Новые синаптические рецепторы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

Петренко Александр Георгиевич

НОВЫЕ СИНАПТИЧЕСКИЕ РЕЦЕПТОРЫ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Институте биооргшшческой химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчшппкова РАН, Медицинском Институте Говарда Хьюза и Медицинском Институте Университета Ныо-Йорка

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корр. РАН, академик РАМН Ткачук В.А. доктор химических наук, член-корр. РАН Кочетков С.Н. доктор химических наук, профессор Цетлин В.И.

Вепутая организация: Институт биологии гена РАН

Защита состоится « К/ ноября 2004 года В 10 часов на заседании специализировшшого совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчишшкова РАН по адресу: 117997 ГСП, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан < октября 2004 года

специализировшшого совета, доктор химических наук, профес

Ученый секретарь

[есмеянов В.А.

лчозя

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Функционирование нервной системы определяется высоко организованным взаимодействием нервных клеток, образующих развитую сеть межклеточных синаптических контактов. Синапсы служат для направленной, тонко регулируемой передачи сигналов от одной клетки к другой. Направленность передачи сигнала обеспечивается существованием специальных надмолекулярных структур в месте сипаптического контакта -пресинаптического аппарата, обеспечивающего выброс яейромедиатора путем экзодитоза синаптических пузырьков, на одной клетке и постсинаптических рецепторных комплексов на другой клетке. Образование и исчезновение синаптических контактов является регулируемым процессом, обеспечивающим организацию сложных сетей передачи и обработки сигналов в мозгу.

Детальное понимание механизмов синаптической передачи и синаптогенеза требует идентификации и характеристики молекулярных компонентов синапса. Несмотря на достигнутый прогресс в этой области в течение последних лет, многие молекулы, важные для функционирования синапсов, остаются неизвестными, либо мало изученными. В наибольшей степени дшнюе относится к пресинаптическому аппарату, который осуществляет сложные процессы регулируемого транспорта синаптических пузырьков и их слияние с клеточной мембраной.

Методические сложности изучения молекулярных механизмов выброса нейромедиаторов определяются тем, что в отличие от других биологических процессов таких как, например, ферментативные реакции или трансмембранный транспорт ионов, реконструкция функционального прссинаптичсского аппарата in vitro остается крайне сложной и в настоящее время неосуществлешюй задачей. Выделение белковых компонентов нресинапса на основе легко определяемой биохимической характеристики не представляется возможным. В связи с этим, исследователями синаптической передата были использовшгы непрямые подходы для идентификации пресшсаптических белков, такие как анализ случайных и направленных мутаций в различных организмах, выделите и систематический анализ белковых компонентов синаптических пузырьков, использование нресинаптических нейротокешюв и пр.

' (t'OlLi Л

На сегодня, наше знание о структуре пресинантического аппарата ограничивается коротким и, очевидно, неполным списком белков, которые предположительно участвуют в процессе выброса нейромедиаторов. Вышеизложенное позволяет заключить, что идентификация и структурно-функциональное исследование пресинаптических белков является актуальной проблемой современной физико-химической биологии. Цель и задача исследования.

Основной целью настоящей работы явилась идентификация, структурная и биохимическая характеристика ранее неизвестных белковых компонентов нресинаптического аппарата.

В качестве ключевого методического подхода к решению данной задачи было выбрано использование природного нейротоксина альфа-латротоксина (далее - латротоксина) в качестве инструмента исследования. Латротоксин, белковый компонент яда паука каракурта, является одним из наиболее мощных стимуляторов синаптической передачи, увеличивающим частоту спонтанного экзоцитоза синаптических пузырьков. Действие латротоксина определяется высокоспецифичным взаимодействием с поверхностными белковыми рецепторами, расположенными на поверхности нервных клеток.

На первом этапе работы была поставлена задача выделения данных рецепторов и их первичная характеристика белковым электрофорезом. При этом учитывалось, что возможно также со-выделение белков, не являющихся непосредственно рецепторами токсина, но специфически взаимодействующих с ними, а также примесных белков, не имеющих отношения к рецепторам.

В связи с этим, на втором этапе работы планировалось идентифицировать выделенные белки по их аминокислотной последовательности, получить антитела к ним и определить их роль в рецепции латротоксина. Ключевой задачей на этом этапе стало клонирование структурных генов ранее неизпестных белков, определение их нуклеотидной последовательности, и функциональная экспрессия в эукариотических клетках.

Целью следующего этапа исследования стало определение мембранной топологии и доменной структуры найденных рецепторов путем компьютерного анализа их аминокислотной последовательности в сочетании с иммунохимическим анализом. Также была

поставлена задача определения участков связывания латротокснна в полнпептидных цепях рецепторов.

В ходе данной работы был открыт рецептор, являющийся представителем нового семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии. Было показано, что данный рецептор, кодируемый одним геном, состоит из двух субъединиц. В связи с этим, была поставлена отдельная задача по детальному изучению механизмов эндогенного протеолиза данного рецептора с целью определения участка расщепления и локализации клеточного отдела данного процессинга. Научная новизна работы.

В процессе исследования разработана оригинальная методика и осуществлено выделение рецепторов латротокснна и ассоциированных белков аффинной хроматографией. Впервые установлено, что латротоксин имеет три белковых рецептора в нервных тканях: нейрексин или кальций-зависимый рецептор, CIRL (Calcium-Independent Receptor of Latrotoxin - кальций-независимый рецептор латротокснна), являющиеся ранее неописанными белками, и тирозин-фосфатазу сигма РТРа. Интересно, что данные рецепторы не имеют между собой заметной структурной гомологии и принадлежат к трем различным классам рецепторов поверхности клетки. Нейрексин является белком клеточной адгезии с одним трансмембраш1ым сегментом, CIRL - G белок-сопряженным рецептором, а РТРа -мембршпюй тирозин-фосфатазой.

На основе информации о частичной аминокислотной последовательности осуществлено клонирование полноразмерной кДНК рецептора CIRL. По определенной нуклеотидпой последовательности выведена аминокислотная последовательность состоящая из 1471 остатка. Клонированы также два близких гомолога CIRL - CIRL-2 и CIRL-3. Показано, что CIRL-1 и CIRL-3 экспрессируются преимущественно в нервной ткани, в то время как CIRL-2 встречается практически во всех тканях. Установлено, что рецепторы CIRL принадлежат семейству 11(B) G-белок-сопряженных рецепторов. В составе большой внеклеточной части CIRL идентифицированы домены характерные для белков клеточной адгезии: лектнновый, олфактомедшювый и муциновый. Таким образом, CIRL является представителем нового семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии.

Экспрессией CIRL и РТРсг в эукариотических клеточных линиях и хромафшшых клетках доказало, что клонированные CIRL и РТРсг являются функционально-активными рецепторами латротоксина. Направленным мутагенезом определено расположение осповных участков связывания латротоксина в CIRL и РТРсг.

Впервые установлено, что CIRL, кодируемый одним геном, состоит из двух различных нековалентно связанных субъединиц - р120 и р85, что необычно для G-белок-сопряжениых рецепторов. Обнаружена растворимая форма CIRL представляющая собой комплекс внеклеточной субъедшпщы р120 и короткого пептидного N-концевого фрагмента р85. Показано, что двухсубъединичная структура CIRL является следствием эндогенного внутриклеточного протеолиза и определен сайт расщепления рецептора.

Установлено, что сайт протеолиза находится внутри цистеин- и триптофан-богатого домена с ранее неописанным структурным мотивом, присутствующим в семействе природных гибридов G белок-сопряжешплх рецепторов и белков клеточной адгезии. Поскольку мутации в этом домене приводят к устойчивости CIRL к расщеплению, предложено присвоить данному мотиву наименование GPS (G protein-coupled receptor Proteolysis Site). Практическая ценность работы.

Полученные результаты имеют не только научное, но и прикладное значение. Основная масса широко используемых в настоящее время лекарств, в качестве мишеней, используют G белок-сопряженных рецепторы. Поэтому, каждый вновь открытый G белок-сопряженный рецептор представляет собой потенциальный объект для создания новых лекарств. Структурный и предварительный функциональный анализ CIRL позволяет предположить, что химические соединешш, являющиеся его агонистами либо антагонистами, могут быть использованы для лечения неврологических и психических заболеваний сопровождающиеся нарушениями нейросекреции. Также возможно, что модуляция активности членов семейства рецепторов CIRL позволит контролировать рост злокачественных опухолей. В связи с потенциальной практической важностью рецептора CIRL, на его открытие был получен патент. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на 17 Съезде нейробиологов США (Лос-Анжелес, 1998), Совещании по механизмам передачи сигналов с участием G белков (Ныо-

Йорк, 2000), Конференции «Яды животных» (Гамбург, 2000), 19 Съезде нейробиологов США (Новый Орлеан, 2000), Гордоновской конверенции «Молекулярная Фармакология» (Венхура, 2003), 6 Международной Энгелюардговской конференции (Санкт-Петербург-Москва, 2003), Конференции по G-белок связянным рецепторам (Торонто, 2003). Публикации.

Диссертация обобщает дшшые 25 основных публикаций. Личный вклад автора.

Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке и проверке предложенных в работе экспериментальных подходов, обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов. Весь экспериментальный материал получен автором и непосредственно руководимыми им сотрудниками его лаборатория, за исключением экспериментов по функциональной экспрессии рецепторов латротокспна в хромафшшых клетках, выполненых Проф. Р. Хольцом и Д-ром М. Биттнср (University of Michigan School of Medicine, Ann Arbor, MI), а также поиска клонов кДНК нейрексинов, выполнетплх Проф. Т. Зюдофом и Д-ром 10. Ушкаревым (UT Southwestern Medical Center, Dallas TX). Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемрй литературы, содержащего наименования. Диссертация содержит 41 рисунок и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Латротоксин является пресинаптическим токсином, вызывающим массовый выброс нейромедиатора путем стимуляции экзоцитоза синаптических везикул (Ceccarelli and Hurlbut, 1980; Gorio et al., 1978; Tzeng et al., 1978; Tzeng and Siekevitz, 1978; Tzeng and Siekevitz, 1979a; Tzeng and Siekevitz, 1979b). Латротоксин стимулирует выброс различных нейромедиаторов, в том числе ацетилхолина, глютамата, ГАМК и т.д. Более того, латротоксин стимулирует экзоцитоз в секреторных клетках, таких как хромафинные и панкреатические клетки (Bittner and Holz, 2000; Bittner et al., 1998; Lang et al., 1998).

Многочисленные исследования указывают на то, что действие латротоксина определяется наличием специфических белков на поверхности клетки, с которыми токсин связывается с высокой аффинностью в наномолярном диапазоне. За данными белками исторически утвердилось наименование «рецепторы латротоксина» (Meldolesi, 1982), хотя, поскольку латротоксин не является физиологическим эндогенным лигандом данных мембранных белков, правильнее было бы их именовать «акцепторами латротоксина».

В результате связывания токсина с мембранными рецепторами, его молекулы частично погружаются в мембрану и образуют катион-селективные поры, что объясняет большинство эффектов латроксина на клетку, включая стимуляцию секреции и цитотоксичность (Grasso et al., 1980; Krasil'nikov et al., 1982; Mironov et al., 1986; Orlova et al., 2000; Robello, 1989; Tse and Tse, 1999). В то же время, ряд экспериментов указывает на то, что действие латротоксина возможно в условиях, когда ионные потоки контролируются и повышения кальция внутри клетки не наблюдается (Capogna et al., 1996; Meldolesi et al., 1983; Misler and Falke, 1987; Rosenthal et al., 1990). В частности, было предложено, что латротоксин частично перемещается через цитоплазматическую мембрану и, за счет внутриклеточных взаимодействий, активирует гипотетический эффектор, сопряженный с аппаратом экзоцитоза (Khvotchev and Sudhof, 2000).

Несмотря на то, что детальный механизм действия латротоксина остается предметом дискуссии, не вызывает сомнений тот факт, что его рецепторы, присутствующие в нервных тканях в относительно низких концентрациях, являются маркерами зон экзоцитоза и вовлечены в регуляцию нейросекреции. Этим определяется интерес к рецепторам латротоксина и интенсивные исследования в различных лабораториях мира, направленные на

их идентификацию и структурно-функциональную характеристику (Rosenthal and Meldolesi, 19S9).

Начальные эксперименты по характеристике рецепторов латротоксина показали, что они обратимо связывают латротоксин с высокой аффинностью (Кд порядка Ю40 М"1), имеют белковую природу, и сконцентрированы в зонах пресинантических контактов (Grasso et al., 1982; Meldolesi, 1982; Tzeng and Siekevitz, 1979b; Ushkarev Iu and Grishin, 1986; Valtorta et al., 1984). Также было показано, что количество латротоксин-связывающих участков уменьшается примерно в два раза при удалении кальция из внешней среды хелатированием (Meldolesi, 1982).

В середине 80-х годов прошлого столетия была предложена методика солюбилизации рецепторов латротоксина неионными детергентами, в частности тритоном Х-100. Солгобилизация сохраняла латротоксин-связывающие свойства рецепторов и открывала возможность для их выделения хроматографическими методами. Первая попытка выделения рецепторов латротоксина завершилась идентификацией мультимерного комплекса массой 200 кДа, состоящего из субъедтшц массой 54 и 66 кДа (Scheer and Meldolesi, 1985). Однако, поскольку количество выделенного белка находилось на грани детекции, достоверность идентификации рецепторов вызывала сомнение.

1. Выделение и идентификация рецепторов латротоксина и сопутствующих белков

Для выделепия рецепторов латротоксина нами была разработана методика, основашгая на использовании аффшшой хроматографии на колонке с иммобилизованным латротоксином. Мембранные белки сошобилизировались неионным детергентом (Тритон Х-100 или CHAPS) и отделялись от нерастворимого материала ультрацентрифугированием. Твердофазный радиолигандный анализ с использованием 11М-мечешюго латротоксина позволил подтвердить, что функциональная активность рецептора сохраняется после процедуры солюбилизации, причем связывание токсина в присутствии кальция было примерно в 2 раза выше, чем в его отсутствии.

Фракции мембранных белков, экстрагированные детергентом наносились на аффинную колонку в условиях низкой ионной силы в присутствии 2 мМ Са2+. После продолжительной промывки, связавшиеся белки элюировали 0.13-0.6 М градиентом КС1, в буфере, содержащим 10 мМ EDTA. Кальций-зависимая латротоксин-связывающая

активность присутствовала в единичном остром пике. В то же время, кальций-независимая связывающая активность была широко распределена по всему градиенту элтоции. Нами было установлено, что элюция кальций-независимого рецептора с латротоксин-содержащей матрицы существенно возрастает в буферах высокой соли. Напротив, кальций-зависимые рецепторы элюировались с колонки почти немедленно после внесепия ЕБТА, хотя их взаимодействие с латротоксшюм более устойчиво к буферам с высокой ионной силой. Определение сродства выделенных рецепторов к латротоксину с использованием графика Скетчарда выявил наличие рецепторов высокой аффинности с Кд 2.5 яМ как п присутствии, так и в отсутствии кальция.

Очищенные фракции рецептора были проанализированы ЗОЭ-электрофорезом по методике Лэммли. Белковые полосы с молекулярными массами в 200, 160 и 29 кДа коррелировали с высоким кальций-зависимым связыванием латротоксина. Также воспроизводимо детектировались мажорная полоса с молекулярной массой в 120 кДа, не узнаваемая антителами к латротоксину, имеющему сходную электрофоретическую подвижность, и минорные полосы 80,79,70,65,60,47,43 и 25 кДа.

Индивидуальные белки в препаратах выделенных рецепторов латротоксина были очищены препаративным вйв-электрофорезом. Их структура была проанализирована протсолитическим расщеплением. Ы-концевая последовательность полученных пептидов определялась по Эдману, либо тандемной масс-спектрометрией высокого разрешения. Всего было определено свыше 100 частичных аминокислотных последовательностей, на основании которых была осуществлена идентификация выделенных белков. Было установлено, что белки массой 80 и 70 кДа являются субъедшшцами р80 и р70 рецептор-подобной белковой тирозин фосфатазы сигма (РТРа), что было подтверждено Вестерн-блотом с двумя анти-РТРа антителами, предоставленными Проф. Шлессинджером. Белки 79 и 43 кДа явились субъсдиницами митохондриального фермента метаболизма жирных кислот. Белок 65 кДа оказался идентичным синаптотагмину, мембранному кальций-связывающему белку синаптических везикул, а полосы 60 и 47 кДа - тубулину и актину, основным белкам цитоскелета и мажорным компонентам мозга. В то же время, белки массой 200,160,120 и 29 кДа оказались ранее неизвестными полипептидами.

