. 11 представлена зависимость между результатами действия различных количеств токсина и количеством связавшихся с токсином антител в группах мышей, иммунизированных смесью и конъюгатом пептидов LI, L2 и C-tail. Из рис. видно, что существует прямая связь между связыванием антител с а-БТ и толерантностью против токсического воздействия а-БТ. Немаловажным явля-

ется я то, что антитела к химическому конъюгату, показавшие идентичные значения связывания с а-БТ, по сравнении с антителами против смеси пептидов, позволили создать более эффективную защиту от. токсина (рис. 11). Это наводит на мысль о том, что химический конъюгат способствует биосинтезу антител с более высокими показателями аффинности. По сравнении с протекцией, показанной а-БТ (Р/ = 9,69), мультиэлитопный конъюгат, содержащий иммунодоминантные пептиды а-БТ, проявил исключительно высокую протекцию. Она оказалась почти в два раза эффективнее (Р1 — 18,1), чем защита полученная иммунизацией с а-БТ (табл. 5).

Табл. 5. Протекционные параметры а-БТ и его синтетических пептидов.

Протекционные параметры для: Balb/c: SJL:

Антиген: дя» (шг а-БТ/мышь) Протекционный индекс (РГ) ЛЯ* (мкг а-БТ/мышь) Протекционный индекс (РГ)

Без антигена 3,20 1,00 3,60 1,00

И 10,27 3,21 8,86 2,46

Ll/N-tail 8,36 2,61 7,86 2,18

L2 10,27 3,21 9,76. 2,71

L3 7,86 2,46 7,94 2,21

L3/Ext 8,36 2,61 8,57 2,38

L4/C-tail 8,36 2,61 8,64 2,40

C-tail 10,27 3,21 8,86 2,46

а-БТ 31,00 9,69- 26,50 7,36

Смесь Ll, L2 и C-tail Конъюгат Ll, L2 и C-tail 14,63 57,80 4,57 18,10 - -

Таким образом наши результаты позволяют утверждать, что муль-тиэпитопный химический конъюгат антигенных участков токсина может служить как высокоэффективная синтетическая пептидная вакцина против высокого токсического воздействия а-БТ.

а-БТ является одним из представителей обширной семьи д линных и коротких нейротоксинов и цитотоксинов, с которыми имеет высокую степень гомологии в аминокислотной последовательности и пространст-

венной структуре (Endo Т. and Tamiya N., 1987). В литературе известно, что в группах гомологичных белков антигенные участки очень часто находятся в эквивалентных структурных регионах их молекул (Kazim A.L. and Atassi M.Z., 1982; Atassi M.Z., 1984). Поэтому, представленные результаты с а-БТ могут служить как прототип, и антигенные участки а-БТ могут быть экстраполированы в структурно-эквивалентные участки молекул других членов этой обширной семьи нейротоксинов и цитоток-синов.

Таким образом результаты исследования структуры участков иммунного распознавания четырех представителей белковых нейротоксинов - а-латротоксина из яда паука Latradectus tredecimguttatus, ботулинового нейротоксина А-продуцируемого бактериями Clostridium botulinum, ней-ротоксина II из яда кобры Naja naja oxiana и а-бунгаротоксина из яда змеи Bungarus multicinctus, обладающих как пре- так и постсинаптическим действием позволили установить новые закономерности, свидетельствующие существования непосредственной взаимосвязи между участками молекул, ответственными за нейротоксическую и антигенную функцию. Это позволяет судить о степени инвариантной тропно-сти между токсин-связывающими участками ацетилхолинового рецептора и рецепторов отдельных классов лимфоцитов, принимающих специфический сигнал от антигенной детерминанты.

Установленные антигенные участки нейротоксинов и синтезированные на их основе "искусственные антигены" открывают перспективы для использования синтетических пептидных вакцин.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен синтез иммуносорбентов с иммобилизованными моноспецифическими антителами и их активными ^-фрагментами с целью одностадийного выделения а-латротоксина из яда паука Latrodectus tredecimguttatus и нейротоксина II из яда кобры Naja naja oxiana. Показано, что при выделении этих нейротоксинов практически все активные центры антител (90 - 95 %) реагируют с нейротоксинами.

