Биологически активные компоненты ядов Latrodectus tredecimguttatus и Bufo viridis тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ8 ОД

1 5 А£Н ^

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академика САДЫ КО ВА А. С.

;иологически активные компоненты ядов

LATRODECTUS TREDECIMGL TATUS И

02.00.10 — биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

На правах рукописи

УДК 577.112.547.993.3;577.15:576.3;547.983

ТАШМУХАМЕДОВ Мугражитдин Салахович

BUFO VIRIDIS: СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ.

АВТОР ЕФ ЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени / доктора химических наук

ТАШКЕНТ — 1996

Работа выполнена в Институте биоорганической химш им. академика Садыкова А. С. АН РУ, в лаборатории химш белков л пептидов.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, А. И. МИРОШН ИКОВ,

доктор биологических наук, профессор П. Б. УСМАНОВ, доктор химических наук, профессор Д. Н. ДАЛ И МО В.

Ведущая организация — Институт химии растительных ве ществ АН РУ.

Защита диссертации состоится « ¡к > Мф. 1996 год;

в часов на заседании специализированного Совета Д 015.21.0 прп Институте биоорганической химии имени академика Садыко ва А. С. АН РУ по адресу: 700143, Ташкент, проспект X. Абдул лаева, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт биоорганической химии имени академика Садыкова А. С. АН Р5>

Автореферат разослан « ¡Ь > ■ 1996 ]

Ученый секретарь

специализированного Совета ¿-у*

доктор химических наук, Г у/ '

профессор н и Бдра;

Актузльность проблемы. В течение последнего десятилетия число работ, посвященных изучению структурно-функциональных особенностей компонентов ядов животных, 'непрерывно возрастало. Это связано с тем, что многие яды содержат в своем составе токсические агенты (нейротоксины, цитотоксины, кардиотоксины и др.), а также немало других физиологически активных веществ ¡ФАВ) с широким диапазоном фармакологического действия. Установление химической структуры и механизма действия токсинов и других ФАВ одна из наиболее актуальных. проблем современной физико-химической биологии и биоорганической химии, .так как способствует пониманию структурных основ биологических функций. В научной практике эти всесторонне охарактеризованные вещества ■ могут быть использованы в качестве "Инструментов" .для изучения молекулярных основ функционирования других биоорганических макромолекул, клетки ¡i субклеточных образований, например биологических мембран. Ясно, что эти же вещества могут быть эффективно использованы в медицине для диагноза и лечения различных заболеваний. Для получения достоверной, несодержащей ошибок информации о структурно — функциональных особенностях токсинов, равно как и для их практического использования абсолютно необходимым является выделение отдельных токсических компонентов смеси в максимально очищенном состоянии. Поэтому решение задач, связанных с получением действительно чистых токсинов, является фундаментом всей последующей работы. В этом плане выделение, установление структуры . и изучение структурно — функциональных особенностей основных биологически активных компонентов ядов паука каракурта Latrodectus maclaiis tredecimguttatus и среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis Laur как взаимосвязанные задачи представляют огромный теоретический и практический интерес.

Эффективными инструментами изучения структуры и функции пресииаптической Мембраны и её элементов являются нейротоксины яда пауков рода Latrodectus, которые специфически и Необратимо взаимодействуя с пресииаптической мембраной нервных окончаний, вызывают массированный выброс медиаторов. Этот главный эффект яда э настоящее время приписыбают основному токсическому компоненту яда — а-латротоксину. Однако з последнее время в Этом же яде найдены другие токсические компоненты, конкретный вклад которых в общий токсический эффект яда пока не детализирован. К их

числу относятся обладающей токсической функцией Ca 2 + — связывающий белок, названный ß-латротоксином (ß-ЛТ), токсические компоненты с селективностью для беспозвоночных а,Р,у,5,а— латро— инсектотоксины (ЛИТ), влияющий на пресинаптическую мембрану нервных клеток ракообразных Латрокрустотоксин (АКТ) и др. Одновременно получены убедительные экспериментальные данные относительно разделения каналоформирующего и секретогенного эффектов cí-ЛТ, а также об отсутствии у а-ЛТ способности формировать функционально активные Са2+— каналы. С другой стороны, существует мнение, что в реализации эффекта а-ЛТ в составе цельного яда немаловажную роль играет ß-латротоксин (ß-ЛТ). Предполагается, что взаимодействуя с пресинаптической мембраной нервных клеток оба токсина индуцируют аккумуляцию кальция в цитозоле и высвобождение медиатора из синаптических нервных окончаний. Установление первичной структуры ß-ЛТ и его последующий структурно—функциональный анализ несомненно будут способствовать выяснению молекулярных основ действия ряда белковых токсинов и цельного яда паука каракурта Latrodectus mactans tredecimguttatus и одновременно позволят выяснить структурную организацию и механизмы функционирования, пресинаптической мембраны нервных клеток и ее отдельных элементов, например, — рецепторов. а-ЛТ представляется достаточно подробно изученным объектом и поэтому, в настоящей диссертационной работе рассмотрены вопросы выделения и последующего изучения различных уровней структуры ß-ЛТ, другого токсического компонента яда паука каракурта Latrodectus mactans tredecimguttatus. Мы полагали, что его структурно— функциональный анализ в ряду других белковых токсинов позволит более полно представить структурные основы организации токсической функции и ее реализации во взаимодействии с соответствующими молекулами и надмолекулярными образованиями клеток.

Этот фундаментальный аспект биоорганической химии мог получить развитие при анализе токсинов, принадлежащих К другим классам биоорганических соединений. В рамках данной диссертационной работы проведено также детальное изучение белковых и небелковых компонентов яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis Laur. Проиеденные исследования по выделению, установлению химической орухтуры и биологического Действия токсических компонентов »д„ среднеазиатской 'зелёной, жабы Bufo viridis Laur, где наряду

С белково — пептидными веществами найдены в большом количестве разные буфадиейолиды. Они Также расширяют и одновременно уточняют существующие представление относительно организации токсической функции в природе.

Успехи в экспериментальном изучений жабьего яда и соответствующие клинические наблюдения послужила основанием тому, что в ряде стран (Япония, Индия, Тайвань и др.) были разработаны лекарственные препараты на основе цельных ядов Жаб. Однако отдельные компоненты этого яда, обладающие физиологическим эффектом, мало изучены; практически отсутствуют работы по исследованию молекулярных механизмов действия яда и. соответствующих физиологических ответов организма. Возрастающий интерес к этим исследованиям обусловлен прежде всего фундаментальными потребностями медицины глубже понять протекающие в организме процессы для осознанного управления ими. В этой связи актуально изучение действия жабьего яда на адеиилатциклазную систему, преобразующую внеклеточный информационный сигнал во внутриклеточный и запускающий в клетке каскад биохимических превращений, образующих молекулярную основу физиологических эффектов. Поэтому выделение, установление химической структуры, физико-химических свойств и особенностей биологического действия основных компонентов яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis Laur позволят пополнить фундаментальное знание этого объекта и установить важнейшие закономерности, обосновывающие практическое использование этого природного биологически активного материала.

Цель работы, Целью настоящей работы явилось изучение одного.. из токсических компонентов яда паука каракурта Latrodectus mactans , tredecimguttatus связывающего, белка — ß-ЛТ и основных

физиологически активных веществ содержащихся в яде среднеазй — атской зеленой жабы Bufo viridis.

В ходе исследования решались следующие задачи:

— Разработка способа выделения ß-ЛТ из яда паука каракурта Latrodectus mactans tredecimguttatus и его получение в количестве, достаточном мя проведения структурных Исследований.

— Определение физико-химических характеристик и установление четвертичной структуры ß-ЛТ.

— Изучение биологического эффекта ß-ЛТ.

-6— Выделение и характеристика продуктов исчерпывающей триптического гидролиза карбоксиметилированного ß-AT и установление структуры крупных триптических пептидов, формирующие

"кор"

— Изучение биологической активности яда зеленой жабы Bufe

viridis.

— Выделение основных токсических буфадиенолидов яда Buf< viridis в индивидуальном состоянии и установление их химической i конформационной структуры.

— Выделение фосфолипазы А, определение ее специфичности J каталитических свойств ( pH—, температурной — , Са2+-зависимости, константы Михаэлиса).

— Анализ действия жабьего яда и буфадиенолидов на уровен: цАМФ, АЦ. ФДЭ, цАМФ —зависимые ПК и транспортные АТФаз1 (Са2+~, Mg2+Na + /K+-).

— Изучение противоопухолевой активности выделенных соединений в модельных опытах на культуре раковых клеток в системе ii vitro и на животных — опухоленосителях в системе in vivo.

— Исследование кардиотропной активности выделенных соединений в системе in vitro.

— Проведение фармакотоксикологических исследований tyMMi буфадиенолидов яда с целью создания лекарственной формы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из яд паука каракурта Lairodectus raactans tredecimguttatus по разработанно нами методике выделен Ca2 +— связывающий белок — ß латротоксин. На основании данных электрофореза, гель-хроматографии и анализа КД—спектра охарактеризована четвертичная структура молекулы ß-AT. Методом кругового дихроизм показано, что натииная коиформация молекулы ß-AT поддерживаете ионами двухвалентного кальция. Результаты метода изотопного разбавления позволили установить, что ß-ЛТ связывают ионы Ca2 + соотношении 2:1. На основании сравнительного анализа всей совокупности данных пред\ожена модель олигомерной структуры ß-A' согласно которой его молекула состоит из четырех субъединиц.

Проведен исчерпывающий триптический гидролиз карбоксиметилированного производного ß-AT. Из продуктов гидролиза выде лено в индивидуальном виде 06 пептидов, содержащих в обще сложности 764 аминокислотных остатков, что соответствует 85% <

общего числа остатков в молекуле ß-ЛТ. Из нерастворимой части, а также из высокомолекулярных фракций триггпгческого гидролизата выделены пять гомогенных пептидов, содержащих в сумме 138 остатков. Для трех из них установлена аминокислотная последовательность, что в совокупности образует основу для синтеза олиго— нуклеотидных зондов, и клонирования структурного гена ß-ЛТ.

Из яда -зеленой жабы Biifo viridis впервые выделены б индивидуальных буфадиенолндоа относящихся к классу стероидов. Для двух из них, аренобуфагипа и га мабуфоталшta, установлены химическая и конформационная структуры. Разработана методика получения суммы буфадиенолидов, состоящей преимущественно из. аренобуфагина и гамабуфоталина , условно названной препаратом "Бакагин"

Впервые продемонстрирована выраженная противоопухолевая активность гамабуфоталина и аренобуфагина, а также препарата "Бакагин" в системах in vitro и in vivo. .

Фармакологические исследования инотропного эффекта "Бакагана" в тестах in vitro показали, что в сравнении с известным и широко применяемым кардиотоническим препаратом К — строфантином—ß "Бакагин" выгодно отличается меньшей токсичностью и большей широтой фармакологического действия й поэтому представляет большой интерес для практической кардиологии.

Методом биоспецифической хроматографии из белковой части яда жабы впервыэ выделена в индивидуальном виде фосфолипаза А2, определены ее специфичность и каталитические свойства.

В работе впервые изучено действие яда зеленок ■ жабы Bufo viridis и его основных токсических компонентов на ферменты аде — нклатциклазной системы, в т.ч. показано, что существует корреляция. между активностями АЦ и цЛМФ — зависимыми ПК под действием яда жабы B.viridis в опытах in vitro и in vivo.

