Взаимодействие полипептидных нейротоксинов из ядов змей с тахикининовыми рецепторами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ им. М. М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

УДК 577.354 577.175.82

ЛАЗАКОВИЧ Елена Михайловна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИПЕПТИДНЫХ НЕЙРОТОКСИНОВ

ИЗ ЯДОВ ЗМЕЙ С ТАХИКИНИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1990

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте Сиоорганической химии им. М.М.Шемякина Академии наук-СССР

Научный руководитель:

доктор химических наук

В.И.Цэтлин

Официальные оппоненты:

доктор химических наук кандидат химических наук

Е.В.Гришин А.Д.Кондратьев

Ведущая организация: Институт биологической и медицинской ■

заседании специализированного совета Д.002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР по адресу. 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Сиоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР.

химии АМН СССР.

Защита состоится

- 2

ноября 1990 г. в 10 часов на

Автореферат разослан " ' '"СИЛ ^^ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

/

Актуальность проблемы. Выяснение структурной организации компонентов нервной системы является одной из основных, задач молекулярной нейробиологии. Большой интерес представляют рецепторы, взаимодействующие с эндогенными и экзогенным пептидами-нейромо-дуляторами. В группу эндогенных-пептидов-нейромодуляторов входят соединения, играющие ключевую роль в регуляции таких физплоги-ческих реакций мозга как сон, эмоции, память. Эти соединения оказывают на нервную систему воздействия, природа которых в большинстве случаев остается невыясненной. Наиболее благоприятна в этом отношении ситуация с веществом Р(БР): этот ундехапептид является одним из наиболее вероятных кандидатов на роль пептидного нейропередатчика и участвует в проведении болевых сигналов.

Сходную с БР структуру и фармакологический спектр действия имеют нейрокинины А и В (ЦКА и ЛКВ), обнаруженные в мозге млекопитающих, а также целая группа пептидов из иных источников (эле-доизин, физалеймин и др.). Эти пептиды получили название тахики-нинов, так как все они вызывают быстро наступающие сокращения гладкомышечной ткани.

Рецепторы тахикининов обнаруже:ш в нервной системе млекопитающих. В мозге, периферических органах и тканях они присутствуют в крайне малых количествах. В их изучении в последнее время- достигнут значительный прогресс благодаря применению генно-инженерных методов. Впервые для нейропептидных рецепторов установлен нуклеотидные последовательности генов белков, связывающих ЭР и •ЯКА, и на основе анализа первичной структуры предложены модели укладки полипептидных цепей в мембране. Однако для■подтверждения этих моделей, для выяснения детальной структурной организации и механизмов действия этих рецепторных систем необходимы дополнительные экспериментальные данные.

Поэтому задача поиска новых улобных инструментов исследования тахикининовых рецепторов не утратила актуальность в настоящее время.

Цель работы. Данная работа является частью проводимых в Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина АН СССР исследований рецепторов тахикининов. В ее задачу входило: I) изучение влияния полипептидних нейротоксинов из ядов змей и некоторых хо-лкз:ергичес;сих лигандов на связывание радиоактивных производных тахшигошов с рецепторами, 2) изучение взаимодействия новых фото-ахтивируешх производных БР с тахикининовыми рецепторами и анализ кова.;внтных комплексов, которые являются результатом фотоиндуци-рованных сшивок этих лигандов с мембранами мозга крыс.

Научная новизна работы. Обнаружено взаимодействие некоторых низксмолекулярных Олокаторов никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР), а также ряда нейротоксинов постсинаптического действия из ядов змей с тахикшшновыми рецепторами. При этом показано, что наибольшей эффективностью среди изученных нейротоксинов ха-рякте; ;::зу;'¡тся взаимодействие с а-бунгаротоксином (а-Бт). Этот по-липетгд д;.:зет наибольшее сродство к рецепторам Щ-1 типа. На ; -к полученных данных высказано предположение о том, что

пилотор;:: кз а-оунгаротоксгоювязывающих белков мозга могут быть Еорлочен-; е осуществление физиологических ответов на ЭР. В нестоящей работе охарактеризовано взаимодействие с мембранами ь-.ззгь крис трчх аовых радаоактившх фотоактивируемых производных БР и показало ковалонтное кячеяно этими соединениями а-бунгаро-токсинсвязнвачдих ког-шонеитов мозга.