2. Методом иммуносорбентного связывания проведен эпитопньгй анализ а-ЛТ и установлено, что его молекула может содержать до девяти антигенных детерминантных участков.

3. Установлено, что антигенные регионы НТ II сосредоточены в трех кольцевых структурах и глобулярном остове молекулы; они расположены в следующих фрагментах молекулы нейротоксина: Leu1 -Glu-Cys-His-Asn-Gln-Gln-Ser-Ser-Gln-Pro-Pro-Thr-Thr-Lys'° (первая кольцевая структура); Thrl6-Cys-Ser~Gly-Glu-Thr-Asn-Cys-Tyr-Lys2S (переходящая часть между первой и второй кольцевыми структурами), Gly33-Thr-Ile-Ile-Glu-Arg38 (вторая кольцевая структура), Gly39-Cys-Gly-Cys-Pro-Lys44 и

Val4s-Lys-Pr0-Glyrval-Asn-Leu-Asn-Cys'-Cys-Argss (треля кольцевая структура).

4. 9-флуоренюшетоксикарбонильным методом твердофазного пептидного синтеза осуществлен полный химический синтез 31 пептидов, отождествляющих Нс-регион (М.М. 50 Юа) молекулы ботулинового нейротоксина А из Clostridium botulinum.

5. Получено три разновидовых антител, специфичных к ботулино-вому нейротоксину А и проведен скрининг синтетических пептидов Нс региона БНТ/А к распознаванию полученными антителами. Установлено, что в зависимости от разновидности антитоксических антител антигенные участки //¿.-региона БНТ/А расположены в регионах молекулы представленных следующими пептидами: пептид В1 (аминокислотные остатки 855-873) или В2 (остатки 869-887) (первый антигенный участок); регион В5/В6/В7 (911-929/925-943/939-957) (второй антигенный участок); регион В10/В11 (981-999/995-1013) (третий участок); пептид В14 (1037-1055) или В15 (1051-1069) (четвертый участок); пептид В24 (1177-1195) или регион В25/В26 (1191-1209/1205-1223) (пятый участок); регион В29/В30/В31 (1247-1265/1261-1279/1275-1296) (шестой антигенный участок).

6. Осуществлен химический синтез восьми пептидов, отображающих все кольцевые и высокоэкспонированные участки а-БТ и трех контрольных пептидных аналогов а-БТ, с помощью 9-флуоренилметокси-карбонильного метода твердофазного пептидного синтеза.

7. Определены профили иммунного распознования а-БТ антителами и Г-клетками специфичными к а-БТ и синтезированным пептидам а-БТ. Определены иммунодоминантные антигенные участки а-БТ, которые находятся в трех регионах, расположенные в первой (аминокислотные остатки 3-16) и второй (остатки 26-41) кольцевых структурах, а также в С-концевой части (остатки 66-74) молекулы а-БТ.

8. Установлено, что гидрофобные аминокислотные остатки lie' и Val2 а-БТ и также регион Cys60-Ser-Thr-Asp-Lys- Cys6S , составляющий четвертую кольцевую структуру нейротоксина не входят в состав антигенных участков молекул}.! а-БТ. На примере а-БТ определено влияние высокой степени сегментрой мобильности N- и С-концевых регионов полипептидной цепи молекул белков на Г-клеточный иммунный ответ. Установлено, что аминокислотный остаток Trp2i расположенный во второй циклической структуре а.БТ участвующий в нейротоксичности молекулы а-БТ связываясь непосредственно с АХР, является также неотьемлимой частью антигенного региона нейротоксина

9. Сравнительным изучением субмолекулярной специфичности антительного и Г-клеточного ответов, определены сильно распознаваемые как антителами так и Г-клетками регионы молекулы а-БТ, а также

идентифицированы, участки, которые предпочтительно узнаются толькс антителами или только Г-клетками.

