Исследование малопредставленных в ядах кобр белков новых структурных типов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. акад. М.М. ШЕМЯКИНА и ЮА ОВЧИННИКОВА

направахрукописи

ОСИПОВ АЛЕКСЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ МАЛОПРЕДСТАВЛЕННЫХ В ЯДАХ КОБР

БЕЛКОВ НОВЫХ СТРУКТУРНЫХ ТИПОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

МОСКВА-2004

Работа выполнена в лаборатории рецепции нейропептидов Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.

Научный руководитель

доктор химических наук Уткин Юрий Николаевич

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Румш Лев Давидович

кандидат химических наук Сурин Александр Михайлович

Ведущая организация

Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится " 9 " июня 2004 г. в 10 час. на заседании Специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и ЮА Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 2004 г.

Учёный секретарь Специализированного совета доктор химических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Яды кобр представляют собой сложные многокомпонентные смеси белков, содержащихся в разных количествах. Наиболее обильно представлены в ядах кобр высокотоксичные ч-нейротоксины, цитотоксины и фосфолипазы А2. К настоящему времени их структуры, в целом схожие внутри каждой группы, а также механизмы действия изучены достаточно подробно. Однако яд кобр содержит множество минорных компонентов иных структурных типов. Диапазон биологической активности этих соединений весьма обширен, а токсичность зачастую на порядки ниже по сравнению с нейро- и цитотоксинами. Многие из них обладают уникальным набором фармакологических эффектов и воздействуют на различные функциональные системы организма животных.

Так, в частности, в ядах кобр идентифицированы белки, влияющие на рост и дифференцировку нейронов (например, фактор роста нервов), систему комплемента сыворотки крови (фактор яда кобры), систему свёртывания крови (различные факторы с про-и антикоагулянтной активностью) на мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, опиоидные рецепторы, на клеточную адгезию, репродуктивную систему и многое другое, а также разнообразные ферменты и ингибиторы ферментов. Благодаря своим уникальным свойствам такие соединения ядов всё более интенсивно применяются как биохимические инструменты для исследования биологических процессов, особенно в силу того, что их, как правило, низкая токсичность позволяет проводить опыты не только in vitro.

На основании вышеизложенного весьма актуальным является идентификация и выделение минорных белковых компонентов из яда кобр с последующим исследованием их биологической активности.

Цели и задачи исследования

Цель данной работы - идентификация и выделение из ядов кобр ранее неизвестных минорных белков, обладающих новыми структурными характеристиками.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: оптимизировать условия фракционирования ядов четырёх видов кобр для выделения максимального числа новых компонентов; провести идентификацию известных и поиск новых соединений при помощи анализа полученных фракций методом MALDI масс-спектрометрии и установления полных или частичных аминокислотных последовательностей; усовершенствовать методику определения общей токсичности минорных компонентов ядов кобр; изучить биологическую

активность выделенных полипептидов.

Научная новизна и практическая ценность работы

Предложенная эффективная схема идентификации минорных белков, основанная на комбинации различных видов высокоэффективной жидкостной хроматографии и MALDI масс-спектрометрии, позволила идентифицировать в ядах кобр ряд новых белков. Так, из яда кобры Naja kaouthia выделен гликозилированный цитотоксин - первый гликозилированный представитель семейства трёхпетельных токсинов, установлены его первичная структура, участок и тип гликозилирования. Установлено влияние гликозилирования на некоторые свойства цитотоксина. Впервые в ядах кобр обнаружен белок семейства CRISP (Cysteine-Rich Secretory Proteins - белки с высоким содержанием цистеина). Показано, что в ядах кобр Naja kaouthia и Naja haje белки этого семейства представлены в виде набора нескольких нетоксичных гомологов. В яде кобры Naja oxiana впервые найден гликопротеин, относящийся к репролизинам яда змей. Этот белок является первым репролизином, для которого обнаружено ингибирование системы комплемента сыворотки крови по классическому пути. Фактор яда кобры (CVF) впервые выделен из яда кобры Naja melanohuca в виде двух форм, различающихся по активности. Эти соединения могут быть использованы при исследовании механизма функционирования системы комплемента. Предложено тестирование общей токсичности минорных компонентов яда кобр на насекомых, что сокращает расход исследуемого вещества.

Апробация полученных данных и публикации.

По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Результаты были доложены на XIII Международном конгрессе Международного общества по токсинологии (Париж, 2000), на V чтениях, посвященных памяти академика ЮА Овчинникова (Москва-Пущино, 2000), на X и XI Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2002; 2003) и на Ш съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).

Структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на ¡СУ страницах машинописного текста и состоит из введения, трёх глав основной части (обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 131 ссылку. Материал иллюстрирован 26 рисунками и 3 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выбор рациональной схемы выделения минорных компонентов ядов.

Белки новых структурных типов можно обнаружить в малоисследованных ядах или только среди минорных компонентов достаточно детально изученных ядов. Содержание различных компонентов в ядах кобр варьирует от долей процента до 10% (цитотоксины) и более (25% - а-кобратоксин) от массы сухого яда. Поэтому для выделения малопредстав-ленных компонентов требуется многостадийная схема очистки, основанная на сочетании различных видов хроматографии с чувствительным методом идентификации белков.

Белки новых структурных типов с большой вероятностью должны отличаться по массе от уже известных. Основным способом первичной идентификации белка яда нами было выбрано определение молекулярной массы методом MALDI масс-спектроскопии (MALDI МС), высокая чувствительность которого позволяет анализировать минорные компоненты сложных белковых смесей. Наиболее полно охарактеризованные компоненты яда кобр перекрывают следующие диапазоны масс: 6.4-8.3 кДа - трёхпетельные токсины; 1314 кДа - фосфолипазы А2. Молекулярные массы белковых компонентов новых структурных типов должны, очевидно, находиться за пределами этих диапазонов. Исходя из этой характеристики, в качестве первого этапа схемы разделения ядов кобр мы использовали гель-фильтрацию, позволяющую фракционировать белки по молекулярной массе.

Наилучшие результаты при разделении яда кобр гель-фильтрацией были получены с использованием большой (4.5x150 см) колонки, допускающей нанесение до 1 г яда за этап, с сефадексом G-50 sf (этот носитель оказался оптимальным). В результате гель-фильтрации нам удалось разделить яды кобр Naja kaouthia, N. haje и N. melanoleuca (рис.1-а,б,в, соответственно) на следующие фракции: I - содержащую соединения с массами более 30 кДа; II - 9-30 кДа; III - содержащую основные токсические компоненты с массами 6-8 кДа и кислые фосфолипазы А2 и IV - содержащую низкомолекулярные вещества; основные компоненты этой фракции нами были идентифицированы как аденозин, гуанозин и инозин. Таким образом мы отделяли соединения с массами свыше 9 кДа от большинства компонентов яда, в первую очередь от высокотоксичных.

Фракцию II, содержащую главным образом соединения основного характера, разделяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на катионообменной колонке НЕМА BIO 1000 СМ. Полученные после этого фракции анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПАГЭ) и MALDI MC. Наряду с уже известными соединениями (фактор роста нервов, 13.1 кДа, фосфолипазы А2, 13.4-13.6 кДа, таикобрин, 12.1 кДа), в яде N. kaouthia были (рис. 2-а)

а)

А 2ВО им

б)

А 280 мм

номера фракций

В)

номера фракций

Рисунок 1. Разделение цельного яда кобр N. каошЫа (а), N. Ъще (б) и Л' те1апо1еиса (в) методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом 050 вГ в 0.1 М аммонийно-апетатном буфере, рН 6.2. Арабские цифры - номера пробирок, римскими цифрами обозначены объединённые фракции.

а)

б)

в)

А 280 нм минуты

Рисунок 2. Катионообменная ВЭЖХ на колонке НЕМА 1000ВЮ СМ (8*250 мм, скорость потока 1.4 мл/мин): а) - фракции II яда N. каошЫа в линейном градиенте концентрации аммокийно-ацетатного буфера (рН 7.5) от 6 до 650 мМ за 60 мин; б) - фракции II яда N. Иа}е в нелинейном градиенте концентрации буфера (точечная линия); в) - фракции III яда кобры N. КаошЫа в линейном градиенте концентрации буфера от 5 мМ до 1 М за 100 мин (обозначены компоненты, использованные для тестирования на насекомых. У вершин соответствующих хроматографических пиков обозначены молекулярные массы соединений в Дальтонах).

обнаружены ранее не описанные основные соединения с массами 25.0 кДа (фракция П-6), 23.6 и 23.7 кДа (фракция П-10) и 24.2,24.3 и 9.3 кДа (фракция П-11), а в яде N. Иа]е (рис.2-б) - с массами 25.0 (фракция И-4), 23.6 (фракция И-7) и смесь соединений кислотного характера (фракция П-1), содержащая вещество с массой 25.0 кДа. Фракцию П-1 далее разделяли на ан0

ионообменной колонке ЫЕМА В1О 1000 DEAE (рис. 3-а). Компоненты указанных фракций подвергали дальнейшей очистке методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac И8 (рис. 3-б,в) и определяли молекулярные массы белков с помощью MALDI МС. В результате из яда N. каоШМа выделены белки №25 (молекулярная масса 24953 Да, основной компонент фракции П-6), Nk24 (MALDI масс-спектр характеризуется наличием двух близких по интенсивности сигналов, соответствующим массам 24080 и 24179 Да; компонент фракции II-11, рис. З-б), Nk23 (также два сигнала, 23621 и 23704 Да; компонент фракции П-10, рис. 3-в) и гликопротеин (GP, рис. З-б) с массой ~9.3 кДа. Из яда N Иа]е выделены белки Nh24 (23590 Да, основной компонент фракции И-7), Nh25 (24960 Да, основной компонент фракции Н-4) и кислый белок Nh25A (25006 Да, компонент фракции И-1, рис. 3-а).

а)

б)

в)

020 015 010 005

jj

>11

Ш5А

015

ОЮ-

005-

000

CP Nk24

0 10 20 30 40 50 0 5 10 1 5 20 25 30 35 40

ЛЛОнм хшчтн А 280 ни ынтты

010 006 00« 004 002 ООО'

:JL

ж

N123

0 5 10 15 20 25 30 35 40

А 280 ни н«кущ

Рисунок 3. Разделение фракции П-1 яда кобры JV. haje методом анионообменной ВЭЖХ на колонке НЕМА 1000ВЮ DEAE в линейном градиенте концентрации аммонийно-ацетатного буфера (рН 7.5) от 5 до 400 мМ за 40 мин (а), а также фракций II-11 (б) и II-10 (в) яда кобры N. kaouthia методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac С18.

С целью разработки условий тестирования общей токсичности компонентов яда кобр на насекомых мы выделили несколько известных компонентов ядов N. каоШМа (цитотоксины (СХ) I, III и IV, длинный нейротоксин а-кобратоксин (а-СТ), слабый нейротоксин WTX, мускариновый токсин MTLP1, фосфолипазу А2 СМИ) и N. охгапа (цитотоксины I и II и короткий нейротоксин II). Для этого основные токсические фракции III (рис. 1) ядов разделяли на катионообменной колонке HEMA BIO 1000 СМ (показано на

примере фракции III яда N. kaouthia, рис. 2-в), дальнейшую очистку полученных белков проводили при помощи обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Vidac С18. Идентификацию компонентов осуществляли посредством MALDI МС и определения N-концевой аминокислотной последовательности.

Фракции I ядов N. kaouthia и N. melanoleuca, содержащие в основном кислые белки с молекулярными массами свыше 30 кДа, разделяли при помощи анионообменной ВЭЖХ на колонке НЕМА ВЮ 1000 DEAE (рис. 4-а,б). Анализ полученных фракций методами ДСН-ПАГЭ и MALDI MC показал наличие в яде N. melanoleuca двух белков, близких по физико-химическим свойствам ранее охарактеризованному CVF из яда N. kaouthia.

■ —I---1----1— ■ I-•

0 20 40 60 80 0 20 40 60 80

А 280 им минуты А 280 нч минуты

Рисунок 4. Разделение фракции I яда кобр N. kaouthia (а) и яда N. melanoleuca (б) анионообменной ВЭЖХ на колонке НЕМА 1000ВЮ DEAE в линейном градиенте аммонийно-ацетатного буфера (рН 7.5) от 5 до 700 мМ за 70 мин.

Для выделения нового белка с антикомплементарной активностью из яда кобры N. oxiana была применена другая схема, выбор которой был продиктован необходимостью повторения стадий, описанных ранее другими авторами [Козлов и соавт., 1989]. Согласно такому подходу, для получения фракции CFB-III, содержащей белки, ингибирующие систему комплемента сыворотки крови, яд фракционировали на колонках с DEAE-Сефарозой CL-6B и затем СМ-Сефарозой CL-6B. Далее эту фракцию мы разделяли методом обращбнно-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac C18 (рис. 5). В итоге был выделен новый гликопротеин (фракция V) - ингибитор системы комплемента. Поскольку мы обнаруживали антикомплементарное действие по ингибированию лизиса эритроцитов под действием комплемента сыворотки, то для удаления следов цитотоксина фракция V подвергалась рехроматографии в тех же условиях.

Наличие углеводной части в составе всех белков определяли по окрашиванию полосы белка в геле реактивом Шиффа.

Рисунок 5. Разделение фракции CFB-III яда кобры N. oxiana методом обрашенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac С18. Вставка: MALDJ масс-спектр оксиагина (фракция V).

2. Использование насекомых для определения обшей токсичности соединений.

Поскольку яд кобры высокотоксичен, можно ожидать, что и многие выделенные соединения окажутся в большей или меньшей степени токсичными. Проведение испытания на общую токсичность на млекопитающих требует наличия достаточно большого количества исследуемого вещества. Кроме того, неизбежно возникают этические вопросы о правомочности использования подобной модели. Руководствуясь этими соображениями, мы проверили возможность проведения испытаний общей токсичности на насекомых. В литературе имеются отрывочные данные по токсичности отдельных компонентов ядов кобр на насекомых, однако систематического исследования не проводилось.

С этой целью мы выделили ряд известных компонентов ядов кобр N. kaouthia и N. oxiana разных структурных типов, для которых имеются данные по общей токсичности, полученные в опытах на мышах. Эти соединения, а также цельные яды кобр, были протестированы на тараканах Gromphadorhina portenlosa. Это - крайне неприхотливые насекомые, довольно крупные (5-9 г), и при том умеренно подвижные, что облегчает наблюдение за их состоянием и поведением.

