Выделение, частичная структурная характеристика токсинов из яда LATRODECTUS PALLIDUS и исследование спектра биологической активности яда некоторых пауков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

1" • од

на правах рукописи-

Ада Рут Чарвхв Бэр

ВЫДЕЛЕНИЕ, ЧАСТИЧНАЯ СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТОКСИНОВ ИЗ ЯДА ГАШШЕСТиБ РАЬЫШБ И ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРА БИОЛОГИЧЕСКОМ АКТИВНОСТИ ЯДА НЕКОТОРЫХ ПАУКОВ

02.00.03 - Органическая химия 03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Российской университете дружбы народов и в Институте биоорганической хишш им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор

кандидат химически* наук

А.К. Молодкин К.А. Плужников

Официальные опоненты:

доктор химических наук, профессор М.П. Коротевв доктор хииических наук, профессор В.М. Степанов

Ведущая организация: Институт биохимии их. А.Н.Ваха РАН

Защита диссертации состоится " & " иАШХ^ 1996 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д 053.22.07 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117190, Москва, ул. Орджоникидзе, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан " " (Л-И^МЛ^ 1Э96 г.

УчошЯ секретарь диссертационного совета кандидат химических наук,

доцент

Л,А. Гайворонскяя

Актуальность работы. Выяснение молекулярной организации и принципов функционирования компонентов нервной системы является одной из основных проблем современной органической химии и биохимии. В последнее время в этой области был достигнут значительный прогресс за счет применения генно-инженерных методов и использования нейротоксинов.

Природные нейротоксины обладают высокоспецифичным механизмом действия: они с большой эффективностью связываются с различными компонентами нервных клеток и тем самым влияют на строго определстше стадии проведения нервного импульса. Селективность действия отдельных нейротоксинов позволяет использовать их в качестве инструмента обнаружения, выделения и исследования различных рецепторных и канальных структур, играющих ключевую роль в функционировании нервных клеток. Значительный интерес представляет способность некоторых нейротоксинов действовать на нервную систему только определенной группы тавотных (например, насекомых или позвоночных).

Поиск и структурно-функциональное исследование новых нейротоксинов, изучение молекулярных основ видоспецифичности их действия является важной предпосылкой для создания на их основе высокоэффективных, антинематодных средств, экологически чистых инсектицидов и фармакологических препаратов нового поколения. Одним из наиболее богатых источников для получения молекулярных зондов исследования нервной системы животных являются яды пауков.

В Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН был изучен яд паука Ьаггойесиш та^апв ггсйес1гп§и'Иаию (каракурта). Из него были выделены и охарактеризованы высокоспецифичные токсины . к насекомым, позвоночным и ракообразным. Представляется интересным и полезным исследование компонентов яда близкородственного паука Ьаггойесиш раШсЗиз, изучение их структуры и биологической активности. Проведение сравнительного структурного анализа компонентов ядов двух этих пауков позволит получить важную дополнительную информацию о молекулярных основах высокой специфичности действия этих токсинсз.

Цель работы. Основной целью настоящей работы являлось

- 1 -

сравнительное исследование компонентов яда паука ЬаггрйесЫв раШсЬш с ранее изучетшт токсинами из яда каракурта включая:

1. Характеристику белкового состава и биологической активности яда паука Ьа1:гос1ес-1ив раШЛив. 1

2. Идентификацию и выделение из этого яда ' в индивидуальном виде основного инсектотоксического компонента и токсина для позвоночных. Исследовашш их биологической активности и частичную структурную характеристику. .'

Кроме того, в задачу данной работы входило проведение иымунохимического анализа цельного яда Ьаггойе^иа раШйив с использованием моноспецифических антител к <*-латротоксину -основному токсическому компоненту для позвоночных из яда каракурта.