Практ.:-.'.-;ск;:л ценность работ. Исследования показали перспективность иси-.члучопония токс!'ной по с т с ил п; гт и ч в око г о действия (а-Ст и токсина й аЬлгяпМз) для ьитяожа компонентов тага •

кишшовых рецепторов КК-1 типа с помощью аффинной хроматографии, а так*« изучение топографии рэцепторного комплекса в мембране.

■Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи, материалы дассертащш докладывались на 9 Советско-индийском симпозиуме па химии природных соединений (Рига, 1939), Международном симпозиуме по рецепторам и ионным каналам (Зап. Берлин, 1989), 2 Форуме пептидного общества Франции (Нант, 1988), Симпозиуме по нойропептицам и иымунопептидим (Нью-Йорк, 1989).

Объем работы. Диссертация изложена на /й^ страницах мазинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, результатов и обсуждения, экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы включает наименований.

Содержание работы.

В нервной системе млекопитающих с помощью фармакологических тестов и радиолигандного анализа обнаружено, по крайней мере, три различных типа тахикининовых рецепторов (Ж-1, Ж-2 и щ-3), к которым наибольшее сродство тлеют БР, 1-ЖА и ЖВ соответственно.

ричем, сродство каждого из этих тахикшинов к "своему" типу рецептора на несколько порядков вше, чем к двум другим. К началу настоящей работы была установлена аминокислотная последовательность только одного тахикининового рецептора (МК-2 типа) и показана высокая гомология его структуры с мускариновыки ацетилхоли-нои';ми р-зиепторами, (З-адренергическими рецепторами, родопсинами. Тахикшшновкв рецепторы присутствуют в мозге в крайне малых количествах. Это одна из основных причин, осложняющих их изучение. Вторая причина - это отсутствие удобных инструментов исследования - высекоспоцифичних антагонистов и лигандоп, устойчивнх к протео-

лизу, фотоаффинных производных.

В данной работе предпринята попытка поиска новых лигандов тахикигсшовых рецепторов как среди производных самого вещества Р (получение новых фотоактивируемых аналогов), так и среди известных лигандов других рецепторов.

В литературе описано модулирующее влияние нейропептидов на различные рецепторные системы. Так, например, кейротензин изменяет СЕязивакщие характеристики дофаминовых рецепторов, нейропептид Y и ангиотензин - а2 адренорецепторов-. Обсуждалась также роль SP и как нейротрансмиттера, и как пептида, оказывающего модулирующее действие на рецепторы классических нейромедиаторов. В ряде лабораторий показано веяние SP и некоторых других тахикининов на функционирование нАХР. Так, например, этот пептид, подобно неконкурентным блскаторам, ингибирует инициируемое карбамоилхолином +

поглощение "" На клетками нойрональной линии PCI2, а также свя-1

зивание [ 1]-а-бунгаротоксина с мембранам* Torpedo и клеток линии ECgHI. Возмозаю, некоторые холинергические лиганды яеля-ются потенциальными кандидатами на взаимодействие с тахикинино-выми рецепторами. Для проверки этого предположения было изучено влпяшю лигандов нАХР на связывание тахикинююв со своими рецепторами.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ХОЛШЕРГИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ С РЕЦЕПТОРОМ ВЕЩЕСТВА Р

В качестве радиоактивного лиганда специфичного, к NK-I типу

1 '"'S

тахикининоъых рецепторов, использовали 1-тгрсизводное SP, полу-

Г

чанное с помощью роагонто Болтона-Хаитера Ü П-BH-SP) и обладающее высокой удольной актипностые (1000-2000 Кн/ммоль>. Анализ

связывания БР с мембранами мозга крысы выявил калике специфического насыщаемого связывания, характеризуемого К^ 0,7 нМ и максимальным числом участков связываш!я 60 фмоль /мг белка.

Было исследовано влияние трех типов холинергических лигандов (аггатастов, антагонистов и блокаторов канала) на связывание радиоактивного производного БР с мембранам; мозга крысы.