10. Установлено, что синтезированные пептиды а-БТ, при исполь зовании в свободном виде в качестве иммуногена, способствовуют обра зованию сильных антительных ответов. Антитела к пептидам L2, L1 и С tail довольно сильно распознают соответствующие регионы молекулы а БТ по сравнению с другими пептидами. Показано, что иммунный ответ анти-пептидных Г-клеток к определенному пептиду не взаимосвязан с тем, что этот регион является или не является иммунодоминантным пс отношении, антитоксических Г-клеток. Показано также, что способност! антипептидных Г-лимфоцитов распознавать цельную молекулу а-БТ варьируется среди пептвдов и это явление указало на то, что антипептидный антительный и Г-клеточный иммунные ответы находятся под генетическим контролем, и их способность распознавать соответствующие структурные участки молекулы а-БТ зависят не только от конформаци-онной экспозиции дискретного региона молекулы иейротоксина.

11. Для а-нейротоксинов на примере а-БТ показано, что иммунизация синтетическими пептидами в свободном виде позволяет обеспечить существенную протекцию от токсического воздействия нейротоксинов. Определено, что регионы LI, L2 и C-tail молекулы а-БТ, содержащие иммунодоминантные антигенные участки, оказались самыми протекторными, увеличивая-протекционный индекс примерно в три раза по сравнении с контролем. Пептиды LI, L2 и C-tail в смешанном состоянии проявили еще более сильный протекторный эффект - PI — 4,57.

12. Установлена способность образовать высокоэффективную защиту от нейротоксина, овальбуминового конъюгата пептидов LI, L2 и C-tail (PI = 18,1), почти в два раза превышающая таковую для а-БТ (PI = 9,69), что указало на возможность использования мультиэпитопного химического конъюгата этих антигенных пептидов токсина как эффективной вакцины против нейротоксического действия а-БТ.

Список работ опубликованных по теме диссертации: Статьи:

1. Dolimbek B.Z. and Atassi M.Z. a-Bangarotoxin- Peptides Afford a Synthetic Vaccine Against Toxin Poisoning // Journal of Protein Chemistry, 1994, v. 13, № 5, p.p. 490-493.

2. Atassi~M.Z., Dolimbek BJZ. and Manshouri T. Antibody and T-cell Recognition of a-Bungarotoxin and Its Synthetic Loop Peptides // Molecular Immunology, 1995, v. 32, № 12, p.p. 919-929.

3. Atassi M.Z. and Dolimbek B.Z. Regions of Interactions Between Nicotinic Acetylcholine Receptor and a-Neurotoxins and Development of a Synthetic Vaccine Against Toxin Poisoning // In: Methods in Protein Structure Analysis (M.Z.Atassi and E.Appella, Eds), New York, Plenum Press, 1995, p.p. 311-326.

4. Atassi M.Z., Dolimbek B.Z., Hayakari M., Middiebrook J.L., Whitney B.and Oshima M. Mapping of the Antibody-Binding Regions on Botulinum Neurotoxin Я-Chain Domain 855-1296 with Antitoxin Antibodies from Three Host Species // Journal of Protein Chemistry, 1996, v., 15, No. 7, p.p. 691-700.

5. Dolimbek B.Z. and Atassi M.Z. Protection Against a-Bungarotoxin Poisoning by Immunization with Synthetic Toxin Peptides // Molecular Immunology, 1996, v. 33, № 7/8, p.p. 681-689.

6. Долимбек БЗ., Атасси М.З. а-Бунгаротоксиннинг иммунокимёси. 1. Нейротоксин пегггидяарининг синтези ва уларнинг антитана рекогаи-циялари И Киме ва фармация, 1997, № 3 , 31-36 б.

7. Долимбек Б.З., Атасси М.З. Синтез двух пептидов а-бунгаротоксина и участие аминокислотного остатка Тгри нейротоксина в антигенности молекулы // Химия природных соединений, 1997, № 4, с. 628-631.