Научная новизна и практическое значение работы, опервые охарактеризован белковый состав и токсическое действие яда паука Ьаи'ойесгш раШйцв. Выделены в индивидуальном виде и биохимически охарактеризованы два основных токсических компонента этого яда. Определены их молекулярные массы. Установлены Ы-концевые аминокислотные последовательности и для одного из них первичная структура ряда его триптичвских фрагментов. Показана высокая структурная гомология этих токсинов с ранге исследованными «-латротоксином и а-латрс>инсектотоксином из яда каракурта.

Проведение сравнительного структурного анализа компонентов ядов Ьаггойеств раП1с1иа и 1а1гоаес1ив тасгапв ^ейесипаиПагиа позволит получить дополнительную информацию о молекулярных основах высокой специфичности этих токсинов.

Объом и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страшцах машинописного текста и состоит из

зввдакия; обзора литературы, посвященного токсинам из яда пауков; описания материалов и ыачодов исследования; глав, посвященных результатам и их обсуждению; заключения; выводов и списка испольвованной литературы. Работа иллюстрирована рисунками и . фотографиями. Список цитируемой литературы пкитгает Ж Наименований,

OcjioBHoejgoflepMime_pa60TU На первом этапе работы было проведено исследование антинематодной, инсектотоксической активности, а такяе токсического действия нескольких ядов среднеазиатских и южноамериканских пауков (E.niger, Linotftele, L.sittgoriensis, L.pallidUB и др.). На основании полученных данных для дальнейшего исследования был выбран яд паука Latrodectus pallidus, обладающий выраженным токсическим эффектом против насекомых и позвоночных животных.

К моменту начала этой работы была получена достаточно большая структурно-функциональная информация для ряда токсинов из яда Latrodectuo. mactans tredecimguttatus обладающих высокоспецифическим действием на различные классы животных. Известно, что некоторые из этих токсинов при наномолярных концентрациях вызывают массированный и истощающий выброс нейромедиаторов, ведущий к блокаде передачи нервного импульса В настоящей работе впервые проведено выделение, частичная структурная характеристика, шшунохимические анализы и определение биологической активности двух основных токсических компонентов из яда паука семейства batrodectus - Latrodectus pallidus.

На основании ' полученной в диссертационной работе инфорафцш было проведено сравнение структуры и биологической активности этих токсинов с биохимическими характеристиками токсических компонентов из яда близкородственного паука Latrodectus mactans tredecimguttatus.

Xарэктериotjта биологической активности и состава полилептидных компонентов из яда batrodectus pallidus Для проведения скрининга токсичностей • цельного яда Latrodectus pallidus и его фракций в качестве объектов для тестирования были выбрана личинки домашней мухи Musca domestica, личинки хлопковой совки Heliothis verescens, тараканы Nauíoeta сепегеа и лабораторные мыши.

Исследования биологической активности при внутривенном введении экстракта цельного яда Latrodectus pallidus мышам показали, что он обладает достаточно высокой токсичностью для

- 3 -

позвоночных. Летальная доза этого яда составляла 17 иг/кг.,

Яд также обладает ярко выраженной активностью и для различных видов насекомых. Инъекция его во второй грудной сагмент тараканам в дозах от 0.030 до 0.079 мг/г вызывали паралитический и/или латальтый эффект. Аналогичное действие яда наблюдалось для личинок хлопковой совки и домашней мухи в дозах 0.1 и 0.08 иг/г, соответственно.

В целом, токсичность яда Ьаггойесгив раШйив полностью воспроизводила картину интоксикации позвоночных и насекомых цельным ядом Ьа1;го<1ес1ив тасИапв ^ес1ес1т2и"иа1;иб но, аналогичный эффект наблюдался при более высоких дозах.

Для сравнения состава и молекулярных масс белковых . компонентов. ядов Ьаггойес-Ци раШйиэ и ЬаЪгойесгив гоасгапв {геаесХтцииа^в был проведен их электрофоретический анализ в полиакриламидном гела в присутствии, додецилсульфата натрия (ЗЮ-ПААГ).