2. Функциональное семейство рецепторов латротоксина: кейрексины, CIRL рецепторы и

тнрозин-фосфатаза сигма

Пептвдпое картирование белков 160 и 200 кДа показало, что они являются

изоформами одного белка. На основе информации о частичной аминокислотной

последовательности данного белка было осуществлено клонирование нового семейства

высоко полиморфных мембранных белков поверхности клетки, получивших название

нейрексины. Экзогенная экспрессия нейрексинов в эукариотпческих клетках показала, что

нейрексин 1а является высокоаффишгым кальций-зависимым рецептором латротоксина.

Данная часть работы была выполнена в сотрудничестве с Проф. Т. Зюдофом и Д-рами Ю.

Ушкаревым и Б. Давлетовым (UT Southwestern Medical Center, Dallas TX). Neu resin PTPo CIRL-1

PM

Out

Laminin A G-domain

EGF repeat

О O-linked sugar domain

¡э JgG domain

пз Fibronectin III domain

□ PTP domain

&ЧЧЧЧУ& Lectin domain

СС£££> Olfactomedin domain

О STP-rich domain

R Secretin receptor

0 Cys-rich domain

ñ GPS domain

Рис. 1. Доменная структура функционального семейства рецепторов латротоксина

Известно три различных нейрексина. Каждый из них имеет две формы (а - длшшая и р - короткая), что вероятно является результатом транскрипции с альтернативных промоторов. Кроме того, все кДНК нейрексина имеют множественные сплайс-варианты в 5 внутренних позициях. Анализ аминокислотной последовательности нейрексинов выявил их ярко-выраженную доменную структуру (Рис. 1). В И-конце нейрексинов расположен гидрофобный фрагмент, очевидно играющий роль сигнального пептида, определяющего внеклеточное

расположение N-концевой части нейрексинов. Сигнальная последовательность сопровождается тремя большими повторами, приблизительно 450 аминокислот каждый. Каждый повтор состоит из центрально расположенного домена эпидермалыгого фактора роста (EGF), окруженного гомологичными левым и правым плечами. Таким образом, большая часть внеклеточной области нейрексинов состоит из трех больших повторов, содержащих шесть меньших повторов с вкрапленными EGF доменами. После набора повторов, нейрексины содержат серии- и треонин-богатые последовательности. Анализ баз данных показал гомологию этой области с серии- и треонин-богатыми последовательностями LDL рецептора и предшествсшгака белка Альцгеймсра, которые служат в них областями О-связанного гликозилирования. После области О-связанного гликозшшрования, нейрексины содержат гидрофобную последовательность, которая является их единственной трансмембратюй областью. Трансмембранный сегмент сопровождается коротким, высоко ионным цитоплазматическим хвостом.

Поиск в базах данных выявил гомологию коротких плечей-новторов нейрексинов и доменов присутствующих в С-концах белков внеклеточного матрикса агргага, ламшшна А, и перлекана - так называемый ламишш G домен. Эти белки считаются важными в управлении движения аксона, синаптогенезе, и клеточной адгезии. Таким образом, внеклеточная часть нейрексинов может выполнять функцию межклеточной адгезии в нервных окончаниях.

Как уже отмечалось, другой рецептор латротоксина является ранее известной рецептор-подобной белковой тирозин фосфатазой сигма (РТРа), интегральным мембранным белком плазматической мембраны. РТРа - член семейства трех высоко гомологичных рецептор-подобных тирозин-фосфатаз (Pulido et al., 1995). Гомологи РТРа получили название LAR (leukocyte antigen related) тирозин-фосфатаза и РТР8. РТРа состоит из двух субъедшшц р80 и р70. Они являются результатом внутриклеточного протеолитического расщепления про-рецептора. р80 представляет собой внеклеточно ориентированный гидрофильный белок с 3 иммунопюбулиновыми и 4 фибронектиновыми (первые 3 высокой гомологии и четвертый низкой гомологии) повторами, в то время как р70 состоит из одной трансмембранной области и двух цитошизматических каталитических доменов (Рис. 1). Большая внеклеточная область РТРа напоминает типичный белок адгезии клеток.

CTRL (Calcium-Independent Receptor of Latrotoxin - кальций-независимый рецептор латротоксина), как и два других рецептора, также содержит большую внеклеточную часть со структурпыми модулями, характерными для белков клеточной адгезии (см. ниже). В то же время трансмембранная топология CIRL свидетельствует о том, что он является G белок-сопряженным рецептором (GPCR).

Для доказательства того, что комплексы латротоксина со всеми тремя рецепторами действительно могут образовываться на шггакткых мембранах, была проведена химическая ковалентная сшивка радиоактивно меченного латротоксина с белками мембран мозга. После сшивки мембраны солюбилизировали с денатурацией и иммунопреципитировали антителами против рецепторов. Анализ преципитатов выявил наличие высокомолекулярных продуктов сшивки (Рис. 2). Как и следовало ожидать, в характере полос, представляющих комплексы токсина с РТРа, нейрексшюм и CIRL, имелись существенные различия, что подтверждало специфичность эксперимента (Рис. 2В). В частности, при использовании антител протип внеклеточной субъединицы РТРа, воспроизводимо наблюдалась полоса около 200 кДа, что соответствовало стехиометрическому комплексу мономера латротоксина и внеклеточной субъединицы РТРа р80. Следовательно, латротоксин действительно может образовывать комплексы со всеми тремя рецепторами на мембране.

Сравнительный компьютерный анализ аминокислотных последовательностей всех трех рецепторов латротоксина не выявил существенной структурной гомологии. Таким образом, латротоксин является уникальным примером природного токсина, имеющего три независимые и структурно отличные мишени, принадлежащие к трем различным классам рецепторов поверхности клетки. Взаимодействие специфичного пресинаптического токсина с тремя рецепторами позволяет предположить их сходную или комплементарную функцию в регуляции синаптической передачи. Поскольку рецепторы латротоксина не имеют выраженной структурной гомологии, мы предложили классифицировать группу трех нейрональных рецепторов как функциональное сешйство рецепторов латротоксина.

69

Рис. 2. Химическая сшивка комплексов латротоксина с РТРо, нейрексином 1«, и СЖЬ-1 на мембране. Мембраны мозга с предварительно связанным 1251-латротоксином обрабатывали растворимым бифункциональным сшивающим реагентом ВБ3. Полученный препарат растворяли в буфере, содержащем БОБ и подвергали иммупопреципитации с набором антител

против нейрексина, субъединиц PTPs, р120 субъедпницы CIRL-1, и рецептор-подобной тирозин-фосфатазы RPTPa в качестве отрицательного контроля. Преципитаты полученные из химически сшитых мембран (черные столбцы) или мембран без обработки BS3 (серые столбцы) просчитывались в счетчике гамма-радиоактивности (А). Преципитаты сшитых комплексов также подвергали электрофорезу и авторадиографии (В). В качестве дополнительного контроля специфичности иммунопреципитации с антителами против РТРсг использовалась конкуренция с антигенными пептидами (+Pept).

3. Клонирование и определение полной аминокислотной последовательности CtRL и его гомологов.

кДНК CIRL была клонирована на основе частичных аминокислотных последовательностей, определенных для белка 120 кДа. Была обнаружена одна длинная открытая рамка считывашм, которая кодировала ранее неизвестный белок, состоящий из 1471 аминокислотных остатка. Эксперименты по клонированию CTRL выявили наличие трех гомологичных кДНК и, соответственно, трех почти идентичных белков, образующих семейство CIRL (Рис. 3). Они получили наименование CIRL-1 (или просто CIRL, поскольку именно он является идентичным выделенному нами высоко-аффинному кальций-независимому рецептору латротоксина), CIRL-2 и CIRL-3. Обсуждаемая далее доменная структура является практически идентичной для всех трех рецепторов. Исключение составляет присутствующий только у CIRL-3 дополнительный короткий домен в его N-кощсвой части, сразу после сигнальной последовательности.

Центральная область CIRL (остатки 850-1100) гомологична членам семейства рецептора секретина - семейства П(В) GPCR рецепторов (Рис. 4). Согласно профилю гвдрофобности CIRL, этот район содержит семь сильно гидрофобных сегментов. В GPCR рецепторах, эти гидрофобные последовательности представляют собой a-спиралн, которые формируют компактную трансмембранную структуру овальной формы. Подобно другим GPCR рецепторам, в CIRL идентифицируются три гидрофильных внутриклеточных и три внеклеточных петли между трапсмембрашплми сегментами.

Анализ гомологии CIRL с известными последовательностями в базе данных Entrez выявил наиболее близкие белки: антиген активации лейкоцитов CD97, EMR1 - EGF содержащий муцин-подобный рецептор, F4/80, поверхностный гликопротеин мышиных

макрофагов, и другие члены семейства рецептора секретина, являеющегося частью суперсемейства GPCR рецепторов. Предполагаемые трансмембранные сегменты CIRL существенно гомологичны (идентичность около 30% и сходство около 50-60%) трансмембранным сегментам других членов семейства рецептора секретина таких, как рецепторы секретина, кортиколиберина, калыщтонина, диуретического гормона, VIP, и др. Приблизительно 10% аминокислотных остатков в этих сегментах полностью идентичны у всех членов семейства.

;s; ..................... .........

< -л • .« >f. га л * г *>~»»-»or-nr.»тгг rv. »* >> ггм, * rv> ■"i';';'r«"v'SV'g',"r;'V'? vn »

; ..........

I:i!i^:':i;:i:!:ii:ТТПГГТП^ГГ;:ТТ \НШШАгТ:!i:::IB

Ч « V v?-» т i) IMrr\ V tlifc 14'f *П'/« -I44YV**, ■ ri 'Vy«-» * s i i t i *Vjr4'fVi ;' ¡"1 7ТГГГ «i'T W V : nrvtl ГГ

. Л . « h . « » r • •) ■ i t II « I * mir>t|i>4|!lMkt)|li . T«L.« ...r III^MIIKtl tlnitUMMUHlMl > u il >•

• '»J i* ^ ttnn on i tu - iTm ' у I n'Tli'nn nt'M>>»4T :,»„■< ' t»■»» t » ■,»« "

. ..»i *i • i t i ir.-iV.y, ч Г» »-»"Tv Cr,Tt iTfH.4UM(l.|j|^U .i.-'HIMI'r'I'iwi п—П £

* «*!'*«»' * »у» I' iffi?"' ::»!.'is у I llilvffilU.* r * г' г « 'h'^'н 'I»

> IkTITrrtlirfTf r'.T'l'l t"HVHr.14 П"". ПУУП^ТГ , «с—П т»ГЫТТ*1'1| »....UUMIHiunnj*'

si -ЩЩЩЭ...............ЕПЖ.^З- 2

Б: 5 ^©Ц.'пЗ®^;. К

•v; s |ПТ:1ГПТТПЫ;::;;;; I!!, .У! i;':!! i i i 1 !!! ¡¡ф JI: ГЙГГП'..'!: s

- '-'I'l't'.- ........................r»... ..-Л..Д1 H.v .. .......... .1 .П. »4 «."I »

? f • ПТПТТГТТ-Г^^ТГ^ i Л-П^^УПТ:} S

Г-ЩЕЖ :Г:ГЛ:^гt^M: • ^S

, . иЧ"1Т"гг|'7*''"О"1. «. i л'тг'-.т—чтгг-уп « ^го-'г^Т-vrrn ггч! vi 41 уг; гцлт—т «

«' г 1"!::' I-' v -и- - УIJ: t:: linlil-Kt^ s win;;.: "

Г,|j j1"1 itpl) "^"TT'"!j"TyjT"r't','¡¡[p' -iiij pГ::7;THT

41T v '.ii ГГТ i. r\' .k(, n vr-rv г; и-щнлгпи; r r kvt <n '<7\wsv тпг-тт- /rrrrrKTr—-p v«

i. "t гтттпттт lljj.- v itwi'vivrr nwi '.-vtu >t'"l хч-г

i».>m<h1vm, • ■ < « , |,'(М1-пЛ »«.V, (Tt -i I«. • » 4. д » • »т» мтммим^ a

* - jf.lv \ Н I» • * »*■ <;Hi4imin>tM* <.4*1v '..'j \Li_J

*д i д r —t-j'rrrcvr. v1 м i . t. w . mi . .m. лг,^ ^»¡гтту.i..u- wi1 »гтг^-гт»

innQ-II^-^^S'-ff'tSTTTT).....й.р.-'ТГГ.]^

■ ;; i:!:::;: i;;1:: ■'

j'tti-i !'п< >я'1t 'п '14't."iv 'дл.....о

. v Щ^^^^^Щ^ПЬЕВ"

Рис. 3. Полная аминокислотная последовательность белков семейства C1RL крысы.

Другие районы существенной гомологии включают предсказанные внеклеточные петли между трансмембранными сегментами I и П, Ш и IV, IV и V, и небольшую часть С-концевой цитоплазматической области. Два консервативных остатка цнстеина присутствуют во внеклеточных петлях между сегментами П и Ш, и между сегментами IV и V, являются типичными для в белок-сопряженных рецепторов и, как считается на основе структурных

исследований родопсина, формируют дисульфидами мост.

¿itËœa

В тгспотгамтф! «, мтпдаэдгш'ми

--------u—WHJVAiH

"(Hli.'i г

wi'-vr;

WJV/Л

-----------: I_lj :

Рис. 4. Множествешюе выравнивание фрагментов последовательности CIRL с членами семейства П(В) G белок-сопряженных рецепторов. Белки, гомологичные CIRL найдены в базе данных Entrez, используя программу BLASTP. Семь предположительных трансмембранных спиралей отмечены как ТМ 1-7 и отделены от смежных районов гомологии. Последовательность CIRL подчеркнута. Остатки, идентичные или подобные (K=R, E=D, L=I, Q=N) остаткам CIRL отмечены жирным шрифтом и заключены в рамки, ограничивающие районы гомологии. Сверху указаны остатки, сохраненные во всех последовательностях, * -гидрофобная аминокислота (F, I, L, M., Р, V, W), л - малая аминокислота (A, S, G, С), ~ -полярная аминокислота (С, D, Б, G, H, N, Q, S, Т, Y), + - положительно заряженная аминокислота (R, К), - - отрицательно заряженные аминокислоты (Е, D) и точка - остальные (нет гомологии, нет промежутка).

Помимо семи трансмембранных сегментов, компьютерный анализ последовательности белка СШЬ выявил множество других выраженных структурных доменов (Рис. 5). На основе

профиля гидрофобности и поиска гомологий, нами предложена структурная модель CIRL состоящая из трех главных районов: большой внеклеточной N-концевой области, трансмембрашюй области, которая включает в себя семь гидрофобных сегментов, являющихся отличительной чертой G-белок сопряженных рецепторов (GPCR), и внутриклеточной С-концевой области. На самом N-конце последовательности (остатки 4-22), CIRL содержит гидрофобный сегмент, который имеет характеристики, типичные для последовательности сигнального пептида секреции. Это свидетельствует о том, что N-концевая область CIRL расположена внсклсточно, что является типичным для GPCR. Прямым определением N-концевой последовательности субъединицы CIRL р120 было определено место отщепления сигнального пептида, находящееся к С-концу от G24.

Рис. 5. Доменная структура CIRL. Отмечены домены с гомологией к лектину (lectin-like) и олфактомедину (olfactomedin-like). STP домен - домен, слабо гомологичный муцину и обогащенный Ser, Thr и Pro (mucin-like). В цитоплазматическом С-конце рецептора отмечен пролин-богатый район. Стрелка на вершине рисунка указывает участок расщепления сигнального пептида. Обозначены цистеиновые остатки (SH).

Внутриклеточная С-концевая область CIRL (остатки 1100-1471) также является пеобычно большой по сравнепию с типичными представителями семейства GPCR. Она содержит пару вицпнальных остатков цпстеина, являющихся характерными участками пальмитилпрования GPCR, а также нескольких пролин-богатых кластеров. Помимо богатых пролином белков (таких как экстензин, богатый оксипролпном гликопротеип, коллаген, и т.д.), внутриклеточная С-концевая область не имеет существенной гомологии с известными белками. Единственное исключение составляют два других члена семейства CIRL - CIRL-2 и CIRL-3.