8. Долимбек Б.З., Атасси М.З. а-Бунгаротоксиннинг антитана ре-когницияси // УзР ФА Маърузалари, 1997, № 12, 22-25 б.

9. Долимбек БЗ., Атасси М.З. а-Бунгаротоксиннинг иммунокимёси. 2. Нейротоксин синтетик пептвдларига карши Г-хужайра жавоби // Ким'ё ва фармация, 1998, № 3, ЧШб.

10. Долимбек Б.З., Атасси М.З. а-Бунгаротоксин синтетик пептид-ларининг токсиндан х,имоялаш хусусиятлари II УзР ФА Маърузалари, 1998, № 2,32.-36 б.

11. Долимбек Б.З. Богулин нейротоксини Не 855-1296 домени пептидла-рининг синтези ва антиген детерминанталарининг структуралари // "Узбекистан мустациллиги - унинг фани ва технологияси ривож-ланшиининг гарантияси" 2-Республика илмий коллоквиума, Тош-кент, 1998, 150-152 б.

12. Долимбек БЗ., Атасси М.З., Салихов Ш.И. Пресинаптические и постсинаптические нейротоксины: исследование структур участков им-

мунного распознавания // Химия природных соединений, 1998, № 1, с. 22-40.

Тезисы докладов:

13. Касымов Ш.К., Долимов Б.З., Гариб Ф.Ю., Садыков А.С. Динамика циркуляции антигенсвязывающих лимфоцитов у крыс иммунизированных токсином из яда паука Latrodectus tredecimguttaius // 3-й Советско-Швейцарский симпозиум "Биологические мембраны: структура и функция", Тошхент, 1983, с. 153.

14. Касымов Ш.К., Долимов Б.З., Горина Л.Г., Садыков А.С. Способность плазматической мембраны М. pneumoniae к связыванию эндотоксина из яда Latrodectus tredecimguttaius" II 3-й Советско-Швейцарский симпозиум "Биологические мембраны: структура и функция", Тош-кент, 1983, с. 186.

15. Долимов БЛ. Аффинная хроматография а-латротоксина И Тез. Докл., Конференция молодых ученых и специалистов, посвященное к 60-летию ЛКСМ Уз,-Тошкент, 1985-, с. 108.

16. Долимо» Б.З., Касымов Ш.К. Изучение взаимодействия а-латротоксина с мембранами лимфоцитов вироиммунотестом // Тез. Докл., 1-Конференция биохимиков Узбекистана, Тошкент, 1986, с. 283-284.

17. Касымов Ш.К., Долимов Б.З., Салихов Ш.И. Получение и исследование /■„¿-фрагментов антител к а-латротоксину I/ Тез. Докл., 1-ой Конференция биохимиков Узбекистана, Тошкент, 1986, с. 285-286.

18. Dolimov B.Z., Kasymov S.K., Salihov S.I. Study of a-Latrotoxin Interaction with Lymphocyte Membrane Structures By Viroimmunoassay It Symposium on a Structure, Biosynthesis and Functions of the Molecular Elements of the Immune System, Pusbchino, Abstracts, Moscow, 1987, p. 98.

19. Kasymov S'.K., D'ôlîmov B.Z., Salihov S.I., Inogarnov U.K. Immunochemical Characteristics of a-Latrotoxin // Symposium on a Structure, Biosynthesis and Functions of the Molecular Elements of the Immune System,_Pushchino, Abstracts,. Moscow, 1987^p. 101.

20. Долимов БЗ., Нуриддинов A.P., Касымов Ш.К., Салихов Ш.И. /У Локализация антигенных детерминант токсина II из яда кобры Naja naja

oxiana II 7-Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов, Таллин, 1987, Тез. докл., М„ 1987, с. 48-49.

21. Salihov S.I., Kasymov S.K,, Dolimov B.Z., Nuriddinov A.R. Immunochemical Study of Neurotoxins of the Latrodectus tredecimguttatus Spider and Naja naja oxiana Cobra Venom // 14 th International Congress of Biochemistry, Prague, 1988, Abstracts, Prague,

1988, v. 1, p. 169.