' • , ..........¿и-.....&.......Ь^КкРа

; _^. • __«_212

*г« ■ ■ 17П $

«уу {$3*— 1/и

. в» геаг? еазг ут^Т ''а-..-';,1;*

_____ ' _ 76 1

Рис. 1. Электрофоретический анализ в 10% БШ-ПМГ: цельный яд ЬгДгойесХив раШсШа (2,3) и цельный яд Глггойеств тас^апв ггейесАтеиИв^ (4,5). В дорожках 2 и 4 внесено по 5 ; мкг и в дорожках 3 и 5 по 8 мкг цельного яда. Дорожки 1 и 6 - смесь стандартных маркерных белков (сверху вниз): миозин, а-2-макроглобулин, ■р-гялактозидаза, траисферрин, глутэмат дегидрогеназа.

Согласно электрофоретическому анализу (Рис.1), яды L.pallidus и b.mactans tredecimguttatus представляют собою многокомпонентные белковые смеси и в основном состоят из двух групп белков с молекулярными массами 60-70 и 100-130 кДа.' При этом высокомолекулярная группа белков (100-130 кДа) является менее гетерогенной в случае яда L.pallldua, что свидетельствует о различии в количестве белков в этом диапазоне молекулярных масс. У L.pallidus представлены по крайней .мере 3 высокомолекулярных белка, в то время как в яде L.mactanB tredecimguttatus имеется не менее 5 (Рис.1). Кроме того, у обоих ядов такие присутствуют компоненты с молекулярными массами 30-45 кДа и в меньшей степени представлены полипептидше компоненты с молекулярными массами 8-14 кДа.

Выделение белковых токсинов с помощью хроматогрэфической системы FPLC На первой стадии разделения яда Latrodeetuo pallldu'e была использована ионообменная хроматография среднего давления с использованием системы FPLC (PHarmacia).

Супернатант, полученный после предварительного центрифугирования экстракта цельного яда парса 20 мМ трис-НС1 буфером, рН 8.0, наносили на колонку с анионообменником MONO Q HR 5/5, уравновешенную тем же буфером. Элхированиэ сорбировашшх белков проводит! 20 Ш трис-HCl буфером, при линейно повышающемся градиенте концентрации (0-1.0 U) NaCl (Рис.2).

Фракции полученные после разделения цельного яда на колонке MORO Q, объединяли на основании электрофоретического анализа хроматографического профиля (Рис.3). Для каждой из Фракций (I-VIII) было проведено биологическое, тестирование на личинках доыаашеЛ мухи и мышах. Было показано, что фракции III, 17, V, VI и VII проявляли активность исключительно против насекомых и только фракция VIII была токсична для позвоночных животных. При инъекции аликвот фракций личинкам мясной мухи Фракция VII вызывала быструю и полную парализацию насекомого с последующей его гибелью через 10 минут, фракции V и VI вызывали такой же эффект, но гибель насекомого наступала через 1 час. Фракции III и IV обладали минимальным токсическим эффектом,

- 5 -

фракции I, II и VIII не оказывали токсического эффекта против насекомых.

номер фракции

Рис. 2. Хроматография 100 мг цельного яда LatrodectuB pallidus , на колонке MONO Q ГО 5/5. Элшрование проводилось 20 иМ трис-НС1 . буфером, рН 8.0 при линейно повышаицеысл градиенте концентрации NaCI. Скорость олшровения 1 мл/мин.

1-Поглощение элюата при >.=280 нм O^qq ) J 2-концентрация NaCI в элюирунцем буфере.

I—VIII - фракции получаемые при фракционировании.

Фракции белков с молекулярными массами в диапазоне 70-130 кДа, проявляющие активность только против насекомых десорбировались' с носителя в области 180-320 мМ NaCI, Тлкеическяе компоненты для позвоночных элшровались при концентрациях 330-380 мМ NaCI. ■

- б -

i в ra

д дь . яд . M,kDa-...... _2Û5

------......... ............

