Структура и функция биологически активных низкомолекулярных компонентов яда Bufo viridis тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ррр «рСдАКАДЕМИКА САДЫКОВА А.С.

1 Я 1пп- На правах рукописи

1 УДК 547.993.3

МИРЗААХМЕДОВ ШАРАФИТДИН ЯШИНОВИЧ

СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЯДА ВиГО УПЦОВ.

02.00.10 - бйоорганичесхая химия, хяюм природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации'на соискание ученой степени кандидата химических наук

ТАШКЕНТ-1995

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академика Садыкова A.C. АН РУ, в лаборатории химии белков и пептидов.

Научные донмюдтеж: доктор биологических наук, профессор Ш.Й. Свлш» кандидат химических наук, . старший научный сотрудник v " • • ■ М.С, Ташмухямедов

Официальные ошювеоты: доктор химических наук,

профессор A.A. Садиков кандидат химических наук, старший научный сотрудник М.Н. Сулпшходжяев

Ведущая организация: Ташкентский Государственный

Университет

Зашита диссертации состоится "¿Ы" ьм-О-^Р 1995 года в ; часов на заседании специализированного Совета

Д 015.21.21 при Институте биоорганической химии имени академика А.С.Садыкова АН РУ по адресу: 700143, Ташкент, проспект Х.Абдуплаева, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии АН РУ.

Автореферат разосланА" . ¿ajXiQ J995r.

Ученый секретарь

специализированного Совета „ • '

"f

доктор химических наук _ Н.И.Бярам

- з -

Актуальность проблемы. Среди огромного числа биологически активных веществ природного происхождения одно ив центральных мест занимает компоненты животных ядов - уникальные по своей химической природе и физиологическому действии. Характерной особенностью их являются высокая биологическая активность, выражающаяся в быстром, сильном и разностороннем действии на организм.

К числу животных ядов относится и секрет паротид (надлопаточных желез) жаб, называемый жабьим ядом. Жабий яд уже давно считается важным медицинским средством, обладающим высокой биологической активностью и широким диапазоном фармоколог ическо-го действия. Он обладает кардиотропными, антибиотическими, нейротропными активностями, а также противоопухолевыми, радиозащитными, иммуномоделируюшими и многими другими свойствами.

Успехи в экспериментальном изучении жабьего яда и клинические наблюдения.послужили основанием тому, что в ряде стран (Япония, Индия и др.) были разработаны и с успехом применяются в медицинской практике лекарственные препараты на основе яда. Несмотря на это индувидуальные компоненты яда жаб мало изучены. В связи с этим выделение, установление химической структуры основных компонентов жабьего яда, изучение физико-химических свойств и биологической активности их молекул являются весьма актуальными и позволят найти новые высокоактивные и специфические препараты для медицины.

Цель работы. Настоящая работа является частью комплексных исследований, проводимых в Институте биоорганической химии им. акад. Садыкова A.C. АН РУ по изучению структуры и функции токсических компонентов ядов животных Средней Азии и посвящвив выделению, установлению структуры и изучению биологической ак-

тивности основных токсических компонентов яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis Laur.

Задачами исследования были:

1. выделение основных' токсических компонентов яда Bufo viridis в индувидуалйном состоянии;

2. установление их химической и кокформационной структуры;

3. 'изучение противоопухолевой активности выделенных соединений в модельных опытах на культуре раковых -клеток в системе in vitro и на животных-опухоленосителях в системе in vivo;

4. исследование кардиотропной активности выделенных соединений в системе in vitro;

5. проведение фармако-токсикологических исследований суммы буфадиенолидов яда с целью создания лекарственной формы.

■ Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных исследований из яда зеленой жабы Bufo viridis впервые выделены б индувидуальных стероидных соединений буфа-диенолидной природы: Для двух из них, аренобуфагина и гамабу-фоталина, установлена химическая й конформационная структуры. Разработана методика получения суммы буфадиенолидов, условно названной "Бакагин", состоящей преимущественно из аренобуфагина и гамабуфотаяина. Впервые показана выраженная противоопухолевая активность гамабуфоталина и аренобуфагина, а также препарата "Бакагин" в системах in vitro и in vivo. Проведены фар-макологйчеакие исследования по инотропному действию "Бакапша" в сравнении с известным и широко применяемым кардиогошгческим препаратом К-строфантином-в в тестах in vitro. Показано, что "Бакагин" выгодно отличается от К-строфантина-р меньшей токсичностью и большей широтой фармакологического действия и поэтому представляет большой интерес для практической кардиологии.

Апробация работы и публикации. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на 1-й конференции биохимиков Таджикистана (Душанбе, 1993 г.), на 2-м симпозиуме по биохимии клеточных мембран (Бари, Италия, 1993 г.), на 2-й конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1993 г.), на научной Конференции "Структура и функции биологических мембран", (Ташкент, 1995 г), 1-м международном симпозиуме по химии природных соединений, (Ташкент, 1994 г). По материалам диссертации опубликовано 8 работ в научных журналах и сборниках.

