Клонирование генов полипептидных нейротоксинов яда членистоногих тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи УДК 577.112.5:615.919:595.44-114.52.088

Липкин Алексей Валерьевич

"Клонирование генов полипептидных нейротоксинов

яда членистоногих "

Специальность 02:00.10 - Биоорганическая химия, химия природных

и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н., член-кор. РАН, профессор ГРИШИН Е.В.

МОСКВА -1999

1. ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................5

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

«МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТОКСИНОВ ПАУКООБРАЗНЫХ»..................8

2.1 Введение..................................................................................................................8

2.2 Анализ структуры сигнальных пептидов и 3'- нетранслируемых последовательностей кДНК, кодирующих токсины скорпионов..............................11

2.3 Анализ кодирующей последовательности кДНК.................................................14

2.4 Клонирование геномной ДНК..............................................................................18

2.5 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей токсинов скорпионов, выведенных на основе последовательности их кДНК........................19

2.6 Семейства гомологичных токсинов из яда паукообразных................................26

2.7 Пространственное строение токсинов пауков....................................................30

2.8 Заключение............................................................................................................33

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................35

3.1 Выделение и анализ РНК из ядовитых желез пауков и тельсонов скорпиона. 35

3.2 Семейство токсинов из яда скорпиона О. scrobiculosus....................................37

3.2.1 Синтез первой цепи кДНК на основе poly (А)+-мРНК чёрного скорпиона......38

3.2.2 Клонирование кДНК, кодирующей Os3 близкородственные полипептиды. ..38

3.2.3 Нуклеотидные последовательности кДНК семейства Os3R...........................41

3.2.4 Анализ аминокислотных последовательностей семейства Os3R................... 42

3.2.5 Масс-спектрометрический анализ цельного яда Orthochirus scrobiculosus ..45

3.2.6 Клонирование кДНК, кодирующей полипептидный инсектотоксин Osl-1 из яда скорпиона О. scrobiculosus..........................................................................47

3.2.7 Нуклеотидная последовательность токсина Osl-1..........................................48

3.2.8 Структурный анализ аминокислотной последовательности инсектотоксина Osl-1 из яда чёрного скорпиона.........................................................................49

3.3 Семейство полипептидных инсектотоксинов из яда паука Segestria florentina 51

3.3.1 Клонирование кДНК, кодирующих семейство инсект-специфических нейротоксинов из яда паука S. florentina...........................................................52

3.3.2 Нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующих семейство инсектотоксинов из яда паука Segestria florentina............................................53

3.3.3 Структурный анализ аминокислотных последовательностей семейства инсектотоксинов из яда паука Segestria florentina............................................55

3.3.4 Анализ аминокислотной последовательности токсина БРИ..........................57

3.4 Низкомолекулярные полипептиды из яда паука каракурта (1_а1тос1есШ5 тайапэ ^ес1еатдииаШз)...........................................................................................58

3.4.1 Клонирование кДНК, кодирующей низкомолекулярные белковые копоненты яда ¡-а^схЗесШз та^апэ (гес1еатдиНа№з.......................................................... 59

3.4.1.1 Синтез кДНК....................................................................................................59

3.4.1.2 Получение библиотеки кДНК в плазмидном векторе рЭР65.......................61

3.4.1.3 Поиск клонов, содержащих ген низкомолекулярного белка........................62

3.4.2 Нуклеотидная последовательность структурного гена низкомолекулярного белка....................................................................................................................65

3.4.3 Анализ аминокислотной последовательности низкомолекулярного белка... 67 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................70

4.1 Материалы.............................................................................................................70

4.1.1 Оборудование.....................................................................................................70

4.1.2 Реактивы и ферменты........................................................................................70

4.1.3 Биологический материал...................................................................................72

4.1.4 Олигонуклеотидные зонды................................................................................72

4.1.5 Бактериальные штаммы и плазмидные векторы.............................................72

