Исследование механизма действия биологически активных компонентов яда зеленой жабы Bufo viridis тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

РГ6 О/Г АКАДЕМИКА САДЬ'КОВА А. с. I Я М'ПМ

I ¡¡МП М-\0 На правах рукописи

УДК 577.15:576.3;547.963

ЗАКИРОВА ОЛИЯ КАДЫРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЯДА ЗЕЛЕНОЙ ЖАБЫ BUFO VIRIDIS

02.00.10 — биоорганическая химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТАШКЕНТ - 1995

Рабога выполнена в Институте биоорганической химии им. академика Садыкова A.C. АН РУ,в лаборатории химии белков и пептидов.

Научные руководители; доктор биологических наук, профессор Ш.И.Салихов

кандидат химических наук, старший научный сотрудник М.С.Ташмухамедов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ш.С.Азимова кандидат биологических наук, доцент Х.С.Мухамеджанов

Ведущая организация; Институт биохимии АН РУ

Защита диссертации состоится (-г-г01995 г.

в_часов на заседании сиецяализироваиного Совета

Д.015.21-21 при Институте биоорганической химии имени академика А.С.Садыкова АН РУ по адресу: 700143, Ташкент, проспект X. Абдуллаева, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института бпоорганической химии АН РУ.

Автореферат разослан «___»____ 1995 г.

Ученый секретарь специализированного Совета» доктор химических наук

Н.И.Барам

Актуальность проблемы. В настоящее время имеются многочисленные сведения о широком диапазоне физиологического действия яда яаб, в т.ч. антибиотическом, радиозапртном, противоопухолевом и др. Наиболее ярко выраженным действием яда является его кардиотропность, что представляет большой интерес для практического здравоохранения. Однако отсутствуют работы по исследованию молекулярных механизмов действия яда и природы физиологических ответов организма, что необходимо для глубокого понимания протекающих в организме процессов с целью осознанного управления метаболизмом в живых системах.

Креме того, одним из важных направлений фармакологии является поиск и изучение биологически активных веществ природного происхождения и создание на их основе новых фармакологических препаратов с выраженным биологическим действием при условии безвредности для организма. Яд зеленой жабы'Bufo viridis, являющийся предметом исследования, обладающий широким спектром Физиологических эффектов с давно обнаруженными лекарственными свойствами и используемый в цельном виде, может рассматриваться как прототип биологически активного средства, которой нуждается в выяснении механизма реализации этих эффектов на клеточном уровне с целый выявления активного действующего начала и дальнейшего совершенствования препарата. В связи с этим изучение яда среднеазиатской зеленой жабы, механизма действия- его Физиологически активных компонентов на клеточные системы организма представляется важным и актуальным.

Представляют интерес и белково-пептидкые компоненты жабъего яда. Практически отсутствуют работы по исследованию этой группы веществ. Выделение фосфолипазы из яда зеленой жабы Bufo viridis, одного из его белковых компонентов-, определение ее сне-

цифичносги, каталитических характеристик позволят пополнить этот класс ферментов, что может иметь определенное.теоретическое значение.

' Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение действия яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis, его физиологически активных компонентов на клеточные системы организма. В ходе исследования решались следующие задачи:

- выделение и очистка физиологически активных компонентов яда зеленой жабы Bufo viridis,

- выделение фссфолшазы, определение ее специфичности : каталитических свойств ( pH-,, температурной-, Са2+-зависимости, ' константа Михаэлиса) ,

- иэучение действия яда аеленой жабы и двух его буфади-енолидов на транспортные АТРазы (Cas+-, Mg2+-, Na+/K^-),

- изучение'«действия яда и его буфадиенолидов на ватаей-шую клеточную систему - аденилатциклазную, ■ включающую фермент! АЦ, сАМР-зависимые ПК и ФДЭ CAMP.

Научная новизна и практическая значимость исследования

Впервые из яда зеленой жабы Bufo viridis методом биоспецифической хроматографии выделена в индивидуальном виде фосфоли паза, определена ее специфичность как фосфолилааы Aß, изучен-ее каталитические свойства. •

Впервые изучено действие яда зеленой жабы Bufo viridis его основных токсических компонентов на ферменты аденилатаик лазной системы. Показано участке фермектоЕ АЦ-системы в реали аации эффектов жабьего яда. Установлено дозозависимое действи яда xaún 8.viridis на ферменты АЦ-системы, корреляция меяд •активностями АЦ и сAMP-зависимыми ПК под, действием яда лаб В.viridis-в опытах in vtvo и in vitro.