Полученные данные помогут интерпретировать такие известные физиологические эффекты яда, как иммуномодуляциго, кардиотроп— ность и противоопухолевую активность.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались й обсуждались ю 3-м Сопетско—Западногерманском симпозиуме по химии пептидов и белков, Махачкала, 1980; 5—м Всесоюзном симпозиуме по химии и физике белков и пептидов, Баку, Í980; 12—м Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Баку, 1981; 6—м Индо — Советском симпозиуме по химии природных

соединений, Пуна (Индия), 1981; |— м Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1981; 6—м Советско—Французском симпозиуме по структуре я функции белков н нуклеиновых кислот, Цхалтубо, 1982; 47 —й Советско — Германской конференции общества биохимиков "Токсины — как инструменты в нейрохимии", Берлин, i9®3; 1 — й конференции биохимиков Таджикистана, Душанбе, (993; 2-й симпозиуме по биохимии клеточных мембран, Бари, i Италия) ,1993; 2-й конференции биохимиков Узбекистана, Ташкент, 1993; 1-й международном симпозиуме по химии природных соединений, Ташкент, 1994; Научной конференции но структуры и функции биологических мембран, Ташкент, 1995.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 32 работы в научных журналах и сборниках, в том числе подучен один патент.

Структура и объем работы: Работа изложена на 260 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 37 рисунка и ) схему.

I. Выделение ц цзуче»ше четвертичной структуры ß-латратркснна из яда наука lalrodecjue mactang (redecimguttatUs

ß-Латротоксин из цельного яда паука каракурта latrotiectus mactans tredecimgultatus выделяли по методике, разработанной Нами а лаборатории химии белка и пептидов Института биоорганическо^ химии им. Садыкова A.C. АН РУ, используя методы высаливания, гелевой и ионообменной хроматографии. Молекулярный вес белка, определенный по методу Вебера н Осборн, равнялся 75000 Da. Антисыворотка к цельному яду паука Lalrodectus mactans tredecimgultatus образовала одну линию преципитации с выделенным белком при двойной радиальной иммунодиффузии. При N—концевом анализе концевая аминокислота не была обнаружена. Отсутствие на N — конце молекулы белка остатка пироглутаминовой кислоты демонстрирую!' результаты обработки ß-ЛТ иироглутаминпептидаэой и HCl в метаноле. Поскольку при идентификации ДНС — аминокислот с помощью тонкослойной хроматографии на цластинке найдены значительные количества ДНС — е — Lys и ДНС-o-Tyr, что свидетельствовало о полноте реакции дансилирования, предполагается, что аминогруппа N — концевого аминокислотного остатка ß-ЛТ (локирована

■ ■ ... -9-

Элюирование при рехроматографии на ДЗАЭ — целлюлозе ПЕ — 52 в виде одного симметричного пика, наличие одной полосы при электрофорезе в ПЛАТ в присутствии ДДС — N3, образование одной линии преципитации при иммунохимическом анализе, отсутствие дополнительных 14— копцевых аминокислотных остатков в совокупности доказывают высокую степень чистоты выделенного белка.

В процессе выделения и очистки р-АТ получены дсгпгые, характеризующие четвертичную структуру молекулы белка. Так, судя по И при гель—хроматографии на колонке с сефадексом в—100, р—ЛТ обладал значительным молекулярным весом—более 250000 Оа. В то же время с помощью электрофореза в 10% ГТААГ в присутствии ДДС —Иа показано,, что он имеет м.м. около 750С0 Ва. Методом электрофореза в ПААГ при рН 8,3 на готовых пластинках "СЛАБ" с градиентом кон центрации акриламида в отсутствии детергентов удалось показать, что белок проявляется в виде трех полос, соответствующих веществам с молекулярным весом 75000, 150000 и 300000 дальтон. Эта формы были разделены путем препаративного электрофореза в ПААГ. В условиях обычного электрофореза каждая форма белка превращалась в исходную смесь трех компонентов, а в дезагрегирующих условиях все компоненты проявлялись в виде одной полосы с одинаковой подвижностью.' Для подтверждения идентичности всех форм белка был проведен аминокислотный анализ продуктов 24, 48 и 72 часового гидролиза каждой формы 5,7н соляной кислотой. Все формы белка имели одинаковый аминокислотный состав, который представлен в таблице !.

Молекулярный вес, определенный на основании аминокислотного состава, находится в хорошем соответствии с данными, полученными на основании электрофореза в ПААГ. в присутствии ДДС-Иа. Полученные данные свидетельствовали об идентичности всех протомеров, входящих в состав молекулы белка. Исходя из этого, мы предположили, что молекула р-ЛТ является олигомерным белком, который при нейтральных и слабощелочных значениях рН существует в виде димера и тетрамера, с м.м. 150000 и 300000 Оа, способных при низких значениях рН и в присутствии детергентов распадаться на мономер с м.м. 75000.

-to-

Таблица 1

Аминокислотный состав p-латротоксина __

Амино- Число Мольный Амино- Число Мольный

кислота остатков- процент кислота остатков процент

Asp 78.66 12.5 Met* 10.66 1.5

Thr 28.60 4.3 Ile 38.45 5.9

Ser 32.49 4.9 Leu 59.10 а.?

Glu 66.96 10.3 Тут 24.35 3.7

Pro 31.16 4.7 Phe 33.81 5.1

Gly 36.70 5.4 His 22.54 3.4

Ala 39.78 6.1 Lys 43.06 6.5

Val 49.06 7.6 Arg 39.11 5.9

1/2 Cys" 12.94 1.9 Trp" 3.97 0.6

'Цистеин и метношш определяли в виде цистешговой кислоты и метнонинсульфона, соответственно после окисления р-ЛТ надмурвьиной кислотой. Цистедн также определяли в виде карбоксиметилцистеина в восстановленном и карбоксиметилированном р-ЛТ.

"Триптофан определяли после г идролиза белка 4н. метансульфоновой кислотой.

Для характеристики р-ЛТ мы проводили качественную реакцию на содержание углеводного компонента, определяли изоэлектрическую точку, число свободных сульфгидрильных групп, КД— спектр а также ферментативную активность.

Окращивание электрофореграмм йодной кислотой и реактивом Шиффа выявило отсутствие углеводного компонента молекулы р-ЛТ.

Электрофокусирование на амфолинах показал, что изоэлек — трические точки всех трех форм белка лежит в интервале рН от 5,4 до 5,6.

Определение количества свободных сульфгидрильных групп по методу Эллмана показало, что молекула белка имеет три свободных сульфгидрильных группы- Однако, из анализа аминокислотного состава молекулы р-ЛТ нам известно, что и молекуле имеется 13 остатков нолуцистина. Исходя из этого, можно предполагать, что молекула р-ЛТ имеет пять внутримолекулярных дисульфидных мостика, которые, по — видимому, участвуют в образовании третичной структуры молекулы Мономера р-ЛТ,

В спектрах КД * нативного раствора р-ЛТ в 0,05 М трис —НС1 буфере с рН 8,0 при концентрациях 0,95x10"5 М (РисЛа) наблюдались п—я и я—я переходы пептидных хромофоров при длине полны 222,208 и 192 нм, а также малоинтенсивные, запрещенные в соответствии с правилами отбора я—я переходи ароматических остатков в области 250-300 нм. Полученные данные об электронной структуре Р-АТ позволили нам судить об особенностях структурной организации этого белка. Расчет содержания регулярных структур для (5-ЛТ по спектрам КД методом Грннфельда и Фасмана дает 12% а-спирали, 40% p-структуры is 40% неупорядоченных фрагментов. Десятикратное разбавление водой раствора ¡5-ЛТ (рис. 16) существенно не изменяет содержания а-спиралей, (5 — и неупорядоченных структур, что свидетельствует об устойчивости основной конформации молекулы Этого беЛка. Так. как известно, что пресинаптическое действие цельного яда связано с изменением потоков ионов Са^+ , нами исследовано влияние концентрации ионов Са^+ на параметры спектров КД молекулы р-ЛТ.

Добавление к раствору нативного белка до 10 мМ CaCl2 (Рис.1в) приподило к уменьшению доли а-спиральных структур в молехуле, 'по следовало из значительного уменьшения величины эллиптичности при 208 нм, ji-структура при этом существенно не изменялась, поскольку значение экстремума при 217 нм падало незначительно. Изменение параметров спектров КД в области Х>250 свидетельствовало о существенной перестройке четвертичной структуры этого белка при взаимодействии с ионами Са2"1", что характеризовалось изменением полярности микроокружения остатков ароматических аминокислот. При десятикратном разбавлении раствора р-ЛТ водой с одновременным добавлением до 10 мМ СаС12 спектр КД существенно изменялся (рис.1г). Сравнение с расчетными спектрами КД для модельных систем показывало, что доля беспорядочного клубка в fl-ЛТ увели — чивалась примерно до 80%, однако при этом сохраняется а-спиральная структура белка (экстремум при к — 220 нм). Добавление к'этой системе ДДС— Na и ЭДТА приводило к образованию структур типа беспорядочного клубка (рис.1д).

Спектры КД снимались в Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской АН.

[9i. ю-з град-см d-моль

Ей)-10

-1 град-cm*

Рис.1. Спектрл КД ß-латротоксина в 0,05 М трис—HCl буфере, pH 8,0, концентрация белка 0,95х10—5м. а) на — тианый токсин; б) при десятикратном разбавлении водой; в) при добавлении CaCi2 (C'caCi /Cg~10Q0); г)при добавлении CaCi2 (CcaCI '7Cß = 10000); д) при добавлении 100 мМ ЭДТА и 1% ДДС — Na.

Таким образом, образование четвертичной структуры ß-ЛТ в значительной мере обусловлено процессами комплексообразования с ионами + . Определение содержания Са^ + в молекуле методом изотопного разбавления показал, что ß-ЛТ связывает ионы Са^+ в соотношении 2:1.

На основании полученных нами результатов можно яредпола — гать, что Ca ^ т — связывающий ß-ЛТ вызывает формирование функционально активных кальциевых каналов и индуцирует вход кальция в аксоплазму нервных окончаний. Тогда значение Са^+ сводится не только к поддержанию структуры белка, но также способствует запуску механизма высвобождения Медиатора.'

Эти предположения подтверждают электрофизиологические исследования проведенные с.и.с Славновой Т.М. в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН под руководством профессора Л.Г.Магазаннка, в которых изучалась роль

|£ухвалентных катионов в механизме действия р-ЛТ на нервные жончания и оценивалась зависимость его нейротоксического эффекта )т состояния четвертичной структуры.

Ими установлено, что Р~ЛТ увеличивает частоту мПКП вызывая тпшчный нресинаптический эффект только в присутствии ионов узухпэлентных катионов (Са + 2 и Мд + 2),хелатообразующие агенты ЭГТА и ЭДТА напротив полностью снимают такое действие.

Пресйнаптическое действие Р-ЛТ на мембране рН —зависим: зри рН окружающего раствора ниже 4,8 пресинаптический эффект ¡5-Л.Т полностью подавЛяеТся, но восстанавливается при увеличении рН раствора до 7,4.

Таким образом, эффектом Р-ЛТ можйо управлять путем изменения рН столь же эффективно, как и путем вариаций содержания »двухвалентных катионов., ; .

Эти же результаты позволяет предполагать существований ди — нам1гческого равновесия во взаимодействии р-ЛТ с мембраной. Такая точка зрения подтверждена исследованиями академика Б.А.Ташмухамедова с сотрудниками в Институте физиологии и биофизики АН РУ каналоформпрующей активности р-ЛТ на искусственных БЛМ: ими установлено, что р-ЛТ образует в БЛМ каналы проводимости, свойства которых аналогичны свойствам каналов, наблюдаемых в бнелое при действии цельного яда: эффективность влияния р-ЛТ на БЛМ увеличивается в 10 раз с ростом рН от 5,0 до 7,0. ; :

И. Выделение й устакоалешю структуры кеатидов трип-Тического гидролиза карбоксиметилироппшгога р-ЛТ.