Структура и объем работы: Работа наложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 11 рисунков. Диссертация состоит из трех глав и выводов. Список используемой литературы содержит 176 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Выделение гаыабуфоталина и арекобуфагкна, яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis.

Цельный яд зеленой жабы Bufo viridis получали из среднеазиатского зонального комбината. Свежеполученный цельный яд представляет собой вязкую жидкость белого цвета, при высыхании он приобретает вид стекловидной массы бледно-желтого цвета. В воде плохо растворяется, но хорошо растворяется в 20-30% растворах этилового спирта. Учитывая плохую растворимость цельного яда в водных растворах солей, препарат яда экстрагировали 0,05 М NH4HCQ3 буфером, содержащим 102! этиловый спирт. Экстракт освобождали от нерастворимых компонентов центрифугированием и .яиофильно высушивали. Сухой яд хранился до использования прй >4°С в течение нескольких месяцев без потери активности.

Токсичность цельного яда и полученных фракций определяли на тараканах Peroplnnet/i americana массой около 000 мг И на

белых беспородных мьшшх. Внутрибрюшенное введение яда в доае 100 мкг вызывало устойчивый паралич у 100Х особей. Юбо, определенная на белых беспородных мышах, составляла 10 мг/кг.

Учитывая особенности химического состава жабьего яда (относительно высокЬе содержание сильногидрофобных соединений -буфадиенолидов и стеринов), первичное фракционирование проводили 'методом гель-проникающей хроматографией на сефадексе Ш-го, используя в качестве элвента 0,05 М КН4НСО3 рН 8,2, содержащий 60Х этанола (Рис.1), в результате чего было получено 6 фракций. Фракция 1 содержала в себе в основном белковые компоненты, из которой нами ранее выделена новая фосфолипааа Аг-Согласно результатам тестирования, только фракция 6 содержала в себе практически всю паралитическую активность яда. .

Объем (мл)

Рис.1. Гель - хроматография цельного яда зеленой жабы В. viridis на колонке (2,6x100см) с сефадексом LH-20 в 0,05 М NH4HCO3 буфере содержащий 60Z этанола, pH 8,2. Скорость элюции 45 мл/час. . '

Обращает внимание- тот факт, что содержание токсической фракции, хотя имеет наибольшее поглощение при 280 нм, составляет всего 1-2% от массы нанесенного в колонку материала. По

всей видимости, эта фракция обогащена ароматическими соединениями или содержит в своем составе хромофорную группу, которая сильно поглощает в этой области спектра. Это хорошо согласуется с литературными данными о том, что основные токсические Компоненты ядов жаб являются производными индола (буфотенин, серотонин, триптамин и др.), а также буфадиенолидами.

Следующий этап разделения проводили на гидрофобном носителе полихром П-1. Элюцию проводили сначала деионизированной водой, затем ступенчатым градиентом концентрации этанола (рис.2). В результате были подучены 4. фракции. По данным тестирования, паралитической активностью обладала фракция 2, которая элюировалась Ю£-ным раствором этилового спирта.

гОЙ ■В4

100 1ÍO 200

Объем (мя) . .. •

Рис.2. Гидрофобная хроматография 6 фракции на колонке (1x10см) о полихромом П-1 в ступенчатом градиенте концентрация-этанола (10-60Х). Скорость злюции 10 мд/час. v! :: >í

Эфу фракцию пйсле лиофильного высушивания раотворяли в растворе ЮХ-ного этилового спирта и далее разделяли- методом обращеннофазовой хроматографии на высокоаффективном жидкостном хроматографе на колонке ОоЬайесу! 31-100 о градиентом концеят-

рации ацетонитрила (рис.3). По данным тестирования, фракции 2 и 3 обладали токсичностью. Рехроматография полученных фракций в более пологом градиенте концентрации ацетонитрила давала один симметричный пик, что указывает на высокую степень чистоты выделенных соединений.

Время (мин)

Рис.3. Обращеннофазовая' высокоэффективная хроматография фракции N 2 на-колонке (4,6мм х 25см) 0сЬас1есу1 31-100 в градиенте концентрации ацетонитрила. Скорость элюции 1 мл/мин.

Оба токсические соединения, а также вещества, содержащиеся в остальных 4 фракциях, давали положительную цветную реакцию с реактивом Лавдей, что характерно для буфадиенолидов, и также дают максимум поглощения при 300 нм в УФ области спектра, что еще раэ подтверждает принадлежность выделенных в индувидуаль-ном виде соединений к классу буфадиенолидов (Рис.4). Кумзлино-вое кольцо каждого соединения характеризовалось интенсивной полосой поглощения в ИК - области'спектра (Рис,5) при 1680 см"1 (С-0 группа) и двумя полосами при 1620 и 1538 см"1 (сопряженные С-С связи).