Обнаружено, что ходинергические агонистц карбамоилхолин, никотин и цитизин (последний лиганд специфичен по отношению к ней-рональным холинорецепторам) даже в концентрации 10 ^ М не влияли на связывание [ 13-ВН-БР. Таким образом, участок связывания БР не является центром связывания эгонистов холинорецептора.

Заметной конкурирующей способностью с радиоактивным производным БР за участки связывания в мозге крысы обладали некоторые неконкурентные блокаторы холинорецепторов (фенциклидин, трифенил-метилфосфоний) и антагонист й-тубокурарин. Как видно из рис. I,

-!д!С1.м

ток

Рис.1. Ингибирование связывания С и-ВН-БР й-тубокурарином (с), фенциклидином (а) и трифенилметилфосфонием (л), 1,5-Ю-4

—А -4 " 1

М, 2,6'10 Ми 2,9'10 4 м соответственно.

- б -

эти соединения взаимодействуют с N" I рецепторами тахикининов с низкой эффективностью. Значения К^ составляют для d-тубокурарина, фенциклидина и трифенилметилфэсфония 1,5-Ю"4 М, 2,6-Ю"4 М, 2,9'Ю-4 м соответствешо. Приведенные параметры связывания, по-крайней мере, ка 2-3 порядка превышают те значения, которые характеризуют их взаимодействие с нАХР.

ИЗУЧИ ME ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НЕЙРОТОКСИНОВ ИЗ ЯДОВ ЗМЕЙ С ТАХМКИНШОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ

Предварительная инкубация мембран мозга крысы с а~Бт в течение I часа полностью ингибирует связывание радиоактивного производного SP тахикининовыми рецепторами NK-I типа с К^ 8-10 М (рис. 2). Тог участок в мозге крысы, за который конкурируют между собой SP и а-Бт, не является центром связывания нейромеди-атора в нАХР. Этот вывод сделан на основании того, что карбамэ-

илхолин, негидролизуемый аналог ацетилхолина, в концентрации 1мМ

125

практически не ингибирует связывание [ IJ-BH-SP и не снимает ингибиругадего эффекта а-Бт.

Представляло интерес проверить, будет ли а-Бт связываться с 'гчхж'П'иновкми рецепторами других типов, наибольшее сродство к

1 ос

которым имеют t '^Il-His-NKA (Ж-2) и нейрокинин В или 3-(3-иод-

T2S

4-гидроксифешл )пропионилэледоизин ([ IJ-Bfí-Ele) (fíK-3). Предварительная инкубация мембран с а-Бт приводит к полному ингиби-рованию связывания J 1]-ВН-Е1е (рис. 2). При этом константа ин-гибированил 1,1' 10""° М (значение К^ вычислено с учетом Кц

T9R

[ Ii-iiH-EIe 0,4 нм) примерно на 2 порядка пто константы, ха-рактерияутаюй вытеснение ('^I J- BH-SP с участков связывания а-буигаротоксгдюм. Следовательно, а-Бт тюакждойстьует с ponen -

СВЯЗЬ! ВАНИЕ.%

Рис. 2. Ингибирование связывания [ И-ВН-БР (0,2 п'Л, кривая I), [ 51]-ВН-Е1е (0,25 нМ, кривая 2) с мембранами мозга крысы (2,5 мг бежа/мл) и С1251]-Н1з-ККА (0,6 нМ, кривая 3) с мембранами мочевого пузыря крысы (0,8 мг белка/мл) а-бунгаротоксином. К^ 8'10-8 М, 1,1-10~6 М, М соответственно.

тором типа NK-3 с меньшей эффективностью, чем с NK-I.

Для того, чтобы охарактеризовать связывание а-Бт с NK-2 типом тахикининових рецепторов, были использованы мембраны из моченого пузыря крысы. Рецепторы этого типа присутствуют, главным образом, в периферических органах и тканях; связывание соответствующих лигандов с мембранами мочевого пузыря млекопитающих используется в качества высокоспецифичного теста для детекции этих рецепторов. Мембраны, выделенные из мочевых пузырей, содержали 20

1ps

фмоль NK-2 участков связывания на мг белка. Кд для t Il-His-NKA

_q

составляла 2,6-10 М (неспецифическое связывание опрзделяли в

с

присутствии 2-10 М SP). Полученные характеристики, в частности Вмах, отличаются от описанных в литературе данных в 2-3 раза,

что, по-видимому, связано с особенностями выделения мембран. а-Бт обладал заметной кнгибк_/ющей сносооностью 10~5), хотя и более слабой по сравнению с действием на два других типа рецепторов (рис. 2).

