Выделение и характеристика глутаматных рецепторов из мышцы саранчи тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

Перестенко Павел Валерьевич

Выделение и характеристика глутаматных рецепторов из мышцы

саранчи

02.00.10 Биоорганическая химия, химия природных и

физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: член-кор. РАН, доктор химических наук профессор Е.В. Гришин к.х.н. Волкова Т.М.

МОСКВА 1999

Оглавление:

- стр.

Список условных сокращений - 4

Введение - 6

1. Глутаматные рецепторы (обзор литературы) - 8

1.1. Введение - 8

1.2. Классификация глутаматных рецепторов - 12

1.2.1. Глутаматные рецепторы ММОА-типа - 19

1.2.2. Глутаматные рецепторы не-КНУГОА типа - 23

1.3. Молекулярная биология рецепторов глутамата - 28

1.3.1. Молекулярная биология рецепторов

АМРА и каината - 28

1.3.2. Молекулярная биология метаботропных рецепторов глутамата - 33

1.3.3. Молекулярная биология глутаматных рецепторов ИМОА-типа - 39

1.4. Глутаматные рецепторы беспозвоночных - 40

1.4.1. Глутамат-активируемые хлорные каналы беспозвоночных - 43

1.4.2. Ионотропные возбуждающие глутаматные рецепторы беспозвоночных - 47

1.5. Заключение -53

2. Материалы и методы - 54

2.1. оборудование и материалы - 54

2.1.1. Оборудование - 54

2.1.2. Расходные материалы и реактивы - 54

2.2. Методы - 55

2.2.1. Выделение мембран из мышечной ткани

и нервной системы саранчи -55

2.2.1.1. Определение концентрации белка - 57

2.2.2. Выделение рецепторных белков - 57

2.2.3. Реконструкция в липосомах - 58

2.2.4. Получение поликлональных

кроличьих антител Я13 - 58

2.2.5. БОБ-ПААГ электрофорез и электроперенос

на РУББ мембраны - 59

2.2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ - 60

2.2.7. Радиолигандный анализ - 60

2.2.8. Синтез 3-1М-(карбоксиацетил)-Ь-2,3-диаминопропионовой кислоты - 61

2.2.9. Электрофизиологическая характеристика рецепторного комплекса - 62

2.2.10. Триптический гидролиз отдельных белков выделенного рецепторного комплекса, очистка полученных пептидов и изучение

их аминокислотной последовательности - 64

2.2.11. Выделение мРНК из тканей саранчи - 65

3, Результаты и обсуждение - 67

3.1. Выделение глутаматрецепторного комплекса

из мышечных тканей саранчи - 67

3.1.1. Получение мембранных препаратов из

нервных и мышечных тканей саранчи - 67

3.1.2. Радиолигандный анализ связывания

Ь-[3Н]01и и Ь-[3Н]Азр с препаратами мембран - 69

3.1.3. Солюбилизация - 72

3.1.4. Аффинная хроматография - 73

3.2. Радиолигандный анализ связывания Ь-[3Н]С1и и Ь-[3Н]Азр с глутаматрецепторным комплексом

из мышечной ткани саранчи - 77

3.2.1. Реконструкция в липосомах - 77

3.2.2. Радиолигандный анализ связывания Ь-[3Н]С1и

и Ь-[3Н]Азр с протеолипосомами - 78

3.2.3. Характеристика участков связывания Ь-[3Н]С1и

с рецепторным комплексом - 80

3.2.4. Исследование влияния З-Ы-(оо-карбоксиацил)-Ь-2,3-диаминопропионовых кислот на связывание Ь-[3Н]С1и с рецепторным комплексом - 84

3.2.5. Вытеснение И-фталамоил-Ь-глутаминовой кислотой Ь-[3Н]01и с реконструированного рецепторного комплекса - 88