Напротив, несколько областей внеклеточной N-концевой области CIRL показывают существенную гомологию с различным рецепторами и нерецепторными белками. За последовательностью сигаалыюго пептида следует цистеин-богатый домен (остатки 30-120) гомологичный D-галактозид-специфичному лектину из яйца морского ежа (идентификатор GenBank Р22031) и растительной fi-галактозидазе (Z99708). Тот же домен присутствует в ортологе CIRL из С. elegans (Z54306). Следующий смежный домен (остатки 120-400) подобен олфактомедину (AF028740), главному структурному блоку внеклеточного матрикса обонятельного нейроэпителия и нескольких других гомологичных белков, включая семейство панкортина. Следующий структурный домен (остатки 400-470) обогащен остатками Ser, Tlir, и Pro и имеет слабую гомологию с муцином, белком клеточной адгезии и другими пролин-богатым белкам. Гомология необычно большой внеклеточной области CIRL с перечисленным выше белками свидетельствует о ее взаимодействии с гликопротеинами внеклеточного матрикса и/или цитоплазматических мембран соседних клеток. Таким образом, по структурным признакам, CIRL мог бы выполнять роль белка клеточной адгезии.

Область между остатками 541 и 800 имеет слабую гомологию с BAI-3 (АВ005299), другим большим орфановым GPCR, который, среди всех известных больших GPCR рецепторов, наиболее подобен членам семейства CIRL. Недавно обнаруженное семейство BAI (Brain-specific Angiogenesis Inhibitor) считается вовлеченным в регуляцию ангиогенеза опухолей, причем экспрессия BAI-1 регулируется белком р53.

Наконец, четыре остатка цистеина в С-концевой части внеклеточной области CIRL, расположенные по соседству с сайтом эндогешюго протеолиза CIRL, являются составной частью GPS домена, подробно описанного в разделе 8.

Вестерн-блот показал, что р120 субъедшшца имеет мозг-специфичное распределение в тканях, что соответствовало описанному в литературе наличию высокоаффшшых участков связывания латротоксина в мозгу, но не других тканях. Наличие клонов кДНК позволило провести анализ тканеспецифичного распределения всех трех рецепторов CIRL используя также Нозерн-блоты. Из семи проанализированных тканей крысы (мозг, печень, сердце, легкое, почка, селезенка, скелетная мышца и кишечник), с зондом на CIRL-1 только мРНК мозга давала специфично гибрвдизусмую полосу около 6 т.п.о. Распределение CIRL-3 было сходным - наибольшая концентрация его мРНК наблюдалась в мозгу, и лишь следовые количества обнаруживались в плаценте, сердце, поджелудочной железе, почках и яичках. CIRL-2, напротив, присутствовал практически во все анализируемых тканях, за исключением тимуса и лейкоцитов. Наибольшие концентрации CIRL-2 были найдены в плаценте, селезенке, яичниках, сердце, легких, почках и простате.

4. Экспрессия CIRL рецепторов в эукариотичсских клеточных линиях

Для доказательства того, что CIRL действительно является высоко-аффинным рецептором латротоксина, была осуществлена его экзогенная экспрессия в COS клетках, являющихся линией клеток не-нейронального происхождения. Анализ связывания мечешюго латротоксина в координатах Скетчарда (Рис. б) показал, что клетки, экспрсссирующие CIRL, связывают латротоксин с высокой аффишюстыо (Kd=0.1 нМ), что близко соответствовало аффинности кальций-независимых связывающих участков в мембранах мозга крысы (Kd=0.28 нМ).

Поскольку CIRL (CIRL-1) имеет два близких гомолога - CIRL-2 и CIRL-3, одновременно был проведен анализ латротоксин-связывающей активности COS клеток, трансфецированных двумя другими рецепторами. Анализ показал, что CIRL-2 является низко-аффинным рецептором латротоксина, со сродством примерно в 15 раз ниже, чем у CIRL-1 (Рис. б). Латротоксин-связывающей активности C1RL-3 обнаружить не удалось.

С помощью экзогенной экспрессии было также доказано, что предложенная трансмембршшая топология CIRL является правильной - р120 субъединица ориентирована наружу клетки, а С-конец р85 субъединицы находится внутри. COS клетки, трансфецированные CIRL окрашивали анти-р120 и анти-р85 антителами с пермсабилизацисй и без. Оба антитела равномерно окрашивали пермсабилизовашше клетки, экспрессирующие

СШЬ. Анги-р120 антитело давало хороший сигнал в гаггактных клетках, который становился еще сильнее при пермеабилизацни. В то же время, анти-р§5 антитело пе окрашивало интактные клетки, что свидетельствует о том, что его эгаггоп находится внутри клетки.

и. й

1.5

0.5

0.0 . 0.0 0.2

1.0

0.6 0.8 1.0

В, пМ

Рис. 6. Экспрессия рецепторов латротокешга в COS клетках, трансфецировашплх плазмидами, кодирующими CIRL-1 и CIRL-2.

5. Участки связывания латротоксина в CIRL и тирозин-фосфатазе сигма

Рекомбинатная N-концевая внеклеточная область CIRL способна связываться с иммобилизованным латротоксином. Поскольку данная область содержит набор разнообразных доменов, представляло интерес идентифицировать в рецепторе непосредственно участок связывания латротоксина. С этой целью был получен набор делецимшых мутантов внеклеточной области CIRL (Рис. 7 А).

Полученными плазмидами были трансфецированы COS клетки. Собствешю клетки, а также кондициошгыс среды были собраны и проанализированы на наличие рекомбинатных белков Вестерн-блотом с анти-р120 антителами. Из всех проанализировшшых конструкций, pCDR-120, pCDR7N, pSTR7-2,-6,-7 и-20 экспрессировались н секретировались в среду. Белки, кодируемые pSTR7-l,-3,-4,-5,-9, и-16 экспрессировались хорошо, но накапливались внутри клеток. Следует обратить внимание на то, что большинство секретировашплх белков имели N-концевые делеции, в то время как большинство несекретированных делеционных мутантов были укорочены с С-ко1ща. Данное наблюдение свидетельствует о том, что

внеклеточная область СПИ, содержит в ее С-концевой части последовательность, определяющую прохождение рецептора по секреторному транспортному пути.

А

Л,

. // // <■/// ш*

4 // ##

55-855 »—г.. ,->—■" I ■ '■ -гС^ЗипчpSTR7-Z

12s-8s5 irr 7-;-:---scz3' .................................[str7-b

185-856 H '■ ,.==>-<-aCZJ. 11 p3TR7-20

39^856 к-Ы Niiiimiimiiii ii livwQ pSTR7-7

487 856 B| . . ........... WO pSTR7-8

538-856 С.........■«»■■ дпд"» pSTR7-0

■167705 CCZZ3.......-..=3 pSTR7 16

25-770 —— ' -Ц^. — Jt___J=CT4:f.w».'.....м» pSTR7S

25-705 "—.."—1 - ^r1 -sT i. ымоя вы pSTR7-e

25-631 ="' „! "=»— ' - sa-g-pSTR7 3

J5 598 8-c;' 1 1 .■.■=т- ■ „,, 1 ■—<■ . ¿СШЗ=з PSTR71

Clone number

2 6

EL'EL

20 7 120,9

1£L LL LL bL

7N 5 4 3 1 16

EL t L liL Ь L EL £ L

194 120 87 6452 39

26 21

00

oO SO

oOe

О • ,

Рис. 7. Локализация латротоксин-связывающего участка в СШЬ. А. Структура рекомбинантт>к белков (подписаш>1 справа) показана с отмечешплми доменами. Номера слева

указывают границы делецпонных мутантов согласно аминокислотной последовательности CIRL. В. 1 мл кондиционной среды COS клеток, трансфецированных делеционными мутантами CIRL (конструкции pSTR7-2,-6,-7,-16,-20 и pCDR7N), либо сами клетки (pSTR7-1,-3,-4,-5 и -9), солюбилизпрованные 1 мл буфера с 2% Тритона Х-100, инкубировали с 10 мкл латротоксин-агарозы. Сорбенты элюировали и анализировали элюаты Вестерн-блотом с анти-р120 антителом (L). Параллельпо анализировались 2 мкл трансфецированных клеток для проверки экспрессии рекомбинантных белков (Е).

Для анализа латротоксин-связывающей активности рёкомбинатных белков проводили их сорбцию на латротоксин-сефарозе, с последующим Вестерн-блотом с анти-р120 антителами (Рис. 7В). Анализ показал, что сайт связывания латротоксина расположен в С-концевой половине р120 между остатками 467 и 837, причем один из важных центров взаимодействия находится в районе остатка 770, а лектиновЬш, олфактомединовый и STP (подобные муцину) домены в N-концевой половине р120 не участвуют в связывании латротоксина.

Интересно, что растворимые фрагменты CIRL в наномолярных концентрациях практически не ингибировали связывания меченного латротоксина с мембранными рецепторами. Таким образом, сродство латротоксина к растворимому р120 и его фрагментам существенно шоке, чем к полноразмерному рецептору. В то же время, мембрано-связанные формы укороченного CIRL связывали токсин с такой же высокой аффинностью, как и полноразмерный рецептор. Эти данные свидетельствовали о возможности участия р85 в связывании латротоксина.

Для определения роли р85 во взаимодействии с латротоксином были сконструированы два мутанта CIRL с удаленными частями р85 субъединицы путем введения стоп-кодонов. Первый мутант pCDR-7TMR не содержал большей части С~концевого цитоплазматического фрагмента р85. Во втором мутанте pCDR-lTMR был сохранен только один трансмембранный сегмент непосредственно присоединенный к N-концевой внеклеточной части CIRL. Оба делеционных мутанта экспрессированые в COS клетках связывали латротоксин с той же высокой аффшшостыо, что и рецептор дикого типа. Таким образом, внеклеточные петли и цитоплазматический фрагмент р85 не важны для стабилизации комплекса латротоксина с

р120. По всей видимости, высоко-аффшшое связывание латротоксина с CIRL основано на его взаимодействии с С-концевым участком р120 и дополтпчзльно стабилизируется за счет погружения токсина в мембрашгый бислой.

Локализация участка связыва!шя латротоксина в РТРа бьша проведена аналогичным образом. Известно, что внеклеточная часть РТРа может отщеплятся протеолитически и секретироватся в среду (Aicher et al., 1997). Это расщепление вторично по отношению к первичному внутриклеточному протеолизу, приводящему к образованшо стабильного двух-субъединичного комплекса РТРа. Анализ кондиционной среды COS клеток трансфсцированных РТРа показал, что растворимый отщепленный эктодомсн фосфатазы может связываться с латротоксин-агарозой.

Анализ связывания делеционных мутантов внеклеточной области РТРа с латротоксин-агарозой показал, что латротоксин-связывающий участок РТРа расположен между аминокислотными остатками 407 и 685 и включает в себя два фибронектшювых домена, но ни одного из иммуноглобулиновых повторов. Таким образом, участок связывания латротоксина в РТРа фундаментально отличается от сайта связывания в CIRL. 6. Функциональная экспрессия рецепторов в хромафинных клетках.

Латротоксин способен вызывать секрецию в хромафинных клетках при концентрациях превышающих 100 пМ. Радиолигандный анализ показал, что бычьи хромафинные клетки содержат приблизительно 60 фмоль/мг бежа рецепторов латротоксина (-13 % от уровня, найденного в мозгу), причем две трети специфического связывания является кальций-независимым. Мы предположили, что экзогенная экспрессия рецепторов латротоксина в хромафинных клетках увеличит у них число латротоксин-связывшощих участков и, таким образом, сделает их более чувствительными к стимулирующим эффектам латротоксина. Поскольку удается трансфецировать лишь небольшую часть клеток (3-5%), чтобы определить секрецшо только из фактически трансфецированных клеток, мы использовали ранее разработанный метод, основанный на ко-трансфекции кДНКа человеческого гормона роста (hGH) сопровождаемого определением количества секрстпрованного hGH. Транзиентно экспрессированый hGH накапливается в секреторных гранулах, и служит маркером регулируемой секреции из фракции трансфецированных клеток. При ко-трансфекции, по

крайней мере 90-95 % клеток, которые экспресснруют hGH также экспресснруют второй

анализируемый белок. А _

В

20-

10-

0-

1

10 100 1 (a-LTX), р(И

10 100 |«-LTX], рМ

Рие. 8. Экспрессия CIRL и его делеционных мутантов увеличивает чувствительность хромафинных клеток к активации латротоксином. Хромафшшыс клетки трансфецировали плазмидами pCDR7 (черные кружки), pCDR-7TMR (черные квадраты), pCDR-ITMR (пустые квадраты), pSTR7-8M (треугольники) или pCMVneo как контроль (пустые кружки) с фосфатно-кальциевым методом. Спустя пять дней клетки обрабатывали указанными концентрациями латротоксина в PSS без Са2+ или Mg2+ и с 0.2 мМ EGTA. Через 4 мин токсин был удален, и клетки инкубировали дополнительно 5 минут в PSS содержащем 2.2 мМ Са2+ и 0.5 мМ Mg2+. Количество секретируемого в среду hGH (группа А) и катехоламина (группа В) и их количество в клетках определяли люминисцентным и спектрофлуорометрическим анализами. Показано среднее и доверительный интервал четырех независимых измерений.

Как было установлено экспериментами выполненными совместно с Проф. Р. Хольцом и Д-ром М. Биттнер (University of Michigan School of Medicine, Ann Arbor, MI), дозовая зависимость латротоксин-стимулируемой секреции человеческого гормона роста в хромафинных клетках, трансфецировашнлх CIRL (рис. 8А) либо РТРа (рис. 9А), была смещена в сторону существенно более низких концентраций токсина по сравнению с контрольными клетками. Чтобы убедиться в жизнеспособности клеток и эффективности секреции, параллельно измерялся выброс катехоламинов (рис. 8В и 9В). Так как приблизительно 95 процентов всех клеток в препаратах не бьши реально трансфецированы, никакого существенного различия в секреции катехоламинов из CIRL или РТРа-трансфецировашшк клеток, по сравнению с трансфецированными контрольными клетками, не наблюдалось. Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что как CIRL, так и

РТРа не только являются латротоксин-связывающими белками, но и представляют собой независимые, фуныдаоналыю-компетенпые рецепторы латротоксина.

Для ответа на вопрос, необходима ли передача сигналов через СЖЬ или РТРа для стимулирующего эффекта латротоксина, мы трансфецировали хромафинные клетки мутантами рецепторов, в которых были удалены их цитоплазматические домены, осуществляющие передачу сигналов внутри клетки. Это были описашше выше конструкции СШЬ pCDR.-l.TMR, pCDR-7TMR и pCDR7-8, а также С-концевой делеционный мутант РТР, у которого были удалены его внутриклеточные каталитические фосфатазные домены, но сохранен трансмембранный сегмент. Каждая из трех конструкций СШЬ увеличивала чувствительность трансфецируемых клеток к низким концентрациям латротоксина (2.5 и 10 пМ), а величина эффекта была сравнима с СШЬ дикого типа (рис. 8А). Выброс катехоламина был подобен для всех плазмид (рис. 8В). Таким образом, С-концевая часть СГОЬ не является критической для стимуляции латротоксином секреции в хромафшшых клетках. Интересно, что при более высоких концентрациях латротоксина, отмечалось определещюе снижение секреторного ответа в случае СШЬ и pCDR7-8, которое отсутствовало для С-концевых делеционных мутантов 1TMR и 7ТМЯ, Следовательно, С-концевой цитонлазматический домен СШЬ может играть дополнительную роль в модуляции латротоксин-стимулируемой секреции.

с

о 1| Зя

11

« I

л

Iе

•я о^ « —

30

20Н

А иен о

6 я

□ пео о /

а

О 3 1-875

я 0

10 100 [а -1-ТХ] р!Ш

10 100 [а -1.ТХ] рМ

Рис. 9. Экспрессия РТРа и ее делеционных мутантов увеличивает чувствительность хромафшшых клеток к стимуляции латротоксином. Хромафинные клетки трансфецировали плазмидами, кодирующими 1ЮН в сочетании с СЖЬ (черные квадратики), либо РТРа (черные кружки), РТРз_1-875 (черггые кружки) и рСМУпео (белые квадратики). Спустя

четыре дня клетки инкубировали с указанными концентрациями латротоксина в РвБ в течение 6 мин. Количества 1ЮН (А) и катехоламина (В) секретируемые в среду и количества, остающиеся в клетках были определены, как указано в Рис. 8. Стимулируемую секрецию определяли как разность между секрецией в присутствии токсина и в его отсутствие. Показано среднее и доверительный интервал четырех независимых измерений.

