Выделение и структурный анализ полипептидных токсинов из яда скорпионов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

/ 7 / ^ ,

^'.ч --лл^ 3 «у ■ол.'**' :■» у,-

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

На правах рукописи

Козлов Сергей Александрович

УДК

Выделение и структурный анализ полипептидных токсинов из яда скорпионов

02.00.10 Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук

Научный руководитель: членкор. РАН, доктор химических наук, профессор Е.В.Гришин

Москва -1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................5

II. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ТОКСИНОВ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С К+-КАНАЛАМИ (обзорлитературы).........................7

И. 1. Введение..........................................................................................................................7

II. 2. ТИПЫ К+-каналов..........................................................................................................7

II. 3. Природные токсины ингибиторы К+-каналов..................................................11

II. 3.1. "Длинные" токсины ингибиторы К+-токов...............................................................11

II. 3.2. Апамин и MCD пептид - нейротоксины из яда пчелы Apis mellifera.....................16

II. 3.3. Нейротоксины из яда скорпионов..............................................................................19

II. З.З.а) Токсины, обладающие широкой специфичностью к разным типам калиевых

каналов.....................................................................................................................24

II. 3.3.Ь) Токсины, специфичные к потенциал-активируемым К+-каналам задержанного

выпрямления...........................................................................................................29

II. 3.3.с) Токсины, специфичные к потенциал-активируемым К+-каналам А-типа.........30

И. 3.3.d) Токсины, специфичные к Са++-активируемым К+-каналам большой

проводимости (ВК-типа).......................................................................................31

II. 3.3.е) Токсины, специфичные к Са++-активируемым К+-каналам малой

проводимости (SK-типа)........................................................................................32

II. 3.4. Токсины, выделенные из морских анемон и пауков, демонстрируют новый тип

пространственной организации молекулы.............................................................34

II. 4. Заключение...................................................................................................................37

III. РЕЗУЛЬТА ТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................................39

III. 1. Исследование влияния цельного яда скорпиона Orthochirus

scrobiculosus на ингибирование проводимости к+-токов в культуре клеток NG 108-15.....................................................................................................39

III. 2. Исследование влияния цельного яда скорпиона Burnus eupeus на

ингибирование М-токов в культуре клеток NG 108-15..............................40

III. 3. Получение препаратов яда....................................................................................42

III. 4. Стратегия выделения токсинов...........................................................................43

III. 5. Выделение токсина ВеКм-1 из яда скорпиона Burnus eupeus...................43

III. 6. Исследование влияния токсина ВеКм-1 на ингибирование М-токов в

культуре клеток NG 108-15...................................................................................46

III. 7. Определение первичной структуры ВеКм-1.....................................................47

III. 8. Выделение токсина OsK-1 из яда скорпиона Orthochirusscrobiculosus49

III. 9. Определение биологической активности промежуточных фракций и токсина OsK-1 в электрофизиологических экспериментах на культуре клеток NG 108-15...................................................................................53

III. 10. Определение первичной структуры OsK-1......................................................54

III. 11. Сравнительный анализ первичных структур токсинов OsK-1 и ВеКм-155

III. 12. Анализ пространственной организации токсина OsK-1...........................57

IV. МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................61

IV. 1. Материалы...................................................................................................................61

IV. 1.1. Оборудование..............................................................................................................61

IV. 1.2. Расходные материалы.................................................................................................61

IV. 1.3. Реактивы и ферменты.................................................................................................62

IV. 1.4. Клетки...........................................................................................................................63

IV. 1.5. Растворители и основные растворы..........................................................................63

IV. 1.5.а) Хроматографические буферные растворы............................................................63

IV. 1.5.Ь) Буферные растворы для электрофореза................................................................64

IV. 1.5.с) Растворы для проведения электрофизиологических экспериментов.................65

IV. 2. Методы..........................................................................................................................65

IV. 2.1. Получение и первичное фракционирование ядов...................................................65

IV. 2.1 .а) Получение яда скорпионов.....................................................................................65