3.3. Исследование ионных каналов реконструированного рецепторного комплекса - 89

3.4. Анализ выделенных рецепторных препаратов

с помошью ЗББ-ПААГ и твердофазного ИФА - 93

3.5. Анализ первичной стуктуры белков рецепторного комплекса - 96

3.6. Изучение экспрессии генов глутаматных рецепторов

в тканях саранчи в процессе онтогенеза - 99

Выводы - 103

Список литературы - 104

Список сокращений

ГР - глутаматные рецепторы

ДТТ - дитиотреит

Втах - максимальное число участков связывания лиганда

- константа диссоциации

- константа ингибирования

- центральная нервная система

- Y-D-глутамилглицин

- 0,Ь-3-гидрокси-4,5,6,7-тетрагидроксиоксазоло-[5,4-с]- пиридин-5(7)-карбоновая кислота

- 1-аминоциклобутан-1,3-дикарбоновая кислота

- цис-1-амино-1,3 дикарбоксициклопентан

- а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолопропионовая кислота

- 1-(4-бромбензоил)пиперидин-2,3-дикарбоновая кислота

- 4-бромгомоиботеновая кислота

9f

CAPS , - З-циклогексиламино-1-пропансульфоновая кислота

- 1-(4-хлорбензоил)пиперидин-2,3-дикарбоновая кислота CGP40116 - [8-(КД)]-[3-[[1-(3,4-дихлорфенил)этил]амино]-2-гидроксипропил]

(циклогексилметил)фосфоновая кислота CGS19755 - 7-трифлуорометил-4-(4-метил-1-пиперазинил)пирроло[1,2-а]-хиноксалин

CGS37849 - 4-[2-[[6-амино-9-(Н-этил-Р-0-рибофурануронамидозил)-

9Н-пурин-2-ил]амино]этил]бензенпропановая кислота CHAPS - 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфоновая кислота

CNQX - 6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион СРАА - транс-2-карбоксил-3-пирролидин-2,3-дион CPG - 3,4-циклопропилглутаминовая кислота

СРР - 3-((+/-)-2-карбоксипиперазин-4-ил)-пропил-1-фосфоновая

кислота

D-aAA - D-a-аминоадипиновая кислота

Kd К,

цнс

y-DGG 5-НРСА

ACBD ACPD АМРА BB-PDA

Вг-ШВО

^

CB-PDA

D-AP5 - 0-2-амино-5-фосфонопентановая кислота D-AP7 - В(-)-2-амино-7-фосфоногептановая кислота DNQX - 6,7-динитрохиноксалин-2,3-Дион GABA - у-аминомасляная кислота

GAMS - у -D-гл у там и л ам и н о м ети л сул ь ф о н о в ая кислота

GDEE - диэтиловый эфир глутаминовой кислоты

G1DAP - 3-М-(карбоксиглутарил)-Ь-2,3-диаминопропионовая кислота

GYKI52466 - 1-(4-аминофенил)-4-метил-7,8-метилениокси-5Н-

2,Збензодиазепина гидрохлорид НА-966 - 1-гидрокси-3-аминопирролидин

L-689,560 - транс-2-карбокси-5,7-дихлоро-4-фениламинокарбонил-

амино-1,2,3,4-тетрагидрохинолин L-AP3 - L-2-амино-З-фосфонопропионовая кислота L-AP4 - Ь-2-амино-4-фосфономасляная кислота ls3R-ACPD - 1-аминоциклопентан-18,31^-Дикарбоксиловая кислота MaDAP - 3-К-(карбоксиацетил)-Ь-2,3-Диаминопропионовая кислота МК-801 -(+)-5-метил-10,11 ,дигидро-5Н-дибензо[а,(1]циклопентен-5,10-

иминмалеиновая кислота NAAG - Ы-ацетил-Ь-аспартил-Ь-глутаминовая кислота NBQX - 6-нитро-7-сульфамоилбензо[1]хиноксалин-2,3-дион NMDA - N-метил-О-аспарагиновая кислота ODAP - Р-Ы-оксалил-а-р-диаминопропионовая кислота PCP - фенциклидин