Аналогично СШЬ, укороченный вариант РТРа без сигнальных доменов также поддерживал латротоксин-стимулируемый экзоцитоз в хромафинных клетках, причем лучше чем РТРа дикого типа (рис. 9А). Это можно объяснить либо более высокой поверхностной экспрессией делеционного мутанта не способного генерировать сигналы, либо клеточной токсичностью экзогенно экспрессированой РТРа дикого типа, которая имеет полную функциональную потентность. В любом случае, можно заключить, что стимулирующий эффект латротоксина в хромафинных клетках не зависит критически от передачи сигнала посредством РТРа.

7. Двух-субъедшшчная структура СГОЬ - нммунохммичсский и масс-спектрометрический анализ.

кДНК СШЬ была клонирована на основе частичных аминокислотных последовательностей р120 субьедшшцы СШЬ с молекулярной массой 120 кДа. Была найдена всего одна длшшая открытая рамка считывания, которая кодировала белок состоящий из 1471 аминокислотного остатка. Таким образом, предсказанный размер клонированного белка (около 162 кДа) был существенно больше, чем кажущийся размер очищенного белка 120 кДа. Анализ очищенного препарата пептидным картированием при помощи масс-спектрометрии выявил наличие пептидных фрагментов, покрывающих в общей сложности более чем 80% предсказанной аминокислотной последовательности белка. Однако, антитело против 18-членного пептида из С-концепого района не узнавало белок 120 кДа. В то же время, набшодалось интенсивное окрашивание данным антителом высокомолекулярных агрегатов (Рис. 10А). Для их разрушения в систему вВв-электрофореза по Лэмли была включена 8М мочевина. В такой измененной системе, С -ко]щевое антитело окрашивало полосу около 85 кДа в препарате очищешюго рецептора из мозговых мембранах и в исходных мембранах (Рис. 10А,В). Напротив, антитело против белка массой 120 кДа окрашивало только полосу данного

размера в тех же препаратах, по не окрашивало полосу с молекулярной массой S5 кДа (Рис. 10А,В). Таким образом, в препаратах рецептора и в исходных мембранах содержалось по меньшей мере два различных белковых компонента рецептора - р120 и р85.

Иммунопреципигация с использованием анти-р85 антитела выявила паппчие комплекса р120 с р85 (Рис. ЮС), а также возможность образования тройного комплекса с латротоксином (Рис. 6D). Таким образом, CIRL первоначально синтезируется в виде одной полипептидной цепи, которая далее подвергается протеолитическому расщеплению с образованием двух-субъединичного комплекса состоящего из N-концевого гликозилированного р!20 и С-концевого мембранного р85.

А

CIRL

RMU'ti - î - +

йя_ R œ> g3

Ijf —

rJ4 — а

■U'J—-

ass—

ÄTityPR trtK'IXl

В

Membranes

- + — + — +

sa — ; . is? —

м — ¡ta'

«.3 —- 1

'î

Hi_

"„S

¿03 -13? ■

«1 ■ •МЭ -

сэ

D

Ш

ira

S сэ I

£ о> t

й" ta »

§

<° m

Рис. 10. Двух-субъедшшчная структура CIRL. Очищенный CIRL (А) или мозговые мембраны (В) анализировали гель-электрофорезом с SDS в стандартной системе Леммли, либо с добавлением 8 М мочевины. Вестерн-блоты данных препаратов окрашивали анти-р85 или анти-р120 антителами. С. CIRL иммунопреципитировали из солюбилизата мембран мозга анти-р85 антителом, либо предиммушюй сывороткой и анализировали Вестерн-блотом с

антн-р120 антителом. О. Иммунопреципитацию солюбплизата мембран мозга анти-р85 антителом с добавленным радиоактивно-меченным латротоксином (столбец 1). Негативными контролями служили осаждение с предиммунной сывороткой (столбец 2), либо с иммунной сывороткой, но без сошобилизата мембран (столбец 3).

Определение Ы-концевой аминокислотной последовательности высоко очищеиного препарат СШЬ выявило наличие последовательности Т№АУЬМАНЯЕУ1. Данная последовательность начинается с остатка Там по предсказанной структуре белка. Таким образом, Твзз мог бы быть сайтом протеолиза рецептора. Расщепление в данном месте должно было бы привести к образованию двух фрагментов с молекулярными массами около 70 кДа (С-кощевого) и 93 кДа (Ы-ко1щевого). В таком случае, полоса р85 имела бы истишгую массу 70 кДа, а полоса р120 - 93 кДа. В случае р120, меньший предсказанный размер легко объяснить значительным гликозилированием данной субъединицы.

Местоположения участка расщепления было подтверждено масс-спектрометрией продуктов протеолиза. р85 слишком велик для точной идентификации С-концевого фрагмента протеолиза. Поэтому было получено два мутанта С1ИЦ которые должны были бы давать относительно малые С-концевые фрагменты после расщепления. Первый представлял собою всю И-концевую внеклеточную область СЖЬ соединенную с туе - эпитопом на С-конце. (рис. НА, в центре), представляющий растворимый секретировшшый белок. Вторая конструкция была химерой внеклеточной области СП\Ь с одним трансмембрашшш сегментом и цитоплазматическим фрагментом нейрексина 1« (75 аминокислотных остатков). По существу, это мембранный комплекс, подобный СШЬ, но с существенно меньшей "р85" субъединицей (рис. 11А, справа).

Полученные химерные белки выделяли аффшшой хроматографией на латротоксин-агарозе и далее анализировали масс-спектрометрией. В масс-спектре растворимого мутанта наблюдался выраженный пик с массой 3758.7 Да (М+Н+), соответствующий расчетной средней массе 3759.1 Да (М+Н+) пептида ТЫРАУЬМАБиОРЕСЯаЛЗЕЕОЬНЗАУОНННННН (рис. 11С). В случае мсмбранно-связанной химеры СШЬ-нейрексин главный пик (10,752.9 Да) также был отмечен в области, соответствующей ожидаемому продукту расщепления, начинающемуся с Тазк (рис. 11Е). Уширение пика можно объяснить частичным окислением белка по метионину

в результате очистки в присутствии Тритона Х-100, использовавшегося для солюбшшзации химерного белка.

А

Lccinhka doma'n

ЕЗМВ

fesfrw.-и- .- "iCys-rlch molil 01SR i n и»i. i LTX-btaHng domain ОИаяоткшШе domain | муымзбрИоро

STP domain

I Neurexin fragment

X

107 — ,18—О

89—

fie—

B

AnS-p120 AntUnyc

D

16? —

U.3 о

и —

с.

ссс.

20_

20—

% —

yyv

Рис. 11. Локализация участка расщепления СН1Ь. А. Доменная структура СЖЬ и С-концевых химер его внеклеточной области с мембранным доменом нейрексина и с тус-эпитопом. В.

28

Протеолитическос расщепление pl20/myc в COS клетках. Трансфецироват1ые клетки анализировали Вестерн-блотом с анти-р120 и анти-myc антителами непосредственно (Cell), либо после экстракции Тритоном Х-100 и очисткой на латротоксин-агарозе (Extr./LTX). Секретировашплй белок бьш выделен из кондиционной среды и проанализирован параллельно (CM/LTX). С. Масс-спектромстрический анализ продуктов расщепления р120/тус. Кондиционную среду COS клеток, трансфецированных р120/тус, хроматографировали на латротоксин-агарозе и анализировали MALDI-TOF. D. Протеолитическое расщепление химеры р120/нейрексин в COS клетках. Трансфецировашше клетки лизировали в буфере для образца с SDS и анализировали Вестерн-блотом с анти-нейрексин и анти-р120 антителами. Обозначены нерасщеплишый предшествешшк (черная стрелка) и два продукта расщепления, р120 (открытая стрелка) и фрагмент нейрексииа (серая стрелка). Е. Масс-спектрометрический анализ продуктов расщепления р120/нейрексина. COS клетки, трансфецированные р120/нейрексином экстрагировали Тритоном Х-100, хроматографировали на латротоксин-агарозе и анализировали MALDI-TOF.

Таким образом, данные, полученные масс-спектрометрией мутантов CIRL подтвердили, что протеолиз рецептора проходит с N-конца от Trjs, на расстоянии 19 остатков от предполагаемого первого трансмембранного сегмента CIRL. 8. GPS домен - сайт внутриклеточного протеолиза гибридных рецепторов.

Абсолютное большинство известных случаев внутриклеточного протеолиза рецептора проходит с участием фурин-подобных протеаз, которые расщепляют белковые цепи по кластерам основных остатков. Поскольку сайт расщепления CIRL SHLTNF очевидно отличался, мы попытались для идентификации расщепляющей протеазы не-фуринового типа провести поиск гомологичных последовательностей п других белках. Была использована последовательность участка расщепления CIRL CACSHLTNFAVL для поиска в базе дашштх Entrez с использованием алгоритма BLAST. В результате поиска были обнаружены гомологичные последовательности в ряде других GPCR рецепторах. Дальнейший более чувствительный поиск с использованием алгоритма V-BLAST выявил наличие в районе сайта расщепления CIRL белкового домена, состоящего из 60 остатков и содержащего ранее неописанный цистеин-богатый структурный мотив, встречающийся в ряде недавно

обнаруженных «сиротских» GPCR рецепторов (Рис. 12). Последовательности семи трансмембранных сегментов данных GPCR рецепторов были также гомологичны, и по своей структуре принадлежали семейству П(В), также именуемому семейством рецептора секретина. Таким образом, этот новый домен представляет собой восьмую область существенной гомологии, что является весьма необычным для GPCR рецепторов.

Cleavage site

gi# C--W--------------G-W---GC------------C-C-Hï—FAVLM CONSENSUS

2239297 CSFWNYSERSML------GYWSTQGCRLVESNK---THTTCACSHLTNFAVLM CIRL1 (RAT)

3766205 CSFWNYSERTMM------GYWSTQGCKLVDTNK---TRTTCACSHLTNFAILM CIRL2 (RAT)

3882981 CSFWSYSKRTMT------GYWSTQGCRLLTTNK---THTTCSCNHLTNFAVLM CIRL3 (RAT)

12313916 CSFWNYSERTMM------GYWSTQGCKLVDTNK---TRTTCACSHLTHFAILM LECTOMEDIN-1 (HUMAN)

7662324 CSFWNYSERSML------GYWSTQGCRLVESNK---THTTCACSHLTNFAVLM LECTOMEDIN-2 (HUMAN)

14149677 CSFWSYSKRTMT------GYWSTQGCRLLTTNK---THTTCSCNHLTNFAVLM LECTOMEDIN-3 (HUMAN)

14423362 CAFWNYSVDAMNN-----GXWSTEGCELTHSND---THTSCRCSHLTHFAILM ETL1 (MOUSE)

11560111 CAFWNYSVDDMNN-----GSWSSEGCELTYSND---THTSCRCSHLTHFAILM ETL (RAT)

11545908 CAFWNYSPDTMN------GSWSSEGCELTÏSNE---THTSCRCNHLTHFAILM ETL (HUMAN)

753408 CVFWNHSLDTGGT-----GGWSAKGCELLSRNR---THVTCQCSHSASCAVLM G-TYPE RECEPTOR (MOUSE)

4469185 CVFWNHSLAVGGT-----GGHSARGCELLSRNR---THVACQCSHTASFAVLM ORF (HUMAN)

2935597 CVFWEHGQN-GC------GHWATTGCSTIGTRD---TMTSCDCTHLTHFAVLM GPCR (C.ELEGANS)

2495072 CVSWSTDVK-G-------GRWTSFGCVILEASE---TYTICSCNQMANLAVIM EMR1 (HUMAN)

7305025 CVFWEHGQN-GC------GHWATTGCSTIGTRD---TSTICRCTHLSSFAVLM EMR2 (HUMAN)

13183149 CVYWKSTGQ-G-------SQWSRDGCFLIHVNK---SHTMCNCSHLSSFAVLM EMR3 (MOUSE)

15528829 CVHWEGSEE-G-------GSWSTKGCSHVYTNN---SYTICKCFHLSSFAVLM EMR4 (MOUSE)

5031733 CVFWDLGRNGGR------GGWSDNGCSVKDRRL---NETICTCSHLTSFGVLL HE-6 (HUMAN)

15638633 CAFWKHDGSNG-------GHWATSGCRXLGNGN---DSTTCQCNHLSSFAILV CD97 antigen (SUS SCROFA)

6226566 CAFWKSDSDRG-------GHWATEVCQVLGSKN---GSTTCQCSHLSSFTILM CD97 (HUMAN)

61223769 CVSWNTDVED--------GRWTPSGCEIVEASE---THTVCSCNRMANLAIIM F4/80 (MOUSE)

9256531 CVFWVEDPA-SSST----GSWSSAGCETVSRD----TQTSCLCNHLTYFAVLM SERPENTINE RECEPTOR (MOUSE)

5031725 CVFWVEDPTLSSP-----GHWSSAGCETVRRE----TQTSCFCNHLTYFAVLM GPCR-56 (HUMAN)

10719900 CILWDETDVPSSSAPPQLGPWSWRGCRTVPLDA---LRTRCLCDRLSTFAILA BAI1 (HUMAN)

10719903 CASWDYSRADASS-----GDWDTENCQTLETQA---AHTRCQCQHLSTFAVLA BAI2 (HUMAN)

12643618 CVLWDDSKTNESL-----GTWSTQGCKTVLTDA---SHTKCLCDRLSTFAILA BAI3 (HUMAN)

1665821 CVFWNHSILV-SGT----GGWSARGCEWFRNE---SHVSCQCNHMTSFAVLM ORF (HUMAN)

6468391 CVFWNFRLANNT------GGWDSSGCÏVEEGDG---DNVTCICDHLTSFSILM KXAA 0758 (HUMAN)

3449298 CVQWDPPGLAEQH-----GVWTARDCELVHRKG---SHARCRCSRTGTFGVLM MEGF2 (HUMAN)

6681360 CVFWNHSILV-SGT----GGWSARGCEWFRNE---SHVSCQCNHMTSFAVLM MEGF3 (RAT)

13786140 CVQWDPPGPADQH-----GMHTARDCELVHRNG---SHARCRCSRTGTFGVLM RECEPTOR 3 (RAT)

5525078 CVFWNFSLANNT------GGWDSSGCTVEDDGRDNRDRVFCKCNHLTSFSILM IG-HEPTA (RAT)

9663052 CSWWDTED----------MKWSTSGCSLQSHNS---THTVCACSHMTHFAVLM 110-R (H. CONTORTUS)

7304025 CVFWNYID----------HAWSANGCSLESTNR---THSVCSCNHLTNFAILM ORF (DROSOPHILA)

7494834 CVYWDLME----------SKWSTLGCTLIATSS---NSSQCSCTHLTSFAILM ORF (C.ELEGANS)

16549885 CVFWDFSH----------LQWNDAGCHLVNETQ---DIVTCQCTHLTSFSILM ORF (HUMAN)

11359914 CAFLDFSS—GE------GVWSNHGCALTRGHL---TÏSVCRCTHLTNFAILM ORF (HUMAN)

19882213 CLLWNQAAAS--------WLSDSQFCKVIEETA---DYVECACSHMSVYAVYA VLGR-1 (HUMAN)

1353653 CNFWNEDQ----------QEWDSTGCKVGPLSK—PSTTHCLCNHLTGFFGSS REJ ( STRONGYLOCENTROTUS )

5832705 CVRWNSFT----------NRWTRLGCQTEIPDF«QAILVNCSCTHISSYAVIV FMI (DROSOPHILA)

2627436 CQYFSESE----------KQWRTDGMVPLAETN--ASRAVCRTRHLTAFAAGL PKD1 (TAKIFUGU RUBRIPES)

1176908 CYFYQKTS----------DVFNSEGMYPSDGQG—MQFVNCSTDnLTMFSVGA ZK945.9 (C.ELEGANS)

1586345 CQYFSEED----------MVWRTEGLLPLEETS—PRQAVCLTRHLTAFGASL POLYCYSTIN (HUMAN)

7499172 CVRFDEKS----------GTWTARGAALIGLNL---THAACEYNSIGVFTMFV ORF (C.ELEGANS)

•DGDFNPAAQ

Рис. 12. Множествешюе выравшнзшше GPS доменов в гомологичных GPCR рецепторах. В левой колонке указан идентификатор последовательности по базе данных Genbank. В верхней строчке указан примерный консенсус данного мотива. В отделенной нижней части выравнивания приведены GPS-нодобные домены в рецепторах, не являющихся GPCR.