Полученные результаты (в сравнении с известными данными для мышей) приведены в таблице 1. Видно, что цельные яды и цитотоксины имеют LDjo для тараканов на порядок выше, чем для мышей (цитотоксин I из яда N. oxiana для тараканов оказался наименее токсичным). Степень токсичности фосфолипазы для тараканов и мышей близка.

Как короткий, так и длинный -нейротоксины яда кобр не проявили токсичности в отношении тараканов в дозах, превышающих LD50 для мышей более чем на 3 порядка. Это можно объяснить тем, что при выбранном нами способе введения нейротоксины не достигают своих мишеней в ЦНС таракана, а легко доступная для них нервно-мышечная передача не является у насекомых холинэргической. MTLP-1, представитель мускариновых токсинов, для тараканов тоже оказался нетоксичным. Практически нетоксичный для мышей

WTX оказался нетоксичным и для тараканов, причём в концентрации почти на 2 порядка выше.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что насекомых можно использовать для тестирования токсичности некоторых компонентов ядов кобр, в частности, цитотоксинов и фосфолипаз А2.

Таблица 1.

Токсичность ядов кобр и их компонентов для тараканов и мышей.

Соединение Кобра LDso*

Тараканы Мыши, внутривенно

нмоль/г мкг/г нмоль/г мкг/г

Цельный яд N.oxiana - 16 - 0.96

N. kaouthia * 7 - 0.4

Цитотоксин I N.oxiana >5 >35 0.16 1.1

Цитотоксин П N.oxiana 1.5 10.5 0.25 1.75

Цитотоксин I N. kaouthia 2 13.4 0.11 0.75

Цитотоксин III N.kaouthia 2 13.4 0.18 1.2

5.8** 38,8**

Цитотоксин IV N.kaouthia 2.3 15,4 0.22 1.48***

ФЛА2 СМИ N. kaouthia 2.85 38.5 7.4 10±3

Нейротоксин II N.oxiana >15 >100 0.02 0.13

а-кобратоксин N.kaouthia >15 >117 0.01 0.1

WTX N.kaouthia >15 >114 >0.27 >2

MTLP-1 N.kaouthia >16 >117 - -

1ЛЭ5о* - доза вещества, вызывающая гибель половины подопытных животных ** данные для сверчков *** внугрибрюшшшо.

Нами была проверена общая токсичность некоторых белков семейства CRISP (см. раздел 4), цитотоксина III, GP и его дегликозилированной формы (см. раздел 3) на сверчках Grillus assimilis. Их вес составляет 0.3-0.5 г, соответственно, снижается расход вещества. Сходство результатов, полученных во время испытаний на тараканах и сверчках, говорит о возможности использования более мелких насекомых, например, сверчков, в случае ограниченного количества испытываемого вещества

3. Гликозилированный цитотоксин из яда кобры N. kaouthia

После катионообменной ВЭЖХ фракции II яда N. kaouthia ДСН-ПАГЭ показал во фракции II-11 и, в намного меньшей степени, в II-10 присутствие гликопротеина (GP) с молекулярной массой около 9 кДа. Полученная после очистки на обращенной фазе (рис. 3-6) фракция GP дала на MALDI-масс-спектре группу пиков в диапазоне 8900-9400 Да.

Суммарный выход GP из фракций II-11 и II-10 составил 0.17%.

GP, после восстановления дитиоэритритом, был подвергнут пиридилэтилированию с последующим прямым автоматическим определением N-концевой аминокислотной последовательности. Установленная последовательность из 24-х аминокислотных остатков полностью совпала с N-концевой последовательностью цитотоксина Ш (СХЗ), содержащегося в яде этой же кобры в значительно большем количестве (выход 5.1%). Для проверки идентичности полных последовательностей и локализации участка гликозилирования, пиридилэтилированный GP был расщеплен трипсином, и, после разделения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ, полученные пептиды анализировали методом MALDI-MC (таблица 2). Проведённый анализ обнаружил пептид, имеющий в спектре группу пиков в диапазоне масс 2600-3000 Да (рис. 6-а). Деградацией по Эдману установлена его последовательность MFMVSXK, где X - неизвестный остаток. Данная последовательность соответствует фрагменту Met24-Lys30 цитотоксина СХЗ, с допущением, что X - это Asn29, содержащий углеводную часть. В следующем эксперименте анализировали методом MALDI-MC смесь продуктов триптического гидролиза пиридилэтилированного GP без их предварительного разделения. Полученные данные показывают присутствие всех триптических фрагментов (таблица 2), которые можно получить при гидролизе СХЗ (за исключением массы 856,5 Да, соответствующей фрагменту 24-30 СХЗ). Не обнаруженные фрагменты (1-2, 3-5, 31-35, 59-60) с массами менее 600 Да входят в состав более крупных (1-5, 31-36, 51-60). Дегликозилирование GP с помощью протеин-^гликозидазы F (PNG-F) привело к полипептиду с массой 6710 (по данным MALDI-MC), что практически совпадает с массой СХЗ (6708 Да), тем более, что превращение гликозилированного остатка аспарагина в остаток аспарагиновой кислоты под действием PNG-F увеличивает массу на 1 Да. В спектре дегликозилированного GP наблюдался также сигнал с m'z 6724. что может быть объяснено частичным окислением одного из остатков метионина. MALDI-MC триптического гидролизата дегликозилированного GP показала присутствие всех расчётных триптических фрагментов СХЗ, в том числе сигналов m/z 857 и 873 Да (рис. 6-6), соответствующих фрагменту 24-30 СХЗ (+1 Да) и его форме с одним окисленным остатком метионина (+ ещё 16 Да). Таким образом, данные деградации пептида по Эдману и MALDI-MC показывают, что аминокислотные последовательности GP и СХЗ совпадают.

Углеводный анализ GP обнаружил присутствие в молекуле маннозы, галактозы, N-ацетилглюкозамина, фукозы и N-ацетилпейраминовой кислоты, позволяя определить углеводную часть как N-гликан сложного типа. Разница в 145-147 Да между сигналами в масс-спектре для интактной молекулы GP и в 146 Да в спектре пептида Met24-Lys30 (рис. 6-

а) б)

Рисунок 6. MALDI масс-спектр триптического фрагмента GP MFMVSXK (а); фрагмент спектра триптического гидролизата дегликозилированного GP (б).

Таблица 2

Молекулярные массы триптических пептидов пиридилэтилированных GP и СХЗ

Фрагмент пептидной цепи СХЗ Масса, рассчитанная исходя из последовательности СХЗ Определённая масса

для пептида, выделенного посредством ВЭЖХ для триптического гидролизата без разделения

после короткой инкубации GP с трипсином после длительной инкубации GP с трипсином после инкубации СХЗ с трипсином

1-2 260.2 н.о. н.о. н.о. н.о.

3-5 469.2 и.о. н.о. н.о. н.о.

6-12 817.5 817.4 816.9 817.4 817,6

13-18 681.3 681.3 680.9 681.2 681,4

19-23 745.4 н.о. 744.8 745.2 745,5

24-30 856.4 2627-3017" 857.3"' н.о. 856,5

31-35 543.3 н.о. н.о. н.о. н.о.

37-44 1016.5 1016.5 1015.9 1016.3 1016,6

45-50 673.4 н.о. 672.9 673.3 673,5

51-58 1183.5 1183.5 н.о. 1183.3 1183,7

59-60 341.1 н.о. н.о. н.о. н.о.

1-5 710.4 н.о. 709.8 710.3 710,5

31-36 699.5 н.о. 698.9 699.3 699,5

51-60 1505.6 н.о. 1504.7 1505.5 1505,8

6-23 2206.2 н.о. 2205.7 н.о. н.о.

45-60 2160.0 н.о. 2159.7 2160.7 2160.2

Гликозилированный пептид (см. рис. 6-а). в| Масса, определённая в триптическом гидролизате дегликозилированного GP (см. рис. 6-6). и.о. - не обнаружено.

б) позволяет предположить, что гетерогенность гликозилирования может быть обусловлена различным содержанием терминальных остатков дезоксигексозы (фукозы) или частичным её отщеплением в условиях хроматографии на обращенной фазе или снятия MALDI масс-

спектров. Обработка иР смесью галактозидаз и фукозидаз привела, по данным МЛЬЭ1-МС. к удалению по меньшей мере одного остатка дезоксигексозы. Это значит, что фукоза является одним из терминальных остатков Сахаров углеводной части молекулы ОР.

Итак, ОР представляет собой СХЗ, содержащий углевод на остатке абп29, расположенном в «консенсусном» участке М-гликозилирования белков Лзп29-Ьуз30-8ег31 на верхушке центральной петли молекулы (рис. 7). Этот гликопротеин является пока единственной существующей моделью для изучения влияния гликозилирования токсина трёхпетельного типа на его свойства.

В первую очередь было проверено влияние гликана на токсические свойства цитотоксина. Цитотоксичность ОР была определена на клеточной линии ИЬ60 (промиелоцитарные лейкемические клетки человека), а общая токсичность - на насекомых (сверчках ОгуИт assimilis). Концентрации, при которых погибает 50% клеток, равны 21 цМ и 0.16 цМ для ОР и СХЗ, соответственно, т.е. гликозилирование приводит более чем к 100-кратному понижению токсичности в отношении этих клеток. Стоит заметить, что дегликозилирование ОР с помощью РМО-Б полностью возвращает соединению цитотоксичность СХЗ, несмотря на превращение нейтрального остатка аспарагина в отрицательно заряженный остаток аспарагиновой кислоты. Разница в значениях ЬЭ50 для ОР и СХЗ, установленных в опытах на сверчках, оказалась не столь разительна (13.4 и 5.8 нмоль/г, соответственно).

О влиянии гликозилирования на физические свойства цитотоксина можно судить по хроматографическому поведению и спектрам кругового дихроизма (КД) соответствующих белков. Обращенно-фазовая ВЭЖХ показала, что углевод практически не влияет на общую гидрофобность белка (данные не приведены), однако при проведении катионообменной ВЭЖХ чётко видно следующее (рис. 8): дегликозилированный ОР оказывается более кислым,

Рисунок 7. Схематическое изображение молекулы цитотоксина 3 ада N. каошЫа с углеводным заместителем при остатке аспарагина-29

чем СХЗ (это объясняется заменой А$п29—»АБр29 под действием РМО-П. а сам ОР является более кислым, чем и его дегликозилированная форма, и СХЗ (что может быть объяснено присутствием остатка(ов) М-ацетилнейраминовой кислоты в углеводной части молекулы).

Нами были получены спектры КД для ОР, его дегликозилированной формы и СХЗ (рис. 9). Существенное сходство этих спектров, типичных в целом для трёхпетельных токсинов, указывает на незначительное влияние гликозилирования токсина на его конформацию.

В связи с обнаружением ОР встаёт вопрос о биологическом смысле натичия гликана в структуре цитотоксина. Имеющиеся данные [БиЬоузки й а1. 2001] свидетельствуют о том. что при взаимодействии с фосфолипидной мембраной центральная петля цитотоксинов погружена в липидный бислой. Гликозилирование А8п29, расположенного на верхушке

центральной петли, вводит объёмный заместитель, что должно существенно затруднять такое взаимодействие. Поскольку гликозилирование приводит к более чем 100-кратномуснижению цитотоксичности, можно предположить, что это является защитным механизмом для самих секреторных клеток (подобный механизм самозащиты используется в случае никотинового ацетилхолинового рецептора кобры: гликозилирование делает его нечувствительным к а-нейротоксинам); дегликозилирование может происходить потом в другом отделе ядовитой железы. Однако из 90 известных аминокислотных последовательностей цитотоксинов элапид только у 13 (все - из ядов азиатских кобр) имеется «консенсусный» участок для N-гликозилирования (рис. 10).

1 10 20 30 40 50 60

LKCNKLIPLA YKTCPAGKNL CYKMFKVSNK TVPVKRGCID ACPKNSLLVK YVCCNTDRCN CX3NMP01446)

LKCNKLIPLA YKTCPAGKNL CYKMFMVSNK TVPVKRGCID VCPKNSLLVK YVCCNTDRCN CX2Nk(P01445)

LKCNKLIPLA YKTCPAGKNL CYKMYMVSNK TVPVKRGCID VCPKNSLVLK YECCNTDRCN CXlNn (P01447)

LKCNKLIPLA YKTCPAGKNL CYKMFMVSNK TVPVKRGCID VCPKNSLVLK YVCCNTDRCN CX3Nn(P24780)

LKCNKLVPLF YKTCPAGKNL CYKMFMVSNb TVPVKRGCID VCPKNSALVK YVCCNTDRCN CX2Na(P01442)

RKCNKLVPLF YKTCPAGKNL CYKMFMVSNb TVPVKRGCID VCPKNSALVK YVCCNTDRCN CX4Na (P01443)

LKCNKLVPLF YKTCPAGKNL CYKMFMVSNL TVPVKRGCID VCPKNSALVK YVCCNTDRCN tr0738S7

LKCNKLVPLF YKTCPAGKNL CYKMFMVSNK TVPVKRGCID VCPKNSALVK YVCCNTDRCN tr0738S3

LKCNKLVPLF YKTCPAGKNL CYKMFKKSUK TVPVKRGCID VCPKNSALVK YVCCNTDRCN tr073S59

LKCNKLVPLF YKTCPAGKNL CYKMFMVSNL TVPVKRGCID VCPKNSALVK YVCCNTDRCN trnewAAC27691

LKCNKLVPLF YKTCPAGKNL CYKMFMVSNL TVPVKRGCID VCPKNSALVK YVCCNTDRCN trnewAAC27692

RKCNKLVPLF YKTCPAGKNL CYKMFMVSNL TVPVKRGCID VCPKSSLLVK YVCCNTDRCN trQ9W6W9

LKCNKLIPLA YKTCPAGKNL CYKMYMVSNK TVPVKRGCID VCPKNSLLVT YECCNTDRCNL trQ9PSN2

Рисунок 10. Аминокислотные последовательности цитотоксинов змей, содержащие консенсусный участок N-гликозилирования Asn29-X30-Thr31 (жирный шрифт). CX2Nk и CX3Nk - цитотоксины 2 и 3 Я kaouthia; CXlNn и CX3Nn - цитотоксины 1 и 2 N. naja; CX2Na и CX4Na - цитотоксины 2 и 4 N. atra; tr07857, &07858 и tr07859 - кардиотоксины 5А, 6 и 7 N. sputatrix; trnewAAC27691 и trnewAAC27692 - кардиотоксины 5а и 5Ь N. sputatrix; trQ9W6W9 - кардиотоксин 4N N. atra; tr09PSN2 - цитотоксин-подобный основный белок N. nuju.