с=а

шдаазэмаазгзаашгиг»}

аш-гаи 1е» 1й2&-152й

«¿¿та®, а**

Рис.'4. УФ-спектр характерное для выделенных буфадиенолидов.

Рис.В. ИК-спектр для выде леншх буфадиенолидов.

Таким образом, нами выделены в чистом виде два токсических буфадиенолида, условно названные ИТ-1 и ИТ-2, и 4 соединения буфадиенолидной природы. Выход токсцчесюк компонентов составлял 0,1% и 0,2%, соответственно, от исходной сухой массы цельного яда. Сумма токсических компонентов составляет 80% от хаосы нанесенного в колонку материала.

Введение ИТ-1 в дозе 5 мкг на особь таракана давало устойчивый паралич в течение 5-10' минут и сохранялся в течение 5 ? час. Введение ИТ-2 в эквивалентной дозе вызывало паралич с последующим наступлением смерти (через 2-3 минуты) .

Установления структуры и кои$ормационкчй анализ буйадиенаяилов НТ-1 и ИТ-2.

Для установления химической структуры выделенных соединений применяли такие методы, как ПМР, масс-спектрометрия, а также метод рентгенсютруктурного аналиаа.

Результаты ПМР-спектроскопии показали (рис.6),' что характерными чертами ПМР спектра ИТ-2 (200 МГц, СОзОО) являются наличие еинглетпк двух мегилышх групп (0,93 мд и 1,21 ид),

сложного многопротонного сигнала в области "метиленового возвышения" (1,0-2,2 ид) и трех однопротонных сигналов в области слабого поля при 6,31 мд (J-10,0 Гц), 7,63 мд (J-2,5 Гц) и при 7,92 мд (J-10,0 и 2,5 ГЦ). Параметры спектра позволяй предположить наличие tf молекуле ИТ-2 стероидного скелета с ангуляр-ными метильными группами при Cíe и Cía. а также кумалинового кольца. Из сравнения со спектрами других соединений можно сделать заключение о принадлежности ИТ-2 к буфадиенолидам.

Из масс-спектра высокого разрешения соединения ИТ-2 определен состав молекулярного иона 41б+.

. Окончательное расположение функциональных групп и пространственное строение молекулы ИТ-2 следует из данных рентге-ноотруктурного анализа. • ..

Результаты рентгеноструктурного анализа строения молекулы ИТ-2 показали, что циклы А,В и С имеют конформацию бС9, 1С4 и еС12 - кресел соответственно. Сочленение циклов А/В-, С/Б-цис и В/С-транс характерно для скелета буфадиенолидов, В цикле В

молекулы гидрокеил 0(3)-Н занимает аксиальную поаицию, а в цикле С группы 0(11)-Н, 0(14)-Н расположены в экваториальном положении. Анализ Кэмбриджского Банка Структурных Данных пока-аал, что в нем имеется вещество с таким строением - аренобуфа-гин, выделенный из китайской жабы Ch'an Su, в виде диацетилп-роизводного. Структура аренобуфагина была установлена после гидролиза ацетильных групп диацетиларенобуфагина. В индувиду-альном виде аренобуфагин впервые был выделен из яда южноамериканской жабы Bufo arenarum, и поэтому этот буфадиенолид был назван аренобуфагином. Кристаллографические параметры выделенного нами ИТ-2 отличаются от таковых аренобуфагина, что указывает на наличие полиморфизма у этого стероида (кристаллы аренобуфагина получены из растворов в 1:1 смеси метанола с этила-цетатом, а монокристаллы ИТ-2 мы вырастили из растворов этилового спирта). Для облегчения дальнейшего обсуждения модификацию аренобуфагина, включенного в Банк, мы назвали полиморфом А, а нами расшифрованную кристаллическую разновидность - полиморфом В.

В полиморфе А пятичленный цикл D имеет конформацию, промежуточную между конформациями Е14-концерта и 13Т14-полукресла. В полиморфе В этот цикл приобретает конформацию искаженного полукресла 14Т15 (рис.7). В двух кристаллических модификациях аренобуфагина наблюдается существенное различив и по расположению б-лактонного цикла относительно стероидного остова ыоле-(сулы. Расчеты показали, что для свободного вращения лактониого цикла вокруг ординарной связи С(17)-С(20) молекула должна преодолеть достаточно высокий энергетический барьер. Тем на колее, ориентация этого цикла в днух полимерфах отличается на •ч170° (торсионный угол 0(13)С(1?)0(й0) С(<;1) составляет -69,1°

и 81,0° в полиморфах А и В соответственно) и в полиморфе В становится аналогичным ориентации цикла в буфалине и его предшественниках. :

Рис.7. Конформация молекулы аренобуфагина (полиморф В).

• Длина связи и валентные углы в молекуле имеют обычные для таких соединении значения и практически не отличаются от их значений, наблюдаемых в полиморфе А.