11.1 Выделение и установление структуры растворимых пептидов трип гического гидролиза КМ - Р~ДТ,

По данным аминокислотного анализа молекула р-ЛТ содержит 43 остатка лизина и 39 остатков аргинина: следовательно, при трип — тическом гидролизе можно было ожидать образования максимально 83 пептидов.

Для предотвращения окисления остатков цистеина в ходе гидролиза препарат белка восстанавливали меркаптоэтадолом, а затем карбоксиметилировали монойодуксусной кислотой в денатурирующих условиях, Аминокислотный анализ карбоксиметилИрованного (КМ)

белка показал, что модификация остатков цистеина прошла практически количественно, а остатки других аминокислот не были затронуты.

Триптический гидролиз КМ—препарата белка проводили при pi: 8,4 ^ течение 12 часов (конечное соотношение фермента к субстрат) 1:50), Гидролиз останавливали постепенным подкислением реакционной смеси 0,1 н iiCl до рН 2,5. При этом образовался осадок нерастворимых пептидов, который был отделен центрифугированием Таким образом, было проведено разделение пептидов триптическогс гидролизата на две группы. Объектом дальнейшего исследования данной работы явились растворимые триптические пептиды.

Первоначальное фракционирование полученной смеси растворимых пептидов гель—фильтрацией на биогеле Р—10 позволило распределить их по деум фракциям — I и II (рис.2).

100

J 80

8

w w

4)

О ' 20

К ■

а

a úo юз ■ iso 200. ¡so зоо •

Объем (мл)

Рис.2. Фракционирование растворимых пептидов трип — тического гидролизата на колонке (1,6x185 см) с биогелем Р — 10 в 0,05 М nh4hco3 рН 8,0. Здесь и далее границы объединенных фракций отмечены черными прямоугольниками.

Для дальнейшего разделения пептидов фракции I и II была использована ионообменная хроматография »на катионите Аминекс А—6 В градиенте концентрации и рН пиридин ацетатных буферов. Профиль элюции пептидов с колонки показа}! на рис.3 и 4.

В результате разделения ионообменной хроматографией из фракции 1 было получено 26, а из фракции II — 8 объединенных

фракцибг. Анализ полученных фракций на гомогенность проводили с помощью хроматографии в тонком слое целлюлозы в системе С (пиридннуксусная кислота-н-бутанол-вода, 10:3:15:12) и определением К—концевых аминокислотных остатков.

Объем (мл)

Рис.3. Разделение пептидов фракции II (Рис.2.) на катеоните аминекс А—6. I —градиент I (0,2 М, рН 3,1 — 0,2 М, рН 5,0), II-градиент II (0,2 М, рН 5,0 0,5 М, рН 5,0), III-■ градиент Ш (0,5 М, рН 5,0 - 2М, рН 5,0), 1У-2 М пиридин.

1СЗ

Объем (мл)

Рис.4. Разделение Пептидов фракций I (Рис.2.) на кати— оните аминекс А-6. 1-градиент I (0,2 М, рН 3,1 - 0,2 М, рН

■•■'. -165,0), II-градиент II (0,2 М, рН 5,0 0,5 М, рН 5,0), III-градиент III (0,5 М, рН 5,0 - 2М, рН 5,0), IV-2 М пиридин.

Анализы показали, что десять из объединенных фракций (1—5 1-7, 1-8, 1-14, 1-17, 1-18, 1-21, 1-22, 1-25, И-8) являются гомогенным и не требуют дальнейшей очистки. Остальные фракцш представляли собой смеси сравнительно небольшого числа пептидов Для дальнейшего разделения объединенных фракций и очистки пептидов был применен один из наиболее эффективных методов -хроматография на бумаге, а также методы пептидных карт.

Таким образом, из растворимой части триптического гидролизата выделен 81 индивидуальный пептид и они содержат в сумм« 625 аминокислотных остатков, что соответствует примерно 80% о: общего числа аминокислотных остатков в молекуле (?~ЛТ. Определение аминокислотной последовательности растворимых триптическю пептидов КМ — (5-ЛТ осуществлена старшим научным сотруднике!. Абдурахмановой Ж.А. по методу Эдмана с идентификацией аминокислот в виде Dns — производных. Структура этих пептидов представлена в таблице 2. .

11.2. Выделение и установление аминокислотной последовательности нерастворимых триптических пептилов

км-р-лт.

Исходя из .числа аминокислотных остатков в молекуле (3-ЛТ i количества выделенных низкомолекулярных растворимых в кисло; среде пептидов триптического гидролизата следовало предположит] наличие в нерастворимой части смеси одного — двух крупных пептидов и нескольких пептидов среднего молекулярного веса.

В начале с целы» выбора наилучших условий разделения Кориных пептидов была проведена серия аналитических опытов. Разделение коровых пептидов методами гель —хроматографии на колонках с сефадексом, биогелем, сефакрилом, SE — сефадексом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ — целлюлозе, а также бумажной хроматографии и высоковольтного электрофореза не привел] к поло ж ¡пели юм у результату. Лишь в одном случае — при хроматографии на сефадексе QAE— А — 25 в 0,1 М трис — НС! буфере (рН 8,2 в градиенте концентрации NaOI удалось выделить в гомогенном со-сшшши один пептид с незначительным выходом (0,02 мкм). Пр] идентификации N — концевого аминокислотного остатка на

_ Тг блица 2

Аминокислотная последовательность растворимых пептидов триптического гидролиза Са*^

связывающего белка 8 — АТ ял> паука Ьа1:гос1дсШз тасЦпз Вге<1еС1тс1иЦа1:ц5.'_____

ШИФР ПСЯ-•тнд» К-во Л-ИЫХ остат -ков Аминокислотная последовательность Шиф р : :СП- п-да' К-ео а* них ооат-ксв Амлкоксслотная последовательность Шкфр пеп-•пуа К-аа 1 сап- Амивохислем 1Я ко» последователен ость

Ы-М 14 A-S-C-E-N-I-P-T-D-Q.I-D.E-R 1-12-1 . 6 С-Е-С-А-О-Н 1-24-1 1 К

1-1-1-2 13 А-С-2-Т-1-С.О-Е-КУ,5.Р,К) 1-12-2 5 и-К-О-Е-И 1-24.2 3 Н-С-К

1-1-2 3 Р-СЗ-О 1-13-1 5 У-П-С-р-И 1-24.3 7 В-З-Е-М^У-Й

1-2-1 12 К.С- Е-Р-С-С- З-Ч - П-Т- К 1-13-2 9 Г-О-Е-Ь-С-^Е-г-К 1-25 7 ¡Ь-О-Р-Е-Н-СЗ-Н

1-2.2 15 ЬК-Р-У-О-О-О-Е-Ь-С-Р-У-Т-А-К 1-13-3 10 1-26-1 17 В-Е-р-Н-З-Е-С-В-р-С-Е ииУ-Р-С

1-3-1-1 14 S-V-F-V-P-P.L-E-E-I-F-P-Y.I4 1-14 3 4-Е-Я 1-25-2 9 fe-L-L-H.G-Q-D.L-R

1-3-1-2 и г.о-с-р.о-у-ы-о-ы-и-т-р-к и5-1 ■ 7 с-и-у-о-г-в-я 1-25-3 8 В^-Е-Е-Ы-С-К

1-3-3-1 12 Э-^У-А-С-Е-Г-О-С-С-Е-К 1-13-2 10 З-Я-С-Т-З-Е-А-О-Е-К П-1-1 4 Ь-Е-О-К

1-3-3-2 10 У-У-Ь-У-Е-О-Т-Р-З.?! 1-15-2 4 Й-ЬС-К 1Ы-2 4 рЗ-Г-К

1-4-1 14 1-15-4 14 ¡Ь-ОЛ-Е-С-А-МЛ-С-Э-О-Е-Ь-С-С-К 11.1.3

1-4-2 5 1-16-1 4 Ьо-Э-К П-2-1 2 Б-К

1-5 7 О-Ь-О-Е-А-Е-К 1-16-2 15 (3-1-С-Е.'^.С-А.Е-С.О-Р-Т-Р-А-К П-2-2 12 |Р-Ы-С-А-<Н.К,К,3,&2 V)

1-6-2 10 к-сз-о-ис-ыз-с-Е-н 1-17 I 2 "•!'. П-2-3 3 ¡Ь-1-К

1-6-3 17 1-1-У-А-Т-0-3-М-Н.<5-£.Н-З.Т-Р-аК 1-13 1 8 •• «ВЛ^Н-З-О-Р-К П-3-1 2 Ь-Й

1-6-4 9 г-У-О-Ь-С-Е-М-А-Н 1-19-11 9 Р-Т-Е-Ь-Ы-Е-Р-О-К И-3-2 3 ГГ-А-К

1-7 13 ^-д-о-ьс-ир-с-Е-н-с-з-к 1-19-2 10 A-V.P-A-A-D-T-F.A-K П-3-3 3 [\-t-K

1-8 17 ^у-Б-у-г-з-м-г-с-н-гэл'.т.РАак) 1-19-3 6 р-И-Е-Ы-К И-3-4 4 р-Т-У-Я

1-9-1 4 ымэ-к 1-19-4 9 Р-У-Р-А-В-М-В-К 11-4-1 11 k-D-T-V-Q-M.Y-A.G-S К

1-9-2 4 Е-А-Т-К 1-20-1 4 Я-С-Е-Н Ц-4-2 4 Г/.ЬК-К

1-9-Э 13 1-20-2 12 ЬР-Е-О-Р-Ь-Е-С-О-Н-У-К 11.5-1 з • Ь-к-я

1-9.4 9 M-N-V.E-S-H.P-R 1-20.3 11 J-V-V-S.P-C-N-D-D.G-K 11-5-2 4 а-1-ы<

1-104 3 Е-О-Я 1-20-4 7 |У-П-0-5.С-М-Р: 11-6-1 2 Й-К

1-10-2 7 3-1-Е-0-А-0-К 1-21 • 2 р-К 11-6-2 2 Ьк '

МО-4 10 иА-У-О-Ю-Ч-З-С-К 1-22 7 Й-Ы-ЬУ-Р-О-К 11-7-1 3 Ь-Э-К

1-П-1 3 гз-к 1-23-1 4 К-О-С-Р, 11-7-2 3 Ь-Р-К

Н1-2 3 С-А-й 1-23-2 4 Е-И-А-К П-в з ь-р-й

1-!Ы 14 r-A-Z-T.fS.2B,г, У.ир,Н,Я1!) 1-23-3 2 А-Р.

1-11-4 16 1-23-4 17 ГЛ.У-А.д.Б.Н-З.О-Е-Е-Ь-С-Р-М.Е-К 1

* — аминокислотная последовательность пептидез установлена с.н.с. Абдурахмановой Ж.

N—конце пептида, обозначенного нами К—I, обнаружен остаток лейцина.

Для разделения остальных крупных, склонных к агрегацию, пептидов применяли оригинальный, не традиционный для данного типа работ подход: гель—фильтрацию смеси новой порции гидро— лизата без предварительного подкисления и отделения "кора". Для прекращения гидролиза и одновременного фракционирования пептидов была проведена гель—хроматография на колонке с сефадексом G—50Î. Профиль хроматографического разделения 0,5 мкМ гидро — лизата КМ—р-ЛТ приведен на рисунке 5.