Интересно, что по крайней мере для семи данных рецепторов, а именно, CD97, CIRL-2, CIRL-3, ETL, Фламинго, VLGR-1, IgHepta и EMR4, было установлено, что они также состоят из двух субъедшшц, кодируемых одним геном, что предполагает посттрансляциошгый протеолитический процессинг подобно CIRL. Логично предположить, что участок расщепления, найдсшолй в CIRL и присутствующий в других гомологичных GPCR рецепторах из семейства рецептора секретина, определяет их протеолиз и двух-субъединичную структуру. В связи с этим, мы предложили обозначение GPS (QPCR Eroteolysis Site) для данного мотива.

Во всех гомологичных GPCR рецепторах, GPS домен расположен в С-концевой части внеклеточной области рецепторов, непосредственно примыкающей к первому трансмембрашюму сегменту. Множествешюе выравнивание GPS доменов разных рецепторов (Рис. 12) выявило наличие следующих полностью консервативных остатков: четыре цистеина, включая мотив СХС, и два триптофана. В других положениях предпочтительно находятся малые, гидрофобные, либо ароматические остатки. В частности, короткий кластер гидрофобных остатков найден в С-конце мотива, после сайта расщепления. Самое простое описание GPS мотива - CX2WX6.16WX4CX10.22CXC.

Множественное выравнивание GPS доменов свидетельствует о том, что остатки, непосредственно окружающие сайт расщепления, варьируют. N-концевой остаток сайта расщепления, как правило, не заряжен и не является ароматическим, в то время как С-ко1щевой остаток малого размера и гидрофильный. Чтобы оценить вероятность того, что весь GPS домен может играть роль сайта протеолиза в CIRL, мы сконструировали три мутанта CIRL с точечными заменами аминокислотных остатков в районе протеолиза. В первом мутанте остаток Тезе, С-концевой в месте расщепления, был заменен на Р. Во втором Сем, который является одшш из двух соседних цистеинов вблизи от сайта протеолиза, был заменен на W. В третьем Wris, весьма отдаленный от участка расщепления, но высоко сохраненный в области GPS, был замещен на S.

Три мутанта, а также CIRL дикого типа экспрессировали в COS клетках и далее анализировали Вестерн-блотом с анти-р120 и анти-р85 антителами. Клетки, трансфецированные как рецептором дикого типа, так и его точечными мутантами в GPS домене экспрессировали сравнимые количества рецептора. Однако, в отличие от CIRL дикого

типа, признаков эндогенного протеолиза мутантов не было выявлено. Мы дополнительно проверили, не могли ли данные точечные мутации привести к катастрофическим нарушениям в укладке рецептора. Для этого была проанализирована латротоксин-связывающая активность экспресснрованых рецепторов. При анализе взаимодействия солюбилизированных рецепторов с латротокешюм иммунопрсципитацией токенн-рецепторных комплексов с анти-р85 антителами, была подтверждена полная функциональная активность как CIRL дикого типа, так и его мутантов. Таким образом, мутации не только непосредственно сайта расщепления, но и консервативных остатков GPS домена, нарушают его эндогенный протеолиз, что служит подтверждением ключевой роль GPS мотива в протеолизе CIRL. 9. GPS семейство больших гибридных семнстолбовых рецепторов.

ClRtl CIRL-3 ВАИ BAI-2 0087 EMR1 EMR4 CtRL-a ВЛ1-3

радо НИ QPiTW Fml

ttO-R EU-VfcSRI

© GPS Qlfactomedin domain 1 lg-like domain RQD

0 Lamlnln A domains 0 CIRL-3 N-terminal domain A EGF repeats

о Cadherin ropoate о Thrombospondin repeats ва Integrin-like domain

1—~ ] Lectin domain tn STP-rich domain ' 0 Pentraxln-like domain

Рис. 13. Семейство больших гибридных семнстолбовых рецепторов - доменная структура.

Наличие GPS домена, восьмого сегмепта гомологии, определяет новое семейство гибридных GPCR рецепторов с белками клеточной адгезии (Рис. 13). Согласно нашей гипотезе о роли GPS домена, как определяющего структурного элемента эндогенного протеолитического процессинга, все данные рецепторы должны состоять из двух гетерологичных субъединиц, образующих прочный нековалентный комплекс. Последние литературные данные говорят о том, что данное положение справедливо для всех подробно

изученных GPS рецепторов. В настоящее врет не известен ни один пример, опровергавший бы данное положение.

В отличие от млекопитающих, несущих около тридцати GPS рецепторов, в геноме дрозофилы и нематоды присутствует всего лишь по два гена, кодирующих длинные гибридные рецепторы с GPS доменом. В расшифрованных геномах бактерий и дрожжей генов GPS-содсржащих рецепторов нами обнаружено не было. По всей видимости, GPS рецепторы играют роль в регуляции межклеточных контактов и, таким образом, характерны для многоклеточных.

10. Внутриклеточная локализация протеолитического процессинга CIRL.

Для выяснения физиологического значения протеолиза CIRL представлялось интересным определение отдела клетки, в котором происходит протеолитический лроцессинг рецептора. С этой целыо были проанализированы параллельно расщепление и гликозилирование экзогенно экспрессированого рецептора CIRL, а также его нерасщспляемого мутанта методом «пульс-чейз».

А_ Wild type CIRL В Таяд/Р mutant of CIRL

104— 110— i 04— вг~ 51 — 0 min 30 min öOmln iso min в 3 e f to 5%PAG О min 30 min ÖOfTlItl 150 mm 1 D» Я

3 1 'S 2 § 2 ш S ' ; й £ a | u. X 1 s « s z fi ? 5 Iii 1 s 1 2 £ S | IL X • i 1 2 ID S 1 P § « g £ fi | U. I £ (5 S Q Z с 2 l3

трщ^ппи' ... ■ • -1 • ^ и ы ы ы L, и Li1 T Г' H ""i' . r • jHU' •U i-i • : Г Г • .. t

8% PAG 184— 1 M- 64- 62- 51 _

Рис. 14. Пульс-чейз анализ экспрессии CIRL, внутриклеточного расщепления и гликозилирования. COS клетки трансфецировали плазмидами кодирующими CIRL (А) или его нерасщепляемый TWP мутант (В). Пульс инициировали добавлением "^-меченных аминокислот в течение 30 минут. В обозначенные интервалы времени (чейз), клетки лизировали и иммунопреципитировали с анти-р85 антителами. Преципитаты обрабатывали PNGa30H F (PNGF) или эндогликозидазой Н (endo Н) и анализировали электрофорезом с последующей авторадиографией. В качестве контроля использовалась преципитация с

предиммупной сывороткой (background). Сплошными стрелками указаны белки предшественники CIRL, прозрачными - р120 субъединида.

Известно, что за внутриклеточным транспортом белков можно следить, анализируя степень их глнкозилирования специфичными глшсозидазами. В частности, PNGase F удаляет большинство N-связанных сахарных цепей, в то время как эндоглнкозидаза Н эффективно отщепляет только углеводы, добавленные в эндоплазматическом ретикулуме, но не затрагивает сложных углеводных цепей, синтезируемых в аппарате Гольджи. Электрофореткческий анализ продуктов экспрессии CIRL, меченных пульсом радиоактивных аминокислот (рис. 14А), показал, что его гликозилировашшй предшественник (полоса 180 кДа) расщепляется протеазой достаточно рано с образованием предшественника р120 (полоса 105 кДа), который может быть дегликозилирован обеими гликозидазами. Начиная с 30 мин точки, р120 гликозилируется дополнительно (полоса 120 кДа), и зрелый белок становится частично устойчив к эндогликозидазе Н, что указывает на его нахождение в аппарате Гольджи. Зрелый р120 становится частично устойчивым также и к PNGase F, что можно объяснить обширным О-гликозилированием в его серин, треонин и пролин-богатом муцин-подобном домене. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что протеолитическая обработка CIRL проходит параллельно с ранним гликозилированием в эндоплазматическом ретикулуме и существенно предшествует этапу синтеза сложных сахарных цепей, устойчивых к эндогликозидазе Н, в аппарате Гольджи.

Подобный «пульс-чейз» эксперимент был проведен также с Твза/Р мутантом. Как ожидалось, протеолитическго расщепления мутанта обнаружено не было. В остальных аспектах, процесс гликозилировашш этого мутанта не отличался существенно от CIRL дикого типа. В частности, наблюдалось конечное присоединение углеводов (рис. 14В, отмечено звездочкой), и этот продукт был частично устойчив к эндогликозидазе. Таким образом, внутриклеточный транспорт мутанта был по существу подобен транспорту протеолизируемого CIRL дикого типа вплоть до последней стадии, когда рецепторы выходят на поверхность цитоплазматической мембраны. 10. Нейрексофилин - эндогенный лиганд нейрекснна.

Анализ частичной аминокислотной последовательности белка молекулярной массы 29,000 Да показал, что он является ранее неизвестным белком. Поскольку данный белок образовывал устойчивый комплекс с нейрексином и в таком виде выделялся на колонке с иммобилизованным латротоксином, мы предложили назвать его нейрексофшшном.

Для клошфования кДНК нейрексофилина была использована определенная нами длинная (15 аминокислотных остатков) пептидная последовательность из бычьего нейрексофилина. В результате гибридизации библиотеки кДНК из мозга быка с 32Р-мече1шым продуктом ПЦР были найдены четыре положительных клона, один из которых (pD7) содержал полноразмерную кодирующую часть кДНК. Затем был проведен скрининг библиотеки кДНК из мозга крысы с использованием зонда на основе фрагмента кодирующей части бычьей кДНК. Были выделены три положительных клона, один из которых содержал полную кодирующую часть (pD14).

А

В M-HbRPbS'LWreGLbQLLFC D SEKVVHATEGIJDtJEDKD&TG----TLVGN-W 48

R ios

В HSRXI-Ml¿UiFVKQSPVPKPGIUAYADSMENFHDHljJ®52EVQEPlAMraRPX 102

R VKTGKFKKMFGWGDFHSHIKCTKLNLLITGKIVDHGHOTFSV^FRHMSSGQGOTS 16-1

В VKTGKFKKMFGWGDFIJSNIKTVKI^rXITGKrraHGa^FSVyFRHJJSTGLGtaB 157

R VSLVPPralvEFDW^Í5MsKSní'mEYQcfeMK^l|á^DPSK^!V 219

В VSLVPPSKWEFEVSPQSTLETKESKSnígRIEYEKTDRRKKTAI^IÍFDPSKlpy 212

r qkq'rqshvswléskpfkvíeiyisfysídyklvqkvcpdvnyhsdtpyfpsg 271

В QEQTQSHVSWl|jSKPnWltílYIAFYSVOYKIiVQOTgPDYfIYHSETPYLSSG 264

Slgnal CHO

Papuda V Y Y С CC И С

.. рятам .........................................[:•:•

RAKR

Рис. 15. Структура нейрексофилина. А. Выравнивание полных аминокислотных последовательностей нейрексофилина крысы (Я) и быка (В). Звездочками отмечены

различающиеся аминокислотные остатки. Одной полосой подчеркнуты потециальные сайты N-гликозилирования. Двойной полосой подчеркнут копсенсус узнавания фурип-иодобных протеаз - место эндогенного протеолпза нейрексофилина. Остатки цистеина выделепы штрихованным фоном. В. Доменная структура нейрексофилина.

кДНК нейрексофилина крысы и быка кодируют белки, состоящие из 274 и 267 аминокислотных остатков, соответственно (Рис. 15А). Поиск гомолопш в банках данных ДНК и белковых последовательностей не выявили сходства с известными белками. Выравнивание последовательностей нейрексофилина крысы и быка показало, что у них нет гомолопш в их N-концевой части, но при этом наблюдается высокое сходство в центральной и С-кощевой части. Анализ профиля гидрофобности показал, что нейрексофилины содержат единственную гидрофобную последовательность, расположенную в их N-концевой части. Эта последовательность недостаточно длинна, чтобы представлять собой трансмембранный сегмент, но имеет характерные признаки сигнальной пептидной последовательности, определяющей внеклеточную локализацию белков. Компьютерный анализ N-концевых последовательностей нейрексофилинов с использованием алгоритма нахождения сигнальной последовательности предсказал участки отщепления сигнальных пептидов после остатка 21 (крыса) и 20, либо 22 (бык). Последовательности нейрексофилина содержат четыре консенсуса N-гликозилирования. Характерным признаком нейрексофилина является наличие в С-концевой части шести остатков цистеина. В центральной части нейрексофилина находится короткая последовательность из основных аминокислот, содержащая мотив RXKR, являющийся консенсусом узнавания фурин-нодобных эндопептидаз, осуществляющих эндогашый процессипг предшественников гормонов и рецепторов.

Доменная модель нейрексофилинов (Рис. 15В) свидетельствует о том, что они являются гормон-подобными растворимыми секретируемыми белками, так как, при наличии сигнальной пептидной последовательности, не содержат трансмембранную область. Об этом также свидетельствует присутствие неконсервативных N-концевых доменов, сопровождаемых консервативными С-концевыми районами. Они напоминают структуру нейропептидов (например, NGF) в котором неконсервативпые области являются частью пропептидов, которые отщепляются в процессе созревания секретируемых молекул. Наличие консенсуса узнавания эндопептидазы на границе между вариабельной и консервативной

последовательностями (RXKR) свидетельствует о возможности эндогенного процессинга, приводящему к расщеплению но данному сайту. Возможность процессинга также подтверждалась анализом N-концевой последовательности бычьего нейрексофилина, в результате которого была получена смесь двух последовательностей, начинающихся с остатков 100 и 103 выведенной последовательности нейрексофилина.

Для экспериментального подтверждения того, что нейрексофилин является N-гликозилированным белком, очищенный рецептор латротоксина обработали N-гликопептидазой F (PNGase F), которая избирательно отщепляет N-связанные углеводы от белковых цепей гликопротеинов. В результате такой обработки наблюдалось заметное уменьшение в кажущемся размере нейрексофилина - от 29 до 19 кДа, свидетельствующее о высокой степени N-гликозтгарования природного нейрексофилина.

Для подтверждения того, что клонированная нами кДНК нейрексофилина действительно кодирует белок, связывающийся с нейрексином, мы проанализировали взаимодействие двух рекомбинантных белков между собой. Для этого был использован химерный белок GST-нейрексофилин полученный экспрессией в бактериях и выделенный хроматографией на глутатион-агарозе. В составе дагаюго химерного белка находилась последовательность зрелого нейрексофилина с присоединенной с N-конца глутатион S-трансферазой. В качестве рекомбинантного нейрексина использовался химерный белок N-концевого внеклеточного домена нейрексина 1а с Fc-фрагментом человеческого иммуноглобулина G на С-конце. Данную химеру получали экспрессией в COS клетках в виде секретируемого растворимого белка и очищали адсорбцией на белок А-агарозе. Специфичное осаждение GST-нейрексофилина на сорбенте с иммобилизованным IgG-нейрексином 1а продемонстрировало взаимодействие рекомбинантных нейрексофилина и нейрексина. Таким образом, секретируемый гормон-подобный белок нейрексофилин связывается с внеклеточным доменом нейрексина, что позволяет предположить, что нейрексин является не только акцептором экзогенного лиганда латротоксина, но и физиологическим рецептором нейрексофилина.

11. Взаимодействие рецепторов с синантотагмином и синтакснном.

Сравнение частичных аминокислотных последовательностей белков, выделенных аффинной хроматографией на иммобилизоватюм латротоксине в присутствии кальция, с

базой данных позволило установить, что полипептид 65 кДа является идентичным сннаптотагмипу - мембранному белку синоптических пузырьков. Идентификация белка 65 кДа как сннаптотагмина была подтверждена иммуноблопшгом со специфичными антителами, предоставленными Проф. Т. Зюдофом.

Чтобы установить, взаимодействует ли синаптотагмин с рецепторами латротоксина или непосредственно с самим токсином, бьи проделан следующий эксперимент. Солюбилизат мембранных белков синаптических везикул наносили в присутствии Са2* на латротокешювую колонку после предварительного нанесения сошобилизированных мембран из мозга быка и промывки градиентом соли, удаляющей синаптотагмин (на данной колонке находились адсорбнровашше рецепторы латротоксина без слабо связанных ассоциированных бежов, в частности, сннаптотагмина). Анализ Вестерн-блотом показал, что синаптотагмин присутствовал только в элюатах с колоши, содержащей предварительно нанесенный рецептор, и отсутствовал в элюатах с латротоксиновой колонки без рецептора и других контрольных колонок. Более того, анализ элюированных белков электрофорезом с окрашиванием серебром показал, что синаптотагмин является основным белковым компонентом фракций элюции данной колошей солевым градиентом. Таким образом, удалось очистить синаптотагмин одностадийной аффинной хроматографией на рецепторе латротоксина, адсорбированном на иммобилизованном латротоксине, что свидетельствует о высокой специфичности его взаимодействия с рецепторами латротоксина.