Из токсинов трёхпетельного типа консенсусные участки N-гликозилирования в аминокислотной последовательности имеют также отдельные -нейротоксины - как короткие, так и длинные, - однако ни один из них не включает Asn-29.

Другое возможное объяснение наличия GP - гликан необходим для стабилизации какого-то другого компонента яда (сами цитотоксины - легко растворимые и очень устойчивые белки) при его кооперативном взаимодействии с GP. Также не исключено, что для GP имеется пока не идентифицированная мишень.

4. Белки семейства CRISP в ядах кобр TV. kaouthia и N. haje

Для проведения структурной характеристики выделенные из ядов кобр N. kaouthia и N. haje белки с молекулярными массами в диапазоне 23-25 кДа после восстановления дитиоэритритом подвергали пиридилэтилириванию с последующим анализом производных

методом MALDI МС и определением N-концевой аминокислотной последовательности. Разница в молекулярных массах между пиридилэтилированными производными и интактными белками составила 1600-1650 Да для всех соединений, что соответствует включению 15.5-16 моль остатков винилпиридина на 1 моль белка и показывает содержание остатков цистеина в полипептидной цепи. Основываясь на данных по молекулярной массе и содержанию остатков цистеина в молекуле, можно предположить, что выделенные нами белки принадлежат к семейству белков CRISP (cysteine-rich secretory proteins - секреторные белки с высоким содержанием остатков цистеина), для которых характерно наличие в аминокислотной последовательности 16 остатков цистеина, образующих 8 дисульфидных связей.

Для определения аминокислотной последовательности пиридилэтилированное производное белка Nk25 подвергали триптическому гидролизу с последующим разделением и анализом образующихся пептидов методами MALDI масс-спектрометрии и деградации по Эдману. Установленные аминокислотные последовательности включают 101 остаток, сумма их молекулярных масс соответствует 47% молекулярной массы белка. Сравнение установленных фрагментов последовательности Nk25 (рис. 11-а) с известными первичными структурами белков убедительно указывает на его принадлежность к белкам семейства CRISP, ранее в ядах кобр не выявлявшихся. Последовательности фрагментов Nk25 полностью повторяются в последовательности открытого позже CRVP-1 (Q7T1K6) из яда кобры N. atra, а из белков млекопитающих Nk25 имеет наибольшее сходство (42% идентичных остатков) с последовательностью CRISP-белка ТРХ1 (Q8HX97) из семенников лошади.

Результат сравнения N-концевых аминокислотных последовательностей выделенных нами и известных белков семейства CRISP представлен на рис. 11-б. N-концевая аминокислотная последовательность Nk25 совпадает с CRVP-1 из яда N. atra (на 100%) офанином (Q7ZT98) из яда королевской кобры (на 96%), Белок Nk24 гомологичны белку CRVP-2 (Q7ZZN8) из яда N. atra (95% идентичных остатков), букарину (Р81993) из яда крайта Bungarus candidus (94%) и латисемину (Q8JI38) из яда морской змеи Laticauda semifasciata (91%). Установленная последовательность белка Nk23 совпадает с таковой букарина, CRVP-2 и латисемина, имея расхождение с последней лишь в позиции 11. Белок Nh25 гомологичен Nk25 и CRVP-1 (96% идентичных остатков) и офанину (92%), так же, как и единственный выделенный из ядов белок CRISP кислого характера (Nh25A) - 82% и 79%, соответственно. N-концевая последовательность Nh24 наиболее близка таковой букарина (71% совпадений). Отчетливо видно, что все белки семейства CRISP в N-концевой области гомологичны друг друг}.

а)

10 20 30 40 50 60 70

NVDFNSZ5TR RKKKQKTIVD LHNSt VS PTASNMLKME WYPEAASNAE RKANTCSUffl SfDNLR N1(25

EPAFSALLTT OTCVQBEIVN KHNELPKSVS PPASNMLKME WSPEATANAQ KHAHKCTLEH S3ADDRKTST -RCGE TPX1

NVDFNSE3TR RKKKQKEIVD LHNSLRRRVS PTASNMLKME WYPEAASNAE RWANTCSLNH SPDNLRVLEG I0CGE CRVP1

TADFASES-S NKKYQKEIVD khnalrrsvx ptarnmlcmk wnsraaqww rhanrctfah SPPHKRTVGK LRCGE Pseud

80

100

110

120

130

140

150

90

TWTEII вшита Nk25

NIYMS SDPTPWS2AI QSWYDISLDr TYGVGPKSAG SVVGHYTQAV WYSSYRVGCG IAYCPNQESL KYYYVCQYCP TPX1

SIYMS SNARTWTEII HbWHDEYKNF VYGVGANPPG SVTGHYTQIV WYQTYRAGCA VSYCPSSAWS -YFYVCQYCP CRVP1

NIFMS SQPFPWSGW QAWYDEIKNF VYGIGAKPPG SVIGHYTQW WYKSYLIGCA SAKC-SS-S- KYLYVCQYCP Pseud

220

160 170 160 190 200 210

TAT PYK QS SCQDDWIKSN CPASCF

VGNJJVNKKNT PYQQGTPCAS CPGNCDNGLC TNSCEYEDLL SNCDSLKKTA GCEHEIXKEK CKATCRCENK IY sgnfogktax PYKLGPPCGD cpsacdnglc tnpctiynkl tncdsllkqs scqddwiksn CPASCPCRKK II AGNIRGSIAT PYKSGPPCAD CPSACVNKLC TNPCKR.WDF SNCKSLAKKS KCQTEWIKKK CPASCFCKNK II

N1C25 TPX1 CRVP1 •Pseud

6)

Белок Поз.

25Nk 1-25 NVDF NS E

24Nk** 1-23 (V) D F A S E

23Nk 1-13 E

Nh24 1-14 D

Nh2S 1-2S NV D FN S E

Nh25A 1-29 D VD FN S E

CRVP-1 19-47 N VD FN S E

CRVP-2 20-48 T VD F A S E

Офанин 1-29 N VD FN S E

Букарин 1-25 E

Латисемин 20-48 T VD F A S E

TPX1 2-31 D P A F S AL

Аминокислотная последовательность

STRRK- - - KKQKEIVDL HNSL SXNKRENQ- -Q- - I VDKHNAL SSNKRENQ-KQ- - IV SSNLPPNQ-KQ- - I V D

STRRK---KKQKEIVDLXNSL

STRRK-N- - KQKE I VDLHNS LKKTV STRRK- - - KKQKE I VDLHNSLRRRV SSNKRENQ-KQ- - I VDKHNALRRSV STRR- - - QKKQKE I VDLHNSLRRSV SSNKRENQ-KQ- - I VDKHNALRRSV SSNKRENQ-K--EIVDKHNALRRSV L TT --QTQV-QREIVNKHNELRKSV

Рисунок 11. Сравнение аминокислотных последовательностей выделенных нами белков с полными последовательностями (а) и N-концевыми участками (б) известных белков, относящихся к семейству CRISP. Жирным шрифтом - выделены остатки, занимающие одинаковые положения в Nk25 и одном из белков CRISP (а) или совпадающие не менее чем в половине приведённых последовательностей (б). *Pseud - псевдехетоксин.

**В Nk24 определены две последовательности, у одной из которых отсутствует N-конпевой остаток валина.

Спектры флюоресценции как основного (Nh25), так и кислого (Nh25A) белка имеют Хмах 348.8 нм и ДА1/2 67.5 нм и Хмах 344 нм и ДХ1/2 56.4 нм, соответственно. Эти величины указывают на экспонированность в растворитель всех имеющихся остатков триптофана в обоих полипептидах.

Поскольку имеется заметное сходство (рис. 11-а) фрагментов последовательностей белка Nk25 и псевдехетоксина (Q8AVA4) из яда австралийской змеи рода ехидн Pseudechis australis, являющегося блокатором кальциевых каналов, управляемых циклическими нуклеотидами [Brown et al. 1999], мы проверили действие белка Nk25 на обонятельные

каналы, активируемые ц-АМФ и ц-ГТФ (совместно с проф. С. Фрингсом. Университет Гейдельберга, Германия). При использовании Nk25 в концентрации 1 цМ, наблюдали лишь очень слабое (не более 5%) уменьшение тока. Известно, что псевдехетоксин в этой концентрации полностью подавляет функцию таких каналов. Было проверено также влияние Nk25 на каналы фоторецепторных клеток быка, однако эффект не был более выраженным.

Учитывая низкое содержание изучаемых соединений в яде (выход Nk25 и Nh25 - не более 0.5% от массы сухого яда. остальных - существенно ниже), испытание на токсичность проводили выборочно для наиболее представленных белков. Белок Nk24 испытывался на тараканах Gromphadorhina portentosa, белок Nk25 - на тараканах и на самцах мышей линии NMRI, а все CRISP из яда N. haje - на сверчках Gryllus assimilis. В дозах до 5 нмоль/г не было отмечено гибели ни одного животного. Принимая во внимание близость физико-химических свойств этих соединений, можно предполагать, что вся группа белков CRISP ядов кобр N. haje и N. kaouthia практически нетоксична как для мышей, так и для насекомых.

Обнаружение такого числа нетоксичных CRISP-белков в яде обоих видов кобр и их консервативность, хорошо прослеживающаяся теперь во всех семействах змей, секретирующих нейротоксические яды, неизбежно ставят вопрос об их роли в повреждающем действии ядов. Однако следует отметить, что данные о биологических эффектах CRISP малочисленны, разрозненны и противоречивы.

Известно, что белки CRISP из репродуктивного тракта самцов млекопитающих совершенно необходимы для процессов созревания сперматозоидов и слияния гамет. Но, к примеру, ятя CRISP из слюны млекопитающих функция не известна. Псевдехетоксин является блокатором каналов, управляемых циклическими нуклеотидами, а белок Nk25 на них практически не действует, несмотря на заметное сходство фрагментов последовательностей. Офанин, как и некоторые другие CRISP, умеренно ингибирует сокращение мышц хвостовой артерии крысы, вызываемое высокой концентрацией ионов калия, а CRISP-белки из яда N. atra не ингибируют такое сокращение мышц. Для них биологическая активность вообще не установлена. Мы надеемся, что обнаружение в общей сложности шести новых членов этого семейства и их дальнейшее исследование позволит установить настоящий биологический смысл их присутствия в ядах змей.

5. Репролизин из яда кобры N. oxiana

Из нескольких фракций, полученных при разделении фракции CFB-III обращённо-фазовой ВЭЖХ, только фракция V (рис. 5) обладала выраженной антикомплементарной активностью (основной белок фракции CFB-III, цитотоксин II, имел по сравнению с ней

удельную активность на 3 порядка ниже). Выход целевого белка из фракции V. названного оксиагином, составил 1.3% от массы сухого яда.

Анализ оксиагина методом ДСН-ПАГЭ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях показал, что он содержит единственную гликозилированную полипептидную цепь с молекулярной массой около 50 кДа. MALDI-MC дала величину 49.7 кДа (рис. 5, вставка). Анализ углеводного состава показал присутствие галактозы, N-ацетилглюкозамина, фукозы и маннозы в молярном соотношении 2:2:1:5, характеризующим углеводную часть молекулы как N-гликан сложного типа. Видимо, гликан совершенно необходим очищенному белку для поддержания его в растворимом состоянии, поскольку при добавлении PNG-F в отсутствие детергента белок полностью и довольно быстро выпадает в осадок вне зависимости от рН раствора.

N-концевые последовательности пиридилэтилированного белка и некоторых фрагментов его расщепления бромцианом были определены деградацией по Эдману. Сравнение установленных последовательностей с таковыми известных белков показало, что наш белок имеет выраженное сходство с репролизинами из ядов змей, которых на основании данных по первичной структуре относят к металлопротеиназам (рис. 12). N-концевая последовательность оксиагина соответствует N-концевой последовательности металлопротеазного домена репролизинов (особенно велико сходство с мокархагином из яда кобры N. mossambica). Один из бромциановых фрагментов оказался гомологичен части С-концевой области богатых цистеином доменов мокархагина и каоутиагина из яда N. kaouthia. Эти два белка имеют металлопротеиназный, дизинтегрин-подобный и богатый цистеином домекы и, таким образом, относятся к репролизинам класса Р-Ш [Bjarnason and Fox 1995]. Длина полипептидной цепи оксиагина сопоставима с длиной полипептидных цепей зрелого мокархагина и каоутиагина, а гомология с этими белками как в N-, так и в С-концевой области позволяет рассматривать его как репролизин класса Р-Ш. Однако для двух бромциановых фрагментов оксиагина не удалось установить гомологичные участки ни в одной из известных последовательностей металлопротеиназ. Вероятно, оксиагин является новым структурным аналогом репротизинов класса Р-Ш.

Для ряда репролизинов (например, ТRO42138, TrQ9PT47-50) протеолитическая активность не установлена. С использованием некоторых обычных субстратах протеиназ (фибриноген, -казеин, гемоглобин, миоглобин, ферритин, химотрипсиноген и мелиттин) для оксиагина также не удалось обнаружить протеолитическую активность.

Оксиагин обладал способностью эффективно ингибировать активацию системы комплемента сыворотки крови по классическому пути. Для установления механизма антикомплементарного действия оксиагина мы (в совместной работе с к.х.н. Б.Б. Шойбоновым) использовали метод, основанный на лизисе эритроцитов барана сывороткой

Белок

Фрагмент Аминокислотная последовательность Идентичность, %

Оксиагин

Мокархагин 1 ,прдш. Мокархагин, N-фр. Каоутиагин Кобрин, предш. МП, 451, предш. МД-подобн. белок Беритрактиваза МП, 400 МП, 230

.Ярарагин, предш. МП, 604, предш.