Рис.5. Гель—фильтрация 0,5 мкМ продуктов триптиче— ского пгдролизата КМ— р-ЛТ на колонке 2,5x100 см с сефадексом й — 501 в 0,1 М трис —НС1 буфере, рН 8,2. Скорость элюции 20 мл/ч. А — фракция, содержащая смесь пептидов высокого и среднего молекулярных весов.

Первая фракция представляла собой незначительное , количестве не расщепившегося исходного КМ —белка и трипсин, вторая фракция, обозначенная нами А, по результатам электрофореза в 18% ПЛАТ г присутствии /\ДС—Ыа, представляла собой смесь пептидов высокого г среднего молекулярного весов, а третья фракция — смесь, состоящая I основном из низкомолекулярных пептидов.

Для дальнейшей очистки фракции А применяли методы гель-хроматографии на колонке с ТЭК — гелем Н\У—50, ВЭЖХ на холонк< со смолой "Сферагель - ТБК — С - 2000 БУГ' и Метод пептидных карт н<

пластинках с тонким слоем целлюлозы ММ— 300 и в результате было получено еще 4 гомогенных пептида обозначенных К—2, К —3, .К —4 и К-5. Полученные петтгнды в сумме включали 138 аминокислотных остатков.

Изучение аминокислотной последовательности пептидов осуществляли эдмановской деградацией с последующим дансилированием укороченных пептидов. Определенно амидов днкэрбоновых кислот осуществляли путем прямей идентификации ФТГ— производных с помощью ТСХ. С —концевой аминокислотный остаток и.С-коицевуто последовательность пептидов определяли путем гидролиза пептидов с помощью смеси карбокеппептидяз А и В и последующего аминокислотного анализа продуктов ре-ткшш. Структуру пептида К —1 из-за чрезвычайно малого количества и пептядч К—2 из-за отсутствия свободной а-'1мпногруппи и устойчнгости к деградации не исследовали. Лад установлении полной структуры пептида К —3 потребовалось применение лополшггалътшх рэсщеплепкй тпмотртосином н протеиназой из 31прЬу'ососси5 аигеш. Полная' аминокислотная по — следозэтелъпость этих пептидов представлена в табляце 3.

Таким образом, сочетанием метода Эдмапа с последующим • данешнрованнем по метилу Грея установлена последовательность ашяюкйслотных. остатков в пептидах К —3, К — 4 и К —5, содержащих в сумме 45 аминокислотных остатков.

; Таблица 3.

Полная аминокислотная последовательность пептидов из вы —

ПЕПТИД АМИНОКИСЛОТНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

К-3 10 20 -Г-1-**- Г-2 -м--—Г-3-:--> <-Х-1 -х-Х-2-к-Х-3-> |

К —4 10 У-У-Ь-У-Е-О-Т-Р-Э-Я

К —5 10 С-Е-С-Р-Е-О-Ы-А-Е-В-Я

ггротеазои.

X — хнмогриптические пептиды.

• 20 - ■ .. ' ' При сравнении структуры выделенных нами триптических пептидов по банку белковых структур Нидлмана - Вунча выявлены высокая гомология со структурными фрагментами медьсодержащего белка гемоцианина выделенного из яда американской тарантулы Europelma calinica. Так, пептиды I— 1 — 1; 1—3— 1 — 1; 1-26— 1 обладают значительным структурным подобием {57,1 — ВО %) с участками молекулы гемоцианина:

Кроме того, пептиды 1-2-1; 1-2-2; 1 — 3—1 -2; 1-3-3- 1; I-11 — 4; 1-16-2; 1-20-2; 1-20—3; 1-20-4; также имеют множество гомологичных участков (50,3 — 75,9%) в молекуле гемоцианина. Эти участки, вероятно, играют важную роль в проявлении функциональной активности обоих белков.'

Установленные структуры триптических пептидов являются основой для клонирования структурного гена ß-латротоксина. Высокая гомология структуры множества триптических пептидов ß-ЛТ со структурными фрагментами гемоцианина и его Са^ + — связывающей способность позволят отнести этот белок к классу металлопротеинов.

10v 20v 30v 40v 50v

tilhdkqvqalklfeklsvaatgepvpadqiderlrnittlgpnefpscfy

A:GE:P: DQIDER

1-1-1 asgeniptdqider

80v 90v lOOv UOv 120v

ddfvslakqars'fmnstlfafsaevallhredcrgvivppvqevfadrfip

gv: VPP :: e : f ;: r

1-3-1-1 gvfvppl eeifpyr

50Qv 510v 520v 530v 540v

lrpgkntivrsstdssvtlssvhtf.kellrgedlvegqtefcscgwpohll vpkgn

: ef : s: g : :: ; llvp í-26-l sefhsegdege llvpck

III. Физиологически активные компоненты яда сред"

неазиатской зеленой жабы Bulo viridis Laur

г

Свежеполученный цельный яд зеленой жабы Bufo viridis представляет собой вязкую жидкость белого цвета; при высыхании он приобретает вид стехловидной массы бледно — желтого цвета, плохо растворяющейся в воде, но хорошо в 20—30% растворах этилового спирта. Из-за плохой растворимости цельного яда в водных рас —

творах солей, его экстрагировали 0,05 М nh4hco3 буфером, содержащим 10% этиловый спирт. От нерастворимых компонентов экстракт освобождали центрифугированием, и супернатант лиофильно высушивали. Сухой яд хранился до использования при +4°С в течение нескольких месяцев без потери активности.

Для характеристики цельного яда были определены токсичность и фосфолипазная активность, изучались кардиотрошгость, иммуно— модулирующие свойства и действие на поведенческую активность подопытных животных.

Токсичность яда определяли путем инъекций его водного раствора под 3 — ий сегмент брюшка таракана Pereplaneta americana со средним весом 500 мг. Была проведена оценка Al 00' дозы, вызывающей устойчивый длительный.паралич у 100% животных. Так, исходный яд проявлял паралитическую активность в дозах, начиная от 100 мкг на особь. Летальный эффект достигался при использовании более высоких доз яда: 250 мкг и пыще. ld50, определенная на белых мышах, составляла 10 мг/кг.

Фосфолипазиую активность определяли по гидролизу яичного фосфатидилхолнна, растворенного в диэтиловом эфире. В результате проведенного теста была обнаружена фосфолипазная активность цельного яда Ауд=0,033 мкМ/мг.мин.

Влияние цельного яда на поведенческую активность оценивали методом "Open íield" ("Открытого поля"). Эксперименты показали неспецифическое активирование различных типов поведенческой активности: проявлялись психотропный дезадаптациошшй эффекты, наблюдались неадекватные ситуации, эффект гиперангезии.

Иммунотропное действие яда зеленой жабы сравнивали с влиянием ядов других животных, таких как яды щитомордника, гюрзы, эфы, большого и малого шершней, белого и черного каракурта и осы. Опыты проведены на белых беспородных мышах, иммунизированных внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (ЭБ). Яды использованы в дозах, составляющих 1/20 их LD50. Количество АОК определяли а селезенке иммунизированных животных прямым методом локального гемолиза в ara розе. Эксперименты показали, что все исследованные яды, за исключением яда зеленой жабы, проявляли иммунодепрессивное действие, вызывая уменьшение количества АОК относительно контроля.

• -22-

При изучении дозозавнсимостн иммуностимулирующего дей — ствия яд зеленой жабы Bufo viridis вводили внутрибрюшинно в дозах 1/6, 1/10, 1/20 LD50 одновременно с .иммунизацией. Опыты "доза-эффект" показали, что яд жабы в дозе 1/20 LD50 (0,5 мг/кг) стимулирует образование АО К, в то время как с увеличением дозы до 1/6 L.D50 (1,5 мг/кг) количество антителообразуюхцих клеток отчетливо снижалось.

Учитывая особенности химического состава жабьего яда связанные относительно высоким содержанием буфадиенолидов и сте — рииов. отличающихся высокой гидрофобностыо, первичное фракционирование проводили методом гель—проникающей хроматографией на сефадексе LH—20, используя в качестве элгоента 0,05 М NH4HCO3 pH 8,2, содержащий 60% этанола (Ряс.6): в результате было получено 6 фракций. Фракция 1 в основном содержала белковые компоненты, и характеризовалась активностью фосфолипазы А. Согласно результатам тестирования на токсичность только фракция 6 содержала практически всю паралитическую активность яда.

ОПъем (мл)

Рис.6. Гель — хроматография цельного яда зеленой жабы 0. viridis на колонке (2,6x100см) с сефадексом LH— 20 в 0,05 М NH4HCO3 буфере содержащий 60% этанола, pH 8,2. Скорость элюции 45 мл/час. Следующий этап разделения фракции 6 проводили на гидрофобном носителе, полихром П— 1. Для элюирования применяли с-шчала деншшзированную воду, затем ступенчатый градиент кон —

центрации этанола (10,20,30,40,...60%). По данным тестирования,' паралитической активностью обладала фракция 2, которая элюировалась 10% — ным раствором этилового спирта.

После лиофильного высупншапия активную фракцию растворяли п растворе 10% —иого. этилового спирта и далее разделяли методом обращешюфазовой ВЭЖХ на колонке Ос1а<1есу! 51-100 используя градиент концентрации ацетошггрнла (рис.7). .

от

3

ОЛЯ

3 003 £

У ш"н

10 15 ПСТ '. со'

Промлч (мхга)

юа 00 во та оо

-50 •■10 зо га ю

а

40 45

¡г

Рис.7. Обращениофазовая высокоэффективная хроматография активной фракции на колонке" (4,6мм х 25см) Ос1ас1есу1 Б!—100 в градиенте концентрации ацетонитрила. Скорость элюцйй 1 мл/мии.

В этих условиям исследуемый материал удалось разделить па шесть компонентов, из которых по данным тестирования, только 2-й и 3-й обладали токсичностью. Их рехроматография в более пологом градиенте концентрации ацетонитрила демонстрировала одни симметричный пик для каждого компонента, что доказывает высокую Степень чистоты в)иделенных соединений.

Оба токсические соединения, а также вещества, содержащиеся в остальных 4 фракциях, давали положительную цветную реакцию с реактивом Лавдей, и характеризуются Максимумом поглощения при 300 нм, что свидетельствует принадлежности выделенных в ипдиви — Дуальном виде соединений к классу буфадиегюлидов. Кумалинойое кольцо каждого соединения характеризовалось интенсивной полосой

- ■■•.'' -24-

поглощения в ИК — области спектра при 1680 см-1 (С = 0 группа) и двумя полосами при 1620 И 1538 см-' (сопряженные С = С связи).

Таким образом, нами выделены в чистом виде два токсических буфадиенолида, условно названные ИТ—1 и ИТ—2, и еще 4 соединения, также буфадиенолидной природы. Выход токсических компонентов ИТ—1 и ИТ—2 составлял соответственно 0,1% и 0,2% от исходной массы сухого цельного яда.

Введение ИТ—1 тараканам в дозе 5 мкг на особь через 5—10 минут вызывало устойчивый паралич, сохранившийся в течение 5—7 часов, а эквивалентные дозы ИТ—2 — моментальный паралич с наступлением сдгертн через 2—3 минуты.

IY. Установление структуры и «информационный анализ буфадиенолидов

Химическую структуру выделенных токсических буфадиенолидов исследовали методами ПМР, масс — спектроскопии и рентге — неструктурного анализа.