-116 -80

.49

Рис. 3. Электрофоретический анализ в 10% SDS-ПААГ хроматографии цельного ада Latrodectus pall'idus на колонке MONO Q. I-VIII - Фракции используемые для проведения биологического тестирований. Стражами указано положение стандартных маркерных белков (сверху вниз: . миозин, f'-галактозидаза, БСА, овальбумин)".

Фракция белков, несорбирувдаяся в данных условиях на колонке MONO Q, не содержала токсической активности ни для одной из групп тестируемых животных.

При внутривенном введении мышам в дозе 0.7 мг/кг только фракция VIII проявляла выраженную токсичность, в то время как остальные фракции и несорбирупцаяся фракция на колонке MONO Q не проявляли токсического эффекта при введении его мышам в максимальных дозах.

Фракция, десорбирующаяся в области 330-380 ыМ NaCl по электрофоретическому анализу в 10Х SDS-ПААГ ' представляла собой смесь белков. В этой фракции (VIII) как видно из рис.3, одним из основных компонентов является белок с молекулярной массой 120 кДв. . •

Фракции, элшруемые после первой стадии, выделения в области 200-310 мМ NaCl, действующие на насекомых, объединяли и диализовали против 25 мМ Nagffi^ буфера, рН 6.3. Отдиализованную фракцию наносили на колонку MONO Q HR 5/5, уравновешенную тем же буфером. Элшрование сорбированных белков проводили в градиенте концентрации (0-1.0 M) NaCl в присутствии 25 uM N^HP04 буфера, рН 6.3.

После частичного отделения от белковых компонентов с-с молекулярными массами ~70 кДа, к фракциям, обладающим выраженным инсектотоксическим действием и содержащим белки с молекулярными массами 100-120 кДа, добавляли (NH4)2S04 до конечной концентрации 1.7 Н, и наносили на колонку Phenyl

0.5

0.0_

10 15 20 номер фракиии Рис. 4. Хроматография инсектотоксической фракции, содержащей основной инсектотоксин, на колонке MONO Q HR 5/5. Элшрование сорбированных белков проводилось в 20 мМ натрий-фосфатном буфере,' рН 6.5 при градиенте концентрации NaCl. Скорость элгмрования 1 мл/мин. Объем фракций 1 мл.

1-Поглощение элюата при л =280 lot (A,8Q ); 2-концентрация NaCl в элгируицем буфере.

- 8 -

SuperoBe HR 5/5, уравновешенную 50 uM Na^HPO^ буфером, содержащим 1.7 M (WH4)2S04, pH 7.3. После нанесения сорбент отмывали 10 ил стартового буфера и проводили алюированив сорбированных белков тем *е буфером при линейнс пониващемси градиенте концентрации (1.7-0 М) сульфата аммония, Ка этой жо стадии удалось добиться дополнительного отделения от белков о молекулярными массами <„70 кДи.

На последнем этапе очистки основного инсектотокстеского • компонента, основную фракцию содержащую токсин отдиализовяли против 20 мМ NagHPO^ буфера, рН 6.5 и хроматографироваж на колонке MONO Q HR 5/5, уравновешенную тем *е буфером После нанесения хфоводили элшрование сорбированных белков 20 мМ фосфатного буфера, рН 6.5 -при линейно повышающемся градиенте концентрации (0-1.О Ы) NaCl (Рис.4). По данным электрофореза (Рис.5) фракция (17), десорбируюцаяся в области 260-290 мМ NaCl представляла собой электрофоретически ' гомогенный белок с молекулярной массой 120 кДа, имеющий незначительную

Рис. 5. Электрофорез в 10 % SDS-IIAAi фракций (15, 16, 17) после хроматографии на колонке MONO Q. Стрелками ' отмечено позиции стандартных белков, цифрами указаны их молекулярные массы, пр - несорбируюиэяся фракция на носителе.