Таким образом, из яда среднеазиатский -еленой жабы Bufo viridis нами выделен аренобуфагин, отличающийся не только кристаллическим строением, но и молекулярной структурой. Следует отметить, что эта небольшая разница в строении молекул проявляется под воздействием кристаллических полей полиморфов на конформацию молекул. В отличие от известного полиморфа А, в котором межмолекулярные Н-связи объединяют молекулы в трехмерный каркасi кристаллическая структура нового полиморфа В характеризуется наличием одномерного Н-ассоциата из молекул аренобуфагина.

ПМР-спектр ИТ-1, также как и ИТ-2, содержит сигналы характерные для буфадиенолицов с небольшими вариациями их параметров (Рис.8). Наиболее яаметно отсутствие четкого дублет-? при

Эти данные, масса и состав молекулярного нона 402+ позволяют предположить отсутствие кето- группы при С12 в молекуле ИТ-1: Окончательное строение ИТ-1 также определено методом рентгеноструктурного анализа.

Из растворов ИТ-1 в этиловом спирте вырастили монокристаллы двух видов, которые относятся к одной и той же пространственной группе P2i2i2i. Игольчатые кристаллы имели следующие кристаллографические данные: а=7,892(1); в=14,753(1) >. с-17,883(2) A; V=2076,9(1,4)A3 Z=4, Dx=l,23 г/см3, в ТО врем? как для кристаллов ромбического габитуса таковыми являлись

О вп

а-10,166(3); в=13,360(5); с»17,523(18)А; V»2390(2)AJ. AHantfEf Кембриджского банка структурных данных свидетельствовал, что 9 нем имеется вещество идентичное параметрам игольчатых кристал--лов и представляет собой известный гамабуфоталин (Рио.9). На основании этого остается предположить, что ромбически© крио--таллы являются сольватом гамабуфоталина с этанолом (наиболее

Рис.9. Конформация молекулы гамабуфоталина.

вероятный состав 1:1 при плотности Dx=l,19 г/см3), так как явление включения (образование соединений с молекулами растворителей) очень характерно для стероидов и довольно часто встречается.

Гамайуфоталин-был выделен впервые Котаке с сотр. из кожи японской кабы Bufo vulgaris formosus и позже - из препарата Ch'anSu. . Это соединение из яда зеленой жабы Bufo viridis нами выделено впервые'.

Исследования показали, что гамайуфоталин и аренобуфагин сострадают СОХ сукмц буфадиенолидной фракции яда В. .viridis. В оставшиеся 20% входят еще 4 индувйдуальных буфадиенолидов (рис.3). Ранее японскими авторами К. Шимада и др. были выделены из яда зеленой жабы Bufo viridis Laur еще такие буфадиено-лиды, как маринобуфагин - С24Н32О5; геллебригенин - С24Н32О6; телоцинобуфагин - С24Н34О5; и буфоталинин - Сг4НзоОб- Вероятно, эти же соединения присутствуют в цельном яде Bufo viridis и соотЕетсвуют неидентифицырованным 4 - буфадиенолидам полученным, нами после высокоэффективной хроматографии (рио.З. пики 1,4,5,6). Для фармагаэ-токсикологических исследований и препа-

ративной наработки, нами разработан стандартизированный препарат, названными "Бакагин" в котором содержатся ИТ-1, ИТ-2 и 4 неидентифицырованные вещества, т.е. фракция соответствующая пикам 1,4,5,6 (рис.3).

Биологические аффекта гамабуфоталина. аранобуфагина ; н препарата "Бакагин".

Изучение цитотоксической активности цельного яда В.viridis, гамабуфоталина и аренобуфагина в системе In vitro.

Для изучения цитотоксической активности цельного яда и выделенных индувидуальных компонентов использовали следующие клеточные штаммы: асцитной карциномы Эрлиха, выделенной из мышей на 6-ё день после инокуляции опухоли; перевиваемые юхеточ-ные -штаммы эритробластов человека К-562 и лимфобластов человека Molt-4, для выращивания которых использовали питательную среду RPMI-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, глутамина к антибиотиков.

Цитотоксическое действие веществ на клетки определяли по ингибированию включения в ДНК С3Н]-тимидина и [эН1-уридина в РНК в случае асцитной карциномы Эрлиха, по ингибированию включения в ДНК [3Н]-тимидина и С3Н1-смеси аминокислот в белки в случае клеток К-562 и по подсчету количества мертвых клеток в случае Molt-4 после окрашивания 0,5% трипановым синим.

Исследуемые токсические вещества испытывали в широком диапазоне концентраций: от 100 мкг/мл до 0,001 мкг/мл среды.

Результаты проведенных исследований по определению до8аза-висимых цитотоксических эффектов цельного яда и буфадиенолидов представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, СЕ50 цельного яда составляет 50 мкг'мл по отношению к клеткам асцитной карциномы Эрлиха, в то

время как для клеток К-562 и Molt-4 такой эффект проявлялся в

Таблица 1.