Результаты ПМР—спектроскопии показали, что в ПМР спектре ИТ—2 {200 МГц, CD30D) характерны сингдеты двух метальных групп (0,93 мд и 1,21 мд), сложный многопротонный сигнал в области "метиленового возвышения" (1,0—2,2 мд) и три однопротонных сигнала в области слабого поля при 6,31 мд (J— 10,0 Гц), 7,53 мд (J — 2,5 Гц) и при 7,92 мд (J—10,0 и 2,5 Гц). Параметры спектра позволяют предположить наличие в молекуле ИТ—2 стероидного скелета с ан — гулярными метильными группами при С18 и С19, а также кумали — нового кольца.

Результаты изучения масс —спектра высокого разрешения ИТ—2 определен состав молекулярного иона 416 +.

Окончательное расположение функциональных групп и пространственное строение молекулы ИТ —2 следует из данных рентге — но — структурного анализа. Результаты рентгеноструктурного анализа строения молекулы ИТ—2 показали, что циклы А, В и С имеют конформацию f)C-', jC'4 и ftC2 _ KpeceAi соответственно. Сочленение циклов А/В —, C/D —цнс и В/С —транс, характерно для скелета буфадиенолидов. В цикле А молекулы гидроксил О(З)—Н занимают аксиальную позицию, а в цикле С группы О(И) —Н, 0(14) —Н расположены и экваториальном положении. Анализ Кэмбриджского Банка Структурных Данных показал, что и нем имеется вещесгво с

жим строением — аренобуфагин, выделенный из китайской жабы h'an Su в виде диацетилпроизводного и структура стероида была гтановлена после гидролиза ацетильных групп. В индивидуальном яде аренобуфагин впервые выделен из яда южноамериканской жабы ufo arenarum. Однако кристаллографические параметры выделенного ами ИТ—2 отличается от аренобуфагина, что указывает на поли — (орфизм этого стероида (кристаллы аренобуфагина получены из астворов в 1:1 смеси метанола с этилацетатом, а монокристаллы ИТ— , мы вырастили из растворов в этиловом спирте). Для облегчения дльнейшего обсуждения модификацию аренобуфагина, включенного » Банк, мы назвали полнморфом А, а расшифрованную нами его фисталлическую разновидность — полиморфом В.

В полиморфе А пятичленный цикл D имеет конформацию, громежуточную между конформациями Е'4 —конверта и j 3т14 — юлукресла. В полиморфе В этот цикл приобретает конформацию искаженного полукресла (рис.8). Обе кристаллические моди-

фикации аренобуфагина существенно различаются по расположению 5 —лактонного цикла относительно стероидного остова молекулы. Расчеты, проведенные в работе, показали, что д\я свободного вращения лактонного цикла вокруг ординарной связи С(17) —С(20) молекула должна преодолеть достаточно высокий энергетический барьер. Ориентация • цикла в двух полиморфах (торсионный угол С(13)С(17)С(20) С(21)) составляет -89,10 и 81,00 в полиморфах А и В соответственно и следовательно отличается на 170°; в полиморфе В она аналогачна ориентации цикла в буфалине и его предшественниках. Длина связи и валентные утлы в молекуле име!ОТ обычные для таких соединений значения и практически не отличаются от тех же значений в полиморфе А. ■•

Таким образом, из яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis нами выделен аренобуфагин отличающийся не только кристаллическим строением, но и молекулярной структурой. Следует отметить, что эта разница в строении молекул проявляется под воздействием кристаллических полей полиморфов на конформацию молекул. В отличие от известного полиморфа А, в котором межмо— лекулярные Н —связи объединяют молекулы а трехмерный каркас, кристаллическая структура нового полиморфа В характеризуется наличием одномерного Н—ассоциата ИЗ молекул аренобуфагина.

Oí?

J- I "\r-Si2C«y

^ АпЗ /

Рис.8. Конформация молекулы аренобуфагнна [полиморф

В).

ПМР —спектр ИТ—1 также, как íi ИТ—2, содержит cunta характерные для иуфадпеиом1дов с небольшими вариациями их п раметров. Наиболее заметно отсутствие Четкого дублета при 4,41 (Н—11) и дублета дублетов Н—17 при 4,15 мд. Эти данные, а та у значения массы и анализ состава молекулярного иона 402 + позво,м предпололапъ отсутствие кетогруппы при. С*2 в молекуле ИТ-Окончательное строение ИТ—1 также определено методом рептг неструктурного анализа. Из растворов ИТ—1 о: .этиловом спи вырастили монокристаллы двух видов, которые относятся к одно: той же пространственной группе P2¡i2\2\*. Игольчатые криста имели следующие^ кристаллографические параметры: а — 7,095 в— 14,753(1); с— 17,883(2) A; V=2076,9(1,4)А3 Dx= 1.23 г/сгД a кристаллы ромбического 'габитуса а = 10,166(3); ов= 13.36С с=17,523(1В)А; V=2390(2)A3. Анализ Кембриджского Банка, стру турных данных обнаруживает вещества с идентичными параметр игольчатых" .кристаллов хорошо известного гамабуфоталина {Pin Гамабуфоталин был выделен впервые Котаг.е с сотрудниками из кс японской жабы Bufo vulgaris formosus и позже также из. препар Ch'anSu. Соответствующее соединение из яда зеленой жабы I viridis нами выделено впервые. Предполагается, Что. ромбичес кристаллы являются сольватом гамабуфоталина с этанолом (наибе вероятный состав 1:1 при плотности Dx== 1,19 г/см3), так как явле включения образования соединений с включением молекул pacri рителей очень характерны для стероидов.

Ряс.9. Кснформация молекулы гамабуфоталина.

Наши исследования показали, что гамабуфоталия и аренобу — ¡эапш составляют 80. % суммы буфадиенолпдной фракции яда В. /iridis. В оставшиеся 20 % входят еще 4 индивидуальных буфэдиено — \ида (см.рис.7). Ранее японскими авторами К.Шимада и др. из яда зеленой жабы Bufo viridis Laur были выделены еще такие буфадие — нолнды, как Маринобуфапш — С24Н32О5, Геллебригешш — С24Н32О5, Телоцннобуфапш - С24Н34О5, и Буфаталншга — С24Н30О0. Вероятно, эти же соединения присутствуют в цельном яде Bufo viridis и соответствуют не идентифицированным 4 — м буфа — диеиолидам. Для фармако—токсикологических исследований нами предложен стандартизированный препарат "Бакашн", в котором содержатся ИТ-1,-ИТ—2 и 4 не идентифицированные вещества, т.е. фракции включающие обозначения пиками l,4,5,ß компонентов (см. рис.7.)', "Бакапш" удобно получать. из яда в препаративных количествах. При исследовании биологического эффекта выделенных соединений в некоторых экспериментах использовали эту сумму бу — фадиеноллдов. '-..■■'

Таким образом, впервые из яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis нами Еыделены . в индивидуальном виде токсические буфадиенолнды гашбуфоталшт, аренебуфашн и еще 4 соединения буфадиенолпдной природы, Установлено, что для молекул аренобу— фагина, полученных из различных объектов, характерен полиморфизм, и аренобуфагнн яда среднеазиатской зеленой, жабы B.viridis по своей молекулярной структуре отличается от описанного в литературе, Выделенный гамабуфоталин является новым для данного вида жабы.

-28- .

Y. Выделение фосфолипазы А2 из яда зеленой жабы Bufo viridis Laur.

В литературе практически отсутствуют сведения о белково пептидной части яда жаб, и в частности относительно фосфолипаз присутствие которой даже в незначительных количествах может име значение в интегральном эффекте яда.

В связи с этим нами поставлена задача выделения фосфолипа; определение ее специфичности и других каталитических свойс Известные методы выделения. и очистки фосфолипаз из различи источников имеют большое число стадий и дают невысокий выя очищенного фермента. Однако в последние годы получены высокс эффективные аффинные сорбенты, позволяющие одностадийно и хорошим выходом выделять ферменты этого класса. Для сшгп биоспецифического адсорбента нами использован в качестве поситс высокостабильный, Имеющий многоатомную "ножку" Affi — Gel применение такого носителя позволяет пространственно удалить ai ганд (ФДС) от поверхности носителя, что уменьшает влияние сп рических факторов иа его взаимодействие с выделяемым ферменп Десорбцию фермента с адсорбента проводили в различных условп используя в качестве десорбирующих растворов: I) 10 мМ цепь триметиламмоний бромид; 2) 10 мМ ЭДТА Na; 3| 1 М NaCl; 4) гр; диент концентраций тритона X —100 ¡0 —0,1%). Наилучшие результа были получены десорбцией в градиенте концентрации тритона X— {рис. 10).

ano зоа ОСуьом (мл)

о

CD

К

О

Й £

и-"'

Рис.10. Аффинная хроматография белковой фракции яда зеленой жабы на колонке (1x10 см) АШ-ФДС.

:0.(В

V, ххЫ/млп а)

О 20 40 СО 80 100 120 I, М1Ш

СЖКмкМ г)

10 20 30 40 50 . Ш

V, ккИ/юш д)

О 1

3 4 (Я иИ

Рис.11. Каталитические характеристики фосфолипазы А2 иЬ яда зеленой жабы: а) — кинетика гидролиза яичного ФХ; б,в,д) — рН —, темпера — турная —, субстратная зависимости; г) — кинетика гидролиза яичного ФХ в зависимости от ионов + и рН среды: 1 — рН 7,0. Са"^ + — 20мМ, 2 - рН 6,0 20мМ, 3 - рН 7,0 без Са^ + , 4 - рН 6,0 без Са2+.

Определение специфичности выделенной фосфолипазы провели совместно с с.н.с. лаборатории химии липидов ИХРВ АН РУ Исаму-хамедовым А.Ш. Результаты показали, что исследуемая' фосфолипаз; обладает строгой стереоспецифичностыо по отношению к ФХ i гидролизует ЖК в Sn —2—положении в глнцеридной молекуле ФХ что доказывает принадлежности этого энзима к классу фосфолипа: типа А2- Изучение каталитических свойств фосфолипазы Ä2 показало что фермент обладает низкой активностью б соотношении яичноп фосфатидилхолшш: так скорость гидролиза составляла от 2 до 1! ммоль/мин.мг белка. Кинетическая кривая реакции гидролиза яичноп фосфатидилхолина во времени {рис. l'ia) характерна для• большинства известных фосфолипаз А2'из.других источников. Образование свободных жирных кислот pacr-JT и точение первых 30 минут ферментативной реакции, и далее их. количество, остается, постоянным Исследование температурной зависимости выявило относительную термостабильность фермента, который проявлял каталитическую активность в широком пределе температур с максимумом при. 50°С (рис.1 iß); такой температурный режим характерен токсически; фосфолипазам h'i, выделенным из яда большого шершня и пчелы.

Изучение влияния ионов Са^+ па ферментативную активное: фосфолиназы Л2 показало, чго он оказывал .активирующее ¿лияшк хотя фермент проявлял каталитическую активность и в отсутстси ионов (рис.1 Ii). Каталитические константы ферментатпвио

реакции составля \и: Км —2,77мМ и Ушах = 0,02мкМ/мни.

YI. Биологические зффех<ты яда зеленой жабы Bufo viridis и его Суфадиеиолндиых компонентою

Важной особенностью и отличительным свойством яда жаб является его выраженное кардиотропное действие, обусловленное стероидными компонентами яда. В связи с этим совместно с с.н.с. ИХР АН РУ З.А. Хушбахтовой было проведено исследование фармакологических свойств препарата "Бакагин". Исследование показало, чт препарат обладает выраженной биологической активностью и подоби другим известным сердечным гликозидам оказывает избирательно действие на сердечно — сосудистую систему.