примесь полипептида с молекулярной массой ~70 кДа

по. 15 16 17" M.kí*-

i-: •»

обладала выраженной токсичность» к тараканам и личинкам домашней мухи.

Таким образом, фракционирование цельного яда L.pallidua о помощью системы ÍTIC дозволило идентифицировать и выделить, основной*инсектотоксичаский компонент и высокоочищенную фракцию, содержащую токсин к позвоночным.

По сходству электрофоретяческих характеристик, а предварительного тестирования биологической активности полученного белка и инсектотоксического компонента из яда каракурта можно предположить, что выделенный инсектотоксин может быть близким гомологом o-латроинсектотоксина из яда Latrodectus m&ctans tredecimguttatue,- Аналогичное предположение было сделано и для полипептидного компонента с молекулярной массой а.120 кДа, содержащегося во фракции обладающей выраженной токсичностью к позвоночным животным.

• Иммунохимичвский анализ .

Моноклональше антитела для проведения иммунохимического анализа' и имиунооорбенты были любезно предоставлены сотрудниками «ИБХ РАН (Пашковым В.Н. и др.).

После электрофоретачвского фракционирования по молекулярным массам компонентов* ядов этих двух , пауков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата йатрия, разделенные белки переносились на нитроцеллюлозные мембраны с помощью электроблоттинга. Полученные нитроцеллюлозные реплики были протестированы на vx способность взаимодействовать с двумя моноклонвльнымк антителами против а-латротоксина - основного токсического компонента из яда Latrodectus mactans tredecijnguttatus (Рис. 6).

Было доказано, что два различных моноклональных антитела ЯЛ-1 и ЯЛ-? специфически связываются с белком с молекулярной массой 120 кДа из яда Latrodectim pallldus. Известно, что данные моноклональные антитела способны ингибировать одну из .функциональных активностей с-лагротоксина, - фузогенную. Поэтому, взаимодействие белка из яда Latrodectus pallIdus с исследуемыми, антителами указывает не только на структурное сходство (наличие одинаковых • аитигенных эпитопов). но и на

- 10 -

С * * * 1

а

II -»-

А ^

Рио. б. йшуноблоттинг цельных ядов Ь.раПИиз (1) к' L.mactano 1ге<1ес1тй1Г»а1;цз (2), с антителами ЯЛ-1 (А) и ЯЛ-7 (В). Стрелками приведены позиции смеси маркерных белков.

вероятность их функциональной гомологии.

Результаты икмунохинического анализе позволили в дальнейшей для выделения этого токсина использовать иммуноспецифическув аффинную хроматографию.

Выделение основного инсектотоксина (с-ИТЛП) и токсина к позвоночным (и-ТЛР из ЬаггоаесХив раШйцз с помощью аффинной хроматографии

Для одноатапного выделения основного инсектотоксина (а-ИТЛП) и токсина к позвоночным (а-ТЛП) била использована аффинная хроматография с помощью иммуносорбентов, представляюцах собой моноспецифические антитела к

а-латроинсектотоксину и а-латротоксину, ковалентно связанные с хроматографическим сорбентом (протеин А - целлопор).

Экстракта цельного яда 50 мМ трис-КС1 буфером, рН 8.0, наносили на аффинную колонку и инкубировали в течение двух часов оря комнатной температуре. Неспецифически сорбировавшиеся на носителе компоненты яда элгаровала последовательно-промывая его буфером, содержащим. 0.1 и 0.5 Ч ШС1. Элюированяа основных токсинов проводили в том же буфере с добавлением 1 М М£С12..

- 11 ~

С помощью электрофоретического анализа в полиакрилаиидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Рис.7) было показано, что э результате аффинной хроматографии удалось выделить а-ИТЛП и «-ТЛП в индивидуальном виде. Оба белка имеют молекулярные массы »120 кДа.