Установлено иягибкруящее действие буфациенолкдов яда зеленой жабы гамабуфоталина и аренобуфагина на активности ферментов АЦ и САМ?-зависимых протеинкиназ в дсзэ 1/10 LD50 в опыта/, in vivo, а такие в опытах in vitro.

Полученные данные помогут интерпретировать различные физи-слогичесюте эффекты яда, в т.ч. иммуномодулнцию, кардиотрсп-ность и некоторые другие.

Апробация работы и публикации. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на 1-й конференции Оксхге.ш-ков Таджикистана (сентябрь 1993 г.), на 2-м симпозиуме по биохимии клеточных мембран (Бари. Италия, сентябрь 1993г.), на 2-й конференции биохимиков Узбекистана (ноябрь 1993г.), на 1-м международном симпозиуме. по химии природных соединений (Ташкент, 1394 г), на научной конференции '.'Структура и функции биологических мембран" (Танкент, март 1995 г)..По теме диссертации опубликованы 4 статьи и тезисы 9 докладов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их о5-суждения, заключения, еыеодоэ и списка датируемой литературы. Работа содержит 12 рисунков, 7 таблиц и 1 схему. Список литературы включает 225 ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для характеристики цельного яда были определены • токсичность и фосфолипазная активность, изучались имкуномодулирукюе свойства и действие на поведенческую активность подопытных животных.

Лоза яда, вызывающая устойчивый длительный паралич у 100Z животных (Люо). составляла 100 мкг на ocof'b, LD50, определен-

- 6 -

ная на белых мъиач - 10 мг/кг.

Тест на фосфолипаэную активность цельного яда зеленой кабы проводили методом ферментативного гидролиза яичного фосфати-дилхоляна по известной методике.

Тестирование цельного яда на поведенческую активность проводили методом "Open field" ("Открытого поля"). Эксперименты показали неспецифическое активирование различных типов поведенческой активности. Проявлялись психотропный дезадаптацион-ный аффекты, . наблюдались неадекватные ситуации, эффект гипе-рангезии.

Исследование иммунотропного действия яда зеленой жабы было проведено в сравнении с действием ядов других животных, таких как яд щитомордника, гюрзы, эфы, яда большого-и малого шера ней, белого и черного -каракурта и осы. Опыты были проведены на белых беспородных мышах, иммунизированных внутрибркшшнным введением эритроцитов барана (ЭВ). Яды использовались в дозах, составляющих 1/20 LD50. Количество АОК определяли в селезенке иммунизированных животных прямым методом локального гемолиза в агарозе по методу Jeme (1960). Эксперименты показали, что все исследованные яды, за исключением яда зеленой кабы, проявляли иммунодепрессивное. действие, вызывая уменьшение количества АОК относительно контроля.

При изучении дозозависимости яда зеленой жабы Bufo viridis яд вводили внутрибрюшинно в дозах 1/6, "1/10, 1/20 LDso одновременно с иммунизацией. Опыты "доза-эффект" показали, что яд жаба в дозе 1/20 LD50 (0,5 мг/кг) стимулирует образование АОК, в то время как с увеличением дозы до 1/6 LD50 мг'кг) количество антителообразующих клеток отчетливо снижалось.

Для дальнейших исследований необходимо было провести Еыде-

леяие и очистку физиологически активных компонентов яда.

Первичное фракционирование проведено с использованием метода гель-фильтрации на колонке с сефадекссм Б-50Р (рис.1), в результате которого были получены две фракции. Пергая фракция, по ганнкм тестирования, обладала фосфсляпазной активностью.

Объем (мл)

ЯисЛ. Г ель-фильтрация цельного яда зеленой жабы на: колонке (1,6x95 см) с сефадексом G-50f в 0,1 М СНзС00№4, рН 4,7. Скорость потока 40 мл/час.

Низкомолекулярная £ фракция, • обладающая,'' по данным тестирования, токсичностью, была'затем разделена методом гидрофобной хроматографии на колонке с гидрофобным носителем полихрсм П-1 в ступенчатом градиенте концентрации этанола (10-60%).' Токсичную фракции, элюируемун 101 раствором этанола, далее разделяли методом обращеннсфазовой хроматографии на колонке НИгароге ЯРМС С8 в градиенте концентрации метанола (рис. 2) .