Установлено, что в 1г "Накатана" содержится 2500 — 3500 КЕД 10000 —12000 ЛЕД. Действие "Бакагина" на изолированных папиллярных мыщцах начинает провялят»,ся с концентрации 5х10~8 г/м.

СЕ50 инотр. препарата составляет 4,1 х 10— ? г/мл, СЕ50 хрон. — 8 х 10 ~ 6 г/мл, коэффициент избирательности положительного ино — тройного действия 0,05.

Анализ результатов проведенных исследований показывает, что новый суммарный сердечный стероид — "Бакагин" оказывает действие на сердце подобно известных гликозидам строфантияоподобного типа, проявляющееся в опытах in vitro и in vivo. "Бакагин" выгодно отличается от строфантина — К меньшей токсичностью. Эти результаты дают основание рассматривать "Бакагин" как ценное перспективное кардиотоническое средство, представляющее определенный практический и теоретический интерес.

Кардиотропное свойство буфадиено.\идов яда жаб многие исследователи связывают с действием их на Na + /К + — АТФазу. В связи с этим, изучено действие составляющих "Бакагин" гамабуфоталина и аренобуфагана на активность транспортных АТФаз. Эксперименты показали, что исследуемые стероиды даже в высоких концентрациях (2x10 ~4М) не влияли на активность Са2+— и Мд2 + — АТФаз, но в концентрациях 10~ Ю —10 существенно ингибировали микро-сомальную Na + /К + — АТФазу из различных органов животных.

В связи с кардиотропностыо буфадиенолидов представилось интересным исследовать их действие на АЦ —систему, участвующую в регуляции сократимости сердечной мышцы. Одним из главных звеньев механизма регуляции является фосфорилирование субстратных белков клетки с помощью протеипкиназ.

В опытах in vivo нами исследовано действие цельного яда зеленой жабы и двух его стероидных компонентов, гамабуфоталина и аренобуфашна, на активность АЦ, цАМФ'— зависимой ПК и ФДЭ — цАМФ. Предварительно мы установили LD50 цельного яда и буфадиенолидов составившее для крыс 60 мг/кг и 15 мг/кг соответственно. В опытах использовались дозы, равные 1/10 LD5Q.

Как показали эксперименты, введение животным цельного яда в дозах 400 мкг и 600 мкг повышает активность АЦ до 190 и 227%, а цАМФ — зависимых ПК — до 139 и 169% соответственно. Активность ФДЭ при тех же концентрациях яда составляет 80,7 и 67,2% соответственно. Напротив стероидные компоненты, гамабуфоталин и аренобуфагин, в дозе уже 100 мкг снижают активность АЦ до 56,2 и 61,4%, цАМФ-зависимых ПК - до 47,3 и 58,3%. Активность ФДЭ под

V - 32-; v

действием стероидов повышается до 165 и 158%, соответственн (рис.12).

Рис.12. Действие цельного яда жабы Bufo viridis (1) и двух его буфадиенолидов — гамабуфоталина (2) и аренобуфапша (3) на активность ферментов АЦ системы в опытах IN VTVO. а-АЦ; б - цАМФ-зависимая ПК; в - ФДЭ Полученные результаты свидетельствуют о несомненно; влиянии цельного яда зеленой жабы и буфадиенолидов на активност ферментов АЦ—системы в опытах in vivo. Для более детального исследования действия яда и 2-х его буфадиенолидов на ферменп АЦ—системы были также проведены серия опытов in vitro.

Исследование действия цельного яда на активность АЦ обна -ружнвает дозозавнсимый характер. Как видно из'рис. 13, с возрастанием дозы активное Ii. АЦ также повышается, достигая пятикратпог увеличения при использовании 40 мкг яда. Дальнейшее увелнчени дозы приводит к резкому падению ферментативной актнвносп Наблюдаемое падение активности под действием высоких концентраций цельного яда, может быть объяснено присутствием в яде ингибиторов этого фермента. Такими ингибиторами являются два стероидных компонента — гамабуфоталин и аренобуфапш, добавлени которых, в инкубационную среду в дозе 5 мкг вызывают резкое подавление активности АЦ до 80 и 75% соответственно (рис. 14).

300-

~r

20 40 60 С,мкг/мл

АЛ 10060-

20-

рис.13. Зависимость активности ферментов АЦ—системы от концентраций яда зеленой жабы Bufo viridis (1,— АЦ, 2.— цАМФ-зависимая ПК, З.ФДЭ).

Рис. 14. Действие буфадиеиолидов яда зеленой жабы B.viridis гамабуфоталина (1) и аренобуфатна (2) на ферменты . АЦ — системы в опытах in vitro, а — АЦ; б — цАМФ— зависимая ПК; в — ФДЭ.

Известно, что угнетающие Na+/K+— АТФазу сердечные гликозиды уабаин, строфантин К, Дигитоксигенин и многое другие реализуют свое кардиотропное действие через увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са^ + за счет ингибнрования Na + /K+— АТФазы —•> накопления Na внутри клетки—ч> стимуляции Na +/Са+—обмена, работающего на вход Са2+ в клетку

-> увеличение внутриклеточной концентрации Са2 + . Возникает

вопрос, каким образом изменяющиеся . концентрации иоцов Ca2"'" оказывают влияние на активность адеиилатцйклазы. В работе (Панчецко МП. и др., 1981} показано, что одна и та же каталитическая субъединица АЦ может активироваться ионами Са2+. Повышение концентрации ионов Ca2 + до 10"" ^М приводит к резкому воз— растению активности АЦ, однако дальнейшее увеличение концентрации Са2 + до 10— 3М вызывает ингибирование фермента {Авдошш П-S. и др. 1978). Такое ингибирующев действие больших количеств ионов Са2+ описано для мембранных препаратов АЦ, выделенных из большинства тканей (Percins j.P.,1973). Можно полагать, что повышение концентрации ионов Ca2 в миокарде сначала приводит к активации АЦ, а затем по мере накопления Ca2"*" до больших кон—

центраций — к ингибированию синтеза цАМФ из—за подавления АЦ. ' Таким образом, ингибироваиии Na+/K+ -АТФазы, приводящее к! увеличению концентрации ионов Са2+ в клетке, возможно модули—; рует активность аденилатциклазы.

Проведенные эксперименты показали, что в присутствии Яда и буфадЯенолидов изменения активности цАМФ-зависимой ПК полностью коррелируют с изменениями активности АЦ: дозы яда от 7,5 до; 40 мкг стимулируют активность обоих ферментов, а начиная с дозы 45; мкг наблюдается 60% ингибирование {рис.13 —2). Буфадиенолпды гамабуфоталин и аренобуфагин б дозе 5 мкг подавляли активность цАМФ —зависимых ПК на 72 и 59% соответственно (рис.14).

Из литературных источников известно, что ингибиторы Na+/К +—АТФазы - сердечные гликозиды (уабаии и др.) лучше всего связываются с фосфорилированной формой Na+/К + —АТФазы (Dupont Y.j 1982). Анализируя полученные нами результаты, можно, предположить, что стимуляция АЦ и увеличение активности цАМФ —, зависимой ПК увеличивают число фосфорилированных молекул Na +/К +—АТФазы, И в связи с этим происходит более быстрое, связывание АТФазы с буфадиенолидами яда, что и приводит к резкому ее ингибированию.

G другой стороны, можно было бы предположить, что изменение концентрации цАМФ и связанные с этим изменение активности цАМФ —зависимых ПК может быть результатом модуляции активности фосфодиэск.'разы. Однако изучение действия исследуемых веществ на активноеть ФДЭ показало, что при увеличении дозы яда до 40 мкг : существует тенденция к снижению ее активности на 32,5%, однако дальнейшее увеличение дозы повышает активнедть ФДЭ до базального уровня (рис. 13—3).

Гамабуфоталин и аренобуфагин в дозе 5 мкг также повышали активность 'ФДЭ, но незначительно на 8,7 и 1!,5% соответственно (рис.14), т.е. ФДЭ цАМФ практически не влияет на концентрацию цАМФ.

На основании анализа полученных результатов можно предположить следующую последовательность событий в клетке при действии яда среднеазиатской зеленой жабы B.viridis: ингибирование

буфадиенолидами яда Na+/К +—АТФазы -> повышение кон-

центрации ионов Са2+-> стимуляция активности АЦ за счет повышающихся (стимулирующих) концентраций ионов Са2 + —>

повышение активности цАМФ—зависимых ПК —фосфорилиро— вание Na + /К + — АТФазы —* более быстрое связывание буфадие-

нолидов яда с фосфорилированное формой Na+/K + — АТФазы-»

резкое ингибирование Na+/К +-АТФазы -—» быстрое повышение

концентраций ионов Са2+ -► ингибирование АЦ более высокими

(инактивирующими) концентрациями ионов Са2+ -—> индукция Са2 + — зависимых процессор в клетке.

Для изучения цитотоксической активности цельного яда и выделенных индивидуальных компонентов использовали следующие клеточные штаммы: асцитной карциномы Эрлиха, выделенной из мышей на 6 — 8 день после инокуляции опухоли; перевиваемые клеточные штаммы эритробластов человека К —562 и лимфобластов человека Molt—4, для выращивания которых, использовали питательную среду RPMI—1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, глутамина и антибиотиков. Цитотоксическое действие веществ на клетки определяли по ингибированию включения в ДНК {3HJ—тимидииа и [ЗН] — уридина в РНК в случае асцитной карциномы Эрлиха, по ингибированию включения в ДНК |3Н]~ тимидина и (3HJ—смеси аминокислот В белки в случае клеток К —562 и по подсчету количества мертвых клеток в случае Molt—4 после окрашивания 0,5% трипановым синим. Исследуемые токсические вещества испытывали в широком диапазоне концентраций: от 100 мкг/мл до 0,001 мкг/мл среды. Результаты проведенных исследований по определению дозазависимых цитотоксических эффектов цельного яда Н буфадиенолидов представлены в таблице 4.

Таблица 4

Цитотоксйческая активность яда Bufö viridis и его токсических компонентов иа моделях опухолевых клеток,

НАЗВАНИЕ ВЕЩЕСТВ ДОЗЫ ВЕЩЕСТВ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ 50% (СЕ50 ) ГИБЕЛЬ КЛЕТОК (мкг/мл), определенные по:

Асцнт.карц.Эрлиха К — 562 Molt-4

включению ¡3Н]тими —дина включению [ЗН1- уридииа включе -иию [ЭН1ТИ-миднна включе — иию[3н|-смеси ам — кислот подсчету количеств мертвых клеток

Цельный яд 50 50 100 JOO 100

Гамабуфоталин 30 10 Ю 0,1 ?о

Аренобуфагин 0,1 0,1 0,1 0,01 0,1

Как видно из таблицы 4, СЕ50 Цельного яда составляет 50 мкг/мл' по отношению к клеткам асцитной карциномы Эрлиха, в то время как для клеток К —562 и Molt-4 такой эффект проявлялся в дозе 100 мкг/мл. Индивидуальные буфадиенолидные компоненты яда —: гамабуфоталин и аренобуфагин в концентрациях 10 и 0,1 мкг/мл,' соответственно, вызывали 50% — ю гибель клеток.