Дальнейшие исследования в дашюм направлении, проведешше совместно с Д-ром 10. Хатой и Проф. Т. Зюдофом, позволили установить, что синаптотагмин в частности взаимодействует с С-концевой частью нейрексина, кальций-зависимого рецептора латротоксина.

Мы также проанализировали, может ли синаптотагмин (а также другие пресинаптические белки) выделяться совместно с кальций-независимыми рецепторами латротоксина. Для этого была проведена аффинная хроматография сошобилизированных мембран мозга на латротоксин-агарозе в присутствии БОТА. В этих условиях только кальций-независимые рецепторы латротоксина сорбировались на колонке. После продолжительной нромывки буфером с физиологической концентрацией солей, аффинная колонка была элюирована ступенькой буфера с 1,5М соли. Иммуноблотинг элюата набором

пресинантических антител (против синаптоташина, сшггаксшт, синаптофизина, SNAP-25, сшгапстт, ИаЬЗЛ, синаптобревинов I и II, и Мипс-18/п5ес1) выявил наличие синаптоташина и сшггаксина, но не других белков, в частности синаптофизина, мажорного компонента мембран синаптических пузырьков (рис. 16А).

А В

■>14,- с 1л"° "

ш— 1 А<Ы -

Ы - сп ед

4*-- ^ |<1М -

- СУ С' О

л а* , |

<1

-

& —

<4 * -

©9 й ©@ ..8© I о "

Е}СЭ* се» ©О

•М-ЧТ, иЛЭ'^Рг»

Рис. 16. Взаимодействие калыщй-независимых рецепторов латротоксина с синтаксином А. Совместное выделение синтаксина и синаптотагмина с кальций-независимыми рецепторами латротоксина на аффинной колонке с латротоксин-агарозой. Мембраны мозга крысы в количестве 35 мкг или аффинно-очищенный препарат кальций-независимых рецепторов латротоксина в количестве 0.15 мкг анализировали Вестерн-блотом с антителами против синтаксина (апЧ-БТх), синаптотагмина (anti-STg) и синаптофизина (ап^-БРИ). В. Иммунопреципитация латротоксин-связывающей активности. Комплекс 1251-латротоксина с рецепторами из солюбшшзата мозговых мембран иммунопреципитировали антителами против

39

р120 субъедшшцы CIRL (anti-pl20) либо антителами к сшггаксипу (черные столбцы), а также предиммунной сывороткой или нормальными иммуноглобулинами мыши (серые столбцы). В дополнительных контрольных экспериментах солюбилизат мембран исключали (белые столбцы). С. Иммунопреципитация комплекса синтакспна с CIRL. Солюбилизат мозга крысы иммунопрецшштнровали антителом против р85 субъедшшцы CIRL (дорожки 3) или предиммунной сывороткой (дорожки 2) и анализировали электрофорезом с последующим Вестерн-блотом. В качестве положительного контроля использовали 5 мкг солюбнлизнрованного мозгового белка (дорожки 1). Блоты окрашивали антителами против синтаксина, синаптотагмина и синаптофизина. Звездочками отмечены тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов кролика, дающие неспецифическое окрашивание.

Для проверки специфичности взаимодействия CIRL с синтаксином, была проанализирована способность антител против синтаксина иммупопреципитировать кальций-независимую латротоксин-связывающую активность из солюбилизата мембран мозга. Анализ показал, что антитела против синтаксина осаждали существенно больше меченного латротоксина по сравнению с контролями, что свидетельствовало о существовании комплексов кальций-независимых рецепторов латротоксина с синтаксином (Рис. 16В).

В дополнительном эксперименте анти-р85 антитела были проверены па способность ко-преципитировать синтаксин вместе с CIRL из солюбилизата мембран мозга. В соответствии с результатами предыдущих экспериментов, синтаксин был обнаружен в составе комплекса с CIRL, преципитированного иммушгыми антителами, но не предиммунной сывороткой (Рис. 16С), причем это взаимодействие не разрушалось промывкой сорбента буферами с 0,5М соли.

Таким образом, синтаксин и синаптотагмин выделяются совместно с рецепторами латротоксина, что позволяет предположить о существовании пресипаптических комплексов, частью которых являются данные рецепторы. Синаптотагмин, мембранный кальций- и лшшд-связывающий белок спнаптических везикул, является наиболее вероятным кандидатом на роль кальциевого сенсора, контролирующего выброс нейромедиаторов в нервных окончаниях. Синтаксин, один из так называемых SNARE рецепторов, является частью белкового комплекса, играющего ключевую роль в слиянии мембран цитоплазмы н синаптических

везикул. Более того, известно, что синтаксин и синаптотагмшг способны образовывать кальций-зависимые комплексы. Взаимодейстпие данных белков с рецепторами латротоксина -нейротоксина, вызывающего массовый экзоцитоз синаптических везикул в нервных окончаниях - свидетельствует о том, что рецепторы латротоксина функционально сопряжены с экзоцитотическим аппаратом и могут служить как непосредственными регуляторами выброса нсйромсдиаторов, так и факторами, определяющими архитектуру пресинаптичсских комплексов.

выводы

1. Разработана оригинальная методика и осуществлено выделение нейрональных рецепторов пресинаптического нейротокснна латротоксина. Открыты два ранее неизвестных белка: нейрексии и СШЬ (£а1сшт-1ш1ереп(1еп1 £есер!ог of ЬаЬЭДохш), являющиеся высокоаффиннымц рецепторами латротоксина. Впервые показано, что ранее известный белок тирозин-фосфатаза сигма (РТРа) также является рецептором латротоксина. Таким образом, латротоксин является уникальным примером природного токсина, имеющего три независимые и структурно отличные мишени, принадлежащие к трем различным классам рецепторов поверхности клетки.

2. Осуществлено клонирование полноразмерной кДНК рецептора СШЬ, определена ее нуклеотидная последовательность и выведена полная аминокислотная последовательность рецептора СШЬ из мозга крысы, состоящая из 1471 остатка.

3. Показано, что СШЬ принадлежит к семейству Н(В) в белок-сопряженных рецепторов. В составе большой внеклеточной части СШЬ обнаружены структурные домены, характерные для белков клеточной адгезии: лектшювый, олфактомединовый и муциновый. Таким образом, СШЬ является представителем ранее неизученного класса природных гибридов в белок-сопряжешплх рецепторов и белков клеточной адгезии.

4. Клонированы кДНК и определены полные аминокислотные последовательности двух других рецепторов, высоко гомологичных СШЬ - СШЬ-2 и СШЬ-З. Показано, что СШЬ (СШЬ-1) и СШЬ-З экспрессируются преимущественно в нервной ткани, в то время как СШЬ-2 присутствует практически во всех тканях.

5. Осуществлена экспрессия СШЬ в эукариотических клеточных линиях и хромафинных клетках. Анализом трапсфецированпых клеток доказано, что клонированный СШЬ действительно является высокоаффтшым рецептором латротоксина, в то время как СШЬ-2 -низкоаффинным рецептором латротоксина. Функциональная экспрессия данных рецепторов в хромафинных клетках подтвердила, что взаимодействие с ними латротоксина приводит к стимуляции экзоцитоза.

6. Определено местоположение основного участка связывания латротоксина в районе 467-770 аминокислотных остатков И-концевой внеклеточной части СШЬ.

7. Установлено, что CIRL состоит' из двух нековалентно связанных субъединиц - р120 и р85, кодируемых одним геном. Показано, что двухсубъединичная структура CTRL является следствием эндогенного внутриклеточного протеолиза рецептора.

8. Определен участок протеолитического расщепления CIRL, находящийся в его внеклеточной части между остатками Leus37 и ТЪгкз». Компьютерным анализом показано, что данный сайт протеолиза находится внутри цистеин- и триптофан-богатого домена с ранее неизвестным структурным мотивом CX2WX6-16WX4CX10.22CXC, получившим наименование GPS (ü protcin-couplcd receptor Eroteolysis Sile). Мутации в GPS домене приводят к устойчивости CIRL к протеолизу. Предложена гипотеза, что наличие GPS домена является ключевым фактором, определяющим эндогенный протеолиз и двух-субъединичную структуру гибридных G белок-сопряженных/адгезивных рецепторов.

9. Открыт новый секретируемый гликопротеин пейрексофилин, способный образовывать комплексы с нейрексином, и определена его полная аминокислотная последовательность по структуре кДНК крысы и быка. Структурные особенности нейрексофшшна свидетельствуют о том, что он является эндогенным лигандом нейрексшш.

10. Обнаружено взаимодействие рецепторов латротоксина с синаптотагмином и сшгеаксшюм, указывающее на то, что рецепторы латротоксина являются компонентами пресинаптических комплексов вовлеченных в экзоцитоз.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Petrenko AG. Kovalenko VA, Shamotienko OG, Surkova IN, Tarasyuk ТА, Ushkaryov YuA, Ovchiimikov YuA. Isolation and properties of the a-latrotoxin receptor. Neurochem. Int. 1988, v,13s, p.159.

2. А.Г. ТТетренко. И.Н. Суркова, О.Г. Шамотненко, В.А. Коваленко, В.Н. Красноперов, JI.A. Третьяков, Ю.А. Ушкарев, Б.В. Гришин. Исследование рецептора нейротоксппа паука каракурта. I. Характеристика мембраносвязанного исолюбилизированного рецептора из мозга быка. Биоорганическая химия, 1990, т.1б, с.149-157.

3. А.Г. Петренко. О.Г. Шамотненко, И.Н. Суркова, В.А. Коваленко, Е.В. Гришин. Исследование рецептора нейротоксина паука каракурта. П. Выделение и характеристика рецептора из мембран мозга быка. Биоорганическая химия, 1990, т.1б, с.158-165.

4. Petrenko AG. Kovalenko VA, Shamotienko OG, Surkova IN, Tarasyuk ТА, Ushkaryov YuA , Grishin EV. Isolation and properties of the a-latrotoxin receptor. EMBO Journal 1990;9:2023-2027.

5. Petrenko AG. Perin MS, Davletov BA, Ushkaryov YA, Geppert M, Sudhof TC. Binding of synaptotagmin to the a-latrotoxin receptor implicates both in synaptic vesicle exocytosis. Nature 1991;353:65-68.

6. Ushkaryov YA, Petrenko AG. Geppert M, Sudhof TC. Neuiexins: synaptic cell surface proteins related to the a-latrotoxin receptor and laminin. Science 1992;257:50-56.

7. Geppert M, Ushkaryov YuA, Hata Y, Davletov B, Petrenko AG. Sudhof TC. Neurcxins (1992) in: Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, SL 483-490.

8. Brose N, Petrenko AG. Sudhof TC, Jahn R. Synaptotagmin: a calcium sensor on the synaptic vesicle surface. Science 1992;256:1021-1025.

9. Davletov B, Sontag JM, Hata Y, Petrenko AG. Fykse EM, Jahn R, Sudhof TC. Phosphorylation of synaptotagmin I by casein kinase П. J Biol Chem 1993;268:6816-6822.

10. Petrenko AO. a-Latrotoxin receptor implications in nerve terminal function FEBS Lett 1993, 325;81-85.

10. Hata Y, Davletov B, Petrenko AO. Jahn R, Sudhof TC. Interaction of synaptotagmin with the cytoplasmic domains of neurexins. Neuron 1993;10:307-315.

11. Sudhof TC, Petrenko AOT Whittaker VP, Jahn R. Molecular approaches to synaptic vesicle

exocytosis (1993) in: Progress in Brain Research, 2S, 235-240.

12. Peirenko AG. Lazaryeva VD, Geppert M, Tarasyuk TA, Moomaw C, Khokhlatchev AV, Ushkaryov YA, Slaughter C, Nasimov IV, Sudhof TC. Polypeptide composition of the a-latrotoxin receptor. High affinity binding protein consists of a family of related high molecular weight polypeptides complexed to a low molecular weight protein. J Biol Chem 1993;268:1860-1867.

13. Davlctov BA, Krasnoperov V, Hata Y, Petrenko AG. Sudhof TC. High affinity binding of a-latrotoxin to recombinant neurexin la. J Biol Chem 1995;270:23903-23905.

14. Petrenko AG. Ullrich B, Missler M, Krasnoperov V, Rosahl TV/, Sudhof TC. Structure and evolution of neurcxophilin. J Neurosci 1996;16:4360-4369.

15. Krasnoperov VG, Beavis R, Chepurny OG, Little AR, Plotnikov AN, Petrenko AG. The calcium-independent receptor of a-latrotoxin is not a neurexin. Biochem Biophys Res Commun 1996;227:868-875.

16. Krasnoperov VG, Bittner MA, Beavis R, Kuang Y, Salnikow KV, Chepumy OG, Little AR, Plotnikov AN, Wu D, Holz RW, Petrenko AG. a-Latrotoxin stimulates exocytosis by the interaction with a neuronal G-protein-coupled receptor. Neuron. 1997;18:925-937.

17. Geppert M, Khvotchcv M, Krasnoperov V, Goda Y, Missler M, Hammer RE, Ichtchenko K, Petrenko AG, Sudhof TC. Neurexin la is a major a-latrotoxin receptor that cooperates in a-latrotoxin action. J Biol Chem 1998;273:1705-1710.

18. Petrenko AG, Krasnoperov VG. a-Latrotoxin receptors, in: Molecular and Cellular Mechanisms of Toxin Action, Vol. 2, Secretory Systems and Toxins, M. Linial and A. Grasso, eds., Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 1998,185-212.

19. Bittner MA, Krasnoperov VG, Stuenkel EL, Petrenko AG. Holz RW. A Ca2+-independent receptor for a-latrotoxin, CIRL, mediates effects on secretion via multiple mechanisms. J Neurosci 1998;18:2914-2922.

20. Krasnoperov V, Bittner MA, Holz RW, Chepurny O, Petrenko AG. Structural requirements for a-latrotoxin binding and a-latrotoxin-stimulated secretion. A study with calcium-independent receptor of a-latrotoxin (CIRL) deletion mutants. J Biol Chem 1999;274:3590-3596.

21. Ichtchenko K, Bittner MA, Krasnoperov V, Little AR, Chepurny O, Holz RW, Petrenko AG. A novel ubiquitously expressed a-latrotoxin receptor is a member of the CIRL family of G proteincoupled receptors. J Biol Chem 1999;274:5491-5498.

22. Hlubek MD, Stuenkel EL, Krasnoperov VG, Petrenko AG. Holz RW. Calcium-independent receptor for a-latrotoxin and neurexin la facilitate toxin-induccd channel formation: evidence that channel formation results from tethering of toxin to membrane. Mol Pharmacol 2000;57:519-528.

23. Krasnoperov V, Bittner MA, Mo W, Buryanovsky L, Neubert TA, Holz RW, Ichtchenko K, Petrenko AG. Protein tyrosine phosphatase sigma is a novel member of the functional family of a-latrotoxin receptors. J Biol Chem 2002 277^5887-35895.

24. Krasnoperov V, Bittner MA, Mo W, Buryanovsky L, Neubert TA, Holz RW, Ichtchenko K, Petrenko AG. Post-translational proteolytic processing of CIRL, a natural chimera of cell adhesion protein and G protein-coupled receptor;. The role of the GPS motif. J Biol Chem 2002 277;46518-46526.

25. A.G. Petrenko, V.N. Krasnoperov. Nucleic acids encoding a calcium-independent receptor of a-latrotoxin, characterization and uses thereof. US Patent US 6,630,345 B2,2003, Oct 7.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус.

www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел. 939-3338 Заказ № 69 тираж 100 экз. Подписано в печать 08.10.2004 г.

РНБ Русский фонд

2007-4 17021

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1 Семейство семистолбовых рецепторов с GPS доменом и модулями клеточной адгезии — гибридные рецепторы нового типа.

1.1.1. EGF-содержащие гибридные рецепторы иммунной системы.

1.1.2. Кальций-независимые рецепторы латротоксина CIRL.

1.1.3. Рецепторы Flamingo.

1.1.4. Мозговые рецепторы BAI.

1.Ь5— Другие гибридные рецепторы.

1.2. Особенности субъединичной структуры гибридных рецепторов.

1.2.1. Протеолитичеслий процессинг гибридных рецепторов.

1.2.2. GPS-подобные домены в других рецепторах.

2. Результаты и их обсуждение.