22. Dolimov B.Z. Utilization of the Protein-Cellulose Complex to Increase Immunogenicity of Toxin 1Г from the Venom of Naja naja oxiana Cobra // Symposium on Biotechnological Aspects of Protein Production by Cultural Cells, Prague, Abstracts, 1988, p. 72.

23. Долимов Б.З., Иногамов У.К. Использование иммуноэлектрофореза для контроля чистоты а-латротоксина и нейротоксина II // В сб.: "Актуальные проблемы укрепления связи науки и производства", Фергана, 1988, с. 88.

24. Иногамов У.К., Долимов Б.З., Касымов Ш.К., Салихов Ш.И. Модификация целлюлозного сорбента, используемого в аффинной хроматографии И Всесоюзная конференция "Проблемы использования целлюлозы и его производных в медицинской и микробиологической промышленностиТошкент, 1989, Тез. докл., М., "Наука",

1989, с. 33.

25. Иногамов У.К., Долимов Б.З., Касымов Ш.К., Салихов Ш.И. Синтез иммуносорбента для извлечения гомогенного антигена // 14-Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Тошкент, 1989, Сб. докл. и сообщ., М., "Наука", 1989, с. 533-534.

26. Salihov S.I., Kasymov S.K. and Dolimov B.Z. Immunochemical Investigation of Toxins of Some Central Asian Venomous Animals H lffh World Congress on Animal, Plant and Microbial Toxins, Singapore, 1991, Abstracts, Abst. № 238.

АЙРИМ ПРЕСИНАПГИК ВА ПОСТСИНАПТИК НЕЙРОТОКСИН-ЛАР ИММУН РЕКОГНИЦИЯ КИСМЛАРИНИНГ СИНТЕЗИ ВА СТРУКТУРАВИЙ ЖИХАТЛАРИНИНГ ТАДКДВ^И

Бех.зод 3. Долимбек

Ушбу тадкикотда пресинаптик нейротоксинлар - Latrodectus mactans tredecimguttatus ургимчагн захарндан ажратилган а-латротоксин (а-ЛТ), Clostridium botulinum бактериялари А ботулин нейротоксини-нинг (БНТ/А) //с-решони ва постсинаптик нейротоксинлар - Naja naja oxiana Марказий Осиё кобраси захаридан олинган нейротоксин II (НТ II) ва Bungarus multicinctus илон захарининг асосий токсик компонент-ларидан бири а-бунгаротоксинларнинг (а-БТ> иммунокимёвий хусусият-ларини белгиловчи антиген детерминант кисмлари аникланди.

Биринчи марта, иммуносорбент анализи усули билан, а-ЛТ ва унинг антитаналари уртасидаги узаро боглашпи урганилиб, а-ЛТ, моле-куланинг ташх,аридан етишиш мумкин булган регионларида жойлашган туккизта антиген кисмларшш уз ичига олиши мумкин экани аникланди, Адсорбентларга кимёвий боглангаи токсин антитаналари ёки уларнинг фаол булакларини куллаб, а-ЛТ ва НТ II ларни Latrodectus mactans tredecimguttatus корахурт ва Naja naja oxiana кобра захарларидан ягона боскич билан тоза холда ажратиш шароитлари ишлаб чихилди.

Биринчи марта, НТ И нинг антиген кисмлари молекуланинг учта халка структуралари ва глобуляр асосини ташхил этувчи куйидаги реги-онларда экани аникланди: Leu'-Glu-Cys-His-Asn-Gln-Gln-Ser-Ser-Gln-Pro-Pro-Thr-Thr-LysIS (биринчи халка структураси); Thr"5-Cys-Ser-Gly-Glu-Thr-Asn-Cys-Tyr-Lys25, Gl^-Thr-Ile-Ile-Glu-Arg38 (иккинчи халка структураси); Gl^-Cys-Gly-Cys-Pro-Lys44 B& Val^-Lys-Pro-Gly-Val-Asp-Leu-Asn-Cys-Cys-Arg55 (учинчи халк,а структураси).