Для определения противоопухолевой активности в системе in. vivo животным — опухоленосителям вводили сумму буфадиенолидов в виде препарата "Бакагин". Результаты Исследований представлены в таблице 5. \ .'.'■.'■

: Как видно из таблицы, препарат "Бакагин" при 11—разовом введении в дозе 10 мг/кг дает 93,4% торможения роста опухоли по отношению к контролю. При этом средний вес опухоли составляет 0,3 г., в то время как в контроле ~ 4,85 г. Известный противоопухолевый препарат сарколизин в эффективной лечебной дозе 0,75 мг/кг (Ларионов Л.Ф.,1962) в этих же условиях дает всего 22,75%; торможения, и средний вес опухоли при этом составляет 3,6 г.

Таблица 5.

Результаты изучения противоопухолевой активности препарата "Бакагин"'

Препараты Доза преп. Средн. вес Достовер. Торможение,

мг/кг опухоли г стат. обр. о/ /а

Бакагин 10 0.3 i 0 Р<0,002 93,4

Сарколизин " U,75 З',б ± 0,572 Р< 0,398 22,75

Контроль без препарата 4,85 ±0,919 ---- - - -

"Опыты проводились в Институте онкологии и радиологии АН РУ, Препарат вводился зараженным Седым беспородным мышам Balb раком тонкой кишки "Акатоц" через 48 ч. после перевивки, ежеднейю в течение 11 дней. В к<)честие контроля взята опухоль мышей, где вместо препарата был введен физраствор, содержащий 10% этиловый спирт а также мыши, которые подвергались лечению с известным противоопухолевым препаратом Сарколизин.

Таким образом, из приведенных экспериментов в системе in vitro и in vivo можно заключить, что выделенные соединения обладают выраженным противоопухолевым эффектом, активность которых превосходит известный противоопухолевый препарат сарколизин.

-37- .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты наших исследований характеризуют две токсические истемы, использующие при своем функционировании ¡неорганические соединения разных классов. Несмотря на [ринципиалыше структурные отличия и разницу в конечных ффектах (5-ЛТ и буфадиенолидов продемонстрирована роль ионов Га2+ как наиболее уязвимого для них звена метаболизма в клетке. Збсуждены возможные механизмы действия токсинов при ювреждении Са2+—транспортирующих систем с последующим лиянием на другие структуры, обеспечивающие передачу ■нутриклеточного сигнала. Представлены данные, характеризующие 1ыделенные токсины в качестве эффективных инструментов изучения ¡иологических структур, и даны предложения о практическом (спользовании некоторых из них как лекарственных препаратов, -¡овые перспективы применения токсинов, например, из жабьего яда ткрываются в связи с обнаружением их цнтотоксичности и влияния [а митогеиез иммунокомпетсптньп: клеток.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан способ получения Са2+- связывающего белка 0-штротоксина из яда паука 1аЦ-сс?ес^и5 {гесЗес1п:дииа1из з'частом виде, ключающий этапы высаливания, голевой — и ионообменной роматографии. .Показано, что (1-ЛТ связывает ионы Са2+ в оотношении 2:1.

2. Организация пространственной • структуры Са р-ЛТ роанализирована с помощью электрофореза, гель —хроматографии и 1Д—спектра.. Установлено субъедгшичнос строение н предложена юдель олигомерной структуры р-ЛТ, согласно которой его молекула остоит из четырех субъедшшц. Нативпая конформация и етвертичная структура р-ЛТ поддерживается конами кальция.

3. Из исчерпывающего триптипеского гндролизата КМ —р-ЛТ ыделено 86 пертидоз, содержащих п сумме 764 аминокислотных статков (с учетом свободного лИзина), что соответствует 85% От бщего числа остаткоа в молекуле р-ЛТ, и установлена минокислотная последовательность крупных трнпТиЧескнх пептидов юрмирующих "кор", Осуществлен структурный анализ выделенных риптических пептидов по банку белковых структур и выявлена ысокая гомология (57,1-60%) пептидов 1-1-1 — 1; 1-3-1-1; 1-26-

-381 со структурными фрагментами медьсодержащего белка гемоцианина, выделенного из яда американского тарантула Europeta calinica.

4. Осуществлено детальное исследование небелковой и белково фракции яда зеленой жабы Bufo viridis. Впервые из этого я/ методами гель—проникающей, гидрофобной и обращеннофазово хроматографии выделены В индивидуальном виде 6 соединени стероидной природы, идентифицированные как буфадиенолиды.

5. Методами 'Н —ЯМР, масс - спектроскопии, а таю» рентгенов-структурного анализа установлена химическая конформационная структура для двух из выделенных буфадиенолидо; гамабуфоталина (3ß, Па, 14—три-гидрокси-5р,14р-буфа-20,22-диенолида) и аренобуфагина (3ß, 11а, 14-три-гидрокси- 12-оксо-5ß, Hß-буфа — 20, 22—диенолйда).

6. Установлено, что для аренобуфагина из различных объекте характерен наличие полиморфизм: по своей молекулярной структур аренобуфагин яда зеленой жабы Bufo viridis отличается от описании в Литературе; гамабуфоталйн как компонент секрета ядовитых желе жаб этого вида идентифицирован впервые.

7. Из яда среднеазиатской зелёной жабы Bufo viridis с помощы аффинной хроматографии на синтезированном нам биоспецифическом сорбенте Affi —ФДС впервые выделена индивидуальном пндр фосфолипаза А. Установлено, что выделенны энзим относится к группе фосфолипаз А2, изучены его каталитически свойства (pH-, температурная — , Ca2 + —зависимости, определен константа Михазлиса Км = 2,77мМ).

8.; Изучено действие яда зеленой жабы B.vmdis°H его дву стероидных компонентов на ферменты А1Д—системы в опытах in viti и in vivo. Установлено, что низкие дозы яда { до 40мкг) стимулируя активность АЦ и "цАМФ-зависимых ПК, более высокие (от 45 мкг выше) — ингибируют. Найдена корреляция действия яда и двух ег буфадиенолидов на активность ферментов АЦ и цАМФ —зависимы ПК в опытах in vitro и in vivo. В опытах in vitro установлено, т индивидуальные гамабуфоталйн й аренобуфагин в дозе 5 мг ингибируют активность фермента АЦ . Показано ингибирующе действие яда зеленой жабы и обоих выделенных буфадиенолидов н №+/К+-АТФазу.

-399. В опытах in vitro на клеточных линиях К —562 (эритробласты еловека), Molt—4 {лимфобласты человека) и асцитной карциномы >рлиха, а также in vivo на животных — опухоленосителях показана ыраженная противоопухолевая активность гамабуфоталина, ренобуфагина и суммы буфадиенолидов, названной "Бакагин". становлено, что "Бакагин", состоящий преимущественно из ренобуфагина и гамабуфоталина образующих в совокупности 80% от сей массы препарата, в дозе 10 мг/кг подавляет опухоль тонкой ишки "Акатон" на 93,4%.

10. Показана кардиотропность препарата "Бакагин" in vitro, и становлено, что он выгодно отличается от К —строфантина —р [еньшей токсичностью и большей широтой фармакологического ействия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Satikhov Sh.I., Adylbekov М.Т., Slavnova T.I., Tashmukhamedov IS., Abdurakhhmanova J.A., Komeyev A.S., Sadykov AS. Structural aculiarities and mechanism of action of presinaptic neurotoxin from' enoms of Latrodectus and Lytefantus spiders.// Toxins of tools in eurochemistry, Berlin,New York, 1983, p. 325 - 335

2. Salikhov Sh.I., Adylbekov M.T., Slavnova Т.1., Tashmukhamedov IS., Abdurakhmanova J.A., Sadykov AS. Structural peculiraties and lechanism of action of presinaptic neurotoxins from venoms of Latro — ectus and Lytephantus spiders.// Hoppe — Sey'er's.Z.Physiol, Chem., 1933, 01.364, p.619

3. Salikhov Sh.I., Slavnova T.I., Tashmukhamedov M.S., Adylbekov IT., Komeyev A.S., Abdurakhmanova J.A., Sadykov A.S. Structure and lechanism of action of neurotoxin from the venom of Latrodectus aiders.// Chemistry of peptides and proteins.vo!.l2. N4 Berlin — New York. 384, p.319-326

4. Ташмухамедов M-C., СаЛихов Щ.И. Садыков A.C. Влияние анцентрации ионов Са2+ на параметры КД спектра р-датротоксина з яда паука latrodectus tredecimguttatus.// ДАН УзССР,19Яб, N 1 с.48-з

5. Тошмухамедов М.С. Захар нкма? Улардан фойдаланса уладнми? //Вш куч, Тошхент 1991, N2, р.25 .

6. Ташмухамедов М.С., Закирова O.K., Мирзаахмедов Ш.Я., алихов Ш.И.. Якубов И.Т., Рахимов М:М. Выделение фосфолипазы А2

из яда зеленой жабы Bufo viridis. //Химия природных соединени 1994, N1, с. 105- 109

7. Ташмухамедов М.С., Мирзаахмедов Ш.Я., Закирова O.I1 Ибрагимов Б.Т., Камаев Ф.Г., Умарходжаев A.C., Салихов Ш.1 Аренобуфагин и гамабуфоталин из яда среднеазиатской жабы Bu viridis. //Химия природных соединений, Í994, N1, с.140— 141

8. Ташмухамедов М.С., Мирзаахмедов Ш.Я., Кузнецова H.I-Салихов Ш.И. Биологическая активность некоторых ядов животных их компонентов в системе in vitro. //Узбекский биологический жури; 1994, N2, C.G7-69

9. Ташмухамедов М.С., Закирова O.K., Салихов 1II.V Абдувахабов A.A. Действие яда среднеазиатской зеленой жабы Bu viridis и его токсических компонентов на активность аденилатциклаз печени крысы. //ДАН РУ, 1994, N10, с.42 -43

10. Ташмухамедов М.С., Закирова O.K., Мирзаахмедов 1Ш Туляганов Р.Т., Салихов Ш.И. Влияние некоторых ядов животных I первичный иммунный ответ мышей //Узбекский биологичесм журнал, 1995. N1. c.l 1 -13

J!. Ташмухамедов М.С., Мирзаахмедов Ш.Я., Ибрагимов Б.1 Камаев Ф.Г., Бекетов K.M., Хушбактова З.А., Салихов Ш.1 Аренобуфагин и Гамабуфоталин яда среднеазиатской зеленой жаб Bufo viridis, выделение, структурно — функциональные особенност //Химия природных соединений, 1995, N2, с, 260 - 268

12. Исамухимодон А.Ц1., Закирова O.K., Ташмухамедов М.С Определение сторо»«специфичности фосфолипазы А из яда зеленс жабы Bufo viridis.// Химия природных соединений, 1995, N5, с. 750

751 . ■ \ : ■

V . Патенты: 0

13. Ташмухамедов М.С., Мирзаахмедов Ш.Я., Салихов Ш.1-Хушбактова ЗА. Способ получения суммы буфадиенолидов "Бакапн яда золеной'жабы Bufo viridis.// Патент N 2938 Заявка N I Н / 9500112.1 приоритет от 03.02.95.