2.1. Функциональное семейство рецепторов латротоксина: нейрексины,

CIRL рецепторы и тирозин-фосфатаза сигма.

2.1.1. Выделение рецепторов латротоксина и сопутствующих белков.

2.1.2. Идентификация рецепторных и сопутствующих белков.

2.1.3. Клонирование и доменная структура рецепторов латротоксина.

2.1.4. Экспрессия рецепторов в эукариотических клеточных линиях.

2.1.5. Определение участков связывания латротоксина в рецепторах.

2.1.5.1. Участок связывания CIRL.

2.1.5.2. Участок связывания тирозин-фосфатазы сигма.

2.1.6. Идентификация комплексов латротоксина с рецепторами в мембрнах мозга.

2.1.7. Функциональная экспрессия рецепторов в хромафинных клетках.

2.1.8. Нейрексофилин - эндогенный лиганд нейрексина.

2.1.9. Взаимодействие рецепторов с синаптотагмином и синтаксином.

2.2. Структурные особенности CIRL рецепторов.

2.2.1. Двух-субъединичная структура CIRL - иммунохимический и масс- спектрометрический анализ.

2.2.2. GPS домен - сайт внутриклеточного протеолиза гибридных рецепторов.

2.2.3. Внутриклеточная локализация первичного протеолиза CIRL.

2.2.4. Растворимая форма CIRL рецепторов.

2.2.5. Внеклеточный протеолиз рецепторов и его регуляция.

2.2.6. Модель биосинтеза и протеолитического процессинга CIRL рецепторов.

3. Экспериментальная часть.

4. Список сокращений.

5. Выводы.

6. Благодарности.

Функционирование нервной системы определяется высоко организованным взаимодействием нервных клеток, образующих развитую сеть межклеточных синаптических контактов. Синапсы служат для направленной, тонко регулируемой передачи сигналов от одной клетки к другой. Направленность передачи сигнала — обеспечивается существованием специальных надмолекулярных структур в месте синаптического контакта - пресинаптического аппарата, обеспечивающего выброс нейромедиатора путем экзоцитоза синаптических пузырьков на одной клетке и постсинаптических рецепторных комплексов на другой клетке. Образование и исчезновение синаптических контактов является регулируемым процессом, обеспечивающим организацию сложных сетей передачи и обработки сигналов в мозгу.

Детальное понимание механизмов синаптической передачи и синаптогенеза требует идентификации и характеристики молекулярных компонентов синапса. Несмотря на прогресс, достигнутый в этой области в течение последних лет, многие молекулы, важные для функционирования синапсов, остаются неизвестными, либо мало изученными. В наибольшей степени данное относится к пресинаптическому аппарату, который осуществляет сложные процессы регулируемого транспорта синаптических пузырьков и их слияние с клеточной мембраной.

Методические сложности изучения молекулярных механизмов выброса нейромедиаторов определяются тем, что в отличие от других биологических процессов таких как, например, ферментативные реакции или трансмембранный транспорт ионов, реконструкция функционального пресинаптического аппарата in vitro остается крайне сложной и в настоящее время неосуществленной задачей. Выделение белковых компонентов пресинапса на основе легко определяемой биохимической характеристики не представляется возможным. В связи с этим, исследователями синаптической передачи были использованы непрямые подходы для идентификации пресинаптических белков, такие как анализ случайных и направленных мутаций в различных организмах, выделение и систематический анализ белковых компонентов синаптических пузырьков, использование пресинаптических нейротоксинов и пр.

На сегодняшний день, наши знания о структуре пресинаптического аппарата ограничиваются коротким и, очевидно, неполным списком белков, которые предположительно участвуют в процессе выброса нейромедиаторов. Вышеизложенное позволяет заключить, что идентификация и структурно-функциональное исследование пресинаптических белков является актуальной проблемой современной физико-химической биологии.

Основной целью настоящей работы явилась идентификация, структурная и биохимическая характеристика ранее неизвестных белковых компонентов пресинаптического аппарата.

В качестве ключевого методического подхода к решению данной задачи было выбрано использование природного нейротоксина альфа-латротоксина (далее -латротоксина) в качестве инструмента исследования. Латротоксин является пресинаптическим токсином, вызывающим массовый выброс нейромедиатора путем стимуляции экзоцитоза синаптических везикул (Ceccarelli and Hurlbut, 1980; Gorio et al., 1978; Tzeng et al., 1978; Tzeng and Siekevitz, 1978; Tzeng and Siekevitz, 1979a; Tzeng and Siekevitz, 1979b). Латротоксин стимулирует выброс различных нейромедиаторов, в том числе ацетилхолина, глютамата, ГАМК и др. Более того, латротоксин стимулирует экзоцитоз в секреторных клетках, таких как хромафинные и панкреатические клетки (Bittner and Holz, 2000; Bittner et al., 1998; Lang et al., 1998).

Многочисленные исследования указывают на то, что действие латротоксина определяется наличием специфических белков на поверхности клетки, с которыми токсин связывается с высокой аффинностью в наномолярном диапазоне. За данными белками исторически утвердилось наименование «рецепторы латротоксина» (Meldolesi, 1982), хотя, поскольку латротоксин не является физиологическим эндогенным лигандом данных мембранных белков, правильнее было бы их именовать «акцепторами латротоксина».

В результате связывания токсина с мембранными рецепторами, его молекулы частично погружаются в мембрану и образуют катион-селективные поры, что объясняет большинство эффектов латроксина на клетку, включая стимуляцию секреции и цитотоксичность (Grasso et al., 1980; Krasil'nikov et al., 1982; Mironov et al., 1986; Orlova et al., 2000; Robello, 1989; Tse and Tse, 1999). В то же время ряд экспериментов указывает на то, что действие латротоксина возможно в условиях, когда ионные потоки контролируются и повышения кальция внутри клетки не наблюдается (Capogna et al., 1996; Meldolesi et al., 1983; Misler and Falke, 1987; Rosenthal et al., 1990). В частности было предложено, что латротоксин частично проходит через цитоплазматическую мембрану и за счет внутриклеточных взаимодействий активирует гипотетический эффектор, сопряженный с аппаратом экзоцитоза (Khvotchev and Sudhof, 2000).

Несмотря на то, что детальный механизм действия латротоксина остается предметом дискуссии, не вызывает сомнений тот факт, что его рецепторы, присутствующие в нервных тканях в относительно низких концентрациях, являются маркерами зон экзоцитоза и вовлечены в регуляцию нейросекреции. Этим определяется интерес к рецепторам латротоксина и интенсивные исследования в различных лабораториях мира, направленные на их идентификацию и структурно-функциональную характеристику (Rosenthal and Meldolesi, 1989).

Начальные эксперименты по характеристике рецепторов латротоксина показали, что они обратимо связывают латротоксин с высокой аффинностью (Кд порядка Ю~10 М"1), имеют белковую природу и сконцентрированы в зонах пресинаптических контактов (Grasso et al., 1982; Meldolesi, 1982; Tzeng and Siekevitz, 1979b; Ushkarev Iu and Grishin, 1986; Valtorta et al., 1984). Также было показано, что количество латротоксин-связывающих участков уменьшается примерно в два раза при удалении кальция из внешней среды хелатированием (Meldolesi, 1982).

В середине 80-х годов прошлого столетия была предложена методика солюбилизации рецепторов латротоксина неионными детергентами, в частности тритоном Х-100. Солюбилизация сохраняла латротоксин-связывающие свойства рецепторов и открывала возможность для их выделения хроматографическими методами. Первая попытка выделения рецепторов латротоксина завершилась идентификацией мультимерного комплекса массой 200 кДа, состоящего из субъединиц массой 54 и 66 кДа (Scheer and Meldolesi, 1985). Однако, поскольку количество выделенного белка находилось на грани детекции, достоверность идентификации рецепторов вызывала сомнение.

На первом этапе данной работы была поставлена задача вьщеления рецепторов латротоксина и их первичная характеристика белковым электрофорезом. При этом учитывалось, что возможно также со-выделение белков, не являющихся непосредственно рецепторами токсина, но специфически взаимодействующих с ними, а также примесных белков, не имеющих отношения к рецепторам.

В связи с этим, на втором этапе работы планировалось идентифицировать выделенные белки по их аминокислотной последовательности, получить антитела к ним и определить их роль в рецепции латротоксина. Ключевой задачей на этом этапе стало клонирование структурных генов ранее неизвестных белков, определение их нуклеотидной последовательности, и функциональная экспрессия в эукариотических клетках.

Целью следующего этапа исследования стало определение мембранной топологии и доменной структуры найденных рецепторов путем компьютерного анализа их аминокислотной последовательности в сочетании с иммунохимическим анализом. Также была поставлена задача определения участков связывания латротоксина в полипептидных цепях рецепторов.

В ходе данной работы был открыт рецептор, являющийся представителем нового семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии. Было показано, что данный рецептор, кодируемый одним геном, состоит из двух субъединиц. В связи с этим, была поставлена отдельная задача по детальному изучению механизмов эндогенного протеолиза данного рецептора с целью определения участка расщепления и локализации клеточного отдела протеолитического процессинга.

В процессе исследования нами была разработана оригинальная методика и осуществлено выделение рецепторов латротоксина и ассоциированных с ними белков аффинной хроматографией. Впервые установлено, что латротоксин имеет три типа белковых рецепторов в нервных тканях: нейрексин или кальций-зависимый рецептор, CIRL (Calcium-Independent Receptor of Latrotoxin - кальций-независимый рецептор латротоксина), являющиеся ранее неизвестными белками, и тирозин-фосфатазу сигма РТР а. Интересно, что рецепторы латротоксина не имеют между собой заметной структурной гомологии и принадлежат к трем различным классам рецепторов поверхности клетки. Нейрексин является белком клеточной адгезии с одним трансмембранным сегментом, CIRL - G белок-сопряженным рецептором, а РТРа - мембранной тирозин-фосфатазой.

На основе информации о частичной аминокислотной последовательности осуществлено клонирование полноразмерной кДНК рецептора CIRL. По определенной нуклеотидной последовательности выведена аминокислотная последовательность состоящая из 1471 остатка. Клонированы также два близких гомолога CIRL - CIRL-2 и CIRL-3. Показано, что CIRL-1 и CIRL-3 экспрессируются преимущественно в нервной ткани, в то время как CIRL-2 встречается практически во всех тканях. Установлено, что рецепторы CIRL принадлежат семейству 11(B) G-белок-сопряженных рецепторов. В составе большой внеклеточной части CIRL идентифицированы домены характерные для белков клеточной адгезии: лектиновый, олфактомединовый и муциновый. Таким образом, CIRL является представителем нового семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии.

Экспрессией CIRL и РТРо в эукариотических клеточных линиях и хромафинных клетках доказано, что клонированные CIRL и РТРа являются функционально-активными рецепторами латротоксина. Направленным мутагенезом определено расположение основных участков связывания латротоксина в CIRL и РТРо.

Впервые установлено, что CIRL, кодируемый одним геном, состоит из двух различных нековалентно связанных субъединиц - р120 и р85, что необычно для G-белок-сопряженных рецепторов. Обнаружена растворимая форма CIRL, представляющая собой комплекс внеклеточной субъединицы р120 и короткого пептидного N-концевого фрагмента р85. Показано, что двухсубъединичная структура CIRL является следствием эндогенного внутриклеточного протеолиза и определен сайт расщепления рецептора.

Установлено, что сайт протеолиза находится внутри цистеин- и триптофан-богатого домена содержащего ранее неизвестный структурный мотив, характерный для семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии. Поскольку мутации в этом домене приводят к устойчивости CIRL к расщеплению, предложено присвоить данному мотиву наименование GPS (G protein-coupled receptor Proteolysis Site).

Полученные нами результаты имеют не только научное, но и прикладное значение. Основная масса широко используемых в настоящее время лекарств, в качестве мишеней, используют G белок-сопряженные рецепторы. Поэтому, каждый вновь открытый G белок-сопряженный рецептор представляет собой потенциальный объект для создания новых лекарств. Структурный и предварительный функциональный анализ CIRL позволяет предположить, что химические соединения, являющиеся его агонистами либо антагонистами, могут быть использованы для лечения неврологических и психических заболеваний, сопровождающихся нарушениями нейросекреции. Также возможно, что модуляция активности членов семейства рецепторов CERL позволит контролировать рост злокачественных опухолей. В связи с потенциальной практической значимостью рецептора CIRL на его открытие был получен патент.

140 ВЫВОДЫ

1. Разработана оригинальная методика и осуществлено выделение нейрональных рецепторов пресинаптического нейротоксина латротоксина. Открыты два ранее неизвестных белка: нейрексин и CIRL (Calcium-Independent Receptor of Latrotoxin), являющиеся высокоаффинными рецепторами латротоксина. Впервые показано, что ранее известный белок тирозин-фосфатаза сигма (РТРо) также является рецептором латротоксина. Таким образом, латротоксин является уникальным примером природного токсина, имеющего три независимые и структурно отличные мишени, принадлежащие к трем различным классам рецепторов поверхности клетки.

2. Осуществлено клонирование полноразмерной кДНК рецептора CIRL, определена ее нуклеотидная последовательность и выведена полная аминокислотная последовательность рецептора CIRL из мозга крысы, состоящая из 1471 остатка.

3. Показано, что CIRL принадлежит к семейству 11(B) G белок-сопряженных рецепторов. В составе большой внеклеточной части CIRL обнаружены структурные домены, характерные для белков клеточной адгезии: лектиновый, олфактомединовый и муциновый. Таким образом, CIRL является представителем ранее неизученного класса природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии.

4. Клонированы кДНК и определены полные аминокислотные последовательности двух других рецепторов, высоко гомологичных CIRL - CIRL-2 и CIRL-3. Показано, что CIRL (CIRL-1) и CIRL-3 экспрессируются преимущественно в нервной ткани, в то время как CIRL-2 присутствует практически во всех тканях.

5. Осуществлена экспрессия CIRL в эукариотических клеточных линиях и хромафинных клетках. Анализом трансфецированных клеток доказано, что клонированный CIRL действительно является высокоаффинным рецептором латротоксина, в то время как CIRL-2 - низкоаффинным рецептором латротоксина. Функциональная экспрессия данных рецепторов в хромафинных клетках подтвердила, что взаимодействие с ними латротоксина приводит к стимуляции экзоцитоза.

6. Определено местоположение основного участка связывания латротоксина в районе 467770 аминокислотных остатков N-концевой внеклеточной части CIRL.

7. Установлено, что CIRL состоит из двух нековалентно связанных субъединиц - р120 и р85, кодируемых одним геном. Показано, что двухсубъединичная структура CIRL является следствием эндогенного внутриклеточного протеолиза рецептора.

8. Определен участок протеолитического расщепления CIRL, находящийся в его внеклеточной части между остатками Leug37 и ТЬгюв. Компьютерным анализом показано, что данный сайт протеолиза находится внутри цистеин- и триптофан-богатого домена с ранее неизвестным структурным мотивом CX2WX6-16WX4CX10-22CXC, получившим наименование GPS (Q protein-coupled receptor Eroteolysis Site). Мутации в GPS домене приводят к устойчивости CIRL к протеолизу. Предложена гипотеза, что наличие GPS домена является ключевым фактором, определяющим эндогенный протеолиз и двух-субъединичную структуру гибридных G белок-сопряженных/адгезивных рецепторов.

9. Открыт новый секретируемый гликопротеин нейрексофилин, способный образовывать комплексы с нейрексином, и определена его полная аминокислотная последовательность по структуре кДНК крысы и быка. Структурные особенности нейрексофилина свидетельствуют о том, что он является эндогенным лигандом нейрексина.

10. Обнаружено взаимодействие рецепторов латротоксина с синаптотагмином и синтаксином, указывающее на то, что рецепторы латротоксина являются компонентами пресинаптических комплексов вовлеченных в экзоцитоз.

БЛАГОДАРНОСТИ

Осуществлению намеченных планов и завершению работы над диссертацией во многом способствовали плодотворные дискуссии с академиками РАН Вадимом Тихоновичем Ивановым и Анатолием Ивановичем Мирошниковым, членами Национальной Академии США Томасом Зюдофом и Йосифом Шлессенджером, а также с членами-корреспондентами РАН Евгением Васильевичем Гришиным и Александром Габйбовичем Габибовым, за что автор им искренне признателен.

Автор считает своим приятным долгом поблагодарить коллег и друзей, совместно с которыми были получены экспериментальные результаты, составившие основу данной работы: Валерия Красноперова, Константина Ищенко, Виктора Коваленко, Юрия Ушкарева и Олега Чепурного

Работа выполнялась при поддержке Программы по Физико-Химической Биологии РАН, Национальных Институтов Здоровья (США) и Медицинского Института Говарда Хьюза (США).