Цитотоксическая активность яда Bufo viridis и его токсических компонентов на моделях опухолевых клеток.

НАЗВАНИЕ ДОЗЫ ВЕЩЕСТВ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ 50Z (СЕ50) ГИБЕЛЬ КЛЕТОК (мкг/мл), определенные по:

ВЕЩЕСТВ Асцит. карц.Эрлиха К-562 Molt-4

включению С НЗ-тими -дина включению С НЗ-ури дина включению С НЗ-ти-мидина включению С3НЗ-смеси аминокислот подсчету количеств мертвых клеток

Цельный яд 50 50 100 100 100

Гамабуфоталин • 10 10 10 0,1 10

Аренобуфагин 0,1 0.1 0,1 0,01 ОД

дозе 100 мкг/мл. Индувидуальные буфадиенолидные компоненты яда - гамайуфоталкн и аренобуфагин в концентрациях 10 и 0,1 мкг/ил, соответственно, вызывали гибель 50% клеток.

Сопоставление полученных данных при изучении цитотоксичес-кого аффекта на 3-х видах клеток повреждающее действие цельного яда и его компонентов по разным показателям хорошо коррелировало. . Во всех изученных опухолевых клетках повреждающее действие аренобуфагина выгодно отличается от гамабуфоталина (на два порядка больше). Наиболее выраженная цитотоксическая активность аренобуфагина, по всей видимости, объясняется наличием карбонильной.группы в 12-подожении, поскольку молекула аренобуфагина по своей химической структуре отличается от га-цабуфоталина отсутствием лишь этой группы, причем, как это видно из таблицы 1, аренобуфагин, обладая значительным ннгиби-рующиы действием на синтез ДНК, в то же время в очень низких

концентрациях (ниже. 0,01 мкг/мл) ингибирует синтез белков, что позволяет предположить образование комплекса с белками рибосом или полисом по карбонильной группой в положении 12.

Таким образом, нам удалось показать, что выделенные из яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis индивидуальные компоненты гамабуфоталин и аренобуфагин обладают выраженным цито-токсическим эффектом по отношению к опухолевым клеткам асцит-ной карциномы Эрлиха, эритробластоза человека К-562 и лимфоб-ластоза человека MoIt-4.

Определение противоопухолевой активности "Ваиагнн" в системе in vivo.

Известно, что хотя в литературе имеются убедительные экспериментальные данные, показывающие о выраженную противоопухолевую активность цельного яда жаб, однако отсутствуют работы по определению противоопухолевой активности буфадиенолидов, являющихся основными токсическими компонентами яда.

В связи с этим мы правели исследования по определению противоопухолевой активности непосредственно на животных - опухо-леносителях фракции суммы буфадиенолидов, названной нами "Ба-кагин".

Противоопухолевую активность препарата "Бакагин" определяли на белых беспородных мышах Balb весом 20 гр. Мышам была перевита опухоль "Акатон" (рак тонкой кишки) в количестве 0,1-0,2 мл в правое нижнее бедро. Препарат "Бакагин" вводился через 48 ч. после перевивки ежедневно в течение 11 дней. Забой животных производился через 1 месяц после перевивки, и забиралась опухоль, взвешивалась и производились замеры. Параллельно забирались внутренние органы - печень, почки, надпочечники, cp.wwa и TWMVi г.-пп морфологически исследояяпиЛ. Р качестве

контроля взята опухоль мышей, где вместо препарата был введен фиараствор, содержащий 10% этиловый спирт, а также мыши, которые подвергались лечению известным противоопухолевым препаратом сарколизин. Результаты опыта представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Результаты изучения противоопухолевой активности Бакагина.

Препараты доза преп. мг/мышь Средн. вес опухоли г кратное введ.раз Достовер. стат.обр. торможение, %

Бакагин 0,2 • 0,3 11 Р<0,005 93,4

Сарколизин 0,0i5 3,6 11 Р< 0,398 22,75

Контроль 4,85 11 - -

Как видно из таблицы, препарат "Бакагин" при 11-кратном введении в дозе 0,2 мг/мышь дает 93,4% торможения роста опухоли по отношению к контролю. При атом средний вес опухоли составляет 0,3 г., в то время как в контроле - 4,85 г. Известный противоопухолевый препарат сарколизин в эффективной лечебной дозе 0,015 мг/мышь (Ларионов Л.Ф.,1962) в этих же условиях дает всего 22,75% торможения, и средний вес опухоли при этом составляет 3,6 г.

Таким образом, из приведенных экспериментов в системе 1п v<tro и in vivo можно заключить, что выделенные соединения обладают выраженным противоопухолевым эффектом, активность кото-Гчх превосходит известный противоопухолевый препарат сарколи-В1Ш.