PhGA - Ы-фталамоил-Ь-глутаминовая кислота PMSF - фенилметилсульфонилфлуорид PYDF - поливинилидендифторид SKF-10047 - N-аллил-норметазоцин

SuDAP - 3-М-(карбоксисукцинил)-Ь-2,3-Диаминопропионовая кислота t-2,3-PDA - транс-пиперидин-2,3-дикарбоновая кислота TCP - Ы-[1-(2-тиенил)-циклогексилпиперидин]

Введение

Синаптическая передача лежит в основе функционирования центральной нервной системы (ЦНС), поэтому исследование её молекулярных аспектов является предметом пристального внимания ученых. Одним из основных возбуждающих нейромедиаторов ЦНС позвоночных животных является Ь-глутамат. Постсинаптические ионотропные глутаматные рецепторы (ГР), которые воспринимают сигнал этого нейромедиатора, широко изучаются. Доказано, что ГР принимают непосредственное участие в развитии нервной ткани, сложной интегративной деятельности головного мозга позвоночных, а нарушение их функционирования приводит к возникновению целого ряда тяжелых заболеваний ЦНС. Большие успехи достигнуты в последнее десятилетие в области молекулярного клонирования генов постсинаптических ГР позвоночных. В то же время, уже более 30 лет назад было открыто, что глутамат играет важнейшую нейромедиаторную роль как в ЦНС, так и в двигательной системе насекомых и других беспозвоночных животных. Электрофизиологические исследования глутаматергических синапсов насекомых показали, что постсинаптические ионотропные ГР в нервно-мышечных соединениях этих животных играют основную возбуждающую роль, которую у высших животных выполняют рецепторы ацетилхолина. При изучении влияния различных известных агонистов на эти рецепторные системы было выявлено несколько подтипов возбуждающих ионотропных ГР в моторной системе насекомых, причем их фармакологический профиль заметно отличался от такового у различных ГР позвоночных. Так, было показано существование Ь-квисквалат-, Ь-аспартат- и иботенат-чувствительных ГР, активация которых приводит к деполяризации мембраны мышечного волокна. Изучение этих рецепторных систем насекомых на молекулярном уровне, выяснение их сходства

и различия с ГР позвоночных позволит не только понять эволюционные аспекты их развития, но и решить проблему создания новых экологически чистых инсектицидов.

С использованием информации о структуре генов ГР позвоночных осуществлено множество попыток клонирования ионотропных ГР насекомых и только некоторые из них оказались успешными. Так были клонированы гены, кодирующие мышечный рецептор БгозорЬПа DgluR-II [811ш1ег, 1991], экспрессируемые в ЦНС мухи 001иЯ-1 [ХЛ^сЬ, 1992] и ОММОАЮ [ШвсИ, 1993]. Все эти субъединицы имели высокую структурную гомологию с соответствующими ГР позвоночных, но при гетерологической экспрессии не проявляли ожидаемого сродства к соответствующим агонистам. Кроме того, ни один из полученных рецепторов не отвечал на воздействие Ь-квисквалата, который считается одним из основных агонистов ГР насекомых.

Для изучения механизма функционирования различных типов ГР широко используются полиаминные токсины из яда паука А^юре 1оЬша - аргиопинины, которые являются специфическими блокаторами ионных каналов ГР [Гришин, 1986; ОтЫи, 1987; М^агашк, 1987]. Данная работа посвящена выделению и характеристике ГР из мышц саранчи с использованием биоспецифической хроматографии на иммобилизованных аргиопининах.