Высокая разрешающая способность и механическая прочность этой смолы позволили выделить в чистом виде два буфадиенолида,

- а -

aie

о сз

CJ

s

я

0.0В

И

■О

0>-

6 10 ' 16 Время (мин)

Рис.2- Высокоэффективная жидкостная хроматография активно! фракции после гидрофобной хроматографии, на колонке (1,0x25 см' ШЬгароге К! ЯМС Са в градиенте метанола. Скорость элюцм 1 мл/мин. .:■ • ,

выход которых составлял ОД и 0,2%, .соответственно, от- исходной сухой массы цельного яда. Использование'физико-химически: методов, таких как ШР-, масс-спектромегрия, рентгеноструктур ный анализ, позволила" идентифицировать выделенные буфадиеноли ды как гамабуфоталин ' (3»,11а,14-тригидроксй-58,14в-бу фа-20,22-диенадид) и -аренобуфагин (3.8, lia, . 14- тригидрок си12-оксо-5&, Ш-буфа-Ш,22-диенолид):

Л-

Г*шЛуфогвлва

АрвасСуфапш

Полученные таким' образом стероидные компоненты яда, был

использованы для скрининга их биологической активности.

В связи с тем, что в литературе практически отсутствуют введения D6 изучении фосфолипазы яда аеленой дабы, присутствие которой даже в незначительных количествах может сказаться .на интегральном эффекте яда, перед нами была .поставлена задачз выделения фосфолипазы, определение ее специфичности, а тзкхе изучение ее каталитических свойств. Известные методы выделения и очистки " фосфолипаз из различных источников имеет большое число стадий и дает невысокий выход очищенного фермента. Однако в последние годы получены высокоэффективные аффинные сорбенты, позволяющие одностадийно и с хорошим еыходом выделить ферменты этого класса. Для синтеза биоспецкфического адсорбента в качестве носителя нами использован высокостабилышй, имеющий многоатомную "ножку" Affi-Gel 10 (Bio-Rad, США),, позволяющий пространственно -удалить' лиг'анд (ФДС) - от. поверхности носи-' теля, .что уменьшает влияние стеркческих факторов при' взаимодействии его с выделяемым ферментом.. Кегидролизуемость фосфо-липидов, связанных аминоспиртовой частью с полимерным носителем, экспериментально доказана в работе (Wiichek М.,1973).' •

Десорбцию' фермента с адсорбента проводили в.различных ус-, ловйях, используя в качестве десорбируюдах растворов: 1) 10 мМ цетилтриметиламмоний. бромид;- 2) 10 мМ ЭДТА Ка-,' 3) 1 М NaCl; 4) градиент концентраций тритона Х-100 (0 -0,1%).Наилучшие результаты были получены десорбцией' в градиенте.концентрации тритона Х-100.(рис^З). .... ' .

Определена специфичность-выделенной фосфолипазы как фосфолипазы А-2. Изучение каталитических свойств фосфолипазы Аз из яда зеленой дабы показало', . что фермент обладает низкой актиЕ-ностью: удельная активность гидролига яичнрго: фосфагидилхсатаз-

w -О

со

Sä tt

s fcj

OjK-

100 - 200 - 300 400

Объем (мл)

50D

Рис.3. Аффинная.хроматография белковой фракции яда зеленой пасы на колонке (1x10 см) Äff1-ФДС.

составляла от 2 до 18 ммоль/мг-мин, в зависимости от условий опыта. Кинетическая кривая 'реакции гидролиза яичного фосфатк-дилхолина во времени (рис.4а) является характерной для большинства известных фосфолипаз Аг из других источников. Образование свободных жирных кислот растет в течение первых 30 иинут ферментативной реакция, и далее их количество остается постоянным. Исследование, температурной зависимости показало ее от-' носителькую термостабильность, фермент проявлял каталитическую активность в широком пределе температур с максимумам активности при t° ='50°С (рис.4в), ■ что характёрено для токсических фосфолипаз Аг, выделенных из пда большого шершня и пчелы.

Изучение влияния ионов Са2+ на ферментативную активность фосфолипазы Аг из яда аеленой жабы показало, что кальцчй оказывал активирующее влияние на фермент до концентрации ионоз 20 Ш в реакционной срсде, дальнейиее увеличение концентрации ио-

У.ыхМ/ют

сан

У. ииМ/ыпн —-

Рис.4. Каталитические харак-• теристики фосфродгагы Аа из яда зеленой жабы: а)~кинети-ка... гидролиза . яичного ФХ; <5.в,д)-рН~,; температурная-, ... субстратная' • , зависимости; , г)-гашетика- гидролиза яично-■ го ФХ в зависимости от ионов са2^: и :рн. средам 1 - рй?,0 ■л Са2+-20мМ». 2 - рН 0,0 ■'.; 2ЙЛ1,. -:з Г. рН 7,0 без Са?+, : 4 г р» б.О .бгз Са2*,

нов Caz+ не изменяло.скорости реакции, хотя фермент проявлял каталитическую активность и в отсутствии ионов Са"'+. (рис.4г). Каталитические константы ферментативной реакции, . определенные в обратных координатах Лайяуивера - Берка, составляли: Ки=2,77Ш и Утах=0>02мкМ/мин. .