Изучение кардиотрогшых свойств Бакагина.

Учитывая, что для буфадивнолидов харастерно кардиотоничес-шо действие, иы совместно с сотрудником отдела фармакологии и токсикологии Института химии растительные веществ АН РУэ (Куш-

багетовой З.А.), провели фармакологические исследования карди-отропного действия различных концентраций суммы буфадиенолидов яда 8еленой жабы (от Ю-8 до 10~5 г/мл) в сравнении о широко используемым кардиотоническим препаратом К-строфантином-В в тестах In vitro на папиллярных мышцах и полосках предсердий кошек. :

Установлено, что в 1г. кристаллического бакагина содержится 2500-3500 КЦД, тогда как в К-строфантине-0 78Й0-8880 КЕД.

Начально-действующая доза для бакагина, вызывающая увеличение амплитуды изометрического сокращения на 10-12% является 5-1СГ8 г/мл. Увеличение концентрации бакагина до 1'10-7 г/мл вызвало увеличение амплитуды изометрического сокращения на 38-52%, аналогичное изменение величины амплитуды наблюдалось и под действием К-строфантина-в. Применение бакагина, как и К-строфантина-й в концентрации 5-7,5*10"7 г/мл, вызыйало увеличения амплитуды изометрического сокращения в. 1,7-2 раза. Расчет по накопительным кривым CEso инот. показал, что для бакагина эта концентрация составляет 4,1' 1СГ7 г/мл.

Изучение влияния бакагина на частоту сокращений показало, что предлагаемый препарат, Как и широко применяемый строфантин- К, в концентрации 1*10"7г/мл не влияет, а в концентрации 1"1СГ6г/мл вызывает лишь незначительное (на 20-30%) учащение частоты сокращений спонтанно сокращающегося правого предсердия. Дальнейшие исследования показали, что CEso хрон. для бакагина составляет ' 8'10~бг/мл, а для К-строфантина-В -6,6-10~°г/мл'.

На основании полученных данных коэффициент избирательности инотропного действия бакагина составляет СЕ50 ин0тр./СЕ50 хрон." 4,1-10~7/8-10-6 и К-строфантина-В - 3,9-КГ7/6,2-10~б =

0,05. Эти данные показывают, что "бакагин" является выраженным

íSaOS.SiODw ->K"U

кардиоактивным препаратом. ,

■ ¿даи-въиеМ'Ф еючпз ¡эцгсотн&1

Кроме того, нами проведены серии экспериментов по исследо-

¡cspi^ о í!KH9Bssep Е даол и

ванию влияния бакагина на биоэлектрическую активность сердца KoseqsneqiB

морских свинок. При действие бакагина в дозе 0,25 мг/кг наблю-

какэскша ?: яккдак далось незначительное изменение ЭКГ-показателей, выражающееся

в удлинении инотровки R-R на 12-15% и некотором повышении -ткаче»» сюпсхм спсиоекигхзг

вольтажа зубца R. Систолический показатель при этом уменьшался

.К2Я 08S3-CSS? 8-»SSTS!I^OQTO-на 12,5%', При увеличении дозы бакагина в 2 раза до 1,5 КЕД -Н£Д?5Ч R££bjSSiiBiíS KBSSiHSa&i> SJi

(0,5 мг/кг) темп сердечных сокращений через 15 мин урежался на вэтеказг. í3t-0í cu гододафюз ¡

17,5%. Вольтаж зубца R повышался на 15%. Через 30 мин. интересAi N~Qi-í о? азн-г&кзЗ нпувг?хк=

вал R-R удлинялся'на 40% а вольтаж зубца R увеличивался на 52%. ен EHnspsqKCD =>?;

Введение К-строфантина-в в дозе 0,075 мг/кг вызывало уре-к лэсквди&зи едткшю шшяа-з«

жение ритма сердечной деятельности на 10% и уменьшение систо-II .скятйкйо еанекеакаП

дического показателягйа 6%. При увеличении дозы в 2 раза (0,15

-cay сгаецгиа ,za\ 1 * Ох "d,V-c. »

мг/кг) наблюдалось удлинение сердечного цикла R-R на 26%, и .Biso S-T.í s MíKs^qKOD oic.-

уменьшение систолического показателя на 12%. Увеличение дозы -ей кг.« от? «añüSKoa .гож

К-строфантина-в до 1,5 КЕД (0,18 мг/кг) вызывало у отдельных

■ .ЕЫ\1 Oí'i, У ТОЕГУГ. животных учащение интервала R-R, т.е. проявлялось положитель-.егзаакоя üikisдафгзэ утотзи-' ей г,

ное хронотропное.действие, свидетельствующее о проявлении ток-

ййыгкйзмкф! омосрга к >ч сичности. •

а й ,ТС"ЛЕЛ SH 'SMN Таким образом, при. введении бакагина и К-строфантина-в в

eus-j^ap'i ■ (XCS-02 ' cu) еопоьэткк.