4.1.6 Микробиологические среды и растворы...........................................................72

4.1.7 Буферные растворы для проведения электрофореза....................................73

4.1.8 Растворы для приготовления ПААГ..................................................................73

4.1.9 Растворы для гибридизации нуклеиновых кислот...........................................74

4.1.10 Фотографические растворы............................................................................74

4.2 Методы...................................................................................................................74

4.2.1 Приготовление раствора тРНК..........................................................................74

4.2.2 Выделение РНК и ее анализ.............................................................................74

4.2.3 Синтез кДНК........................................................................................................77

4.2.4 Получение библиотеки кДНК.............................................................................79

4.2.5 Скрининг библиотеки кДНК с помощью радиактивно меченых зондов..........81

4.2.6 Выделение и анализ клонов, дающих положительный сигнал гибридизации.83

4.2.7 Приготовление компетентных клеток для электропорации............................83

4.2.8 Выделение высокоочищенной суперскрученной плазмидной ДНК................84

4.2.9 Клонирование кДНК методом З'-концевой амплификации в ПЦР..................85

4.2.10 Отбор рекомбинантных клонов.......................................................................86

4.2.11 Определение нуклеотидной последовательности кДНК по методу Максама-Гилберта (на твердом носителе).....................................................86

4.2.12 Определение нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера........90

4.2.13 Компьютерный анализ нуклеотидных и белковых последовательностей... 92

4.2.14 Масс-спектрометрический анализ...................................................................92

5. ВЫВОДЫ.................................................................................................................93

6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................94

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................95

1. ВВЕДЕНИЕ

Природные токсины являются ценными инструментами исследования функций биологических систем на молекулярном уровне. Особую группу составляют нейротоксины, с высокой специфичностью воздействующие на те или иные компоненты нервной системы. Их изучение оказало огромное влияние на прогресс в области нейрохимии и нейробиологии, позволило идентифицировать и охарактеризовать некоторые ионные каналы, нейрорецепторы и другие белки, участвующие в процессах нейросекреции и нейрорегуляции. Хорошими примерами этому могут служить ацетилхолиновый рецептор никотинового типа, ГАМК-активируемый С1"-канал, потенциал зависимые Ыа+- и Са2+- каналы. Использование нейротоксинов позволило выявить чрезвычайное разнообразие рецепторов и каналов в нервной системе, подтвержденное в последние годы данными молекулярной биологии. Удивительная способность многих нейротоксинов специфически взаимодействовать с определенным подтипом того или иного рецептора или канала позволяет детально изучить их роль в различных процессах, происходящих в нервной системе. Многообразие клонированных подтипов рецепторов и каналов стимулирует поиск новых высокоселективных нейротоксинов. В этом поиске заметно возрастает роль современных методических возможностей молекулярной биологии [1]. Скрининг библиотек кДНК, основанный на структурной гомологии, а также различные методы на основе полимеразной цепной реакции [2] позволяют идентифицировать компоненты, присутствующие в яде или тканях организма в ничтожных количествах.

Фундаментальные проблемы современных нейрохимиии и нейробиологии -не единственная область применения нейротоксинов. В последние годы резко возрос интерес к другому свойству, присущему многим нейротоксинам - видовой специфичности (таксоспецифичности) их действия и ее молекулярным основам.

Выяснение механизмов таксоспецифичности может способствовать созданию пестицидов нового поколения с высокой избирательностью действия. Интересными примерами в этой области являются работы [3, 4], в которых удалось использовать экспрессирующую систему на основе бакуловирусов для создания высокоэффективных инсектицидов. Другой областью практического использования данных о молекулярных основах действия нейротоксинов является создание новых лекарств. Детальное изучение поверхности контакта нейротоксина и его рецептора служит основой для создания расчетных молекулярных моделей этого взаимодействия, которые могут быть использованы для направленного конструирования высокоселективных лекарственных препаратов.