Важной особенностью .'и. отличительным сеойстесм яда жаб является его выраженное кардиотррпное действие, обусловленное стероидными компонентам яда. В связи с этим было г.роаедено исследование кардиотропного действия различных концентраций суммы . б.уфадиенолйдов яда зеленой.жабы'(от 10~8 до 10~5 г/мл), которое проводили в серии экспериментов в сравнении с широкс ■используемым кардиотоническим препаратом К-строфантином-В е тестах in vitro на папиллярных мышцах ■ и полосках предсердш кошек. Было показано, что УВД при концентрации буфадиенолидо! 5- Ю-7 г/ил найлодалось увеличение амплитуды . изометрическое сокращрния ■ в •'1,7-2 раза, в то время как эта концентрация н* вызывала увеличения частоты сокращений. Введение буфадиенолк-дов яда и К-строфантина-р в терапевтических дозах вызывало • подобные эффекты положительного инотропного - и отрицательное хронстропного действия, однако сумма буфадиенолидов отличалас; меньшей токсичностью - и большей широтой • фармаколо'гическоп действия в сравнении с К-строфантином-в. . : Кардидтронное свойство буфадиенолидов яда жаб многими исс ледоаателями связывается с действием их на. Na+/K+-ÁTPa3y. : связи с этим было проведено исследование действия двух буфади енолидов яда зеленой жабы, гамабуфоталина и аренобуфагияа, н активность транспортных АТРаэ. Эксперименты показали, что исс дедуеше стероиды яда зеленой жабы даже. в высоких концентраци ях (2'1о~'1М). не влияли, на активность Са2*"- и Mg2i"-ATPaa, тогд

как добавление этих буфадиенолкдов (Ю-10 - 10_4М) вызывало существенное ннгибирование шкросомаяьной. NaVK4"- АТРагы из различных органов животных. .

.В настоящее время хорошо изучены механизмы большинства внутриклеточных процессов, однако условия реализации реакций Енутри ливой клетки не выяснены, в связи с этим ватсно изучение действия различных биологически активных веществ и на АЦ-сис-тему, участвующую в регуляции системных биохимических и физиологических процессов, в частности, сократимости сердечной мышцы. Одним из главных механизмов этой регуляции является фосфо-ршшрование субстратных белков клетки с ломовгьв рязличгных про-теинкинаэ, а фосфатная модификация белков в значительной степени определяет многообразие биохимических и физиологических ■ эффектов'циклических нуклеотидов.. ■'• . ■

В опытах- in vivo ' нами -проведено .. исследование действия цельного яда зеленой- яз5ы к двух его стероидных компонентов, гамабуфоталина и' аренобуфагина, на активность АЦ, ■ фермента, ■превращающего .неактивный 5'-AWP в активный* 3",5'-АМР (сАМР), а также на-активность с АКР-зависимой ПК. и ФДЭ-сАМР, . фермента, участвующего в'метаболизме''циклических нуклеотидов. ■■

LD50 цельного яда составил для крыс 50 мг/кг, оуфадиеноли-дов'15 мг/кг. В опытах .кспользоватась дозы, ■составляющие 1/10 LDso-

Как показали эксперименты,.введение подопытным животным цельного яда в до?е 400 мкг и 600 ыкг 'повьвшо- активность АД до. 190 и 227%, с АМР-зависимых ПК - до 139 и -ÍSQS, .соответственно относительно контроля'. Введение же.стероидньк компонентов . гамабуфстзлина и аренобуфагина,' в дезе 100 мкг сникало ангивность-ЙЦ-до 56,2 и'61,42,• сАМР-аависадшх'ПК*.- до 47,3 -и.

- М--.

53,31. Активность ЗДЭ три тех же,концентрациях яда составляла 80,? и 67,2%, гачабуфоталин иеренсбуфагин вдозе 250 мкг. повышали активность, фермента до 165 'ч 158%, соответственно, по

отнэдению к контролю.(рис.5).