1-22 Т N Т р Е Q Q С Y L Q A - К С Y I E F Y V V V -

192-213 Т N Т р Е Q 0 R Y L Q A К К • Y I E F Y V V V 86

. 1-22 т К С р Е L 1 P Y L Q - к К С Y I E F Y V V V 73

1-22 т N т р Е Q D R Y L Q A E к - Y I E F Y V I V 78

180-201 т N т р Е Q D R Y L Q A E к - Y I E F Y V V V 78

29-48 т р Е Q D R Y L Q A P к - Y I E F Y V V V 76

188-206 т р Е Q Q А Y L D A К к - Y V E F - V V V 75

189-207 т р Е Q Q А Y L D A К к - Y V E F - V V V 75

1-16 Е - - R Y L Q A P к - Y I E F V V V V 68

10-31 т Т т т Е Q D S Y L к A P к - Y I E F Y V V V 65

149-167 т А Е Q Q R Y - D P Y к - Y I E F F V V V 65

186-207 т N т S А Q D R Y L H S К к - Y I E F V V V V 63

Белок Фрагмент Аминокислотная последовательность Идентичность. %

Оксиагин (М) D Е PGTKCG -

каоутиагин 376-384 MAEPGTKCG 89

Мокархагин!, предш. 588-596 М VA PGTKCG 78

Мокархагин (N-концевая последовательность, TrQ10749, и предшественник-1, TrQ8JGNl) из яда кобры Naja mossambica mossambica; каоутиагин (SpP82942) из яда Naja kaouthia\ предшественник кобрина (TrQ9PVK7) из яда Naja naja; предшественники металлопротеиназ (МП) длиной в 451 (TrQ9PT49) и 604 аминокислотных остатка (TrQ9PT48), и металлопротеиназы длиной в 230 (TrQ9PT50) и 400 аминокислотных остатков (TrQ9PT47) из яда Atractaspis engaddensis; металлопротеиназо-дизинтегрин-подобный белок (ТЮ42138) из яда Agkistrodon contortrix laticinctus; беритрактиваза (TrQ8UVG0) из яда Bothrops erythromelas, предшественник ярарагина (SpP30431) из яда Bothrops jararaca.

Рисунок 12. Сравнение фрагментов аминокислотных последовательностей оксиагина и репролизинов змей. Остатки, совпадающие в последовательностях оксиагина и любого другого репролизина, выделены жирным шрифтом.

крови морской свинки. Было выявлено, что оксиагин ингибирует классический путь активации системы комплемента дозо-зависимым образом. Эта его способность снижалась после предварительной 30-минутной инкубации с сывороткой, что может объясняться медленной инактивацией оксиагина некоторыми компонентами сыворотки (например, при связывании с иммуноглобулинами). Эритроциты барана, сенсибилизированные иммуноглобулинами кролика, (ЕЛ) инкубировались с оксиагином и затем центрифугированием отделялись от избытка оксиагина. После ресуспендирования осадка в литической системе наблюдался ингибирующий эффект оксиагина, лишь слегка сниженный центрифугированием, а также гемагглютинация. Это означает, что оксиагин первоначально связывается с ЕА, а не с компонентами комплемента

Оксиагин в значительной мере ингибироват функционирование ЕАС4Ь (комплекса ЕА с активированным компонентом комплемента С4) и в некоторой степени - формирование

EAC4b. Это означает, что оксиагин практически не влияет на инициирующие стадии процесса, т.е. не затрагивает активацию компонента С1.

Количество СЗ-конвертазы ЕАС4b2а, сформировавшейся во время инкубации ЕАС4Ь с сывороткой, дефицитной по компоненту СЗ, в присутствии №02, зависит от концентрации оксиагина в смеси (рис. 13-а, колонка 1) В то же время добавление оксиагина (до 0.2 мкМ) к уже сформированной и стабилизированной ионами никеля СЗ-конвертазе не влияло на её активность (рис. 13-а, колонка 2). Следовательно, оксиагин не влияет на последующие стадии каскада активации комплемента.

а) б)

Рисунок 13. Ингибирование комплемента под действием оксиагина: а) - влияние оксиагина на формирование и функционирование СЗ-конвертазы, стабилизированной ионами никеля: колонка 1 - оксиагин присутствует при образовании СЗ-конвертазы; колонка 2 - оксиагин добавлен после формирования СЗ-конвертазы; б) - ингибирование оксиагином связывания компонента С2 с комплексом ЕАС4Ь

Ингибирование формирования СЗ-конвертазы вероятно происходит на стадии связывания компонента С2 с комплексом ЕАС4Ь. После осаждения центрифугированием комплекса ЕАС4b2а (СЗ-конвертазы), сформировавшегося в присутствии оксиагина, в супернатанте было определено количество активного не связавшегося С2 с использованием отдельной гемолитической системы с сывороткой, дефицитной по компоненту С2. Оксиагин ингибировал связывание С2 с ЕАС4Ь с ГС50 4 мкг/мл (80 нМ) (рис. 13-6). То, что мы наблюдали повышающийся уровень активного С2 в супернатанте при повышении концентрации оксиагина, говорит скорее о появлении стерических или конформашюнных препятствий для связывания компонента С2, чем о его ферментативной инактивации.

Оксиагин (в концентрации 1.2 мкМ) вызывал гемагглютинацию эритроцитов кролика, барана (0.6 мкМ) и ЕА (0.15 мкМ). Эти данные подтверждают прямое взаимодействие оксиагина с поверхностью эритроцитов, более сильное в случае ЕА, т.е. в присутствии иммуноглобулинов. Важно также то, что оксиагин в концентрациях до 1.2 мкМ не влияет на

активацию комплемента по альтернативному пути, т.е. для проявления своего эффекта ему требуется активация классического пути с участием антител.

Обобщая изложенные данные, можно сделать вывод: новый репролизин из яда кобры ингибирует активацию системы комплемента по классическому пути, связываясь с иммуноглобулинами в составе ЕА в тесной близости от места посадки компонента С4Ь и вызывая этим стерические или конформационные препятствия для последующего связывания и активации компонента С2. Впервые доказано, что репролизины яда кобр могут ингибировать систему комплемента.

6. CVF из яда N. melanoleuca

Анализ фракций I ядов N. kaouthia и N. melanoleuca методом ДСН-ПАГЭ показал, что фракция 5 яда N. kaouthia (Ik-5, рис. 4-а) и две фракции - 3 и 4 яда N. melanoleuca (Im-3 и Im-4, рис. 4-6) содержат белки с кажущимися массами 140-150 кДа (ДСН-ПАГЭ в невосстанавливающих условиях), которые в восстанавливающих условиях распадались на три субъединицы с кажущимися массами 65-70, 50 и 28-30 кДа. Эти массы соответствуют а. ß И у-субъединицам охарактеризованных ранее CVF. Окрашивание геля реактивом Шиффа показало, что субъединицы с массами 70 и 50 кДа гликозилированы (рис. 14). С помощью MALDI-MC удаюсь установить молекулярные массы целых молекул. Они оказались равны 147.4 кДа для Ik-5,142.6 кДа для Im-З и 143.1 кДа для Im-4. Выход белков составил 0.6% для Im-З и 0.2% для Im-4.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

116 _

67 _

45 „

35 , 25 18

«а» щ

50

Рисунок 14. ДСН-ПАГЭ фракций 1к-5 яда N. каоиМа (дорожки 3 и 8), 1ш-3 (дорожки 4 и 7) и 1т-4 (дорожки 5 и 6) яда N. Ме!апо1еиса, в восстанавливающих условиях. Левая половина геля (дорожки 1-5) окрашена кумасси-синим 11-250, правая половина (дорожки 6-9) -реактивом Шиффа. Дорожка 1 -молекулярные маркеры (мол. вес в кДа указан на полях геля). В качестве углевод-содержащего маркера использован оксиагин (дорожки 2 и 9).

Биологическая активность каждой из выделенных форм CVF яда N. melanoleuca проверялась в опытах in vivo и in vitro в сравнении с хорошо охарактеризованным CVF из яда

N, kaouthia. Исследование in vivo показало, что обе формы CVF яда n. melanoleuca истощали содержание компонента СЗ в сыворотке мышей по меньшей мере так же эффективно, как и CVF из яда N. kaouthia. Во всех случаях наблюдалось сильное и примерно равное снижение количества СЗ с самого начала наблюдений (8 ч.), продолжавшееся 4-5 дней. Однако методом иммуноферментного анализа было показано, что в отношении сыворотки человека Im-З превосходит по активности Im-4; при этом обе формы оказались активнее, чем Ik-5, с соотношением уровней активностей 2.5:1.6:1.0. Исследование кинетики истощения комплемента показало, что Im-З действует быстрее, чем Im-4, в среднем в 3.1 раза.

Чтобы установить, определяются ли различия в свойствах белка аминокислотной последовательностью или углеводной частью молекулы, был проведён триптический гидролиз субъединиц Im-З и Im-4 в геле с последующим анализом гидролизатов методом MALDI-MC. Выяснилось, что наборы масс триптических пептидов у-субъединиц этих белков совпадают менее, чем в половине значений, хотя расхождения в наборах масс субъединиц незначительны (однако наборы масс всех субъединиц обеих форм CVFm менее чем на 50% совпадают с наборами масс соответствующих субъединиц CVF из яда N. kaouthia (Q91132), рассчитанными на основании известной аминокислотной последовательности). Поскольку установлено, что CVF может содержать только три или четыре углеводные цепи, а большая доля различий в наборах масс приходится на негликозилированные субъединицы, следует признать, что наблюдаемые различия в свойствах этих белков обусловлены, прежде всего, значительными расхождениями в их первичной структуре.

CVF, идентифицированные к настоящему времени в ядах четырёх видов кобр, выделены каждый как индивидуальный белок. Полученные нами данные означают, что CVF может быть представлен в яде одного вида кобры по меньшей мере двумя структурными формами, различающимися по биологической активности.

Таким образом, использованная в данной работе схема разделения сложных белковых смесей позволила выделить из яда четырех видов кобр ряд малопредставленных белков с новыми элементами структуры. Так, впервые был выделен гликозилированный цитотоксин, присутствующий в яде в существенно меньших количествах, чем «обычный» цитотоксин, впервые обнаружены в ядах кобр белки нового структурного типа (белки семейства CRISP) и белки с новыми биологическими (оксиагин) и структурными (CVF) особенностями.

ВЫВОДЫ

1. С использованием разработанной эффективной схемы идентификации и фракционирования минорных белков из яда кобры N. kaouthia выделен первый гликозилированный токсин трёхпетельного типа. Установление структуры этого токсина показало, что он является цитотоксином 3 из этого же яда, гликозилированным по остатку аспарагина-29, расположенному на окончании центральной петли. Показано, что наличие углеводного остатка в молекуле цитотоксина приводит к снижению его токсичности.

2. Впервые в яде кобры обнаружены белки, принадлежащие к семейству CRISP. Показано, что представители этого семейства присутствуют в ядах кобр в виде набора нескольких нетоксичных гомологов, включающих как основные, так и кислые белки.

3. Из яда кобры N. охiana выделен новый гликопротеин оксиагин - гомолог репролизинов ядов змей, способный ингибировать активацию системы комплемента сыворотки крови по классическому пути. Оксиагин является первым представителем репролизинов ядов змей, для которого доказана такая активность.

4. Впервые комплемент-активирующий фактор (CVF) выделен из яда кобры N. melanoleuca в виде двух форм, имеющих отличия в физико-химических свойствах и биологической активности.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Osipov A.V., Astapova M.V., Tsetlin V.I., Utkin Yu.N. The first representative of glycosylated three-fingered toxins. Cytotoxin from the Naja kaouthia cobra venom. // Eur. J. Biochem. -2004.-V. 271.-P. 2018-2027.

2. Osipov A.V., Starkov V.G., Utkin Yu.N. Toxicity of cobra venom components to cockroach Gromphadorhina portentosa. // Toxicon. - 2002. - V. 40. - P. 1507-1509.

3. Осипов A.B., Вайзе К., Франке П., Кухтина В.В., Фрингс С, Хухо Ф., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. Яд кобры содержит белок CRISP-типа. // Биоорганическая химия. - 2001. • №27.-с. 224-226.

4. Кухтина В.В., Вайзе К., Осипов А.В., Старков В.Г., Титов М.И., Есипов С.Е., Овчинникова Т.В., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. MALDI-масс-спектрометрия для идентификации новых белков в яде змей. // Биоорганическая химия. - 2000. - № 26. - с. 803-807.

5. Уткин Ю.Н., Шойбонов Б.Б., Зинченко А.А., Осипов А.В., Мордвинцев Д.Ю., Галебская Л.В., Рюмина Е.В., Дайя С, Цетлин В.И. Новые гликопротеины яда кобр для иммунологических исследований. Тезисы докладов XI международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Ялта-Гурзуф, 2003, с.344-345.

6. Уткин Ю.Н.. Коротана А.С., Азеева ЕА., Евдокимова Е.Г., Осипов А.В., Мурашев А.Н., Цетлин В.И. Возможности применения компонентов змеиных ядов в создании новых лекарственных препаратов. Тезисы докладов X международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии», Ялта-Гурзуф, 2002, с.347-348.

7. Kukhtina V., Osipov A., Weise С, Franke P., Frings S., Hucho F., Tsetlin V., Utkin Yu. Cobra venom contains protein of CRISP family. Journal of Neurochemistry, 2001, vol.32, suppl.1, p.172.

8. Уткин Ю.Н., Осипов А.В., Вайзе К., Старков В.Г., Цетлин В.И, Яды кобр содержат белки семейства CRISP. Тезисы докладов Ш съезда Биохимического Общества, Санкт-Петербург, 2002, с.383.

9. Utkin Yu., Kukhtina V., Weise 1С, Gillen С, Osipov A., Tsetlin V. New polypeptides from cobra vpnora Abstracts of the XIHth world congress of the International Society on Toxinology. Toxins from animals, plants and microbes. Paris, 2000, p. 164.

10. Уткин Ю.Н., Кухтина В.В., Осипов А.В., Старков В.Г., Цетлин В.И. Новые полипептиды из яда кобры. Тезисы докладов V чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, «Биоорганика-2000», Москва-Пущино, 2000, с.9.

Принято к исполнению 06/05/2004 Исполнено 07/05/2004

Заказ № 174 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

»-8481

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.:.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Минорные компоненты яда кобр.

1. Введение.

2. Нейротоксины.

3. Ферменты.

3.1. Оксидаза L-аминокислот.

3.2. Нуклеазы.

3.3. Гиалуронидаза.

3.4. Ацетилхолинэстераза.

3.5. Прочие гидролазы.

4. Ингибиторы ферментов.

5. Вещества, изменяющие показатели свёртываемости крови.

6. Вещества, влияющие на систему комплемента сыворотки крови.

6.1. Фактор яда кобры.

6.2. Другие полипептиды, влияющие на систему комплемента.

7. Полипептидные соединения с иной функцией.

7.1. Фактор роста нервов.

7.2. Белки семейства CRISP.

7.3. Олигопептиды и муцин-подобный гликопротеин.

8. Соединения непептидной природы.