Среди представителей типа Членистоногие (Апкгоройа) обнаружено большое количество нейротоксинов, обладающих различными механизмами действия. Наиболее распространенными молекулярными мишенями этих токсинов являются ионные каналы. Блокирование ионных каналов или модификация их характеристик быстро приводит к параличу и гибели жертвы, чем, по-видимому, и объясняется широкое распространение токсинов данного типа. Большинство изученных нейротоксинов, действующих на ионные каналы, обладает рядом сходных принципов структурной организации и механизма действия. Как правило, это полипептиды, состоящие из 30-80 а.о., имеющие жесткую пространственную структуру, стабилизированную несколькими дисульфидными связями. Для многих из них характерны различные пост трансляционные модификации, например, отщепление С-концевого ди-(три-)пептида, амидирование С-концевой аминокислоты или образование А^-концевого остатка пироглутаминовой кислоты. Механизм действия этих токсинов обычно заключается в простом взаимодействии с областью молекулярных ворот ионного канала. Одним из наиболее известных и хорошо изученных примеров нейротоксинов этого типа является семейство пептидных токсинов из яда скорпионов, избирательно действующих на Ка+-, К+-, Са2+- или

СЬканалы [5 - 8]. Другим характерным примером могут служить токсины пептидной природы, выделенные из яда пауков Agelenopsis aperta - агатоксины [9] и Plectreurys tristis - плектотоксины [10, 11] - модификаторы Na+- и Са2+- каналов.

В состав большинства исследованных ядов членистоногих входят семейства высоко гомологичных токсин-подобных белковых молекул. Представительность в яде отдельных полипептидов из этих семейств колеблется от тысячных долей процента и редко, когда достигает 2%. На сегодняшний день нет четкого объяснения такому многообразию близких по структуре полипептидов. Некоторые из них являются токсинами, другие по своей первичной структуре похожи на токсины, но пока не удается точно установить функции этих белков. Можно предположить, что токсины членистоногих произошли от небольшого числа генов-предшественников, которые дуплицировались, и отдельные гены-дупликанты подвергались различному селективному отбору. Эта гипотеза может быть одним из вероятных объяснений огромного количества высоко гомологичных токсинов членистоногих.

Данная работа является частью комплексного исследования новых биологически активных компонентов ядов членистоногих, проводимого в ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в рамках структурно-функционального изучения полипептидных нейротоксинов, действующих на различные классы животных. Цель работы состояла в клонировании кДНК, кодирующих отдельных представителей и целые семейства токсин-подобных полипептидов из различных видов членистоногих.

Автор выражает признательность своему научному руководителю д.х.н., член-кор. РАН, профессору Е.В. Гришину, к.х.н. Т.М. Волковой, к.х.н. Е.Д. Носыревой, к.х.н. К.А. Плужникову, а также всему коллективу лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов за постоянную помощь, внимание, многочисленные дискуссии и ценные советы в работе. Автор также признателен к.х.н. Н.С. Быстрову за синтез олигонуклеотидных зондов.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТОКСИНОВ ПАУКООБРАЗНЫХ»

2.1 Введение

Яд членистоногих, как правило, состоит из большого количества низкомолекулярных белковых компонентов, которые токсичны для различных классов животных, включая человека. Для отдельных токсичных компонентов, выделенных из яда членистоногих, характерна таксоспецифичность действия. Так, например, из яда скорпионов «Старого» и «Нового Света» выделены токсины, избирательно воздействующие на млекопитающих [12, 13] и на насекомых [14]. В то же время, найдены токсины, активные по отношению к обеим группам животных, а также действующие на ракообразных [15 - 17]. Кроме того, даже среди токсинов, действующих на млекопитающих, обнаружены токсины обладающие разными механизмами действия. Токсины а-типа, найденные, в основном, у скорпионов «Старого Света», связываются с тремя участками Ма+-канала [18]. Связывание зависит от мембранного потенциала и приводит к замедлению инактивации канала. а-Токсины не влияют на активацию и стабилизируют канал в открытом состоянии. В отличии от них токсины Р-типа, обнаруженные у скорпионов «Нового Света», оказывают влияние на активацию, сдвигая ее в область более положительных потенциалов. Они связываются с четырьмя участками На+-канала [19]. В литературе описаны также токсины у-типа, выделенные из яда скорпиона ТЫуш serru.la.tus [13], которые отличаются от токсинов (3-типа тем, что сдвигают кривую активации канала в область более отрицательных потенциалов.