АХ • 230 "7- •

200'

.150-

.100-

SÜ-

• i • •. 2 • з -.'.:.■ Рис.5." Действие цельного яда кабьгBufo viridis-(1) и двух его буфадиенолидов - гамабуфоталияз, (2) и зранабуфагта (3) на активность ферментов-АН систем а опытах in- .vivo.a-АЦ; -б -сАЫР-гавксгшая' ПК; в - <ЕДЭ

; . Таким сОраеом, волучешше^эультаты свидетельствуют, о. не-' соыненном влиянии, как дельного . яда зелёкЬй-жэбы, • ■так •«. его бут фадкенолидов -ка активность, ферментов АЦ^системы в опытах In vivo. Для более детального .исследования действия - яда и -2-х его' буфадиенрлвдов.- иа: ферменты АЦ-системы . были проведены серии 0ШТ03 1П Vitro.- .."'■■■'•

. Исследование действия жабьего 'яда и .двух, его - буфадиенонк-доз, гаи^уфогалнна арейоОуфагина, на активность. аденилатцкк-лазы проводили.по методу '.(Sutherland и Single, -1974). . 06 .активности 'фермента судили по 'количеству образовавшегося сАМР с помощью специальных наборов фирмы, AStersham '.(Англия). íbe операции. по определении содержания сАМР е ткани проводили н&.хо-

люде, обработку ткани к экстракцию сАМР осуществляли по методу (Tseng- et al,1372) с некоторыми модификациями. Определение содержания сАМР проводили методом изотопного разбавления по методу (Tovey et al, 1974).

Исследование in vitro цельного яда зеленой жабы на активность АЛ показало дозозввисимый характер его действия. Как видно {рис. ф с возрастанием дозы активность АД поЕьазагтся, достигая пятикратного увеличения при дозе яда 40 «кг. Дальнейшее увеличение дозы приводит к резкому паденив ферментативной, активности. Наблюдаемое падение'активности под действием цельного яда при высоких концентрациях может быть объяснено присутствием в яде ингибиторов этого фермента. Действительно, з случае добавления в инкубационную среду двух стероидных компонентов' яда, гамабуфоталина и арекобуфагина, в- .дозе б мкг про- :

-.'16- ■

являлся резкий ингибирущий эффект, достигавший-80 и. 75% соответственно "(рис.7). ...

Известно, что вещества, угнётащие На+/К+-АТРзэу, такие как сердечный гликозвд уайаин,. строфантин К, дигитоксигенин и многие другие.реализуют свое кардиотршное действие через увеличение внутриклеточной ганцентрации тонов Саг+: ингибирование Ма+/К+-дтРазы - —накопление Ма+ внутри клетки —»- стимуляция Ка+/Са+-обмена, работающего нз вход Са2+ в клетку — увеличение внутриклеточной концентрации Са2+. Возникает вопрос, каким образомизменяющиеся^концентрации ионоз Са2^ оказывают влияние -на активность аденилатциклазы.

В работе (Панченко М.'Я. и др., . 1981) было-показано, что одна и та же каталитическая субъединица-ДЦ может активироваться как гормонами и .другими БАВ, так и ионами Саг+. Авдонин П.В. и соавт.." (1978) показали, что повышение концентрации ионов -Са2*- до 10~5Ы приводит к резкому возрастанию, активности АЦ., однако при дальнейшем увеличении, концентрации Са2+ до 10"^/.наблюдалось сильное -ингибирование фермента. Следует подчеркнуть, что ингибирущее действие ионов ОЗ?2^ на активность АЦ. описано для мембранных препаратов фермента, выделенных из болылинстга.тканей (Регс1пз Л.Р.,1973). -Это. заключение весьма •ьаяско для создания представлений о функциональной взаимосвязи между- регуляторным влиянием Са2+ на сшггев и .' распад сАМР: в каждой метке (в т:ч. . миокарда), повышение концентрации/ ионов Са2+ должно приводить'сначала к активации,. а ватем (при больших концентрациях ионов Са2+). - к ккгибировашет синтеза сАМР. Таким образсж, при икгкбировании Ма+/К1"-АТРазы, приводящей к.' увеличению концентрации-конов Саг+ в клетке, возможна модуляция .активности адекилатциклавы.'

- 17 - .

Для комплексного изучения действия исследуемых веществ на АД-систему необходимо было выяснить вопрос.о взаимосвязи изменяющейся- активности АЦ с активностями других ферментов АЦ-сис-темы: с AMP* зависимых. ПК к ФДЗ сАМР.

Как известно, "з результате■активации АЦ происходит очень •эффективная, в 102-103 раз, амплификация внешнего .сигнала, т.е.. взаимодействие одной молекулы'БАБ с рецепторами приводит к синтезу нескольких тысяч молекул сАМР. Учитывая то, что изменения в активности АЦ-и, соответственно, .в содержании сЛМР влекут . за собой изменения многих внутриклеточных сAMP-зависимых' процессов, было' целесообразно.исследование'зависимости активности сАМР-аависимсй ПК при действии тех же. концентраций, яда й его стероидных компонентов.