М,*Да \ а 3

по —* **

ИС —+ «м

76 —- —

И к»

i :

I

• : -1

Рис. 7. Электрофоретический анализ в 10 Ж SDS-ПААГ:

б-ИТЛП (3), а-ТЛП (2). Дорожка 1 - смесь стандартных маркерных белков.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности основного инсектотоксина (а-ИТЛП), токсина к позвоночным (g-ТЛП) и продуктов ферментативного гидролиза а-ТЛП Для исследования N-концевой аминокислотной

последовательности 50 рМ а-ТЛП подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия с последующим электропереносом белковой зоны на поливдашлидендифторид (иммобилон).

Для определения N-концевой . аминокислотной

последовательности основного инсектотоксина а-ИТЛП из tatrodectus pallldus, после его выделения с аффинной колонки, брали аликвоту раствора, содержащего 100 рМ этого токсина.

Аминокислотную последовательность иммобилизованного токсина к позвоночным а-ТЛП, основного инсектотоксина с-итлп и продуктов ферментативного гидролиза а-ТЛП определяли с помощью автоматической деградации на газофазном секвенаторе 470А .Applied

- 12 -

Bloeyeterns. В результате анализа удалось определить N-концезые последовательности у о-ИТЛП и «-ТЛП, Число идентифицированных аминокислотных остатков в полипептидных цепях составило от 5 в случае а-ТЛП до 12 у «-ИТЛП. Как видно из таблицы 1. оба токсина содержат на N-конце глутаминовую кислоту.

Таблица 1. Н - концевые аминокислотные последовательности токсинов, полученных из яда паука Latrodectue pallidus.

Токсин Первичная аминокислотная последовательность

«-ТЛП Glu-Gly-Glu-ABn-Leu-

ci-ИТЛП Glu-Met-Ser-X-Ala-Aop-Gln-X-X-Leu-Leu-Ala-Tyr-Tiir-Alii-

Исследование продуктов ферментативного гидролиза а-ТДП

Определение N-концевой аминокислотной последовательности «-ИТЛП и о-ТЛП являлось одним из этапов в исследовании этих двух белков.

С целью получения дополнительной структурной информации об ч-ТЛП было предпринято изучение аминокислотной последовательности продуктов его протеолитического расщепления трипсином. Для максимальной денатурации белка (~6 нМ), проводили восстановление его дисульфидных связей дитиотреитолом в 6 М мочевине.

Кэрбоксиметилирование -SH групп осуществляли с помощью йодуксусной кислоты. После чего, образец днализовали против 50 мМ трис-HCl буфера, pH 7.5, и концентрировали до конечной концентрации 0.3 мг/мл.

Для получения пептидных фрагментов с<-ТЛП к СМ-токсину добавляли трипсин два раза до конечного соотношения фермент-субстрат 1:40 с интервалом времени 10 часов. Реакцию Ферментативного гидролиза проводили в течение 16 часов при 37'С.

По окончании протеолиза триптический гидролизат СМ-.1-ТЛП фракционировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой на колонке Ultrasphere ODS в градиенте концентрации ацетонитрила. В процессе

- 13 -

минуты

Рис. 8, Фракционирование трюттического гидролиэата СМ-а-ТЛП методой ВЭХХ с обращенной фазой на колонке иПгаврЬеге 01)8 <2.0 пто х 25 ст, 5 Весктап в 0.1 X

трифторуксусноЯ кислоте в градиенте концентрации ацетонитрила. Скорость элшрования 0.3 ил/шш.

•хроматографии было получено свыше 160 фракций ' (Рмс.В).

Пептидные фракции отбирали на основании показаний проточного спектрофотометра при длине волны 214 и 280 ни. Рехроматографию полученных пептидных фракций осуществляли ВЭКХ в 10 мМ аммоний ацетатном буфере, рН 5.7 в градиенте концентрации ацетонитрила. На рисунке 9 представлена рехроматография одной из фракций после разделения суммарного трилтического гидролизата.