Таким образом, показано, что а-Бт взаимодействует с тремя известными к настоящему времени тшами тахикининовых рецепторов, но с разной эффективностью. Наиболее высокое сродство этот полипептидный нейротоксин проявляет по отношению к NK-I типу рецепторов.

В целях более детальной характеристики SP/a-Бт-связывающих

1 ps

участков мы исследовали вытеснение [ U-BH-S? из мембран мозга крысц различными нойротоксинами, которые подобно а-Бт, принадлежат к так называемому "длинному" типу (66-74 остатка, 5 дисуль-флдных мостиков) пли же к "короткому" (60-62 остатка, 4 дисуль-фидных мостика) (табл. I). Оказалось, что способность конкурировать с SP за связывашю с мозгом присуща не только а-Бт: полностью подавляется связывание и под действием "длинного" нейро-токаша 3 Naja naja staxiensla (рис. 3). Среди "коротких" нейро-токсинов заметный эффект был обнаружен для токсина 3 из Naja тоззаяЫса mossccnblca в концентрации 2,2'10 M и нейротоксина II из Naja naja oxiana (I0~4 M). Однако, действие "коротких" нейро-токсшов в диапазоне таких высоких концентраций может быть связано с нарушением структуры мембраны, как это происходит в случае цитотоксинов I и II (рис. 3), хорошо известных мембрано-активных полипептидов.

С другой стороны в диапазоне использованных концентраций практически лишены конкурирующей способности "длинный" пейротоксин I из Naja naja oxiana и остальные короткие нейротоксгаш. Если учесть, что нейротоксин I (е котором остаток Lys-EH, инвариантный практически во всох иейротоксинах змей постсинантичоского дойст-

тос

Таблица I. Ингибироваше связывания [ 13 -ВН-БР с мембранами мозга крысы постсинаптическими нейротоксинами.

Лиганд Концентрация мкМ Ингибирование

Нейротоксины "длинного" типа из ядов змей

а-бунгаротоксин токсин 3 па]а з1атепз1з нейротоксин I ла^а ох1апа

5 28 56

Нейротоксины "короткого" типа из ядов змей

токсин 3 щ/с2 тоззатЫса тоззатЫса

а-токсин Жа^а п1^1со1Из эрабутоксин а ЫИссшОа зет1Тазс1сЛа нейротоксин II И^а тlaJa ох1апа

Нейротоксины из моллюска

22 17 25 12 ЮО

20 <5 <5 <5 75

Конотоксин й! из Сопиз &ео^ар1шз

250

О

СВЯЗЫВАЙ^, %

KXh

80504020-

-ig IC] м

Рис. 3. Ингибнрование связывания íI25I]-BH-SP (0,25 нМ) с мембранам;? мозга крысы (2,5 мг белка/мл) токсином 3 Naja naja alamensts (кривая I), Kj 1,1-IO~6 M, и цитстоксином II Naja naja oxlana (кривая 2), K^ 1,0> Ю-5 М. [С] - концентрации токсинов.

вия, заменен на Glu) значительно уступает по токсичности всем представленным в таблице 1 нейротоксинам, то полученные данные можно интерпретировать как более высокую эффективность "длинных" нейротоксинов в ингибировании связывания SP с мозгом.

Таким образом, рецептор SP проявляет избирательность лишь по отношению к определенным нейротоксинам змей и это сильно зависит от структурных особенностей конкретных нейротоксинов.