Яды змей представляют собой сложные многокомпонентные смеси с подавляющим доминированием белков. Разные белки присутствуют в неодинаковых количествах и обладают разнонаправленным биологическим действием. Наиболее обильно представлены в ядах кобр высокотоксичные а-нейротоксины, цитотоксины и фосфолипазы А2. К настоящему времени их структура и механизм действия, в целом схожие внутри каждой группы, достаточно подробно изучены. Они широко используются как инструменты для биохимических исследований; в частности, благодаря а-нейротоксинам был выделен и охарактеризован никотиновый ацетилхолиновый рецептор (н-АХР), являющийся ключевым звеном механизма быстрой передачи нервного импульса.Цитотоксины и фосфолипазы А2 повреждают мембраны клеток, не проявляя при этом выраженной селективности. По видимому, все их системные эффекты имеют в своей основе именно этот механизм.Однако яд кобр содержит множество менее представленных (минорных) компонентов различных структурных типов, охватывающих значительно больший спектр биологических активностей, при этом зачастую на порядки менее токсичных. Многие из них обладают подчас уникальньпи набором фармакологических эффектов.К настоящему времени среди таких малопредставленных соединений обнаружены белки, воздействующие на различные функциональные системы организма животных. Так, в частности, в ядах кобр идентифицированы белки, влияющие на рост и дифференцировку нейронов (например, фактор роста нервов), систему комплемента сьшоротки крови (фактор яда кобры), систему свёртьшания крови (различные факторы с про- и антикоагулянтной активностью), на мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, опиоидные рецепторы, клеточную адгезию, репродуктивную систему и многое другое, а также разнообразные ферменты и ингибиторы ферментов.Благодаря своим уникальным свойствам такие соединения всё более интенсивно применяются как инструменты для исследования биологических процессов в норме и патологии, особенно в силу того, что их, как правило, низкая токсичность позволяет использовать их не только in vitro.В лаборатории рецепции нейропептидов в течение последних лет проводится исследование низкопредставленных компонентов ядов кобр. Настоящая диссертационная работа выполнена в рамках этого исследования. Цель данной работы - идентификация и вьщеление из яда кобр новых минорных белковых компонентов с необычными структурными рши функциональными свойствами, которые могут быть использованы в качестве селективных и низкотоксичных инструментов для биохимических исследований.Сочетание методов классической и высокоэффективной жидкостной хроматографии и MALDI-масс-спектрометрии позволило сравнительно легко идентифицировать и отделить новые соединения яда от уже известных.В результате выполнения работы из яда кобры Naja kaouthia был выделен гликозилированный цитотоксин - первый гликозилированный представитель семейства трёхпетельных токсинов, установлены его первичная структура, участок и тип гликозилирования, а также влияние гликозилирования на некоторые свойства цитотоксина. Впервые в ядах кобр обнаружен белок семейства CRISP (Cysteine-rich secretory proteins — секреторные белки с высоким содержанием цистеина); показано, что в ядах кобр Naja kaouthia и Naja haje белки этого семейства представлены в виде набора нескольких нетоксичных гомологов. На примере нового гликопротеина из яда кобры Naja oxiana была впервые продемонстрирована способность репролизинов яда кобр ингибировать систему комплемента сыворотки крови. Фактор яда кобры (CVF) впервые выделен из яда кобры Naja melanoleuca в виде двух форм, различающихся по активности.ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР МИНОРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ЯДА КОБР 1. Введение Яд кобр много лет успешно используется в качестве как лекарственного вещества [1, 2], в том числе в гомеопатии [3], так и источника инструментов для биохимических исследований (например, [4 - 6] и др.). Фармакологические свойства яда разнообразны, что отражает сложность его состава Яды змей представляют собой многокомпонентные смеси с подавляющим преобладанием (90-95%) веществ пептидной природы, которьш1и и обусловлены основные эффекты яда [7]. В состав яда кобр входят как высокотоксичные полипептиды, так и вещества с низкой токсичностью.Высокотоксичными являются цитотоксины, а также а-нейротоксины (для хордовых, за исключением мангустов и самих кобр [8]); эти соединения относятся к обширной группе «трёхпетельных» токсинов [9]. Другую группу соединений яда кобр, которые, как правило, тоже высокотоксичны, составляют фосфолипазы А2. Полипептиды указанных структурных типов содержатся в яде в значительных количествах (например, доля а-кобратоксина в сухом яде таиландской кобры доходит до 25%, около 40% от массы сухого яда кобр рода Naja составляют цитотоксины). Эти вещества структурно и функционально наиболее полно охарактеризованы.Низкотоксичные соединения содержатся в яде кобр в небольших количествах, в большинстве случаев не превышающих 1%; об их свойствах известно, как правило, гораздо меньше. Однако их структура намного более разнообразна, а спектр биологических активностей чрезвычайно широк. Нельзя исключить, что ими обусловлены, по крайней мере, некоторые целебные свойства яда. Недаром ведь нашли применение in vivo в практике клинических исследований именно нетоксичные по сути т. наз. фактор яда кобры (правда, пока только на животных - [6, 10, 11]) и фактор роста нервов (уже и на добровольцах — [12]), К тому же, хотя основные фармакологические свойства ядов определяются спецификой действия входящих в их состав мажорных токсических полипептидов, малопредставленные соединения, малотоксичные сами по себе, могут действовать синергично с токсинами, потенцируя или модулируя их эффекты [7,13-15].Поэтому в рамках настоящего обзора будут рассмотрены малопредставленные (минорные) белковые соединения яда кобр. Для полноты охвата будут рассмотрены компоненты ядов как рода Naja (собственно кобры), так и родов Ophiophagus (королевская кобра), Waltherinnesia (пустынная кобра) и Hemashatus семейства Elapidae.Понятие «минорности» компонента в некоторой степени произвольно. Поэтому при выборе объектов для подробного описания использовался следующий критерий: компонент не считался минорным, если его содержание в яде или выход при выделении (включая изоформы и близкие гомологи того же структурного типа с таким же спектром активности) превьппает 4% от массы сухого яда. Впрочем, там, где это требуется для целостности картины, основные и высокотоксичные соединения тоже вскользь упоминаются.Довольно сложно предложить структурную классификацию для всех минорных компонентов яда кобр. Поскольку для многих из них информация по структуре крайне скупа, то, в рамках задач настоящего обзора, удобнее пользоваться классификацией, основанной прежде всего на биологических свойствах рассматриваемых веществ, останавливаясь на структурных особенностях соединений внутри каждой группы.2. Нейротоксины Токсины яда кобр разделяются на две большие функциональные группы: цитотоксины и нейротоксины. Цитотоксины повреждают ткани путём лизиса клеток [14].Нейротоксины нарушают передачу нервного импульса. Постсинаптические нейротоксины (а-нейротоксины) связываются подобно а-тубокурарину с никотиновьпи ацетилхолиновым рецептором (н-АХР) постсинаптической мембраны нервно-мышечного синапса, при этом блокируют участки связывания ацетилхолина и посредством этого предотвращают деполяризующее действие медиатора на мембрану [16]. к-Нейротоксины блокируют нейрональный н-АХР [17]. В целом, эти группы соединений нельзя назвать ни низкотоксичными, ни малопредставленными.Характерная особенность строения токсинов кобр - «трёхпетельная структура», заключающаяся в наличии трёх полипептидных петель, выступающих из гидрофобной сердцевины и ограниченных дисульфидными связями, стабилизирующих молекулу в активной конформации: их восстановление полностью устраняет токсический эффект полипептида. Аминокислотньпии остатками, важньпк1и для поддержания третичной структуры, считаются, кроме цистеина, Туг25, Gly40 и Рго44 (в нумерации эрабутоксина Ь) [18]. По структуре а-нейротоксины кобр делятся на два основных типа: короткие (тип I), состоящие из 60-62 аминокислотных остатков и имеющие 4 внутримолекулярных дисульфидных связи, и длинные (тип II) нейротоксины, состоящие из 66-74 остатков и имеющие пятую дисульфидную связь в средней петле II [9,16].К «промежуточным» типам с «трёхпетельной» структурой, но с относительно невысокой токсичностью можно отнести: мускариновые токсины (состоят из 65-66 остатков, но имеют 4 дисульфидных связи) [19] и «слабые токсины» (состоят из 62-68 остатков, но пятую дисульфидную связь имеют в N-концевой петле I) [20].Мускариновые токсины, впервые выделенные из яда мамб, обладают высоким сродством к мускариновому ацетилхолиновому рецептору (м-АХР). Большинство аминокислот, инвариантных в мускариновых токсинах, инвариантно или высококонсервативно в других трёхпетельных токсинах, и только ТугЗО уникален для них [15]. Селективность определяется участками 28-30 и 31-33. Для токсинов МТ1 и МТ2 из яда мамбы D. angusticeps установлено, что иодирование, предположительно по ТугЗО, приводит к повышению селективности [21]. Единственный мускариновый токсин, для которого установлена пространственная структура методами двумерной спектроскопии ядерного магнитного резонанса и молекулярного моделирования — токсин МТ2 [22] (рис.1-а). Он имеет особенности, не встречающиеся у других «трёхпетельных» токсинов с установленной пространственной структурой: характерный изгиб петли I, образованные трехтяжевым Р-слоем два гидрофобных кластера (вокруг Phe25 на одной поверхности петли П и около Тф28 на противоположной поверхности этой петли) и выстроенных в ряд через петли II и III основных аминокислот (Lys26, 40, 48 и Arg56). И, наконец, петля II между остатками Cys24 и Cys42 содержит 17 аминокислот (в других токсинах 16), что приводит к её закручиванию. На её узком окончании сильно выдаётся вперёд Lys34 (у MLTP-2 и некоторых других здесь - Arg), занимающий удобное положение для проникновения в щель между трансмембранными доменами м-АХР и связьюания с консервативным остатком Asp на её дне [15,22].Из яда кобры N. kaouthia выделено 3 полипептида (MLTP-1-3), имеющих наибольшее сходство в аминокислотной последовательности (до 73%) с мускариновыми токсинами мамб. MTLP-1 (выход 0.2% от массы яда) связывается in vitro с невысоким сродством со всеми подтипами м-АХР, предпочитая м1-подтип. Для MTLP-2 и -3 активность не установлена (выход 0.2% и 0.02%, соответственно) [23]. Исследование их токсичности не проводилось,но мускариновые токсины мамб не считаются токсичньп г^а [15]. а) К48 К34 б) Рисунок 1. Схема укладки полипептидной цепи трёхпетельных токсинов: а) мускариновых токсинов, основанная на структуре МТ2 в растворе [22]; б) - слабых токсинов кобры, основанная на кристаллической структуре слабого токсина кандоксина [24]. Чёрными линиями обозначены дисульфидные связи; I-III - петли, ограниченные дисульфидными связями. Стрелкой указана пятая дисульфидная связь.Слабые токсины получили такое название ввиду более низкой токсичности по сравнению с а-нейротоксинами (LDso 5-80 и более мг/кг против 0.04 - 0.3 мг/кг). В аминокислотной последовательности слабых токсинов присутствуют некоторые аминокислотные остатки, важные для их связывания с н-АХР как мышечного типа, так и а7 типа. Например, WTX из яда Л^ . kaouthia содержит Lys27 и Lys47 для узнавания мышечного и Arg37 для узнавания обоих типов рецептора. Поэтому слабые токсины способны к слабому связьгаанию (полипептид Wntx-5, химически синтезированный по аминокислотной последовательности, выведенной из к-ДНК ядовитых желёз N. sputatrix) и ингибированию (WTX) этих типов н-АХР. Слабый токсин NNA2 из яда кобры N. atra ингибирует сокращения мьппцы лягушки, вызываемые ацетилхолином. Остатки, важные для поддержания третичной структуры, консервативны у всех слабых токсинов кобр (однако Туг25 заменён на Phe) [20]. Пространственная структура слабых токсинов к настоящему времени установлена для таковых из яда крайтов. Один из наиболее токсичных слабых токсинов, кандоксин из яда крайта Bungarus candidus (LD50 0.83 мг/кг), имеет на гомологичных позициях ряд аминокислотных остатков, существенных для связывания н-АХР мьппечного типа aiPyS (Тгр31, Arg35, Gly36, Arg38, Glu40, a также Lys28 и Lys47) (рис. 1-6). Данные КД (кругового дихроизма) и компьютерное моделирование показали, что для NNA2 нехарактерно такое большое количество Р-слоёв, как для коротких и длинных нейротоксинов. Предполагается, что такая менее организованная структура приводит к снижению активности [25]. В целом, однако, принято считать, что действительная молекулярная мишень слабых токсинов ещё не установлена [20].Существуют ли нейротоксины, воздействующие на адренэргическую иннервацию, точно не установлено. Во всяком случае, внутривенное введение нейротоксической фракции яда египетской кобры N. haje вьпьгеает у кроликов повышение концентрации в крови кортизола и инсулина, падение уровня адренокортикотропного гормона, общего содержания липидов, триацилглицеридов, жирных кислот и гипергликемию, связанную с гликогенолизом в печени и почках. Эти эффекты позволяют предполагать, что данная фракция воздействует на адренокортикальные клетки, модулирующие содержание в крови инсулина и глюкозы при стрессе [26].Интересное соединение обнаружено в яде королевской кобры (Ophiophagus hannah): а-нейротоксин, названный ганнальгезин, в дозе 16-32 нг/г массы тела оказьгаал анальгетический эффект, который блокировался налоксоном и L-NGнитроаргинилметиловым эфиром, что позволяет предположить вовлечение в действие ганнальгезина опиоидных рецепторов и системы оксида азота, соответственно.Неврологических и мьппечных эффектов в указанных дозах он не вызывал, имея LDso 80 нг/г внутрибрюшинно [27].3. Ферменты Проведённое сравнительное исследование ядов девяти видов кобр рода Naja обнаружило в них фосфолипазу А2, оксидазу L-аминокислот, 5'-нуклеотидазу и щелочную фосфомоноэстеразу, присутствующие в нескольких изоформах; кроме этого, были выявлены следующие ферментные активности: гиалуронидазная, ацетилхолинэстеразная, фосфодиэстеразная и протеазная [28]. Были продемонстрированы межвидовые различия в содержании в ядах фосфолипазы А2, ацетилхолинэстеразы, гиалуронидазы и фосфодиэстеразы. При изучении яда королевской кобры Ophiophagus hannah, был установлен в нём очень высокий (более чем на порядок в сравнении с ядами других змей) уровень активности щелочной фосфомоноэстеразы. Высокомолекулярная фракция (свьппе 20 кДа) содержит 58% белка яда (у кобр рода Naja — менее 25%) и отвечает практически за всю его ферментативную активность, исключая фосфолипазную, будучи при этом нетоксичной для мьппей в дозах до 5 цг/г внутривенно (в/в) (LDso нейротоксической фракции 0.23 цг/г в/в) [29].Определение токсичности фракций яда N. oxiana на мьш1ах показало, что нетоксичными являются фракции, отвечающие за холинэстеразную, гиалуронидазную и АТФ-пирофосфатазную активность яда, а также одна из двух фракций с фосфолипазной активностью [30].Наиболее полно охарактеризованными ферментами яда кобр являются фосфолипазы А2 (ФЛА2), катализирующих гидролиз фосфолипидов клеточных мембран.ФЛА2 обильно представлены, с преобладанием высокотоксичных изоформ, в ядах различных видов кобр. На этом основании они в настоящем обзоре не рассматриваются.3.1. Оксидаза L-аминокислот Оксидаза L-аминокислот (OLAA) переводит L-a-аминокислоты в а-кетокислоты путём окислительного дезаминирования; не проявляя строгой специфичности, она наиболее активна (в целом для всех ядов змей) в отношении, как правило, гидрофобных L-аминокислот, Но, например, описано, что LAAO из яда королевской кобры Ophiophagus Hannah дезаминирует также лизин и орнитин [31], а для OLAA из яда кобры N. kaouthia наилучшими субстратами являются L-фенилаланин и L-тирозин, в меньшей степени - триптофан, метионин, лейцин и аргинин [32]. Глутаминовая и аспарагиновая кислоты, глутамин и аспарагин всегда устойчивы к действию этого фермента Продуктами реакции также являются водорода пероксид и аммиак [31]. OLAA яда змей может обладать и другими свойствами: ингибировать (как OLAA из яда Naja kaouthia) или активировать агрегацию тромбоцитов, вызьшать апоптоз, эдему, кровотечение, иметь бактерицидное и противопаразитарное действие. Все эффекты связываются с продукцией пероксида водорода. Для OLAA королевской кобры показана цитотоксичность, для OLAA N. kaouthia - нет [31].В частности, OLAA королевской кобры обладает следующими свойствами: 1) в дозе 200 мкг/мл сьшоротки крови человека активирует агрегацию тромбоцитов, не затрагивая тромбиновое время; агрегация предупреждается каталазой (т.е. опосредуется пероксидом водорода, образующимся в процессе окислительного дезаминирования аминокислот) и ингибируется индометацином, ЭДТА, верапамилом (т. е. требует присутствия ионов кальция), а также аспирином и простагландином Е1, но не гепарином или гирудином (т. е. идёт через образование тромбоксана А2) [33]; 2) на клеточных линиях рака рта, меланомы, фибросаркомы и колоректального рака снижает свойства адгезии клеток и ингибирует (на 74%) их пролиферацию. Предполагаемым механизмом такого воздействия является ингибирование включения тимидина в нуклеиновые кислоты и взаимодействие фермента с ДНК [34]. Возможно, авторы в указанных случаях описали два изоэнзима OLAA, поскольку их молекулярные массы оказались различны при одинаковых методах определения (соответственно 135 и 150 Ша для димера согласно данным гель-фильтрации и 65 и 70 kDa для мономера, исходя из электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия). OLAA содержит в качестве кофермента флавинаденин-динуклеотид (ФАД), благодаря чему яд, в состав которого входит этот фермент, окрашен в жёлтый цвет. У кобр его содержание низко (за исключением королевской кобры), и сухой яд кобры имеет лишь лёгкий желтоватый оттенок. OLAA - гликопротеин-гомодимер в нековалентной ассоциации с молекулярной массой 110-150 кДа. Изоэлектрическая точка может существенно варьировать (от 4.4 до 8.12) у изоформ в яде даже одного вида. Неизвестно, отражает ли это различия в фармакологических свойствах.