терапевтических дозах наблюдается в одинаковой степени выра--tjsosetjT! otoEBqn к«пздайдас.'р?оо :

женности развитие положительного инотропного и отрицательного

•гЛ isr .ÍÍCQK оаЗЭ ОХР .txsús-con

хронотропного действия. Бакагин выгодно отличается от К-стро-- Z -£НЙТК£фО0ТО-И КГчД a ,t>!

фантина-в меньшей- токсичностью и большей широтой фармакологического действия и поэтому представляет большой практический «тэоядогеет&гп THSísra4ü;~~-í интерес для кардиологии. fv;3D\ .tJTOHH ОЗЯО- ?SR5SBTDOO

■ n-oi--s,avT'"oi-e,e - я-янктшф-'

- 21 -ВЫВОДЫ.

1. Впервые из яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis Laur методами гель-проникающей, гидрофобной и обращеннофа-зовой хроматографии выделены в индувидуальном виде 6 соединений буфадиенолидной природы.

2. Методами 1Н-ЯМР, масс-спектроскопии, а также рентге-ноструктурного анализа установлена химическая и конформацион-ная структура для двух из выделенных буфадиенолидов, как гама-буфоталин (ЗВ,11ос, 14-тригидрокси-5р,140-буфа-2О,22-диенолид) и аренобуфагин (Зв, Ilot, 14-тригидрокси-12-оксо-5а,14в-бу-фа-20,22-диенолид).

3. Установлено, что для молекул аренобуфагина, полученных . из различных объектов, характерно наличие полиморфизма, и аренобуфагин яда зеленой жабы Bufo viridis по своей молекулярной структуре отличается от описанного в литературе. Показано, что гамабуфоталин является новым для данного вида жабы.

'4. На клеточных линиях К-562 (эритробласты человека), Molt-4 (лимфобласты человека) и асцитной карциномы Эрлиха в опытах in vitro, а также непосредственно на животных-опухоле-носителях в системе in vivo показана выраженная противоопухолевая активность гамабуфоталина, аренобуфагина и суммы буфадиенолидов, названной "Бакагин". Установлено, что Бакагин, состоящий преимущественно из аренобуфагина и гамабуфоталина (80%), в дозе 0,2 мг/мышь подавляет опухоль Акатон (рак тонкой кишки) на 93,4%.

б. Изучено кардиотропное свойство Бакагина (in vitro) и показано, что он выгодно отличается меньшей токсичностью и большей широтой фармакологического действия от к-строфанти-на-р.

- 22 -

СПИСОК РАБОТ. ОЛУБЛИЮВЛИвК ПО ТЦС ДИССЕРТАЦИИ

1.Ташмухамедов U.C., Мирзаахмедов Ш.Я., Закирова O.K., Салихов Ш.И., Камаев Ф.Г., Ибрагимов Б.Т., Умарходжаев A.C. Аренобуфа-гин и гамабуфоталин из яда среднеазиатской жабы Bufo viridis. //Химия природных соединений, 1994. N1. о.140-141.

2.Ташмухамедов U.C., Мирааахмедов Ш.Я., Закирова O.K., Салихов Ш.И. Изучение цитотокоической активности некоторых ядов животных по отношению клеток асцитной карциномы Эрлиха. // Тез. докладов.конференции "Проблемы биохимии".Душанбе, 1993 г. с.8?.

3.Ташмухамедов U.C., ЗакироваО.К., Мирааахмедов Ш.Я., Салихов Ш.И., Якубов И.Т., Рахимов М.М. Выделение фосфолипазы Аг из яда веленой жабы Bufo Viridis. .//Химия природных соединений, 1994, N1. с.105-109. . '

4.Закирова O.K. , Ташмухамедов М.С.-, Мирааахмедов Ш.Я.,Салихов Ш.И. Биоспецифическая хроматография фосфолипазы Аг из яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo viridis. // Тез. докладов конференции "Проблемыбиохимии", Душанбе, 1993 г. с.88. б.Бекмухамедова З.У., Бердиев Б.К., Ташмухамедов М.С., Салихов Ш.И., Мирааахмедов Ш.Я., Закирова O.K. Влияние токсинов из яда среднеазиатской жабы на иоитранспортирующие системы. //Тез.докладовП-Конференции биохимиков Узбекистана. Ташкент, 4993 г. 0.21.

6.Ташмухамедов U.C., Закирова O.K., Мирааахмедов Ш.Я. Действие цельного яда Bufo viridis й его компонентов на активность цАМВ зависимой протеинкинааы печени крыс //Tea. докладов Ii-Конференции биохимиков Узбекистана. Ташкент, 1993. с.76. 7Даимухамедов М.С., Мирааахмедов Ш.Я., Салихов Ш.И., Кузнецова H.H. Биологическая активность некоторых ядов животных и их компонентов в системе in vitro. //Узбекский биологический жур-

!ал 1994. N1. с.67-69.