Учитывая имеющиеся литературные данные о том, что некоторые конотоксиш и тимопоэтин эффективно конкурируют с а-Бт за связывание с АХР из электрического органа Torpedo callforalca, ми проверили способность конотоксина GI и тимопвнтина, представляющего

собой активный фрагмент тимопоэтина, ингибировать взаимодействие радиоактивного производного БР с мембранами мозга крысы. Ни один из этих пептидов в концентрации до 2,5-10~4 М не оказывал влияния на связывание ЭР с мозгом. •

К настоящему времени в ЦНС позвоночных и беспозвоночных животных обнаружена целая группа белков, имеющих значительную гомологию с мышечными холинорецепторами. Некоторые авторы считают, что эти белки являются продуктами одного и того же семейства генов. В то же время среди них наблюдаются структурные и фармакологические различия. Не всем нейроналышм холинорецепторам присуща способность связывать а-Бт, она обнаруживается у рецепторов, выделенных из зрительной доли мозга цыпленка, из дрозофилы, мозга золотой рыбки, саранчи. В тоже время холинорецепторы из клеток нейрональной линии РС12 , мозга быка, человека и крысы не связывают а-Бт.

С другой стороны, в мозге млекопитающих обнаружены белки,

—7 —Я

обладающие различным сродством к а-Бт (10 -10 М), которые не являются функциональными холинорецепторами . Аминокислотные последовательности этих белков пока не установлены, а физиологически роль не выяснена.

Полученные нами данные позволяют сделать вывод о том, что а-Бт-связыващие полипептида "среднего сродства", отличные от известных нейрональных и мышечных хоишорецепторов, являются частью тахикининовых рецепторов или тесно гссоциировакы с ними.

Большой интерес представляют биохимические характеристики этих связывающих участков. Одним из подходов к изучению рецепторов является их ковалентное мечение радиоактивным лигандом и последующий анализ образующегося комплекса. Для козалентной сшив-

ки рецептора с лигандом могут быть использованы фотоактивируемые производные и бифункци..налыше реагенты.

ИЗУЧЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ ФОТОАКТИВИРУЕМЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БР

С МЕМБРАНАМИ МОЗГА КРЫСЫ

В лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ им.М.М.Шемякина был синтезирован ряд радиоактивных, фотозктивируемых производных БР и их "холодных" аналогов (соединения 1-6).

Н^- Агв-Рго-Ьу8(й2)-Рго-С1п-С1п-РПе-РПе-С1у-Ьеи-Мег-1Ш2 БР Н1= Н

1 . Рм= Н, К^ С0СН2СН2-

он

125:

2. СН2Лч

Я-,

3. 1?ч = сн2-^(

4. 1^= С0СН2СН2-<^^^у0Н

2

1*2= С00Н2СН2^(^р-0Н

Й2= сосн2сн2-^(:=^у-он

у

125т

ОН 125I

6. С0д( ,

Ко= н

ОН 1251

Одно из фотоактивируемых производных (соед. 3) получено на основе i ^ 1]-иодоксифенилпропионилыюго аналога SP. Фотоаффинную группировку вводили по а-аминогруппе Arg-I. Полученное производное имело высокую удельную радиоактивность (2000 Ки/ммоль). Аналогичное нерадиоактивное фотоакгивируемое производное SP (соед. 2) при концентрациях больше Ю-6 М практически полностью предотвращало связывание соединения I с мембранами мозга крыс.

Радиоактивное фотоактивируемое производное SP (соед. 3) специфически и насыщающим образом связывалось с мембранами мозга крысы (рис. 4). Анализ связывания по Скэтчарду дает следующие величины Кд и максимального числа связывающих участков: 0,34 й.' и 20 фмоль/мг белка. Эти значения одного порядка с параметрами связывания соединения I (соответственно 0,7 нМ и 60 фмоль/мг белка).

Следует однако отметить, что при вытеснении нативным SP уровень связывания фотоактивируемого производного оставался очень высоким. Такое связывание снижалось в 2 раза в присутствии SP, содержащего две оксифенилпропионильше группы (соед. 4). Полученные данные позволили предположить, что проведенные модификации изменяют специфичность синтезированных лигандов по отношению к различным типам рецепторов.

Согласно литературным данным, модификация реагентом Еолто-на-Хантера вещества Р, приводящая к получению его радиоактивного производного с меткой на Lys-З, сохраняет специфичность данного соединения к NK-I типу рецептора. При аналогичной модификации NKA оксифенилпропионильное производное имеет намного более высокое сродство к рецепторам типа NK-3, чем натившй NKA. Полагая, что при синтезе радиоактивного фотоактивируемого производного SP происходит аналогичное изменение специфичности, мы провели эксперименты, задачей которых являлось ш чоние сродства полученного

Рис.4. Связывание соединения 3 с мембранами мозга крысы (а) и анализ связывания по Скэтчарду (б), а: I -общее, 2 - неспецифическое, 3 - специфическое связывание. С1 - концентрация добавленного лиганда, С2 - концентрация связанного лиганда. 0: В - концентрация специфически связанного лиганда, Р - концентрация свободного лиганда. * —Р,

Неспецифическое связывание определяли в присутствии ЮМ

ЭР. К0 0,34 нМ, Вшх 20 фмоль/мг белка.