Из к-ДНК вьшедены аминокислотные последовательности 4-х OLAA. Они сходны между собой, но имеют сходство с другими ФАД-содержащими ферментами только в области ФАД-связывающего участка.Каждая субъединица OLAA змей состоит из трех доменов: ФАД-связьшающего, субстрат-связывающего и спирального. В димере последние два образуют воронку для прохода субстрата к активному участку. Пространственная структура OLAA яда змей похожа на таковую оксидазы D-аминокислот свиньи, в особенности в ФАД-связывающем домене [31].3.2. Нуклеазы Кроме упомянутой выше 5'-нуклеотидазы (отщепляющей остаток фосфорной кислоты от нуклеотидов, особенно - рибозилмонофосфатов, и наиболее активной в отношении 5'-АМР), а также экзонуклеаз — рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы [35], яд кобр содержит эндонуклеазы различной специфичности. Например, эндонуклеаза яда Naja oxiana (основный белок мол. массой 15,9 кДа) гидролизует полирибонуклеотиды до олигонуклеотидов с концевым 5'-фосфатом, не проявляя специфичности к основаниям [36]. В яде Naja naja выявлена рибонуклеаза (кислый белок с мол. массой до 20 кДа), специфически гидролизующая полирибозилцитидиловую кислоту; для успешного функционирования ей необходимы, как и другим рибонуклеазам, ионы магния [37].Другая эндонуклеаза из яда N. oxiana, названная VI, гидролизует двойные спирали нуклеиновых кислот: установлено, что спиральные ДЬЖ и РНК имеют константу Михаэлиса для VI в 3-10 раз ниже, чем одноцепочечная РНК. VI распознаёт сегмент в 46 нуклеотидов со спиральной конформацией, но не требует строгого спаривания оснований в спирали (что показано при расщеплении фенилаланиновой т-РНК дрожжей).Она также нуждается в присутствии определённых концентраций ионов магния и натрия [38]. Содержание нуклеаз в яде невелико. Структурная характеристика их бедна: лишь в 2000 г. появилось указание, что рибонуклеаза яда кобры имеет в N-концевой последовательности гомологию с фосфолипазами, хотя фосфолипазной активностью не обладает. Иммунологачески показано, что фермент разделяет антигенные участки с РНКазой А [39].3.3. Гиалуронидаза Этот фермент присутствует во многих животных ядах. Гиалуроновая кислота, мукополисахарид, представленный в коже, суставах, соединительной ткани, способствует межклеточной адгезии. Гидролиз гиалуроновой кислоты облегчает диффузию токсинов по тканям жертвы. Гиалуронидазы яда змей расщепляют гиалуроновую кислоту до тетрасахарида как основного продукта и, кроме этого, гидролизуют хондроитинсульфат [40]. Для кобры показано, что степень токсичности яда зависит от присутствия гиалуронидазной активности [35]. Различие в степени активности гиалуронидазы в ядах разных видов кобр более чем 70-кратное. В яде королевской кобры эта активность свойственна высокомолекулярной и основной фракциям [29]. В яде N oxiana она определена в нетоксичной и самой основной фракции X, дальнейшее разделение которой привело к получению двух белковых фракций (возможно, субъединиц) с суммарной удельной активностью, составляющей около 6% от активности X [30]. Структурные данные по очищенному ферменту яда кобр отсутствуют.Ацетилхолинэстераза яда Elapidae (мол. масса около 76 кДа) - гидрофильный мономер, может находиться в яде даже одного вида в нескольких изоформах, имеющих слегка отличающиеся изоэлектрические точки [42]. В образовании эстеразного центра участвуют серии и гистидин [41]. Для ацетилхолинэстеразы яда кобры определена аминокислотная последовательность активного участка, располагающаяся вокруг сериновых остатков: —TVTLFGESAGAASVGM--. Фрагмент идентичен таковому из других тканей змеи; гомологичен фрагменту аминокислотной последовательности ацетилхолинэстеразы Torpedo (76% радентичных остатков) и дрозофилы (42%), а также гомологичен фрагменту лизофосфолипазе крыс (42% идентичных остатка) [44].3.5. Прочие гидролазы Протеазы преобладают в ядах змей других семейств, таких, как Crotalidae и Viperidae, но и представители семейства Elapidae тоже активно их секретируют.Иммунологически, аналогичные эстеразы рода NaJa между собой идентичны, но отличны ОТ ядов других змей [16].Яды кобр не содержат карбоксипептидаз [35], но способны гидролизовать ди- и трипептиды, содержащие глицин и неполярные ароматические или алифатические остатки аминокислот, например, AGG и GGF. Такую активность авторы [45] назвали "малопонятной". Она ингибируется бестатином, каптоприлом (ингибитором ангиотензинпревращающего фермента) и хлорометилкетоном. При этом яд тайваньской кобры N. atra, в частности, не активен в отношении эфирных субстратов трипсин- и химотрипсинподобных энзимов.Пептидазы яда кобр могут обладать кооперативнь»! действием. Это было показано на примере гидролиза нейропептида метионил-энкефалина (YGGFM); комбинируя применение ингибиторов (тиорфан и бестатин), авторы работы [46] установили, что олигопептидаза и аминопептидаза яда N. atra, конкурируя за субстрат, в конечном итоге совместно деградируют его до фрагментов GG и FM (отщепляемый тирозин служит субстратом для OLAA). По действию эти олигопептидазы схожи с пептидазами созревания энкефалина в нормальных услобиях [46].Аргининэстергидролаза, биологический эффект которой проявляется в высвобождении брадикинина, из всего семейства Elapidae обнаружена только в яде королевской кобры [35] и содержится в высокомолекулярной и одной из кислых фракций яда [28].В ядах кобр, видимо, присутствуют и другие эстеразы, биохимическая функция которых не ясна. Однако в них не выявлены кининазная (т. е. кинин-деградирующая), кининогеназная и тирозинэстеразная активности, характерные для змей семейств Crotalidae и Viperidae [47], так же, как и ферменты коллагеназа и эластаза [35]. Однако появилось сообщение о том, что кининазо-подобную активность проявляет яд среднеазиатской кобры {N. oxiana), причём его низкомолекулярная фракция [48], для которой энзиматическая активность, как правило, не характерна.Из прочих ферментов в яде кобры присутствует лактатдегидрогеназа и, возможно, согласно активности неразделённого яда, глутамат-пируваттрансаминаза [35].Больппгаство гидролаз яда кобр структурно не охарактеризовано.Ряд протеиназ яда кобр влияет на систему свёртьгеания крови; эти соединения подробно рассмотрены в разделе 5.4. Ингибиторы ферментов Из яда кобр выделены ингибиторы сериновых протеиназ, относящиеся к Куниц/БПТИ (бычий панкреатический ингибитор трипсина) семейству ингибиторов, широко распространённому в животных организмах. Они характеризуются консервативной укладкой полипептидной цепи (приблизительно из 60 аминокислотных остатков), стабилизированной тремя дисульфидными связями. Филогенетически, нетоксичные ингибиторы семейства Куниц/БПТИ яда змей родственны нейротоксинам дендротоксинам (яды мамб) и В-цепи Р-бунгаротоксинов (яды крайтов), блокаторам калиевых и кальциевых каналов, утратившим ингибиторные свойства [49].Ингибиторы сериновых протеиназ яда кобр состоят из 57 аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу около 6,2 Ша. Ингибитор трипсина из яда кобры N. naja гомологичен (70% идентичных аминокислотных остатков) аналогичному ферменту, выделенному из яда другой кобры, N. nevia, а также ингибитору трипсина из поджелудочной железы быка (42% идентичных остатков) [50, 51].Ингибитор химотрипсина N. naja структурно сходен с ингибитором трипсина, но содержание его в яде значительно ниже [52].Данные соединения содержат немного инвариантных остатков. Однако, как и в случаях полипептидов яда кобр других структурных типов, имеет место строгое расположение остатков цистеина и одинаковое распределение дисульфидных связей (5Ингибитор трипсина [N. naja) Ингибитор химотрипсина {N. naja) Ингибитор п р о т е и н а з {N. nivea) - / / - (Haemachatus haemachatus) RPGFCELPAA KGLC RPGFCELAPS AGSC RPRFCELPAE TGLC RPDFCELPAE TGLC KA FG KA KA RIRS FVSS RIRS RIRS FYYNKDSHRC YYYNRYSNTC FHYNRAAQQC FHYNXAAQQC 40 50 QKF1YGGCGG NANRFRTIDE HSFTYSGCGK NANRFRTIDE LBFIYGGCGG NANRFKTIDE LQFIYGGCGG NANRFKTIDE CNRTCVG (-0H) [52] CNRTCVV (-0H) [53] CHRTCVG (-0H) [54] CRRTCV6 (-0H) [54] о Рисунок 2. Аминокислотная последовательность четырёх ингибиторов сериновых протеиназ из ядов кобр. Остатки цистеина, участвующие в формировании дисульфидных связей, подчёркнуты. Вариабельные остатки выделены полужирным курсивом.Активный участок помещён в рамку.55, 14-38, 30-51). У нетоксичных ингибиторов семейства Куниц/БПТИ змей более консервативна сердцевина молекулы и N-концевая последовательность, но не область активного участка [49].Приведённые на рисунке 2 ингибиторы сериновых протеиназ имеют активный участок в положении 15-16, образованный остатками лизина и аланина, за исключением ингибитора химотрипсина, у которого его образуют Phe-Gly. Полагают, что Phe-15 главного контактного участка с протеазой обусловливает специфичность ингибитора в отношении химотрипсина [52]. Имеется указание, что для проявления своего действия ингибиторам трипсина и химотрипсина важен Gly-36 [52]; этот остаток консервативен и у двух других ингибиторов сериновых протеиназ яда кобр (рис. 2).Трёхмерная структура определена для ингибитора Куниц/БПТИ из яда Bungarus fasciatus — ингибитора химотрипсина, состоящего из 65 аминокислотных остатков. Она имеет дважды-сложенный антипараллельный р-слой с Р-изгибом Ser27-His30 и Сконцевую а-спираль. В активном участке у данного соединения находится Asnl7, этим объясняют его низкую ингибиторную активность [53].Кобра-цистатин, ингибитор цистеиновой протеиназы, был вьщелен из яда тайваньской кобры N. naja atra [54]. Он представлен двумя формами, имеющими р1 6,2 и 6,1 и молекулярные массы 11,870 и 12,087 Ша, соответственно. Кобра-цистатин гомологичен другим цистатинам (25-40% идентичных остатков), особенно недавно описанному цистатину М человека, имея с ним одинаковую вставку из 5 аминокислотных остатков.Для цельного яда кобры N. oxiana показана антихолинэстеразная активность [30], однако ингибирующая субстанция до сих пор не идентифицирована.5. Вещества, изменяющие показатели свёртываемости крови Вещества, влияющие свёртываемость крови, являются важными составляющими ядов различных змей. При этом, выступая как коагулянты, они могут иметь протромбопластино- или тромбино-подобную активность, активировать фактор X, XI или V, активировать протромбин; как антикоагулянты — могут иметь фибриногенолитическую или фибринолитическую активность, стимулировать высвобождение активатора плазминогена рядом клеток, оказывать ингибирующее или разрушающее действие на любой фактор свёртывания крови, активировать протеин С, ингибировать формирование протромбиназного комплекса. Кроме того, эти соединения могут выступать как индукторы, ингибиторы или усилители агрегации тромбоцитов [55].Не всеми, но некоторыми из этих свойств обладают компоненты яда кобр (рис. 3); подавляющее большинство из них является протеиназами. В литературе они иногда встречаются под названиями, отражающими их физиологическую активность, как, например, активатор фактора X коагуляции крови, вьщеленный из яда королевской кобры (Ophiophagus Hannah). Он не активирует протромбин, не оказьгеает влияния на фибриноген, а действует только на фактор X. На принадлежность его к протеазам указало то, что действие его абсолютно зависимо от кальция и угнетается ингибиторами сериновых протеаз, например, трипсиновым ингибитором сои и, частично, - L-цистеином [56].Активированный фактор X требует в качестве кофактора активированный фактор V коагуляции крови (Ас-глобулин). Белки, активирующие фактор V, вьщелены в основном из ядов змей семейства Viperidae. Однако, в яде кобры N. oxiana содержится (в количестве около 3%) кислый одноцепочечный полипептид с молекулярной массой 48 Ша, способный активировать фактор V, разрезая его на два фрагмента в 90 и 77 Ша.Некоторые протеазы обладают несколькими различными эффектами. Так, например, металлопротеиназа мокархагин из яда Naja mossamblca mossamblca гидролизует рецептор фибриногена (гликопротеин ПЬ-Ша), экспрессированный на поверхности тромбоцитов, и таким образом ингибирует агрегацию тромбоцитов [58].Ранее было показано, что мокархагин устраняет у тромбоцитов способность связывать адгезивный лт^анд, фактор фон-Виллебранда [59]. Мокархагин ингибирует также агглютинацию тромбоцитов; этот эффект блокируется ЭДТА или диизопропилфторфосфатом, ингибитором протеиназ [58]. Этот фермент отщепляет декапептид от N-концевого участка PSGL-1, миелоидного рецептора Р-селектина на нейтрофилах, предотвращая таким образом связьшание Р-селектина с PSGL-1 [60]. Во всех случаях эффекты необратимы по причине протеолиза мищеней. Тем не менее, поскольку мокархагин связьшает гепарин [58] и предпочитает отрицательно заряженный кластер сиаломуцина PSGL-1 [60], то он, по-видимому, использует свои лектин-подобные свойства в распознавании и/или связывании мишеней. В базе данных TrEmbl размещена аминокислотная последовательность Mocarhagin 1, выведенная из гена-предшественника; она имеет 83% идентичных остатков с N-концевой аминокислотной последовательностью мокархагина, определённой прямым секвенированием (см. рис. 17).В противоположность этому для металлопротеиназы каоутиагина из яда N. naja kaouthla установлен к настоящему времени единственный участок протеолиза: она селективно гидролизует связь P708-D709 фактора фон-Виллебранда, в результате чего падает агрегирующая и коллаген-связьшающая способность этого фактора [61]. В аминокислотной последовательности каоутиагина найдено две дизинтегрин-подобных области, которые, как показано в случае инактивации протеиназного домена, ингибируют агрегацию тромбоцитов, вызываемую коллагеном [62]. Обе металлопротертазы активны только в присутствии ионов металлов: первая — цинка или кальция, вторая — любого двухвалентного иона металла.В яде кобры N. nigricollis обнаружена фибриногеназа, названная F1 (выход 3%) [63]. F1 - одноцепочечный протеин с молекулярной массой около 58 кДа и изоэлектрической точкой вьппе 10, является цинк-зависимой металлопротеиназой.Альфа-фибриногеназы расщепляют альфа-цепь фибриногена и ингибируют агрегацию тромбоцитов. Протеаза F1 - альфа-фибриногеназа с оптимумом рН 8-10, активная также в отношении а-макроглобулина и фибронектина. К тому же она ингибирует агрегацию тромбоцитов в цельной крови (дозозависртмо), но в промытой суспензии тромбоцитов резко снижает свою активность, т. е. требует присутствия плазмы. Было установлено, что антиагрегирующая способность F1 не зависит от её действия на фибриноген, поскольку продукты F1-опосредованного расщепления фибриногена не вьиьшают значительного ингибирования агрегации тромбоцитов; более того, эта активность четырёхкратно усиливается в отсутствие плазменного фибриногена (при применении так называемой дефибриногенированной плазмы) [64]. Кроме этого, для яда N. nigricollis была определена тромбино-подобная активность [65].Предпочтительно атакует Аа-цепь фибриногена в С-концевой области, но гидролизует (более медленно) и Вр-цепь, а также гемоглобин, казеин и желатин. В дозах до 15 мг/кг не легальна для мьппей, не цитотоксична для клеток Эрлиха и не миотоксична, но вызывает лёгкую эдему [66].Анализ размещённых в базах данных аминокислотных последовательностей металлопротеиназ кобр позволяет отнести их к репролизинам, а именно к высокомолекулярным металлопротеиназам группы Р-Ш, содержащим N-концевой металлопротеиназный домен с консервативным цинк-связывающим мотивом, дизинтегрин-подобный и богатый цистеином домены [67].Яды змей семейства Elapidae рода Naja (кобры), видимо, лишены геморрагинов веществ, вызьшающих геморрагию [65], а яд королевской кобры такие вещества содержит [28]. Основное из них, ганнатоксин, составляет около 2% массы сухого яда и является кислым гликопротеином (р1 5,3) с молекулярной массой 66 Ша (по данньв! электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, ДСНПАГЭ) или 63 kDa (по данным гель-фильтрации). Ганнатоксин - тоже металлопротеиназа, поскольку содержит один атом цинка на молекулу, а добавление ЭДТА полностью ингибирует и протеолитичес1сую, и геморрагическую активность. Воздействие его видоспецифично: он высвобождает белок из гломерулярной базальной мембраны кроликов, но не крыс. Кроме того, он имеет существенно различающиеся минимальные геморрагические дозы для кроликов и мьппей (0,7 и 75 мкг в/в, соответственно) и убивает кроликов в дозах вьш1е 0,18 мг/icr веса тела, в/в, но не смертелен для мышей в дозе 2 мг/кг в/в [68].Двойственные свойства проявляет аргинин/лизин-амидаза, минорный компонент яда королевской кобры. Она гидролизует трипептидиланилиды с С-концевым остатком аргинина или лизина. Фермент не гидролизует казеин, не имеет геморрагической и коагулирующей способности, не оказывает влияния на фактор X, протромбин или плазминоген и не сгущает фибриноген. Однако при помощи электрофореза выявилось следующее: при обработке этой амидазой фибриногена альфа- и бета- цепи последнего исчезают, и появляются фрагменты малой молекулярной массы. Исходя из факта полного ингибирования активности бензамидином и трипсиновым ингибитором сои было сделано предположение, что данная амидаза является также сериновой протеазой [69].Из яда этого же вида выделен пептид с молекулярной массой всего в 610 Da, состояпщй из шести аминокислотных остатков (RHARHD). Его фибринолитическая и фибриногенолитическая активность, проявляющаяся на мышах самцах-альбиносах, сопоставима с активностью стрептокиназы. Вещество, названное Hannahpep, предотвращает in vitro свёртывание крови, по меньшей мере, на 6 часов, при этом не оказьшая гемолитического или геморрагического действия [70]. Механизм действия не описан.Некоторые высокотоксичные мажорные соединения яда кобр, например, кардиотоксины и фосфолипазы А2, тоже влияют на систему свёртьтания крови, но их обсуждение выходит за рамки задач настоящего обзора 6. Вещества, влияющие на систему комплемента сыворотки крови 6.1. Фаюпоряда кобры Классический путь активации системы комплемента реализуется в результате образования комплекса антиген-антитело на поверхности клетки, которое запускает каскад последовательных реакций. Однако существует альтернативный путь активации этой системы без участия антител. Этот второй путь может быть инициирован отдельными веществами, например, полисахаридами клеточной стенки бактерий и т. паз. фактором яда кобры (cobra venom factor, CVF).