минуты

Рис. 9. Рехроматогрэфия фракции 22 (рис.6), на колонке ШЛгаврЬеге ОВБ (2.0 ш х 25 сю, 5 ¿лп) Весктап в 1С им аммоний-ацетатном буфере, рН 5.7 при градиента

концентрации ацетонитрила. Скорость элшровакия 0.3 мл/мин.

В целом, в процессе исследования триптических пептидов ч-ТЛП была определена полная или частичная аминокислотная последовательность 6 фрагментов, содержащих в суше 43 аминокислотных остатков. Результаты анализа последовательностей приведены в таблице 2.

При сравнении аминокислотной последовательности пептидов триптического щепления о-ТЛП и Н-концевого фрамента с полной аминокислотной последовательностью я-латротоксина из яда 1д);гос1егии0 та^апс 1гесЗес1пчги'иаШ8 было установлено, что большинство аминокислотных остатков и их положение в сравниваемых последовательностях идентичны. Практически полная гомология была обнаружена для первичной последовательности пептидов 155-1, 22-7, 155-2 из о-ТЛП с участками К-ко:щсвого фрагмента 61-227 а-лт, который, как предполагают, .может

- ¡5 -

Таблица Сравнительный анализ структур Ы-концеаого фрагмента н триптических пептидов а-ТЛП с участками аминокислотной последовательности а-ЛТ.

Накис МЬ фраки« Перинная амшеюгаяная гилязигаыюсп. патшз Погода не вцзти

а-ТЛП а-ЛТ вконец Скг1ш-;Пе*гг1ш Зилш-Пе-Л^Яа! 1-5

п-ТЛП а-ЛТ ~ 755-1 [в^^^Пи-ОшЗг^^еЧаНа! 62-69

а-ТЛП а-ЛТ 22-7 [^Нвтй^гЧуг-Пе 164-168

а-ТЛП о-ЛТ 155-2 186-200

а-ТЛП а-ЛТ (83-87)-Зб ЗпЧш-11е-йгН/и 659-663

а-ТЛП а-ЛТ 129 ий- X -МаЛЫ- X ЧГе 1062-1075

Первая цифра соответствует номеру фракции из рисунка 8, из которой выделен пептид. Последующие цифры - номера фракций после рехроматографии.

проникать внутрь первшх клеточных окончания и принимать участие в кальцийнезависимой стимуляции секреции иейромедиаторов. С другой стороны, в структуре пептида 129 из триптического гидролизата а-ТЛП, гомологичного участку С-концевого фрагмента 1062-1075, обнаружено три замены и одна делеция. Этот участок находится за пределами предполагаемых функциональных доменов молекулы латротоксина и, в связи с этим, консервативность в его аминокислотной последовательности может быть менее выражена.

- 16 -

bjjjb qjyj

1• Охарактеризованы белковый состав и биололгическое действие яда паука LatrodectuB pallidus. Показано, что яд этого паука обладает ярко выраженным токсическим эффектом как для насекомых, так и для позвоночных.

2. С помощью ионообменной хроматографии из яда паука Latrodectus pallidus был выделен основной инсектотоксип («-ИТЛП) в аналитических количествах.

3. Взаимодействие моноклональных антител против »-латротокснна (а-ЛТ) из яда latrodectus mactans tredécin\guttatus с белком с молекулярной массой 120 кДа из яда Latrodectus pallidus, указывает на структурное сходство этих двух токсинов, т.е. на наличие одинаковых антигенных детерминант в молекулах а'-ТЛП и а-ЛТ, и на вероятность их функциональной гомологии.

4. С помощью аффинной хроматографии на иммуноспецифических сорбентах, из яда паука Latrodectus pallidus выделены в индивидуальном виде два основных токсических компонента, действующих на насекомых (а-ИТЛП) и позвоночных животных («-ТЛП).