Биринчи марта, кдттик фаз ал и пептид синтези усули билан БНТ/А нинг 50 kDa молекуляр огирликка зга булган Яс-кдсмини акс эттирувчи утгиз битта 19 ва 22 аъзолик пептидларининг тулик кимёвий синтези амалга оширилдн. БНТ/А га карши олинган от, одам ва сичкон антитаналари ва синтез кшшнган хар-бир пептиднинг бокланиш профиллари урганилиб, БНТ/А 7/с-регионининг олтита асосий антиген кдсмларни узида тутгани биринчи марта аникланди. Улар полипептид занжирининг куйидаги кисмларида жойлашган: 855-873 ёки 869-887 аминокислота колдикдари (биринчи антиген детерминант кием), 911-929/925-943/939957 (иккинчи регион), 981-999/995-1013 (учинчи регион), 1037-1055 ёки 1051-1069- (туртинчи регион), 1177-1195 ёки 1191-1209/1205-1223 (бешинчн регион) ва 1247-1265/1261-1279/1275-1296 (олтинчи антиген региони).

Кдттик фазали. пептид синтезининг 9 - флуорешл метокс икар бо кил усули билан а-БТ нинг барча халка структур алари ва экспозицияланган кисмларини акс эттирувчи саккизта пептидларининг кимёвий синтези амалга оширилди. Шу билан бир каторда нейрсггоксиннинг учта контрол пептидлари хам синтез килинди. а-БТ иммун рекогниция регионларини комплекс урганиш, токсиннинг антиген кисмлари уртасидаги иммунодо-минантликни аниклашга имкон яратди. Биринчи марта, а-БТ нинг имму-нодоминант антиген кисмлари нейротоксин молекуласининг учта регио-нвда, яъни, биринчи (Cy^-His-Thr-Thr-Ala-Thr-Ile-Pro-Ser-Ser-Ala-Val-Thr-Cys16) ва иккинчи халка структуралари ([Lys26-Met-Trp-Cys-Asp-Ala-Phe-Cys-Ser-Ser-Arg-Gly-Lys-Val-Val-Glu"), х,амда карбокси-термииал кдсмида (.AsnS6-His-Pro-Pro-LysrArg-Gln-Pro~Gly74) зкани аникданди. Шу билан бирга, токсиннинг амино-терминал кисмидаги икки гидрофоб колдик Ile' ва Val2, хдмда токсин молекуласининг туртинчи халка структурасини ташкил этувчи Cys^-Ser-Thr-Asp-Lys-Cys65 кием антиген детерминантала-ри таркибига кирмаслиги аникланди. Биринчи марта а-БТ мисолида, оксил молекуласи амино- ва карбокси-терминал кисмларига хос булган юкори даражадаги сегмент мобиллигининг Г-хужайра иммун жавобига тугри боглик экани исбот килинди. Биринчи марта, а-БТ молекуласининг инвариант аминокислота колдикдаридан бири Тгр2в аминокислота к,олдига молекуланинг нейротоксик хусусияти билан бирга, унинг анти-генлигида хам бевосита иштирок этиши исбот килинди.

Биринчи марта, а-БТ нинг иммунодоминант антиген кисмларини узвда тутган суньий антиген синтез килнниб, унинг, нейротоксин билан иммунизациялащдан олииган а-БТ нинг кучли нейротоксик таъсиридан кимоялашга нисбатан икки баравар кучли кимоялаш хосил этгани, бу суньий антигеннинг, токсиннинг юкори захарли кучидан химоялащда эффектов вакцина сифатвда хизмат кила олишини курсатди.