Под воздействием фактора D CVF образует с сывороточным кофактором В очень стабильный комплекс CVF,Bb — аналог комплекса С2а4Ь, выполняющего функцию конвертазы компонента СЗ системы комплемента, и, таким образом, запускает каскад дальнейших реакций; при этом система гуморального иммунитета эффективно истощается. Например, CVF из яда N. naja atra за 20 часов истощает систему комплемента собаки более чем на 95%, в результате чего снижается иммунный ответ сыворотки на присутствие антигенов. Так, истощение комплемента сыворотки под действием CVF предупреждает развитие аутоиммунного поражения альвеол лёгких, вызываемого олеиновой кислотой [71]. Приведённое исследование иллюстрирует возможности применения CVF для изучения механизмов развития некоторых патологических состояний, а CVF может оказаться полезным для больных с респираторным дистрессным синдромом. Способность CVF к истощению системы комплемента успешно используется в опыгах по ксенотрансплантации, доказывая свою эффективность при пересадке, например, островков поджелудочной железы крысы мышам-диабетикам [7], сердца или лёгкого хомяков крысам [11], тканей сердца морской свинки крысам [12] и др.Функционально CVF сходен с компонентом СЗ комплемента сыворотки крови человека, имея с ним не только иммунологическую кросс-реактивность, но и сходный аминокислотный состав, общие вторичную структуру, ультраструктурную морфологию, изоэлектрическую точку, спектр поглощения в ультрафиолетовой области и спектр КД [72].Родственные виды кобр секретируют неодинаковые Cv^ F. При изучении способности CVF из ядов кобр N. naja и N. haje истощать систему комплемента бьшо показано, что CVF N. naja истощает содержание компонентов СЗ и С5, в то время как CVF N. haje селективен по отношению к СЗ. Оба CVF эффективно истощают систему комплемента, но имеют разную скорость элиминации: период полувыведения для CVF из яда N. naja составляет 11,5 часов, в то время как для CVF из яда N. haje - только 4,5 часа [73]. Сравнительно недавно выяснилось, что CVF обоих видов кобр образуют СЗконвертазу, которая одновременно является С5-конвертазой. Причем обе С5-конвертазы имеют близкие величины кинетических констант катализа A^ at, но в 400 раз различаются между собой по сродству к субстрату (С5), т.е. по величине константы Михаэлиса Km. По этой причине за активный центр в СЗ/С5-конвертазах идет конкурентная борьба между двумя субстратами СЗ и С5. При физиологических концентрациях на одну молекулу С5Ь приходится 7 молекул СЗЬ. В СЗ/С5-конвертазе N.haje низкое сродство к С5 приводит к снижению измеряемой скорости его гидролиза {ktJKm). Эта скорость для СЗ/С5конвертазы N.haje оказывается в 20 раз меньше, чем для СЗ/С5-конвертазы N.naja [74]. CVF выделен и охарактеризован как белок только из ядов N. kaouthia (N. п. siamensis) [75], N naja [76] N. atra [77] и N. haje [78].В работе [65] изучалась про-воспалительная активность ядов 5 видов змей семейства Elapidae: Micrurus ibiboboca, М. spixii, Naja naja, N. melanoleuca и Л'', nigricollis.Все 5 ядов активировали систему комплемента дозозависимым образом (от 5 до 200 мкг/мл сыворотки) и все вьпывали конверсию компонента комплемента СЗ при нормальном содержании в сыворотке ионов кальция и магния. Но если ионы Са^ "^ связывались добавлением Mg-ЭДТА, то это свойство сохраняли только яды N. naja и N. melanoleuca. Те же яды и яд Л/, ibiboboca конвертировали очищенный СЗ в отсутствие других компонентов системы комплемента- Кажется логичным, что из этих видов змей семейства Elapidae только в ядах N. naja и N. melanoleuca удалось открыть протерш требуемой массы (144 Ша) методом вестерн-блоттинга с сывороткой, содержащей антитела к CVF или СЗ [65]. CVF является относительно крупным белком с молекулярной массой 140-147 kDa.Молекула состоит из а-цепи (около 70 кДа), р-цепи (около50 кДа) и у-цепи (около 30 кДа), соединённой при помощи дисульфидных связей с первыми двумя. CVF - один из наиболее анионных белков яда: на каждые 1000 аминокислотных остатков 102-110 приходится на глутаминовую кислоту, 115 - на аспарагиновую кислоту, в то время как доля лизина и аргинина - всего 65-68 и 39-42 соответственно (по данным [35, 72, 75]). а- и р-цепи и, по данным [75], у-цепь гликозилированы: CVF содержит в общей сложности от 5 до 7.4% углеводов по массе (остатки галактозы, маннозы, глюкозы, глюкозамина и фукозы; на нейраминовую кислоту, вносящую дополнительный вклад в кислотность белка, приходится не более 1%). Углеводы присутствуют в молекуле CVF в виде трёх (может быть, и четырёх) олигосахаридных цепей, связанных с пептидным остовом N-гликозидными связями. Особенностями этих олигосахаридных цепей являются нередуцированные терминальные остатки альфа-галактозы (в ядах змей они неизменно встречаются, но в тканях - крайне редки [79]) и фукозы, связанные с проксимальным N-ацетилглюкозамином. [80].Сахара имеют решающее значение для иммунологической кросс-реактивности CVF с СЗ-компонентом системы комплемента человека. Grier et al. показали это при помощи антител мьппи к CVF: одно из антител связывалось с двумя углеводными эпитопами как на CVF, так и на СЗ, другое - с одним эпитопом (как на CVF, так и на СЗ).После дегликозилирования CVF и СЗ с помощью фермента N-гликаназы антитела теряли способность их связывать [81].Аминокислотная последовательность белка-предшественника CVF (кобры Л''. kaouthia) определена исходя из нуклеотидной последовательности кодирующего гена.6.2. Другие полипептиды, влияющие на систему комплемента Яд кобр содержит ряд пептидов, ингибирующих на разных этапах систему комплемента (рис. 4). В яде среднеазиатской кобры N. oxiana их обнаружено по меньшей мере семь.Кислый белок с молекулярной массой 3,9 kDa, составляющий 0,26% сухого яда и названный CFA-Ic, ингибирует классический путь образования СЗ-конвертазы, предотвращая активацию компонента комплемента С2 активированным компонентом Cls [83]. Кислые белки CFA-IIa и CFA-IIb с суммарным содержанием 0.2% и молекулярньп^и массами 5,7 и 3,2 kDa, соответственно, инактивируют нативный компонент С2, причём CFA-IIa более активен [83]. Кислый гликопротеин CFA-Ib с молекулярной массой 61 Ша, имеющий 6 остатков сиаловой кислоты на молекулу и составляющий 0.35% сухого яда, сначала селективно связывается с компонентом С4 (Ki 0,27 мкМ), а затем необратимо инактивирует его (Константа скорости инактивации 0,27 мин'). Мембраносвязанный С4Ь также сохраняет способность к связьшанию с CFA-Ib [84].Белок CFB-I с молекулярной массой 39 kDa, составляющий 0,36% сухого яда, ингибирует классический путь активации комплемента, связываясь с компонентом С4 (Ki 9 нМ) [85]. Этот белок, возможно, аналогичен С1-ингибитору из ядаК haj'e.Мажорные соединения CFB-II, связывающийся только с компонентом комплемента С4Ь, и CFB-III, инактивирующий С4, определены как цитотоксины I и П, соответственно [86].С1-ингибитор из яда египетской кобры N. haj'e - основный глобулярный термолабильный гликопротеин с молекулярной массой 26 kDa, который ингибирует различные стадии активации системы комплемента, включая как классический (с компонента С1), так и альтернативный путь. С1 ингибирует альтернативный путь активации системы комплемента на уровне сьгаороточного фактора В, как полагают, на стадии его расщепления. Кроме того, он способен связываться с компонентами СЗ, С4 и их фрагментами СЗЬ, С4Ь; предполагаемый механизм ингибирования - стерические препятствия. Это вещество не оказывает выраженного эффекта на сборку мембраноатакующего комплекса С6-С9, хотя и не исключается малый ингибирующий эффект [87]. В дозе 5 мкг/г веса тела при внутрибрюшинном введении мьппам С1ингибитор оказался нетоксичен.7. Полипептидные соединения с иной функцией 7.1. Фактор роста нервов Яды змей, принадлежащих к разным семействам, содержат полипептиды, способные поддерживать развитие и выживание нейронов, т. е. нейротрофические факторы [88].Биологические свойства фактора роста нервов (ФРН), присутствующего в яде змей, разнообразны и до конца не изучены. ФРН лишён выраженной энзиматической активности, а его действие обусловлено связьгеанием со специфическими рецепторами (с низким и ВЫС01СИМ сродством, имеющими константы диссоциации 1нМ и 0,01нМ и названными соответственно p-751ngfr и p-140trk) восприимчивых клеток. Все эффекты ФРН можно разделить на нейрональные и ненейрональные.Нейрональные эффекты в периферической нервной системе, похоже, ограничены нейронами симпатоадреналового происхождения (клетки ганглий и параганглий, хромаффинные и некоторые другие), а также эмбриональными чувствительными нейронами. В ЦНС к ФРН кроме них восприимчивы индоламинэргические, пептидэргические и отдельные холинэргические нейроны [88].Морфологически действие ФРН на нейроны проявляется в увеличении числа и ДЛИНЫ отростков клеток и усршении аксонального ветвления. На молекулярном уровне происходят изменения в фосфолипидном метаболизме, токе ионов через плазматическую мембрану и ферментативной активности, повышается синтез белков, вовлечённых в формирование нервных отростков (тубулина, белков нейрофиламента), усиливается синтез и высвобождение нейротрансмиттеров. Всеми этими свойствами обладает ФРН из яда змей, в том числе и кобр [88]. В частности, ФРН из яда китайской кобры N. atra стимулирует продвижение отростков нервных волокон. Для него показано активное участие в процессе ранозаживления, особенно заметное при наличии повреждений периферических нервов. Это же вещество оказывает терапевтический эффект при диабетическом неврите [12]. ФРН из яда NaJa kaouthia вызывает дифференцировку клеток феохромоцитомы крысы PC 12 из популяции делящихся хромаффиноподобных клеток в неделящиеся, обладающие свойствами симпатических нейронов. Кроме того, он предотвращает гибель этих клеток в бессывороточной среде сопоставимо с 78-ФРН мьшш [89].Ненейрональные эффекты ФРН можно подразделить на эффекты, затрагивающие клетки крови, сосудистые и системные.ФРН является относительно сильным дегранулирующим агентом для стволовых клеток. Мононуклеарные клетки, В-лимфоциты крыс и в меньшей степени Т-клетки экспрессируют поверхностные рецепторы для ФРН. Влияние ФРН на полиморфонуклеарные лейкоциты/базофилы выражается в индукции их дифференцировки из предшественников; ФРН может стимулировать секрецию гематопоэтических факторов роста Т-клетками, также влияющих на дифференцировку полиморфоядерных лейкоцитов. В тоже время на тромбоциты человека ФРН кобр не действует [88].Сосудистые эффекты ФРН выражаются, прежде всего, в повышении проницаемости сосудистой стенки с пропотеванием плазмы. Это действие может быть обусловлено нейрогенным влиянием, поскольку капсаицин, истощающий содержание медиаторов воспаления в первичных чувствительных нейронах, уменьшает и эту проницаемость. С другой стороны, поскольку HI- и Н2-антагонисты гистамина также снижают этот эффект, предполагается важная роль эндогенного гистамина в ФРН опосредованной сосудистой проницаемости.На показатели кровообращения ФРН кобр влияния не оказывает, а ФРН мьппи кратковременно снижает кровяное давление у крыс и превращает плазминоген в плазмин [88].Интересны данные о влиянии ФРН яда китайской кобры на репродуктивную систему крыс-самцов. Он повьппает эпидидимальную подвижность сперматозоидов, в результате увеличивается частота беременностей самок и количество приплода. При этом концентрация в крови у самцов лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов при применении деструктанта госсипола при совместном применении с ФРН была ниже, чем одного только госсипола, следовательно, ФРН уменьшает деструктивные эффекты последнего в семенниках [5]. Было показано, что ФРН кобры ускоряет созревание половых клеток в тестикулах, это его свойство может оказаться полезным для мужчин, страдаюпщх от стерильности [12].Вопрос о наличии у ФРН токсических и тератогенных свойств, способности проникать через гематоэнцефалический барьер и ферментной активности остаётся открыгым. Тем не менее, для ФРН змей предполагается кооперативное участие с CVF и ФЛА2 в их повреждающих воздействиях. Стоит заметить, что количество этого вещества, попадающего в организм жертвы за один укус ядовитой змеи, вполне достаточно для проявления большинства его вышеуказанных эффектов. Зачем именно в яде присутствует значительная концентрация (до 0,5%) этого компонента, пока остаётся неясным [88].Впрочем, замечено, что дифференцирующие свойства ФРН из разных источников на клетки PC 12 коррелируют с его токсичностью для этих клеток (для ФРН из яда кобры это 1-5 нг против 10-20 иг, соответственно) [12]. Inoue S. et al. изучали первичную структуру ФРН, вьщеленного из ядов индийской кобры (N. naja) и таиландской кобры (N. naja siamensis) [90], а Oda Т. et al. - из яда тайваньской кобры (Л'', naja atra) [91]. Авторы пришли к заключению, что аминокислотная последовательность ФРН из ядов идентична вьшеденной ранее из кодирующей ДНК, выделенной из ткани желёз N. naja siamensis в 1987 году Selbi et al. [92]. ФРН кобр сходен по аминокислотной последовательности с ФРН мыши и человека на 60%. Следует заметить, что распределение остатков цистеина в них инвариантно [91].ФРН из яда змей рода Naja схожи между собой по первичной структуре и отличаются по значениям изоэлектрической точки: для N. naja pi 6,75, а для ФРН других видов р1 лежит в диапазоне 8-10, даже в пределах одного вида имеются разночтения (у N. naja atra pi 7,2 и 23 кДа согласно [5] и 9,2 и 13.5 кДа согласно [12]). Такое различие в р1 может быть обусловлено углеводной частью молекулы, составляющей около 2%, а такое расхождение в молекулярной массе, — возможно, димеризацией.7.2. Белки семейства CRISP Секреторные белки, богатые цистеином (cysteine-rich secretory proteins, CRISP), участвуют в работе иммунной системы и в процессах созревания гамет и оплодотворения, хотя их функция до конца не выяснена. Встречаются они и в растениях, и в животных ядах. Их консервативная аминокислотная последовательность содержит 16 высококонсервативных остатков цистеина, 10 из которых расположены в С-концевой трети молекулы. CRISP-белки были вьщелены из ядов змей семейства Viperidae (трифлин из яда куфии Trimeresurus flavoviridis и др.), морских змей (латисемин из Laticauda semifasciata) [93] а также австралийских элапид [94]. Скрининг кросс-реактивности с антисывороткой к трифлину показал возможность присутствия родственных белков в ядах Hemachatus hemachatus, Naja mossambica, N. kaouthia, N. nivea, N. haje и О. hannah. Из последнего яда был выделен основный белок офанин с мол. массой 25.0 кДа. Его аминокислотная последовательность, состоящая из 221 остатка, более гомологична с таковой охарактеризованных белков CRISP из ядов змей семейства Viperidae, чем Elapidae.Офанин, как и некоторые другие CRISP (например, трифлин и латисемин), умеренно ингибирует сокращение мышц хвостовой артерии крысы, вызьшаемое высокой концентрацией ионов калия, но не кофеином [95].Из яда N. atra выделены два основных белка с мол. массой около 26 кДа (CRVP 1 и 2), имеющие различное хроматографическое поведение. Их слегка различающиеся Nконцевые последовательности гомологичны таковым белков семейства CRISP. Полная последовательность одного из них, определённая по к-ДНК, высокогомологична таковым для CRISP из ядов других змей. Оба белка нетоксичны для мышей, их биологическая активность не установлена. Они, в отличие от офанина, не ингибируют сокращение мьш1ц хвостовой артерии крысы, вызьшаемое высокой концентрацией ионов калия [96].7.3. Олигопептиды и муцино-подобный гликопротеин Яды змей содержат олигопептиды, состоящие всего из нескольких аминокислотных остатков; некоторые из них обладают собственным биологическим действием. Вьппе уже обсуждался гексапептид Hamiahpep, выделенный из королевской кобры. В яде филиппинской кобры N. naja philippinensis выявлен пентапептид YKKWWNH2, обладающий смешанной активностью к,ц-антагониста опиоидных рецепторов. Восзащищённый пентапептид имеет селективность к/ц, равную 0.05. Участок Тф-Тгр-КНг важен для проявления эффекта ц-селективного антагониста, замена остатка тирозина на фенилаланин, как и изоамиламидирование С-конца, приводит к повышению сродства к кзамена остатка тирозина на фенилаланин, как и изоамиламидирование С-конца, приводит к повьппению сродства к к-опиоидным рецепторам, причём для этого достаточно наличия только одного остатка лизина Синтезированный гомолог этого пептида с одним остатком лизина имеет селективность к/|х, равную 22 [97]. Из яда египетской кобры N. haje недавно был выделен пентадекапептид, усиливающий эффекты брадикинина на препарат предсердия кошки посредством влияния на распределение внутриклеточного кальция [98].Муцино-подобный гликопротеин яда кобры, являясь высокомолекулярным (мол. масса более 1 МДа) веществом, нековалентно связывается с низкомолекулярными гликопротеинами и пептидами яда, поддерживая их в растворённом состоянии.Содержание в яде - 3-4%. В отличие от других муцинов, он не образует высоковязкий раствор. Гликопротеин на 85% состоит из углеводов (как N-, так и 0-связанных).Поскольку в их составе широко представлены терминальные остатки альфа-галактозы, этот гликопротеин реагирует с антиальфа-галактозными антителами сыворотки человека [99].8. Соединения непептндной природы Эта группа включает в себя широко распространённые неорганические ионы, свободные аминокислоты, нуклеозиды, липиды, не являющиеся ядо-специфичными, и поэтому в данном обзоре не рассматривается.Следует лишь заметить, что для нуклеозидов (аденозина, гуанозина, инозина) показано или предполагается кооперативное действие с большнмством остальных соединений яда кобр [13], а ионы металлов (прежде всего кальция, магния и натрия) необходимы для функционирования некоторых ферментов.9. Заключение Яды кобр представляют собой сложнейшие смеси белков и пептидов, обладающие широчайшим спектром биологической активности. Превалирующие высокотоксичные компоненты, будучи наиболее полно охарактеризованными, отвечают лишь за небольшой участок этого спектра.Очевидно, что малопредставленные компоненты вносят свой вклад в общую токсичность яда, воздействуя на организм жертвы сразу по многим направлениям и при этом потенцируя эффекты других компонентов.Некоторые из минорных низкотоксичных соединений могут оказаться (или уже являются) полезными инструментами для биохимических исследований, также как и прототипами лекарственных средств.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