1. Глутаматные рецепторы (обзор литературы)

1.1. Введение

Представление о том, что L-глутаминовая кислота участвует в специфических физиологических и патологических процессах „протекающих^ в центральной

J ' L---5

нервной системе (ЦНС) позвоночных, зародилось из экспериментальных наблюдений, сделанных более 30-ти лет назад. В 1950-х годах было впервые показано, что L-глутамат индуцирует тонические судороги при внутримозговом введении [Hayashi, 1954; Curtis, 1959]. В то время эти данные не вызвали особого интереса, так как трудно было предположить, что L-глутамат играет роль нейропередатчика, являясь широко распространённым внутриклеточным метаболитом. Однако, в течение 1970-х и 1980-х годов было убедительно доказано, что возбуждающие аминокислоты (L - изомеры глутаминовой, аспарагиновой кислот и некоторые из их серусодержащих аналогов) осуществляют внутрисинаптическую передачу в ЦНС [Curtis, 1963; McLennan, 1968; Duggan, 1974]. Эксперименты, проведённые в 1980-х, подтвердили гипотезу, утверждавшую существование нескольких типов специфических мембранных рецепторов возбуждающих аминокислот - глутаматных рецепторов (ГР), и продемонстрировали вовлечённость этих систем рецепции в процессы развития нервной ткани и целого ряда заболеваний ЦНС. С помощью методов электрофизиологии была показана способность глутамата и аспартата вызывать поляризацию нейронов. Были выявлены системы транспорта и утилизации агонистов ГР, механизмы управления ионной проводимостью мембран этими рецепторами и их связь с механизмами вторичного опосредования. Электрофизиологические и фармакологические исследования, проведённые во многих лабораториях мира, подтвердили существование ГР в ЦНС различных видов животных.

Данные, полученные при морфологическом и физиологическом изучении глутаматергических систем, говорили об их участии в сложной интегративной деятельности головного мозга, например, в процессах обучения и запоминания. Это подтверждалось также локализацией основных глутаматергических путей в структурах головного мозга, ответственных за его ассоциативную функцию [Cotman, 1987]. Косвенным доказательством этого являлось также изучение нейротоксического действия глутамата при его локальной или системной аппликации на структуры мозга, которое показывало, что атрофия нервной ткани наступала прежде всего в областях с высокой плотностью глутаматергических синапсов, например в гиппоталамусе, гиппокампе, миндалине и коре [Coyle, 1983; Капо, 1987; Frandsen, 1989]. Такие воздействия, как правило, сопровождались симптомами нарушения поведенческих и вегетативных реакций. Аналогичный эффект оказывали некоторые конкурентные и неконкурентные агонисты глутамата.

Для ГР было показано не только участие в процессах обучения и запоминания [Collingridge, 1991], но также в патогенезе ряда заболеваний ЦНС: эпилепсия, болезнь Альцгеймера [Cowburn, 1989; Collingridge, 1991], хорея Гентингтона, ишемическая нейрональная деградации и др. [Meldrum, 1985; Maragos, 1987; Schwarcz, 1985; Gill, 1987]. Клинические исследования с использованием различных видов животных показывают, что антагонисты ГР могут быть применимы при лечении эпилепсии и нейрональной деградации, как результата травматического повреждения ЦНС. Существуют данные, касающиеся возможности терапевтического применения соответствующих веществ в лечении болезни Паркинсона, шизофрении и хронических нейродегенеративных процессов.

О роли возбуждающих аминокислот в формировании эпилептической гипервозбудимости нейронов ЦНС упоминалось довольно давно. Известно, что экспериментально вызванные у подопытных животных эпилептические припадки высокоэффективно подавлялись аппликацией некоторых антагонистов рецепторов

глутамата [Neuman, 1988; Geng-Chang, 1989; Rogawski, 1992]. И наоборот, активация ГР в норме сопровождается электрическими импульсами, сходными с наблюдаемыми во время судорог в очагах эпилептической активности. Данные некоторых исследований [Urban, 1990], поддерживают теорию, утверждающую, что "молчащие" в норме определенные типы ГР являются компонентами, инициирующими развитие эпилепсии.