Synthesis and Study of the Structure of Immune Recognition Sites of Some Presynaptic and Postsynaptic Neurotoxins

Behzod Z. Dolimbek

In this work the immune recognition sites of presynaptic neurotoxins -a-latrotoxin (a-LT) from Latrodectus mactans tredecimguttatus spider venom and Clostridium botulinum toxin A (BNT/A) Hp-domain and postsynaptic neurotoxins - toxin II (NT II) from Nqja naja oxiana cobra venom and a-bungarotoxin (a-BT) from Bungarus multicinctus banded krait venom have been studied.

Interaction between a-LT and its antibodies studied by the immunoadsorbent analysis has revealed that a-LT may contain nine antigenic sites located on highly accessible and exposed regions of the molecule. Synthesized high-capacity antibody affinity adsorbents afforded a rapid single-step isolation of a-LT and NT II from the corresponding venoms. It has been found that antigenic sites of NT II reside within Leu'-Glu-Cys-His-Asn-Gln-Cln-Ser-Ser-Gln-Pro-Pro-Thr-Thr-Lys15 (first loop structure), ThrI6-Cys-Ser-Gly-Glu-Thr-Asn~Cys-Tyr-Lysls, Gly33 -Thr-Ile-Ile-Glu-Arg3 (second loop) and Gl^-Cys-Gly-Cys-Pro-Lys44, Val4,-Lys-Pro-Gly-Val-Asp-Leu-Asn-Cys-Cys-Arg5 J(third loop) sequences of the polypeptide chain.

Solid-phase peptide synthesis (SPPS) strategy was applied to synthesize thirty-one 19- and 22-residue long overlapping peptides encompassing the entire length of the BNT/A 50 kDa Hcregion and these synthetic peptides were used to map the antibody-binding regions on BNT/A with prepared horse, human and mouse antibodies. Six major binding sites on BNT/A were determined which reside within the following segments of the toxin molecule: residues 855-873 (horse antibody) or 869-887 (human and mouse antibody) (first antigenic region); 911-929/925-943/939-957 (second region); 981-999/995-1013 (third region); 1023-1041/1037-1055 (horse antibody) or 1051-1069 (human and mouse antibody) (fourth region); 1177-1195 (human and mouse antibody) or 1191-1209/1205-1223 (horse antibody) (region five); 1247-1265/1261-1279/1275-1296 (region six).

Eight peptides representing, the loop and surface regions, of a-BT and three control peptide analogs in which these sequences were randomized have been synthesized by SPPS and used to map the immune recognition profiles of the antibodies and T-cells obtained after the a-BT immunization. Also, the abilities of anti-peptide antibodies and T-cells to recognize the immunizing peptide and correlate region on the native a-BT molecule were determined. It was shown that three immunodominant antigenic sites of aBT reside within the three regions of a-BT Cys?-His-Thr-Thr-Ala-Thr-Ile-Pro-Ser-Ser-Ala-Val-Thr-Cys16 (first loop structure); Ly^-Met-Trp-Cys-Asp-Ala-Phe-Cys-Ser-Ser-Arg-Gly-Lys-Val-Val-Glu" (second loop- structure); Asne6-His-Pro-Pro-Lys-Arg-Gln-Pro-Gly'XC-terminal part). In addition, the hydrophobic residues of lie1 and Val2 and the Cys-Ser-Thr-Asp-Lys-Cys63 segment constituting, the fourth cyclic structure of the a-BT molecule were found to be out of the antigenic sites of the toxin. Relationship between high degree of the segmental mobility of the protein amino* and carboxy-terminal regions and the T-cell immune responses have been established. One of the-invariant residues in long and short a-neurotoxins - TrpM directly involved in the binding with acetylcholine receptor found to be an indivisible part of the antigenic region of a-BT.

A chemical conjugate carrying all three immunodominant antigenic regions of a-BT, when used as an immunogen, conferred extremely high protection against a-BT poisoning, which was almost double the protection obtained by a-BT immunization. This indicates that the multiepitope conjugate should serve as an excellent vaccine against toxin poisoning.

' Подписано к печати 9.04.98. Формат бумаги 60x81 I.I6. Объем 2 п.л. Тирах 60 эм. •

Заказ 199

Отпечатано ва ротапринте в типографии ТашГУ.