"• Метод определения, активности сАМР-зависимых ПК основан на' включении радиоактивного фосфора ГЭ2Р]-АТР в гистся Hi в ходе реакции. Активность сАМР- зависимых ПК выражали а количестве-пикомолей фосфата АТР, перенесенных на гистон Нч за 1 минуту под действием 1 мг' белка: ткани. ...'•'"

.Проведенные.эксперименты' показали,. что изменения активности сAMP-зависимой Щ полностью коррелируют с изменениями активности АЦ, т.е. дозы яда от 7,5 до. 40 мкг стимулируют активность фермента, а начиная с дозы 45 мкг ' наблюдается'. 6QZ ипги-бирование (рис.8-2). Еуфадиенолиды гамабуфоталин и аренобуфа-гик. в дозе 5 мкг подавляли активность с AMP-зависимых1 ПК на 72 и 59Х соответственно (рис.7).

. Из литературных . источников . известно, ' что ингибиторы На+/К+-АТРазы - сердечные гликозидн (уабаин и'др.)-лучше, всего связываются с фосфорилированной формой NaVK^-ATPaabi (Dupont Y., : Î982); Анализируя полученные • нами результаты, можно.пред-

. Рис.8. Зависимость активности ферментов АЦ-системы от кон центраций яда зеленой жабы Bufo viridis (1.- АЦ, 2.- сАМР-эа висиыая ПК; 3.- ФДЭ)". ' . .

га • - • ' .

положить, что стимуляция АЦ и увеличение активности сАКР-зави симой ПК увеличивают • число/ ' фосфорилирсшанных •; молеку На^/К^АТРазыи в связи с Этим происходит более быстрое свяеы вание; АТРазы буфадиенолидаыи яда, . что и' приводит .к' резком ее ингибированмо. . . -

С другой.стороны, можно было бы предположить, что измене . кие концентрации сАМР и .возможное в связи с этим изменение ак тивности сАМР- зависимых .ПК.. может быть- результатом моду ля ци • активности фосфодизстеразы сАМР различными концентрациями яда Однако изучение действия исследуемых веществ на активность ФД показало, что хотя существует .тенденций к снижении ее актив ности Ha 32,5% при увеличении дозы яда до 40 мкг, дальнейше увеличение дозы повышает активность фермента 'до бааальног уровюг.. (рис.0-3). Гамабуфоталин и аренобуфагин также в дозе

мкг незначительно повышали"активность ФДЭ на 8,7 и 11,5% соответственно (рис.7), т.е. ФДЭ сАМР практически не Елняет на изменения концентрации сАМР в исследуемом диапазоне концентраций яда и, возможно, буфадиенолиды оказывают непосредственное действие на АЦ-комплекс.

Гипотетическая схема механизма дейстккя еабьего яда.

-- действие стимулирующих АД доз яда зеленой жабы

---------- _ действие ингибирующих АЦ доз яда зеленой кабы

и еТо буфадиенолидов -На основании анализа полученных результатов по действ:» яда зеленой хабы и его буфадиеяолидных компонентов на a".T!iD-ностй ферментов АЦ-системы и транспортных ATF'äo можно предположить следующую гипотетическую последовательность событии г клетке, при действии яда среднеазиатской зеленой жабы В.viridis:' шгибкрование.буйздиешшкаш-яда Ка+/К+-АТРа?.ы павы-

- 20 - ■

венке концентрации ионов Са2+ -*- стимуляция активности. АЦ ■ га счет повышающихся •. (стимулируюалх) концентраций ионов Са2+ ->-. повышение активности с AMP-зависимых . ЦК -»- ¿[«сформирование . Ма+/К+-АГРазы более быстрое связывание буфадиенолвдов яда с фосфорйлнрованкой фермой Ка+/К+-АТРазы резкое ингибирование Кг+/К+-АГРазы быстрое повышение концентрации ионов ингибирование АД более высокими (кнактивирующими) концентрациями ионов Са2+ индукция Саг+-аависюшх процессов в клетке.

Предполагаемый механизм действия яда зеленой жабы Bufo viridis на!клетку представлен на прилагаемой выше схеме.