5.Ташмухамедов М.С., Закирова O.K., Мирзаахмедов Ш.Я., Шленс-«й В.Г., Бердиев Б.К., Бекмухаметова З.У. Действие токсичес-ои компонентов яда среднеазиатской зеленой жабы Bufo .viridis - буфадиенолидов гамабуфоталина и аренобуфагина на транспорт-гае АТРазы. ://Тезисы научной конференции "Структура и функции Зиологических мембран" 1995 г. Ташкент, с.103.

BUFO VIRIDIS ЗА^АРИДАН ОЛИНГАН БИОЛОГИК САОЛ (рЯЮЮЛЕКУЛЯР КОМПОНЕНТЛАИМНГ ТУЗИЛИНИ ВА «УНКЦКЯСИ.

Мфааахмедов Я. Я.

Урта Осиё яшил ба^аси Bufo viridis за^аридан гел-, гидрофоб ва тескари фазали хроматография услублари ёрдамида буфади-енолид туеилишига эга булган 6 та индувидуал бирикма бириичи марта ажратиб олиндй.

За^арнинг асосий токсик компонентлари булган иккитаси учун, ПМР-; масс-спектроскопия ва рентген тузилиш анализи ёрдамида тулик кимёвий ва конформацион тузилиши урнатилди. Улар-дан бири булган гамабуфоталин баканинг ушбу тури учун яигй, иккинчиси эса, аренобуфагиннинг кристалл модификациям булиб, маълум аренобуфагиндан молекуляр ^урилиши ' билан фар^ланади. УФ-, ИК-спектрлари ва сифат реакцияси ёрдамида долган бирикМа-ларнинг ^ам буфадиенолид табиатига эга аканлиги курсатилди. • Гамабуфоталин ва аренобуфагиннинг цитотоксик фаоллиги, Эр-лихнинг асцит карциномаси, К-562 (одам эритробласти) ва Molt-4 (одам лимфобласти) шиш хужайраларида in vitro тизимида урга-нилди. Аренобуфагиннинг гамабуфоталинга яисбатан кущщ цитотоксик таьсир »сучи борлиги курсатилди. In vivo тизимида бево-сита рак пиши при ташийдиган ^айвонларда, пБа»^гин"деб номланган буфвдиегюлидлгр суммасининг шишга (^аргаи фаоллигини анщяовчк

тадфп^тар сшиб борилди. Маълум препарат сарколизинга нисба-тан, Ба^агиннинг шишга ^арши фаоллиги к^проц экани курсатилди.

In vitro тиаиыида Бакагин препаратининг кардиотроп фаолли-гиви ани^лаш буйича тад^и^тлар олиб Сорилди. Ани^ландики, у янррд кардиотроп фаолликка эга булиб, таъсири буйича К-стро-фантин-р га ниобатан кичик токсикликка ва катта фармакологии кенгликка эга экаилиги билан фар^ланади. ЭТШСТШЕ AKD FU".!CTI«S OF В10Ш61САШГ ACTIVE LOWMOLECULAR COSPOHEHTS OF VEHOU BUFO VIRIDIS Mirzaahmedov Sh.Ya.

For the first time from the venom of Central Asian green toad Bufo viridis was derived 6 individual compounds bufadie-nolide nature, with the help of applied gel-penetrating, hydrophobic and reverse phased chromatography.

With the help.of NMR, mass-spectroscopy and X-Ray analysis, was established full chemical and confirmed structure for 2 compounds our of six, which are basic toxic agents in the venom. Samabufotalin - toxic agent is new of its kind, for this species of toad, the scand one - crystallised modification of arenobufagina which differ from the known arenobufagina Just in molecular structure. With the help of UV and IR -spectroscopy and anality reaction shows that, other compounds are also bufadienolides.

Cytotoxical activity of gamabufotalin and arenobufagina *ras studied on canser cells ascit carsinoma Erlich, К-Б62 (erltroblastos human) and Molt-4 (limfoblastos human) by in vitro. It was observed that arenobufagina shows more cytotoxic activity then gamabufotalin. Research was conducted to their antt - tumor activity of bufadienolides, named Bakagin, di-

rectly in animals earring canser cells. By in vivo it is shown that Bakagin is more effective against canser cells than sarkolisin.

Research was conduted for definity cardiotropic activity of Bakagin in vitro. It is established that, it has a wide spectrum of' cardiotropic activity and beneficial, with less toxic effect and wide application in pharmacology from K-stro-fantina-B.

¡1 "

Подписании печати Заказ к 3/6

Тираж ¿"V экз. Объем л. л. Формат бумаги

60 X 84 1/1Г

Отпечатан! ,на ротапринте в типографии Таш ГУ им. В. И. Левина.

Адрес г. Ташкент, ГСП, Вуиородок, Таш ГУ.