1. Abe, J., Fukuzawa, Т., and Hirose, S. (2002). Cleavage of Ig-Hepta at a "SEA" module and at a conserved G protein-coupled receptor proteolytic site. J Biol Chem 277,23391-23398.

2. Aicher, В., Lerch, M. M., Muller, Т., Schilling, J., and Ullrich, A. (1997). Cellular redistribution of protein tyrosine phosphatases LAR and PTPsigma by inducible proteolytic processing. J Cell Biol 138,681-696.

3. Aust, G., Eichler, W., Laue, S., Lehmann, I., Heldin, N. E., Lotz, O., Scherbaum, W. A., Dralle, H., and Hoang-Vu, C. (1997). CD97: a dedifferentiation marker in human thyroid carcinomas. Cancer Res 57,1798-1806.

4. Aust, G., Steinert, M., Schutz, A., Boltze, C., Wahlbuhl, M., Hamann, J., and Wobus, M. (2002). CD97, but not its closely related EGF-TM7 family member EMR2, is expressed on gastric, pancreatic, and esophageal carcinomas. Am J Clin Pathol 118,699-707.

5. Bin Sun, H., Ruan, Y., Xu, Z. C., and Yokota, H. (2002). Involvement of the calcium-independent receptor for alpha-latrotoxin in brain ischemia. Brain Res Mol Brain Res 104,246249.

6. Bittner, M. A., and Holz, R. W. (2000). Latrotoxin stimulates secretion in penneabilized cells by regulating an intracellular Ca2+ and ATP-dependent event: a role for protein kinase C. J Biol Chem 275,25351-25357.

7. Bittner, M. A., Krasnoperov, V. G., Stuenkel, E. L., Petrenko, A. G., and Holz, R. W. (1998). A Ca2+-independent receptor for alpha-latrotoxin, CIRL, mediates effects on secretion via multiple mechanisms. J Neurosci 18,2914-2922.

8. Capogna, M., Gahwiler, В. H., and Thompson, S. M. (1996). Calcium-independent actions of alpha-latrotoxin on spontaneous and evoked synaptic transmission in the hippocampus. J Neurophysiol 76, 3149-3158.

9. Ceccarelli, В., and Hurlbut, W. P. (1980). Ca2+-dependent recycling of synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol 87,297-303.

10. Das, G., Reynolds-Kenneally, J., and Mlodzik, M. (2002). The atypical cadherin Flamingo links Frizzled and Notch signaling in planar polarity establishment in the Drosophila eye. Dev Cell 2, 655-666.

11. Davletov, B. A., Shamotienko, O. G., Lelianova, V. G., Grishin, E. V., and Ushkaiyov, Y. A. (1996). Isolation and biochemical characterization of a Ca2+-independent alpha-latrotoxin-binding protein. J Biol Chem 271,23239-23245.

12. Eichler, W. (2000). CD97 isoform expression in leukocytes. J Leukoc Biol 68, 561-567.

13. Eichler, W., Hamann, J., and Aust, G. (1997). Expression characteristics of the human CD97 antigen. Tissue Antigens 50,429-438.

14. Fanto, M., and McNeill, H. (2004). Planar polarity from flies to vertebrates. J Cell Sci 117, 527533.

15. Formstone, C. J., and Little, P. F. (2001). The flamingo-related mouse Celsr family (Celsrl-3) genes exhibit distinct patterns of expression during embryonic development. Mech Dev 109, 9194.

16. Fredriksson, R., Gloriam, D. E., Hoglund, P. J., Lagerstrom, M. C., and Schioth, H. B. (2003). There exist at least 30 human G-protein-coupled receptors with long Ser/Thr-rich N-termini. Biochem Biophys Res Commun 301,725-734.

17. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Hoglund, P. J., and Schioth, H. B. (2002). Novel human G protein-coupled receptors with long N-terminals containing GPS domains and Ser/Thr-rich regions. FEBS Lett 531,407-414.

18. Fujiwara, Т., Mammoto, A., Kim, Y., and Takai, Y. (2000). Rho small G-protein-dependent binding of mDia to an Src homology 3 domain-containing IRSp53/BAIAP2. Biochem Biophys Res Commun 271,626-629.

19. Gao, F. В., Brenman, J. E., Jan, L. Y., and Jan, Y. N. (1999). Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev 13,2549-2561.

20. Gao, F. В., Kohwi, M., Brenman, J. E., Jan, L. Y., and Jan, Y. N. (2000). Control of dendritic field formation in Drosophila: the roles of flamingo and competition between homologous neurons. Neuron 28,91-101.

21. Gorio, A., Rubin, L. L., and Mauro, A. (1978). Double mode of action of black widow spider venom on frog neuromuscular junction. J Neurocytol 7,193-202.

22. Grasso, A., Alema, S., Rufini, S., and Senni, M. I. (1980). Black widow spider toxin-induced calcium fluxes and transmitter release in a neurosecretory cell line. Nature 283,774-776.

23. Grasso, A., Pelliccia, M., and Alema, S. (1982). Characterization of alpha-latrotoxin interaction with rat brain synaptosomes and PC12 cells. Toxicon 20,149-156.

24. Hamann, J., Hartmann, E., and van Lier, R. A. (1996a). Structure of the human CD97 gene: exon shuffling has generated a new type of seven-span transmembrane molecule related to the secretin receptor superfamily. Genomics 32,144-147.

25. Hamann, J., van Zeventer, C., Bijl, A., Molenaar, C., Tesselaar, K., and van Lier, R. A. (2000). Molecular cloning and characterization of mouse CD97. Int Immunol 12,439-448.

26. Hamann, J., Vogel, В., van Schijndel, G. M., and van Lier, R. A. (1996b). The seven-span transmembrane receptor CD97 has a cellular ligand (CD55, DAF). J Exp Med 184,1185-1189.

27. Hamann, J., Wishaupt, J. O., van Lier, R. A., Smeets, T. J., Breedveld, F. C., and Так, P. P. (1999). Expression of the activation antigen CD97 and its ligand CD55 in rheumatoid synovial tissue. Arthritis Rheum 42,650-658.

28. Jaspars, L. H., Vos, W., Aust, G., Van Lier, R. A., and Hamann, J. (2001). Tissue distribution of the human CD97 EGF-TM7 receptor. Tissue Antigens 57,325-331.

29. Kaur, В., Brat, D. J., Calkins, С. C., and Van Meir, E. G. (2003). Brain angiogenesis inhibitor 1 is differentially expressed in normal brain and glioblastoma independently of p53 expression. Am J Pathol 162,19-27.

30. Khvotchev, M., and Sudhof, Т. C. (2000). alpha-latrotoxin triggers transmitter release via direct insertion into the presynaptic plasma membrane. Embo J19, 3250-3262.

31. Kierszenbaum, A. L. (2004). Polycystics: what polycystic kidney disease tells us about sperm. Mol Reprod Dev 67,385-388.

32. King, N., Hittinger, С. Т., and Carroll, S. B. (2003). Evolution of key cell signaling and adhesion protein families predates animal origins. Science 301,361-363.

33. Kirchhoff, C., Osterhoff, С., Pera, I., and Schroter, S. (1998). Function of human epididymal proteins in sperm maturation. Andrologia 30,225-232.

34. Krasil'nikov, О. V., Ternovskii, V. I., and Tashmukhamedov, B. A. (1982). Channel formation properties of black widow venom. Biofizika 27,72-75.

35. Krasnoperov, V. G., Beavis, R., Chepumy, O. G., Little, A. R., Plotnikov, A. N., and Petrenko, A. G. (1996). The calcium-independent receptor of alpha-latrotoxin is not a neurexin. Biochem Biophys Res Commun 227,868-875.

36. Kreienkamp, H. J., Soltau, M., Richter, D., and Bockers, T. (2002). Interaction of G-protein-coupled receptors with synaptic scaffolding proteins. Biochem Soc Trans 30,464-468.

37. Matsushita, H., Lelianova, V. G., and Ushkaryov, Y. A. (1999). The latrophilin family: multiply spliced G protein-coupled receptors with differential tissue distribution. FEBS Lett 443,348352.

38. McKnight, A. J., and Gordon, S. (1996). EGF-TM7: a novel subfamily of seven-transmembrane-region leukocyte cell-surface molecules. Immunol Today 17,283-287.

39. McKnight, A. J., and Gordon, S. (1998). The EGF-TM7 family: unusual structures at the leukocyte surface. J Leukoc Biol 63,271-280.

40. McMillan, D. R., Kayes-Wandover, К. M., Richardson, J. A., and White, P. C. (2002). Very large G protein-coupled receptor-1, the largest known cell surface protein, is highly expressed in the developing central nervous system. J Biol Chem 277, 785-792.

41. Meldolesi, J. (1982). Studies on alpha-latrotoxin receptors in rat brain synaptosomes: correlation between toxin binding and stimulation of transmitter release. J Neurochem 38,1559-1569.

42. Meldolesi, J., Madeddu, L., Torda, M., Gatti, G., and Niutta, E. (1983). The effect of alpha-latrotoxin on the neurosecretory PC12 cell line: studies on toxin binding and stimulation of transmitter release. Neuroscience 10,997-1009.

43. Mengerink, K. J., Moy, G. W., and Vacquier, V. D. (2002). suREJ3, a polycystin-1 protein, is cleaved at the GPS domain and localizes to the acrosomal region of sea urchin sperm. J Biol Chem 277,943-948.

44. Mironov, S. L., Sokolov Yu, V., Chanturiya, A. N., and Lishko, V. K. (1986). Channels produced by spider venoms in bilayer lipid membrane: mechanisms of ion transport and toxic action. Biochim Biophys Acta 862,185-198.

45. Misler, S., and Falke, L. C. (1987). Dependence on multivalent cations of quantal release of transmitter induced by black widow spider venom. Am J Physiol 253, C469-476.

46. Mori, K., Kanemura, Y., Fujikawa, H., Nakano, A., Ikemoto, H., Ozaki, I., Matsumoto, Т., Tamura, K., Yokota, M., and Arita, N. (2002). Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 (BAI1) is expressed in human cerebral neuronal cells. Neurosci Res 43,69-74.

47. Obermann, H., Samalecos, A., Osteihoff, C., Schroder, В., Heller, R., and Kirchhoff, C. (2003). HE6, a two-subunit heptahelical receptor associated with apical membranes of efferent and epididymal duct epithelia. Mol Reprod Dev 64,13-26.

48. Osteihoff, C., Ivell, R., and Kirchhoff, C. (1997). Cloning of a human epididymis-specific mRNA, HE6, encoding a novel member of the seven transmembrane -domain receptor superfamily. DNA Cell Biol 16,379-389.

49. Ovchinnikov Yu, A. (1982). Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure-function relationships. FEBS Lett 148,179-191.

50. Petrenko, A. G., Kovalenko, V. A., Shamotienko, O. G., Surkova, I. N., Tarasyuk, T. A., Ushkaryov Yu, A., and Grishin, E. V. (1990a). Isolation and properties of the alpha-latrotoxin receptor. Embo J 9,2023-2027.

51. Pierce, K. L., Premont, R. Т., and Lefkowitz, R. J. (2002). Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol 3,639-650.

52. Ponting, C. P., Hofmann, K., and Bork, P. (1999). A latrophilin/CL-l-like GPS domain in polycystic 1. Curr Biol 9, R585-588.

53. Robello, M. (1989). Dependence of the conductance of the alpha-latrotoxin channel on applied potential and potassium concentration. Biochim Biophys Acta 978,179-184.

54. Rosenthal, L., and Meldolesi, J. (1989). Alpha-latrotoxin and related toxins. Pharmacol Ther 42, 115-134.

55. Rosenthal, L., Zacchetti, D., Madeddu, L., and Meldolesi, J. (1990). Mode of action of alpha-latrotoxin: role of divalent cations in Ca2(+)-dependent and Ca2(+)-independent effects mediated by the toxin. Mol Pharmacol 38, 917-923.

56. Scheer, H., and Meldolesi, J. (1985). Purification of the putative alpha-latrotoxin receptor from bovine synaptosomal membranes in an active binding form. Embo J 4,323-327.

57. Senti, K. A., Usui, Т., Войске, К., Greber, U., Uemura, Т., and Dickson, B. J. (2003). Flamingo regulates R8 axon-axon and axon-target interactions in the Drosophila visual system. Curr Biol 13, 828-832.

58. Shiratsuchi, Т., Futamura, M., Oda, К., Nishimori, H., Nakamura, Y., and Tokino, T. (1998a). Cloning and characterization of BAI-associated protein 1: a PDZ domain-containing protein that interacts with BAI1. Biochem Biophys Res Commun 247,597-604.

59. Steinert, M., Wobus, M., Boltze, C., Schutz, A., Wahlbuhl, M., Hamann, J., and Aust, G. (2002). Expression and regulation of CD97 in colorectal carcinoma cell lines and tumor tissues. Am J Pathol 161,1657-1667.

60. Sudhof, Т. C. (2001). alpha-Latrotoxin and its receptors: neurexins and CIRL/latrophilins. Annu Rev Neurosci 24,933-962.

61. Tobaben, S., Sudhof, Т. C., and Stahl, B. (2000). The G protein-coupled receptor CL1 interacts directly with proteins of the Shank family. J Biol Chem 275,36204-36210.

62. Tobaben, S., Sudhof, Т. C., and Stahl, B. (2002). Genetic analysis of alpha-latrotoxin receptors reveals functional interdependence of CIRL/latrophilin 1 and neurexin 1 alpha. J Biol Chem 277, 6359-6365.

63. Tse, F. W., and Tse, A. (1999). Alpha-latrotoxin stimulates inward current, rise in cytosolic calcium concentration, and exocytosis in at pituitary gonadotropes. Endocrinology 140,30253033.

64. Tzeng, M. C., Cohen, R. S., and Siekevitz, P. (1978). Release of neurotransmitters and depletion of synaptic vesicles in cerebral cortex slices by alpha-latrotoxin from black widow spider venom. Proc Natl Acad Sci U S A 75,4016-4020.

65. Tzeng, M. C., and Siekevitz, P. (1978). The effect of the purified major protein factor (alpha-latrotoxin) of black widow spider venom on the release of acetylcholine and norepinephrine from mouse cerebral cortex slices. Brain Res 139,190-196.

66. Tzeng, M. C., and Siekevitz, P. (1979a). Action of alpha-latrotoxin from black widow spider venom on a cerebral cortex preparation: release of neurotransmitters, depletion of synaptic vesicles, and binding to membrane. Adv Cytopharmacol 3,117-127.

67. Tzeng, M. С., and Siekevitz, P. (1979b). The binding interaction between alpha-latrotoxin from black widow spider venom and a dog cerebral cortex synaptosomal membrane preparation. J Neurochem 33,263-274.

68. Ushkarev Iu, A., and Grishin, E. V. (1986). Neurotoxin of the black widow spider and its interaction with receptors from the rat brain. Bioorg Khim 12,71-80.

69. Usui, Т., Shima, Y., Shimada, Y., Hirano, S., Burgess, R. W., Schwarz, T. L., Takeichi, M., and Uemura, T. (1999). Flamingo, a seven-pass transmembrane cadherin, regulates planar cell polarity under the control of Frizzled. Cell 98,585-595.

70. Visser, L., de Vos, A. F., Hamann, J., Melief, M. J., van Meurs, M., van Lier, R. A., Laman, J. D., and Hintzen, R. Q. (2002). Expression of the EGF-TM7 receptor CD97 and its Ugand CD55 (DAF) in multiple sclerosis. J Neuroimmunol 132,156-163.

71. White, G. R., Varley, J. M-, and Heighway, J. (1998). Isolation and characterization of a human homologue of the latrophilin gene from a region of lp31.1 implicated in breast cancer. Oncogene 17,3513-3519.

72. Yan, H., Grossman, A., Wang, H., D*Eustachio, P., Mossie, K., Musacchio, J. M., Silvennoinen, O., and Schlessinger, J. (1993). A novel receptor tyrosine phosphatase-sigma that is highly expressed in the nervous system. J Biol Chem 268,24880-24886.

73. Zhang, W. R., Hashimoto, N., Ahmad, F., Ding, W., and Goldstein, B. J. (1994). Molecular cloning and expression of a unique receptor-like protein-tyrosine-phosphatase in the leucocyte-common-antigen-related phosphate family. Biochem J 302 ( Ptl), 39-47.