ИВОДЫ

-.. 1, Впервые из яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis с помощью аффинной хроматографии.на синтезированная нами биоспецифическом сорбенте Alf i-фДС гЕыделена фосфолипаза А в индивидуальном виде. Установлено, . что■ выделенная фосфолипаза является'фосЛэлипагой Аг- Изучены ее. каталитические' свойства (субстратная-, pH-, температурная-, Саг+~ зависимости,.определена константа Мнхаэлкса Км=2 ,?7мЫ). ""..'•

Й. Показано ингибирующее действие яда веленой жабы и. его 2-х буфзднекапидов на Ка*/К+-АТРзэу, приводящее к. изменению конного баланса клетки, повышению/концентрации'ионов Саг+, • которые, могут модулировать активность АЦ. . ' . '-'-■'' 3. Изучено действие яда зеленой жабы В.'viridis и его 2-х. стероидных компояентоз на ферменты АД-'системы в опытах in vivo и in v.itro. Установдёно дозозависимое участие ферментов АЦ-системн (АЦ и CAMP-зависимых ПК) в клеточных процессах под действием яда .-зеленой жабы Б. viridis. Показано, что низкие дозы яда' (in. vitro - да' 40мкг). стимулируют активность АЦ и оДМР-вависиязК - ПК, . более высокие (от 45- мкг и выдаО - ингиби-

рувт. Показана корреляция действия яда и 2-х его буфадиёноли-дов на активность ферментов АЦ и .сAMP-зависимые ПК в опытах in vivo и in vitro. - -

4. Установлено, что два буфадиенолида яда зеленой жабы, гамабуфоталин и аренобуфагин, являются ингибиторами АЦ в дозе 5 мкг в опытах In vitro. Предполагается, что их действие на АЦ-комплекс происходит не через адренореактизные структуры, а опосредовано ионами Caz+.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1Лашмухамедов М.С., Закирова О. К..Мирзаахмедов Ш.Я., Са-лихов Ш.И., ЯкубОЕ И.Т.', Рахимов М.М. Выделение фосфолипазы Аз иа яда зеленой жабы Bufo. viridis. //Химия природных соединений, 1994. N1. С. 105-109 .

2.Татмухамедов М.С., Мирзаахмедов Ш.Я., Закирова 0.К:,Са-лихов.Ш.й. „ Камаев Ф.Г., Ибрагимов Б.Т., Умарходжаев А.С, Аренобуфагин и гамабуфоталин из яда среднеазиатской жабы Bufo viridis.'//Химия природньк. соединений, 1994. N1. с.140-141..

• 3. Tashmukhamedov- М.S., .Salikhov SH. I., Zakirova O.K. Action of central asian toad toxic components on the activity' of adenilatcyclase of the fat liver.// 2-nd IUBMB conference, . . "Biochemistry of Cell" Membranes" _ Italy,Bari-,1993 ; .September' 29- octbber 3. p. 103.'

4.Закирова O.K., Ташмухамедов М.С., Мирзаахмедов Ш.Я. ,Сали~ хов Ш.И.- Бисспецифическая хроматография фосфолипазы Ло иа яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis. . // tea. докладов. конференции "Проблемы биохимии",Душанбе, с.88

. б.Бёкмухамедова Бердиев Б.К., Таимухамедов М.С.,• Саг

лихов Ш.И., Мирзаахмедов Ш.Я., Закирова O.K. Влияние токсинов' из яда среднеазиатской: жабЫ - на конгранспортирущие системы.

//I I-Конференция биохимиков Узбекистана 22-24 ноября 1993. с.21

о.Гашмухамедов М.С., Закирова O.K., Мирзаахмедов.Ш.Я. Действие цельного яда Bufo viridis и его компонентов на активность цАК® зависимой протеинкиназы печени крыс //II-Конференция биохимиков Узбекистана 22-24 ноября 1993. с.76

7.Тзшмухамедов М.С: Закирова O.K. Уыарходжаеа A.C. Барсе-гян Г.Действие кизкомолекулярных компонентов ядов песчаной.эфы Е. carinatus и зеленой жабы Bufo viridis на поведенческую активность подопытных животных. // V Конференция биохимиков республик Средней Азии и. Казахстана Ташкент, ноябрь 1991г. с.100.

8.Ташмухамедов М.С. Закирова.O.K. Умарходжаев A.C. Салихов ИЛ Влияние.яда зеленой жабы Bufo viridis и. его токсических компонентов на активность аденилатциклазы печени крысы.// V Конференция биохимиков республик Средней Азии и Казахстана Тадкент,12-15 ноября' 1991г. с. 102

9.Ташмухамедов М.С. Закирова O.K. .Мирзаахмедов Ш.Я. Туля-ганов Р. Салихов Ш.И. Влияние некоторых ядов животных на первичный иммунный ответ-мышей //Узбекский биологический журнал, 1695, N1; сЛО*' ■•■•'•

10.Таамухамедов М.С. Закирова O.K. Салихов Ш.И. Действие яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis и его токсических компонентов на. активность аденилатциклазы печени крысы. // ДАН РУз, N10, 19S4 г.. С. 42