В дальнейшем были получены данные, свидетельствующие об избирательной деструкции нейронов, содержащих определенные подтипы рецепторов глутамата, в головном мозге при ишемической и гипогликемической нейрональных деградациях [Meldrum, 1991]. Существует мнение, что избыточное накопление возбуждающих аминокислот при повреждениях, вызванных нарушением мозгового кровообращения, обуславливает начало патологических процессов. В дополнение к способности блокировать повреждения нервной ткани ЦНС, вызванные мозговой ишемией или черепно-мозговой травмой, антагонисты глутаматных рецепторов могут оказаться полезными в лечении хронических нейродегенеративных процессов, в ряду которых стоят такие широко распространённые заболевания, как болезни Паркинсона [Ong, 1997; Bezard, 1997] и Альцгеймера [Thotns, 1997]. Болезни Гентингтона - аутосомно-доминантному заболеванию людей среднего и старшего возраста, сопутствует снижение мест связывания глутамата в некоторых структурах конечного мозга на 93% и 67% соответственно [Young, 1988]. Найдена корреляция между дегенерацией постсинаптических глутаматэргических нейронов и снижением уровня митохондриальной глутаматдегидрогеназы нервных клеток [Tsiotos,1989]. Высказываются предположения о возможности применения антагонистов рецепторов NMDA в качестве адьювантов при лечении болезни Паркинсона [Klockgether, 1989]. В этом случае, очевидно, имеются в виду данные о тесной функциональной и морфологической взаимосвязи [Araneda, 1989] дофаминергической и глутаматергической систем.

Таким образом, к концу 80-х - началу 90-х годов, процесс накопленния знаний о глутаматергической передаче, ускоряемый перспективой их активного применения в медицине, позволил создать достаточно полную картину системы ГР позвоночных, которая в настоящее время постоянно уточняется новыми данными, в первую очередь из области молекулярной биологии.

Несколько иначе обстоит дело с изучением глутаматрецепторной передачи у беспозвоночных. Первые работы, посвященные глутаматным рецепторам насекомых, были выполнены в середине 60-х годов [Kerkut, 1965; Usherwood, 1966], то есть несколько позже открытия глутаматрецепторной передачи у млекопитающих. В этих работах впервые было показано, что глутамат играет роль нейропередатчика как в возбуждающих, так и в тормозных нервно-мышечных синапсах насекомых. Позднее глутаматные рецепторы были найдены и в нервной системе насекомых [Giles, 1985; Wafford, 1986], и, наконец, рецепторы глутамата были обнаружены не только у насекомых, но и у других классов беспозвоночных, таких как нематоды [Maricq, 1995] и моллюски [Jones, 1987; Quinlan, 1991]. В частности, у моллюсков L-глутаминовая кислота играет важную роль в контроле целого ряда биологических функций, например, модуляции пищевого поведения [Jones, 1987; Quinlan, 1991]. Вполне понятно, что эти открытия привлекли внимание исследователей не только с чисто академической точки зрения. Тот факт, что глутамат является основным возбуждающим медиатором нервно-мышечной передачи, делает изучение соответствующей рецепторной системы очень перспективным с точки зрения модельного синтеза новых экологически чистых инсектицидов, способных блокировать двигательную активность насекомых. Кроме того, изучение ГР насекомых необходимо для понимания эволюционного развития соответствующих рецепторных систем.

Судя по всему, основные характеристики глутаматрецепторной передачи сложились до того, как в ходе эволюции произошло разделение на позвоночных и беспозвоночных. Исходя из того, что у позвоночных рецепторы глутамата играют

важную роль в эмбриональном развитии нервной ткани и формировании всей центральной нервной системы, можно предположить их аналогичную роль у беспозвоночных [Douglas, 1995]. Интегративная деятельность ЦНС и ее связь с г