радиоактивного фотоактивируемого лиганда,к другим типам тахикини-новых рецепторов (рис. 5). При этом мы обнаружили, что вещество Р с высокой специфичностью ингибирует связывание фотоактивируемого производного только на 60% , а нейрокинины А и В менее эффективны по сравнению с веществом Р. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что фотоактивируемое производное взаимодействует не только с рецепторами БР Ш-1 типа, но и иными связывающими участками. Анализ полученных данных не дал возможности выяс-

СВЯ9ЫВ«Н^С. Ч

5 ? 5 |ГПд|С|.М

ТОК

Рис.5. Ингибироввние связывания [13- ВН-БР (сплошная линия) и соединения 3 (пунктирная линия) тахикининами: I, I' -ЗР, 2, 2.' - соединением 4, 3' -ЖВ, 4' - ЖА.

нить природу этих "дополнительных центров" связывания и отнести их к какому-тибо из уже известных типов тахикининовых рецепторов. Не ясна и более высокая, чем у ЭР, вытесняющая способность соединения 4, так как по данным, полученным в совместной работе с лабораторией проф. И.Гловинского (Парик), было показано, что при связывании с тахикининовыми рецепторами ЦНС это соединение проявляет ту же относительную специфичность, что и БР: К^, характеризующие связывание с Ш-1 и Щ-З рецепторами, равны соответственно 1,7-Ю"8 М и 3.10"7 Ы.

Два других фотоактивируемых производных были получены с использованием в качестве модифицирующего реагента Ы-оксисукцини-мидного эфира п-азидосалициловой кислоты (соед. 5 и 6). Фотоакти-1ируемая и радиоактивные метки введены в эти соединения благодаря модификации только одного остатка Ьуз-З (соед. 5) или Агд-1

(соед. 6). Сходегво структуры соединения 5 с радиоактивным производным БР, модифицированным реагентом Болтона-Хантера позволяло надеяться, что оно окажется более селективным лигандом, чем соединение 3, по отношению к ГЖ-1 типу рецепторов.

Эти производные специфически связывались с мембранами мозга крысы (рис. 6), хотя обращает на себя внимание существенное уменьшение числа центров связывания. Даже в присутствии высокой концентрации БР (Ю-6 М) общее связывание соединений 5 и б с мембранами в "темновых" экспериментах уменьшалось всего на 20-30% по сравнению с контрольным опытом, когда БР не было добавлено в инкубационную среду.

Рис.6. Связывание соединения 5 с мембранами мозга крысы (а) и анализ связывания по Скэтчарду (б) (соед.5) Неспецифическое связывание определяли в присутствии КЗ"6 М БР. Кв 0,26 нМ, Вмах 5 фмоль/мг белка.

Интересное явление обнаружено при изучении влияния а-Бт на связывание с мембранами мозга крысы фотоактивируемых аналогов БР

(соединений 5 и 6). а-Бт в концентрации 5-10~& М в 2 раза эффективнее, чем БР, подавлял связывание соединений 5 и 6 с мембранами, т.е. несмотря на определенные изменения в специфичности ЭР при введении фотоактивируемых группировок, сохраняется способность полученных производных конкурировать с а-Бт за связывание с мозгом.

КОВМЕНТНОЕ МЕЧЕНИЕ БЕЛКОВ В МОЗГЕ КРЫСУ ФОТ О АКТИВИРУЕМЫМИ

РАДИОАКТИВНЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ БР

Для образования ковалентных сшивок комплексы фотоаффинных производных БР с мембранам! мозга крысы подвергали фотолизу

254 ш * с Расстояния Ю см в течение 6 мин., после чего проводили электрофорез в полиакриламидном геле с последующей радиоавтографией. При этом обнаружено включение радиоактивности в несколько полос. Предварительная инкубация мембран с БР (10 М) практически не влияла на картину мечения. Т.е., несмотря на то, что все полученные нами фотоактивируемые производные способны взаимодействовать с участками связывания БР, эти производные, находясь в соответствующих участках, ковалентных сшибок с рецепторам! не образуют.