11.Таамухамедов М.С.• Мирзаахмедов Ш.Я. Закирова O.K. Салихов Ш.И.- Изучение цитотоксической активности некоторых ядов киеотных по отношению клеток•асцитной карциномы Зрлиха. //Тез. докладов конференции "Проблемы био химии",Душанбе, с.87

12.Ташухаыедов М.С. Закирова O.K. Мирзаахмедов р Ш.Я.-

Оиенский В. Вердиев Б.К Бекмухаметсва 3.У.. Действие токсичес-s

ких компонентов яда среднеазиатской зеленой жабы Buf'o viridis - буфадиенолидов гамабуфоталинз и аренобуфагина на транспортные ЛТРазы. //Тезисы научной конференции "Структура и функции биологических мембран" (23-24 марта 1995 г., Ташкент) с.103 ЯШНЛ EAtyi BUFO VIRIDIS ЗА)$АРИНИНГ ВШЛОГКК ®А0Л KDM10-НЕНТЛАРННКНГ ТАЪСКР {ЖХАНКЗШ1Н ТАЩО[ Ю1ЛИШ.

Зокирова O.K.

Äff i - ФДС биоспецифик сорбенти синтез к^ыиниб, аффин хро-матографияси методи асосида яшил бата Bufo viridis за^ридан фосфолипзза А биринчи бор гсмоген з\слда ажратиб слинди. Унинг багги каталитик хусусиятлари урганилиб, Михаэлис константаси на узига хослиги (фосфолипаза Аг) ани^ланди.

Заз^лрнинг икки токсик компонента Оулмиш гамабуфоталин ва аренобуфагин ажратиб олиниб. уларнинг транспорт АТРазадарга (0а""г-.мб2+-,Ыа+/к+-) таъсири урганилди. Tojcckk буфадиенолид-лар Ca~+-,Mg2"l"-ATPa33 ферментлари фаоллигига таъсир к^шмаган холда, Na+/K+-ATPa3a ферменти фаоллиги анчагина камайтириши курсатилди.

Яшил 6a"£t захарини я>ушт холда, хамда унинг токсик буфади-енслидларини хуиайранинг мухим сигнал системаси булмит - аде-нилатциклаза системаси ферментлари АЦ, сАМР-6орлик> ПК, С>ДЭ га таъсири in vivo ва in vitro такрибаларида биринчи бор урганилди. In vivo такрибаларида зщарнпиг 1/10 LDso мю$дори АЛ ва сАМР-борлик ПК ферментларининг фаоллигкни кучли даражада оик-риши, буфадиеналидлар эса кескин камайтириши ани^а.нди. In vitro тажрибаларида аах^арнинг АЦ - системаси ферментларига таъсири унинг мш^цорига (дозасига) борлигаиги курсатилди.

Олинган натижалар асосида яшил баю. Bufo viridis аа^ари-нинг таъсир килиш механизм« гипотетик схемчси тавсия г^илинди.

• - 24 -

THE STUDÏ OF ACTION fciECHAHISM OF EIGLOSICA11Y ACTIVE COii-POSiEHTS FBOSâ EUFU VIRIDIS SREEH TOAD'S VEHOH.

Zskirova O.K.

For the first time with help of affme chromatography method on synthesized by as biospecific sorbent Aff i-FDS from venom of Eufo viridis greeq toad the phospholipase A has been obtained,! its specificity as phospholipase Ao was determined, some catalytic properties were studied, Michaelis's constant was determined.

Two toxic components of steroid-derived venom - gamabufo-taline and arenobufagine have been obtained. Their action on transport-ATPase' (Ca2"1-, Mgz+-, Na+/K+-) was investigated. It was established that toxic bufadienoli,ds don't influence on Ca2+~, Mg2+- ATPase activities while they considerably reduced activity of other important transport' enzyme - Na+/K+-ATPase.

For the first time the action of pure undiluted venom of green toad with two toxic bufadienolids upon enzymes of adenylate-cyclase system. In "in vivo" and "in vitro" experiments their effect upon the following enzymes has been studied: adenylate-cyclase, cAMP-dcpendent proteinkinase and phosphodiesterase. It was established that "in vivo" experiments with pure venom LPso doses taken in ratio 1/10 considerably increase the activity of adenylate-cyclase and cAMP-dependent protein-kinase, whereas bufadienolids sharply reduced their activités. In series of "in vitro" experiments the dose-dependent action of pure venom of Central Asia's green toad has been shown. On the basis of results of present work the hypotetic scheme of Central Asia's Bufo viridis green toad venom action mechanism has been suggested.