IV. 2.1 .Ь) Первичное фракционирование яда скорпиона Buthus eupeus.............................66

IV. 2.1.с) Первичное фракционирование яда скорпиона Orthochirus scrobiculosus...........66

IV. 2.1.d) Проведение гель-фильтрационной хроматографии............................................66

IV. 2.1 .е) Анализ полученных фракций электрофорезом............................................67

IV. 2.2. Выделение полипептидных токсинов.......................................................................68

IV. 2.2.а) Выделение ВеКт-1...................................................................................................68

IV. 2.2.Ь) Выделение ОзК-1.....................................................................................................69

IV. 2.2.с) Анализ чистоты полученных фракций методом капиллярного электрофореза70

IV. 2.2.ф МАЛДИ-анализ молекулярной массы токсинов.................................................70

IV. 2.3. Определение первичной структуры белков..............................................................70

IV. 2.3.а) Восстановление и модификация 8Н-групп остатков цистеина..........................70

IV. 2.3.Ь) Ферментативное расщепление полипептидной цепи...........................................71

IV. 2.3.с) Определение М-концевого аминокислотного остатка.........................................72

IV. 2.3.ф Определение С-концевого аминокислотного остатка.........................................72

IV. 2.3.е) Раскрытие заблокированного 1Ч-концевого аминокислотного остатка............72

IV. 2.3.1) Определение И-концевой аминокислотной последовательности методом

Эдмана.....................................................................................................................73

IV. 2.4. Компьютерный анализ белковых последовательностей........................................73

IV. 2.5. Анализ биологической активности токсинов и промежуточных фракций..........73

IV. 2.5.а) Определение концентрации белка..........................................................................73

IV. 2.5.Ь) Электрофизиологические исследования................................................................74

V. ВЫВОДЫ.............................................................................................................................77

VI. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................................78

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................81

I. ВВЕДЕНИЕ

Уже давно нейротоксины из яда скорпионов используются как инструмент исследования процессов передачи нервного импульса в нейроне. Яд скорпионов состоит из большого количества токсических компонентов белковой природы, каждый из которых воздействует на свой тип мишени. Традиционно мишенями, или объектами, подвергающимися воздействию со стороны нейротоксинов, считаются экспонированные на нейрональной мембране белки, входящие в состав ионных каналов различной специфичности и проводимости.

На настоящий момент, детально исследованы токсины различных видов скорпионов, как обитающих на территории бывшего СССР, так и скорпионов африканского и американского континентов. Наиболее токсичные из них обладают способностью блокировать проводимость Ыа+-токов в нервных клетках. Эти токсины наиболее представлены в яде в % отношении и обладают видовой специфичностью действия. Кроме токсинов, блокирующих токи №+, в яде скорпионов обнаружено и охарактеризовано большое количество токсинов, блокирующих токи К+. К^токи необходимы нервной клетке для выравнивания мембранного потенциала после прохождения потенциала действия. Разнообразие К+-каналов очень широко, и с каждым годом в литературе описываются все новые и новые типы К^-каналов, обнаруживаемые в различных тканях животных.

Для К'-каналов, активируемых ионами Са++ или потенциалом, обнаружено большое количество белковых ингибиторов, обладающих различной степенью сродства к тем или иным типам ^-каналов. Для изучение транспорта ионов 1С1" через клеточную мембрану, как части общего процесса передачи сигнала, характеристики и подразделению ^-каналов на отдельные группы важной задачей становится выделение новых высокоспецифичных молекул, которые могли бы использоваться в последующих исследованиях как биоспецифические лиганды к каждому определенному типу ^-канала.

В настоящее время, из яда различных пауков, скорпионов, змей и морских организмов выделен ряд полипептидных нейротоксинов, обладающих селективным действием на некоторые типы калиевых каналов. Во многих случаях они оказались весьма полезными инструментами для характеристики каналов. Однако, ни один из известных пептидных блокаторов К^-каналов не воздействует на \С -канал М-типа.