Большинство инсектотоксинов можно разделить на две группы, отличающиеся по механизму действия: на возбуждающие и депрессантные инсектотоксины [14]. Возбуждающие инсектотоксины, обнаруженные в яде скорпионов [20], подобно a-токсинам, замедляют инактивацию Ка+-каналов насекомых, однако их связывание с каналом не зависит от мембранного потенциала. Депрессантные инсектотоксины из яда скорпионов [21, 22] могут конкурировать с возбуждающими токсинами за места связывания с каналом, но, в отличие от последних, вызывают полную деполяризацию мембраны и блокаду передачи нервного импульса.

Такая классификация токсинов удобна, но не абсолютна. Так, токсин АаН1Т4 из яда скорпиона Androctonus anstralis Héctor [15] сочетает в себе свойства токсинов [3-типа и возбуждающих инсектотоксинов. Токсин LqhaIT из яда скорпиона Leiurus quinquestriatus hebraeus [14, 16] действует на каналы млекопитающих и насекомых подобно a-токсинам, хотя его связывание не зависит от мембранного потенциала. В то же время его действие на насекомых отличается от действия и возбуждающих, и депрессантных инсектотоксинов.

В настоящее время интенсивно исследуются полипептидные токсины скорпионов, которые, благодаря своей низкой молекулярной массе и высокой стабильности структуры, являются превосходной моделью для исследования структурно - функциональных взаимодействий молекул белковой природы и уникальным инструментом для изучения механизма действия ионных каналов. Токсины скорпионов способны в пико- и наномолярных концентрациях взаимодействовать с каналами и изменять их характеристики. Содержание этих токсинов в яде скорпионов может достигать нескольких процентов от общей массы белков, они являются главными биологически-активными компонентами яда. Относительно недавно были использованы современные методы молекулярной биологии для клонирования, мутагенеза и гетерологической экспрессии генов,

кодирующих токсины скорпионов. Первое сообщение о клонировании генов из скорпиона Atulroclonus australis Hector (АаН) относится к 1989 году [23]. В этой работе были опубликованы четыре структуры кДНК, кодирующие токсины, действующие на млекопитающих, и три последовательности кДНК, кодирующие токсины специфичные для насекомых.

Целью данного обзора является: 1. представление информации, полученной в результате клонирования и определения нуклеотидной последовательности генов токсинов скорпионов, действующих на Ма+-каналы различных видов животных;

2. рассмотрение молекулярной организации семейств высоко-гомологичных токсинов на примере полипептидов (3-8 кДа), выделенных из ядов паукообразных;

3. описание общих принципов пространственной организации токсинов паукообразных. В обзоре также описываются особенности строения сигнальных пептидов и З'-нетранслируемых областей последовательностей кДНК, кодирующих токсины скорпионов, экзон-интронная организация генов этих токсинов. Значительное внимание уделено сравнению первичных и вторичных структур зрелых токсинов скорпионов, действующих на Ма+-каналы животных и имеющих различную видовую специфичность, и различающихся по механизмам функционирования, а также взаимосвязи структуры токсина с его функцией. Рассматриваются также механизмы процессинга зрелых токсинов из их предшественников.

кДНК, кодирующие нейротоксины из семейства скорпионов Androclonus, Cenîruroides, Leiurus, Tityns и Buthus, действующих на Ыа+-каналы различных видов животных, были клонированы и бы