Тезисы докладов:

14. Салихов Ш.И., Ташмухамедов М.С., Адылбеков М.Т., KopHei A.C., Абдурахманова Ж.А., Ахунов A.A., Садыков A.C. Выделение изучение структуры нейротоксина и кининазы из яда nayi LaUodectus Iredecimguttatus.// Тез.докл.111 СССР-ФРГ симпозиума i химии пептидов и белков. Махачкала, 1980, с.71

15. Салихов Ш.И., Абдурахманова Ж.А., Ташмухамедов М.< Адылбеков М.Т., Корнеев A.C., Садыков A.C. Исследование первичне

структуры токсина из яда паука Latrodectus tredecimguttatus.// Гез.дркл.У Всесоюзн, симпоз.по химии и физике белков и пептидов. Баку. 1980. с.21

16. Ташмухамедов М.С. Выделение и изучение четвертичной структуры нейротохсина из яда паука Latrodectus îredeclmguttatus,//MaTep.II конферен,молодых ученых по физико-шмической биологии». Баку, 1981, с.99

17. Салихов Ш.И., Ташмухамедов М.С., Адылбеков М.Т., Корнеев Ч.С., Абдурахманова Ж.А., Садыков А.С. Исследование структуры гейротоксина из яде паука Latrodectus tredecimguttatus.// Рефераты дол.** сообщ. N2 XII Менделеевского съезда по общей и прикладной симии. М., 1981, с.147-148

18. Salikhov Sh.I, Tashmukhamedov M.S., Adylbecov M.T.. \bdurakhmanova JA, Korneyev A.S., Sadykov A.S. Isolation and itructurial study of a neurotoxin frora the venom of the spider Latrodectus redecimguttatus.// 6th Indo—Soviet ¡symposium of the chemystry of îatura) producta. Poona, 1981, p. 15

|9. Салихов Щ.И., Ташмухамедов M.C., Адылбеков M.T, Корнеев V.C., Абдурахманова Ж.А., Славнова Т.И., Садыков А.С. Структура и «ехаиизма действия нейротокснна из яда паука Latrodectus redecimguttatus.// Тез.докл.У! СССР—Франция симпозиума по труктуре и функции белков и нуклеиновых кислот. Цхалтубо, 1982, .48

20. Салихов Ш.И., Славнова Т.И., Абдурахманова ж.А., адылбеков М.Т., Ташмухамедов М.С., Корнеев А.С., Садыков А.С. ТсследрваНия структуры и механизма действия нейротоксина из яда ayxa Latrodectus tredecimguttatus.// Твз.докл.1 Всесоюзн. цофнзцЧхъезда. .М, 1982, Т.1, с,160 ,

2). Салихов Щ.И.. Ташмухамедов М,С.. Адылбеков М.Т., Садыков i.C. Структурные н функциональные исследования иейротоксинов из Дрв пауков.// Тез. АРКА. УН-Индрсоает. Симпозиума. Тбилиси, 1983,

22. Сагднеа Н.Ж, Корнеез А.С., Сагдиева АД., Ташмухамедов 1С., Садыков АА, Салихов Ш.И. Структура нейротокснноз и цсектотоксина из ЯМ погребного йаука Scgestria florentirta,// ез.докл.Х1У Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. 989, Москва ,с 484

23. Ташмухамедов М.С., Умарходжаев АС., Закирова O.K., алихов Ш.И. Влияние яда зелено?! жабы Pufo vlridis ц его эксических компонентов на активность адениЛатциклазы печени

крысы.// Тез. до к/.. V - конференции биохимиков Средней Азии и Казахистана. Ташкент, 1991, 12-15 ноября, с. 102

' 24. Ташмухамедов М.С., Закирова O.K., Умарходжаев A.C., Барсегян Г. Действие низкомолекулярных компонентов ядов песчаной эфы Е. carinatus и зеленой жабы Bufo viridis на поведенческую активность подопытных животных.// Тез. докл. V—конференции биохимиков Средней Азии и Казахистана. Ташкент, 1991, 12—15 ноября, с. 100

25. Ташмухамедов М.С., Кузнецова H.H., Иногамов У.К., Умарходжаев A.C., СагДиев Н.Ж. Изучение цитотоксической активности некоторых ядов животных Средней Азии и их компонентов в культуре . ткани.// Тез.докл.V—конференции биохимиков Средней Азии и Казахистана. . Ташкент, 1991, 12—15 ноября, с. 101

26. Tashmukhamedov M.S., Atakouziev B.U., Grishin E.V., Arbaiza E., Lenci L, Lizarraga В., Marcelo A, Olivera J., Gonzales A. Efecto de diferente muestras biológicas en globodera pallide. stone,stone,raza P4A. // X— Biological conggress. Lima, Peru 1992, p.78

27. Ташмухамедов M.C., Мирзаахмедов Ш.Я., Закирова O.K., Салихов Ш.И. Изучение цитотоксической активности некоторых ядов животных по отношению клеток асцитной карциномы Эрлиха. //.Тез. докладов конференции "Проблемы биохимии". Душанбе, 1993, с.87

28. Ташмухамедов М.С., Закирова O.K., Мирзаахмедов Ш.Я., Салихов Ш.И. Биоспецифическая хроматография фосфолипазЫ А2 из яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis. // Тез. докладов конференции "Проблемы биохимии". Душанбе, 1993, с.88 .

29. Бекмухамедова З.У.,. Бердяев Б.К., Ташмухамедов М.С., Салихов Ш.И., Шленский В.Г.,Мирэаахмедов Ш.Я., Захарова O.K. Влияние токсинов из яда среднеазиатской , жабы на ионтранспортирующие системы. //И - Конференция биохимиков Узбекистана. 1993, 22 - 24 ноября с.21

30. Ташмухамедов М.С, Закирова O.K., Мирзаахмедов Ш.Я, Действие цельного яда Bufo viridis и его компонентов на активное^ цАМФ зависимой протеиикиназы печени крыс //Н-Конференция биохимиков Узбекистана. 1993. 22 - 24 ноября с.76

31. Tashmukhamedov M.S., Salikhov SH.I., Zakirova O.K. Action ol central asian toad toxic components on the activity of adenilatcyclase ol the rat liver.// 2-nd IUBMB conference, "Biochemistry of Cell Membranes" Italy,Bari, 1993 .September 29- october 3. p. 103.

-4332,' Ташмухамедов М.С., Закирова O.K., Мирзаахмедов Ш.Я., Шленский В.Г., Бердиев В.К., Бекмухамедова З.У. Действие токсических компонентов яда среднеазиатской зеленой жабы Ви/о viridis — буфадиенолидов гамабуфоталина и аренобуфагина на транспортные АТФазы. //Тезисы научной конференции "Структура и функции биологических мембран" (23—24 марта 1995 г., Ташкент) с. 103

LATRODECTUS TREDEC1MGUTTATUS ВА BUFO VIRIDIS ЗАХАРЛАРИНИНГ БИОЛОГИК ФАОЛ КОМПОНЕНТЛАРИ: СТРУКТУРА ВА ФУНКЦИЯСИ.

М. С .ТО Ш М У ХАМ БД О В Кора к,урт ургимчаги Latrodectus mactans- tredecimguttatus зах,аридан Ca2 + — богловчи . ок,сил, ß —ЛТ ажратиб олинди. Электрофорез, гель—хроматография ва КД~спектришшг тахдили асосида ß —ЛТ молекуласининг туртлдмчи структураси таджик, «¡илинди. ß—ЛТ одигомер структурасшшиг модели таклиф цилиниб, унда молекула туртга суббирликдан иборат эканлиги, х;амда табиий конформацияси Са2+— ионларн. ёрдамида ушланиб туриши к\?рсатилди.

KM—ß —ЛТ ни ту ли к, триптик гидролиз кдлиниб, гядролизатдан 86 та пептид индивидуал холда ажратиб олинди. Уларнинг умумий х,олда 764 та • аминокислота к,олдигидан иборат булган кетма—кетлиги урнатиЛди. Бу эса ß — ЛТ молекуласидаги аминокислота к,олди!<^аринииг карийиб 85% ни ташкйл этади.

Яшил ба*;а Bufo viridis заз^аридан стероидлар синфига мвнсуб булга« б та буфадиенолид биринчи марта иидивндуал лолда ажратиб олинди, Улардак иккитаси, — аренобуфагин за . гамабуфоталиннинг кимёвий ва конформацион тузили шлари урнатиддп. Асосап арепобуфапш ва гамабуфоталин буфаднёнолидларининг йнгандисидан иборат болтан ва шартли равншда "Балаган" деб номланган препаратшшг олиниш услуби ишлаб чшуыдп. Биоспецифик хроматография услуби ёрдамида, биринчи марта Индивидуал х,олда фосфолипаза А2 фермента ажратиб олиниб, унинг мах;суслнш ва каталитик хусусиятлари аникланди. Яшил бак,а Bufo Viridis зах,арининг ва унинг асосий токсик компонентларининг АЦ—тизимига таъсири урганилди: хам да in vitro ва in vivo тажрибаларида Bufo viridis бак,асининг зах,ари таъсирида, АЦ ва цАМФ —боглик; ПК нинг фаолликлари орасида мутаносиблик борлиги курсатилди. In vitro ва in

vivo тажрибаларида гамабуфоталин ва аренобуфагиняиаг шунингде» "Ва^агин" препаратинннг рак шишига царшияадол фаоллнги биринч! марта намойиш цилинди. Бацогиннинг ииотроп таъсири б)>йича оли( борилган фармокологак оддоотлар. таббйётда маълум Ьа kbhi ^лланиАадйган кардиотроп препарат К - строфантин —р га дасбата « кичик токсикликка ва кенг фармакологии таъсир »умят Кучига эге эканлнгини курсатди.

BIOLOGICALLY ACTIVE COMPONENTS OP BLACK WIDOW SPIDER LATRODECTU5 TREDECIMGUTTATUS AND BUFO VIHIDIS VENOMS: STRUCTUftE AND FUNCTION.

M.S. Teshmoukhamedov

Ca2+-binding protein p~latrotoxin (P-LT) has been Isolated Iron the venom of black widow spider Lartodectus mactans tredecimguttatus , According to electrophoresis and gel-chromatography data, KD spectral measurements the quaternary structure of p-LT molecule has been studied The model of p-LT oligomer structure has been proposed. According tc this model p-LT molecule consists of four elongated subunits. Native conformation of p-LT molecule 1з supported by Ca2+ — ions. The complete triptycal hydrolysis of carboxymethylated—p-LT has been carried out 8E peptides from hydrolysis products in sum consisting of 764 amino acid residues that correspond to 85% from a common number of residues in 0-LT molecule have been isolated. Their amino acid sequences have been determined.

For the first lime 6 individual bufadienotids concerning a class oi steroids have been isolated from Bufo viridis green toad. Chemical end conformational structures of two steroids — arenobufagin and gamabufotalin have been studied. The method of the obtaining of the sum of bufadienolids composing from mainly arenobufagin and gamabufotalin named the preparation "Bakagin" has been developed. For the first time phospholipasa Ajj in an gomogenous form has been isolated by the method of biospecific chromatography. Its specificity and catalytic properties have been determined. The effect of Bufo viridis green toad venom and its main toxic coinponents on enzymes of adenilatcyclase (AC) system has been studied. It has been shown that there was a correlation between activities of AC and cAMP-dependent protein kinase by the effect of & viridis green toad venom in vitro and in vivo. First the expressed antitumouf activity of gamabufotalin, arenobufagin and also the preparation "Bakagin" in Vitro and in vivo has been shown.

Pharmacologjcal investigations of ionotropic effect of "Bakagin" lowed that "Bakagin" in Comparison with well — known and wildly iopted cardiotonic preparation K—strophanin — ¡3 was advantageously istinguished by its lesser toxicity and greater diapason of the tiarmacological effect

/

. Подпнсаво в печать —

3-ГО,Sé ,

\ Формат бумага бОхМ'Д». Bytiars тяг.аграфевд JA 1, Печать «РОТАПРИНТ». OBtes Тираж Á3 ara. Sagas,

¿ОЗЪ

-f - 'Ткпиграфпя нпшжш «Фаз» АН РУз. 7С017Э. Та®кеяТ| а^Д. X. Лвл^ллаепг, 79,