Предварительные работы, проведенные в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН, показали, что цельный яд среднеазиатских скорпионов Buthus eupeus (Ве) и Orthochirus scrobiculosus (Os) содержит большое количество коротких полипептидных токсинов, способных ингибировать К'-токи.

Основной целью данной работы было выделение и определение первичной структуры новых полипептидных токсинов, ингибирующих К'-токи определенного типа.

В работе представлено выделение из цельного яда скорпиона Buthus eupeus первого активного полипептида, способного ингибировать lC-токи М-типа, и выделение полипептидного токсина из цельного яда скорпиона Orthochirus scrobiculosus, специфично взаимодействующего с редким типом Са++-активируемого К'-канала малой проводимости.

Автор глубоко признателен научному руководителю член-кор. РАН, профессору Е.В. Гришину за оказанное внимание, руководство и поддержку, а также к.х.н. К.А. Плужникову и к.х.н. Т.М. Волковой за помощь при проведении экспериментальной работы. Автор благодарен за помощь на отдельных этапах данной работы сотрудникам учебно-научного центра ИБХ РАН, особенно признателен к.х.н. Е.Д. Носыревой и к.х.н. A.B. Филиппову за проведение электрофизиологических исследований по определению биологической активности выделенных соединений, а также всему коллективу лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов.

П. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ТОКСИНОВ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С К+-КАНАЛАМИ

(обзор литературы)

П. 1. Введение

Природные токсины являются высокоспецифичными инструментами исследования функций биологических систем на молекулярном уровне. Особую группу составляют нейротоксины, с высокой селективностью воздействующие на те или иные компоненты центральной и периферической нервной системы. Многие из них были выделены в индивидуальном виде и детально изучены. С их помощью охарактеризованы различные семейства ионных каналов и нейрорецепторов. С применением нейротоксинов была получена ценная информация о ключевых механизмах передачи нервного возбуждения, ионного и молекулярного транспорта у млекопитающих и насекомых. Использование нейротоксинов совместно с новыми методами молекулярной биологии позволило выявить чрезвычайное многообразие рецепторов и каналов в нервной клетке [1,2,3].

«""-каналы играют ключевую роль в процессах клеточной возбудимости и в стабилизации мембранного потенциала нейронов. В настоящее время они обнаружены во всех типах клеток. Участие К'-каналов в самых разнообразных биологических процессах, протекающих в живых системах, обуславливает многообразие их форм и подтипов. Детальное изучение молекулярных аспектов взаимодействия нейротоксинов различной специфичности с молекулами К+-каналов позволяет приблизиться к конструированию новых молекул, являющихся основой для создания лекарственных форм нового поколения [4].

П. 2. типы К+-каналов

При классификации ионных каналов рассматриваются их основные свойства: ионная селективность, проводимость одиночного канала, кинетика активации и инактивации, зависимость от мембранного потенциала и т.д. Помимо этого, для детальной дифференциации типов и подтипов каналов

часто используют различные ингибиторы, в роли которых могут быть как ионы Са++, Ва++ или малые органические молекулы (тетраэтиламмоний, хинин...), так и полученные из природных источников полипептидные токсины.

Таблица 1. Современная классификация типов К+-каналов. Внизу приведены значения проводимости каналов в пикоСименсах.

КАЛИЕВЫЕ КАНАЛЫ

- Потенциал-активи руемые

КV Ш КУ5 КА шшшшшшшшш КЭР

выпрямляющиеся неинактнвирующиеся выпрямляющиеся быстроакгивируемые неинактивирующиеся вьшрямляющиеся медленноакгивируемы е неинактивирующиеся (А-каналы) скоротечные направленные наружу выпрямляющиеся направленные внутрь саркоплазматического ретикулума

5-60 рв <1-20 рБ 5-30 р8 180 рЭ

-Са++-активируемые

ВКСа 1КСа ЭКСа БКСа'

большой проводимости средней проводимости малой проводимости апамин чувствительные малой проводимости апамин нечувствительные

100-250 рБ 18-50 р8 6-14 рБ 9-10 рБ

-Управляемые рецептором

КМ КАС11 К5-НТ

(М-каналы) мускарин- инактивируемые 5-18 р8 мускарин-активируемые 7-50 рБ 5-НТ-инактивируемые 55 р8