Предварительная инкубация мембран с соединением 4 предотвращает ковалентнсе мечение соединением 3 полипептида с молекулярной массой 59 кДа (рис. 7). Рассмотренные выше данные свидетельствуют о том, что этот полипептид не является рецептором ЫК-1 типа и не может быть однозначно отнесен к какому-либо другому известному типу тахикишшових рецепторов.

Интересно отметить, что ранее в клеточной линии лимфобластов 1М-9 при использовании С^Л-ВГ ЗР и дисукцшшмидилсуберата

Рис. 7.

Авторадиограмма электрофорег-рзммы мембран мозга крысы в 10% ПААТ после инкубации с соед. 3 и облучения УФ-светом в отсутствие (а) и в присутствии (б) соед. 4 (1СГ%).

наблюдали БР-зависимое мачение нескольких полипептидов, в том числе и с ^ 58 кДа. Можно полагать, что дальнейшие исследования дадут более полную картину молекулярной организации как самих тахикининовых рецепторов, так и вероятных мембранных ансамблей с их участием.

В присутствии а-Бт подавлялось ковалентное мечение фотоаффинными производными 5 и 6 полипептида с Мг 7С^2 кДа, а в некоторых случаях также полипептидов - 34 кДа и 29 кДа. Две последние полосы на авторадиограммах имеют очень слабую интенсивность (рис. 8). Полученные данные свидетельствуют о мечении производными ЭР а-Бт-связываюцих компонентов мозга. Т.к. ЭР не предотвращает ко-валентную пришивку к указанным полипептидам, они, по-видимому, являются дополнительными участками связывания фотоактивируемых производных БР.

Обнарукенный нами полипаптид с Мг "70 кДа по своим размерам похок на а-Бт-связиващие компоненты мозга крысы и цыпленка,

1 т - т т т

8 й 8 23 £

£ К- Х- *Г

? & я

Рис. 3. Автор:? циограмш элоктрофореграмм мембран мозга крысы поел- инкубации: А - с производ1шм 5 (10% ПААГ), Б -о производим 6 (7,58 ПААГ),- и облучения УФ-светом р отсутствие (а) БР и а-Бт, в присутствии (б) - БР (Ю-6 М), (в) - в присутствии а-Бт (5'10~6 М).

отвечяг.чнв М„ 65-72 кДа. В мозга краен пока не обнаружены рецепторы а-Ет, способные взаимодействовать с агонистами нАХР, однако в будущем й-.кпя возможность не исклв-юна. Поскольку в данной работе не установлена фармакологическая специфичность дополнительных участков связывания фотоактивируемых проиянодшх, кчлесооб-разно таю® сравнить, как согласуются с размерами суб'юдн^ип из-вестяых иейрпнялышх нАХР молекулярные масс:.' лдонтиф;'а' -чанных нами хкшшеитичов. В целом для субъедшгац нАХР, ви • •• из а:к;га птиц и млекопитающих, характегш Со гида; - ло срав-

нениа с соответствующими им субъеданицами нАХР мышечного типа. Размер идентифицированного нами а-Бт-связывающего компонента с 70-2 кДа наиболее близок к молекулярным массам р или так называемых "не-а" субъединиц нейрональных .солинорецепторов. Несмотря на использование ингибиторов протеаз, в процессе наших экспериментов нельзя исключить возможность протеолитической деградации субъединиц. С этим, по-видимому, связано наличие среди меченных полипептидов таких достаточно низкомолекулярных компонентов, как 34 и 29 кДа, в целом не характерных для нейрональных холшорецепторов и а-Бт-связывающих белков.