5. С помощью олсх:трофоретического анализа определена молекулярная масса «-ТЛП и а-ИТЛП, которая составляет 120 кДа. Установлена N-концевая аминокислотная последовательность с«-ТЛП и а-ИТЛП. ;

6. Проведено сравнении аминокислотной последовательности б пептидных фрагментов ферментативного расщепления а-ТЛП из яда latrodectus pallidus с участками первичной структуры а-ЛТ из яда Latrodectus mactanB tredecimguttatus и показана высокая степень гомологии этих двух токсинов. ■

Список опубликованных работ по м_зтеркалаи ..диссертацш^

1. Чяраха Ада, Карлсон Н.Г., Плужников К.А. Исследование антинеизтодиой активности из адов членистоногих // XXIX Научная конференция факультета физико-математических и естественных наук Российского университета дружбы народов: Тез. докл. науч. конф. 17-31 мая 1993 г.- Москва, 1993.-С.26.

2. Грикш Е.В., Плужников К.Л., Карлсен Н.Г., Галкина Т.Г., Чараха А. Разработка нового антинематодного средства на основе биологически активных веществ из яда паука Linothele// I Всероссийская планово-отчетная конференция по направлению "Белковая инхензрия" в ИБХ РАН: Тез. докл.- Москва, 1994.-C.2S.

3. Чараха Ада, Лазарева В.Д., Плужников К,Л. Сравненительная характеристика ядов пауков Latrodectus mactans tredocimguttatua и Eresus nigsr // XXXI Научная конференция факультета физико-математических и естественных наук посвященной 35-летию Российского университета дружбы народов: Тез. докл. науч. конф. 15-23 мая 1995 г.- Москва, 1995.

4. Чараха Ада, Галкина Т.Г., Плужников К.А. Выделение и характеристика инсектотоксического Селка из яда паука Егевив niger // XXXI Научная ' конференция факультета физико-математических к естествешмх наук," посвященной 35-летию Российского университета дружбы народов: Тез. докл. науч, конф. 15-23 мая 1995 г.- Москва, 1995.

5. Чараха Ада, Лазарева В.Д., Плужшков К.А., Есинэ Н.Я., Молодкин А.К. Выделение и характеристика двух белковых компонентов из яда паука Latrodectus pallIdus // XXXII Научная конференция факультета физико-математических и естественных наук Российского университета дружбы народов: Тез. докл. науч. конф. 27 ыая-2 июня 1996 г.- Москва,1995.

6. Чараха А.Р., Шсэтснко Л.В., Мододкии Л.К., Пдужмков К.А., Волкова Т.М., Гршкш Е.В. Выделение и частичная структурная характеристика основных токсических компонентов из яда паука Latroúectuf! pallidus // Г>иооргэ:шчес:кая химия.- 1996 (в печати).

- 18 -

Ада Рут Чррахл Бэр (Перу)

"Виделенив, частичная структурная характеристика токсинов из яда Latrodectus pallidus и исследовзшо спектра биологической активности яда некоторых пауков"

Выделены и охарактеризованы токсичные компонента яда пауке Latrodectus palltdua, Показано, что этот яд содержит токсин специфичный для ылекоштавдих (а-ТЛП) и по крайней мере один токсин специфичный для насекомых (л-ИТЛП). Определена частичная аминокислотная последовательность этих двух токсинов, обнаружена их "высокая структурная гомология с ранее изученными u-латротоксиноы и «-латрокнсектотоксшгои хгз яда • Jatrodoctus mactana tredocimguttatua, соответственно.

Ada Ruth Char3ja Bar (Peru)

"The Isolation and Partial Characterization oi Main Toxic Componentc from the Latrodectus palliduo Spider Venom"

Isolation and. characterization of the spider latrodectus pallidus venom components waa carried out. It was shown that thla venom contains toxin specific for manuals and at leant one inoectospecific toxin. Partial pjnino acid sequence of both toxins was determined. Their high structural homologo with • earlier studied .j-latrotoxin and c-iatroinsBctotoxln from ~;bo Latrodectus mactane tredecin\guttatufl venom was found.