-Прочие

КАТР КМа КУо1

АТФ-чувствительные 5-90 р8 Ка-активируемые 220 рЭ чувствительные к изменению объема 16-40 рЭ

Калиевые каналы - комплексные мембранные белки, образующие высокоселективные поры в клеточной мембране. В настоящее время идентифицировано около двух десятков различных типов данных каналов. Можно выделить четыре основные категории К^-каналов: 1) потенциал-активируемые каналы; 2) Са++-активируемые каналы; 3) каналы управляемые рецепторами; 4) прочие каналы [5]. Таблица 1 схематично представляет разделение К+-каналов на вышеперечисленные типы.

Потенциал активируемые каналы в основном подразделяются по времени нахождения канала в открытом состоянии:

- на каналы задержанного выпрямления, которые после прохождения по аксону возбуждающего импульса, деполяризующего клеточную мембрану, активируются и остаются в открытом состоянии продолжительное время до нескольких сотен миллисекунд [6];

- на скоротечные каналы (А-типа), быстро активирующиеся и инактивирующиеся после прохождения возбуждающего импульса по аксону со средним временем открытого состояния около 1 миллисекунды [6,7];

- на каналы входящего выпрямления, выравнивающие потенциал при гиперполяризации мембраны (значение потенциала ниже нормального мембранного потенциала равного ~-50 мВ), направляя ток К+ внутрь клетки, имеющие незначительную проводимость при деполяризации мембраны и нахождением в открытом состоянии до нескольких сотен миллисекунд [5,8].

Группа Са++-активируемых ^-каналов отличается еще большим разнообразием канальных свойств. Их подразделяют в основном по величине проводимости того или иного канала:

- наиболее изученные каналы большой проводимости (ВК-каналы), 100-250 пикосименсов, которые встречаются в клетках нервных, мышечных и эндокринных тканей [9], отвечают за клеточную реполяризацию, за механизм регуляции нейроэндокринной секреции и принимают участие в процессах мышечного сокращения;

- Са++-активируемые К+-каналы малой проводимости (БК-каналы), которые отличаются повышенной чувствительностью к присутствию ионов Са++, блокируются малыми концентрациями апамина и имеют проводимость 6-14 пикосименсов [10];

- каналы с малой проводимость, около 10 пикосименсов, нечувствительные к апамину (БК'-каналы) [11];

- каналы средней проводимости, 18-60 пикосименсов, обнаруженные в нейронах моллюсков и эритроцитах, которые также относятся к апамин-нечувствительным каналам [5,12].

Каналы, управляемые рецепторами, и каналы, отнесенные к типу Прочие, (Таблица 1) участвуют во многих важных внутриклеточных процессах. Они лишь в той или иной мере блокируются двухвалентными катионами и низкомолекулярными органическими соединениями. На сегодняшний день пока еще не найдены специфические полипептидные блокаторы для этих типов К^-каналов.

Во многом благодаря молекулярно-генетическому подходу обнаружена большая группа генов потенциалзависимых К^-каналов. Работы по экспрессии этих генов в различных системах позволили выявить несколько важных структурных элементов каналов, вовлеченных в процесс активации, инактивации и ионной проницаемости [2,8,13]. кДНК, кодирующая все основные типы потенциалзависимых К'-каналов, выделена из генов Shaker, Shaw, Shab, Shal плодовой мушки Drosophila melanogaster [14,15,16], а также коры головного мозга мышей и крыс [17,18,19]. Первичные структуры каналообразующих белков во всех случаях высокогомологичны, но каналы отличались своими кинетическими свойствами, что возможно объясняется альтернативным сплайсингом в процессе экспрессии молекул К+-каналов [15].

Выявленное количество К'-каналов к настоящему моменту огромно, но они имеют большой уровень гомологии первичной и, вероятно, пространственной структуры, обладая специфичными для каждого канала биофизическими свойствами. Использование природных нейротоксинов шир