Сейчас не вполне ясно, сколько же белков, кодируемых генами семейства холинорецепторов, существует в нервной системе. Так как эти белки отличаются то фармакологическим и структурным свойствам, часто локализуются в разных отделах мозга, они,вероятно, могут выполнять различные физиологические функции. В нашей работе показано, что, по-крайней мере, некоторые из этих белков представляют собой ЭР/а-Бт-связывающие участки и, следовательно, могут быть вовлечены в осуществление физиологических функций ЭР.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что некоторые низкомолекулярные блокаторы никотинового ацетилхолинового рецептора (й-тубокурарин, фенцик-лидин, трифенилметилфосфоний) ингибируют связывание вещества Р с тахикининовыми рецепторами Ж-1 типа в мозге крысы.

2. Обнаружено взаимодействие нейротоксинов змей постстапти-ческого действия с тахикининовыми рецепторами ЛК-1, МК-2 и Ж-3 типов, эффективность которого зависит от структуры нейротоксина и

типа рецептора: наиболее сильное ингибирование проявляет а-бун-гаратоксин по отношению к NK-I рецепторам из мозга крысы (К1 8-1СГ8 М).

3. Показано, что производные вещества Р, содержащие фотоак-тивируемые группы в положениях I или 3, взаимодействуют с NK-I рецепторами и дополнительными связывающими центрами в мозге крысы; специфические фотоиндуцированные сшивки, подавляемые а-бун-гаротоксином, образуются только с последними..

4. На основании анализа влияния холинергических лигандов и нейротоксинов на равновесное связывание производных вещества Р с мембранами мозга крысы и на образование фотоиндуцируемых сшивок выдвинута гипотеза о том, что а-бунгаротоксинсвязывающиэ полипептиды с невыясненной функцией, отличные от известных нейроналышх и мышечных холинорецепторов, являются частью тахикшшювых рецепторов или тесно с ними ассоциированы.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Лазакович Е.М., Мутуле Н.Э., Уткин D.H., Цетлин В.И. Взаимодействие циклических аналогов вещества Р с мембранами мозга крысы. - Биоорган, химия, 1988, т. 14, № 3, с. 313-317.

2. Лазакович Е.М., Уткин Ю.Н., Мутулис Ф.К., Цетлин В.И., Иванов В.Т. Идентификация тахикининсвязывающего полипептида в мембранах мозга крысы. - Биол. мембраны, 1988, т. 5, № 3, с.233-239.

3. Utkln Yu.N., Lazakovlch Е.М., Kasheverov I.E., Tsetlln V.l. a-Bungarotoxin Interacts with the rat brain tachykinin receptors. - FEBS Lett., 1989, v. 255, N 1, p. 111-113.

4. Уткин Ю.Н., Лазакович Е.М., Кашеверов И.Е., Архиповз С.Ф., Цетлин В.И. Тахикининовыэ рецепторы мозга крысы связывают а-Оунгаротоксин. - Биоорган, химия , 1989, т. 15, А 8,

с. 1030-1036.

5. Yu. N. Utkln, Е.М. Lazakovlch, A.A.Kaydalov, I.E.Kasheverov, V.I.Tsetlln. A study on the rat brain receptors ior tachykinins and muramyl peptides. - In: International symposium on receptors and Ion channels. J. ol Protein Chem.,1989,

v. 8, N 3, p. 368-370.

6. E.M.Лазакович, С.В.Егорова, В.П.Голуйович, Ю.Н.Утккн,

В.И.Цетлин. Синтез и исследование связывания с мозгом фрагментов и химически модифицированных производных вещества Р. -Сборник тезисов 9 Советско-индийского симпозиума по химии природных соединений, Рига, 1939, с. 8

7. V.I.Tsetlln, Yu.N.Utkln, E.M.Lazakovich and A.A.Kaydalov. Tachykinin and glycopeptlde binding sites In rat brain. -In: Second Forum on Peptides (eds. A.M.Marraud, B.Vltoux), 1989, V. 174, p. 171-174.

8. V.I.Tsetlln, Yu.N.Utkln, E.M.Lazako?lch. Sensitivity ol rat brain tachykinin receptors to nicotinic acetylcholine receptor ligands. Symposium on neuropeptides and lmmunopeptides, New-York, 1989, Abstracts, N 25.

Подписано н печати Ай. о/ 90, AT H030 Фзриаг £0x84 Усл. печ.л. <f,4 Тираж -ICC экз. Беодаагно. Заяаз 3GJ7. ШП БелНИИНТЙ. 220004, Минск, пр. Ыаиерова, 23.