1. С использованием разработанной эффективной схемы идентификации и фракционирования минорных белков из яда кобры N. kaouthia выделен первый гликозилированный токсин трёхпетельного типа. Установление структуры этого токсина показало, что он является цитотоксином 3 из этого же яда, гликозилированным по остатку аспарагина-29, расположенному на окончании центральной петли. Показано, что наличие углеводного остатка в молекуле цитотоксина приводит к снижению его токсичности.

2. Впервые в яде кобры обнаружены белки, принадлежащие к семейству CRISP. Показано, что представители этого семейства присутствуют в ядах кобр в виде набора нескольких нетоксичных гомологов, включающих как основные, так и кислые белки.

3. Из яда кобры N. oxiana выделен новый гликопротеин оксиагин — гомолог репролизинов ядов змей, способный ингибировать активацию системы комплемента сыворотки крови по классическому пути. Оксиагин является первым представителем репролизинов ядов змей, для которого доказана такая активность.

4. Впервые комплемент-активирующий фактор (CVF) выделен из яда кобры N. melanoleuca в виде двух форм, имеющих отличия в физико-химических свойствах и биологической активности.

1. Регистр лекарственных средств. Энциклопедия лекарств. Изд. 6-е, перер. и доп. / Под ред. Ю.Ф. Крылова. М.: РЛС-2000,1999. - 1072 с.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд. 13-е, новое. В 2-х ч. Часть 2. Харьков: Торгсин, 1997. - 575 с.

3. Видаль Справочник. Лекарственные препараты в России. М.: АстраФармСервис, 19951999.

4. Hucho F. Toxins as Tools in Neurochemistry. // Angewandte Chemie, Int. Ed. Engl.-1995. -V. 34. P. 39-50.

5. Xu T.R., Wang W. Y., Huang Y.H. A nerve growth factor from the venom of Chinese cobra (Naja naja atra) and its effects on male reproductive system in rats. // Сотр. Biochem. Physiol. С Pharmacol. ToxicoL Endocrinol -1999, Oct. -V. 124. P. 149-156.

6. Орлов Б.Н., Омаров Ш.М., Гелашвили Д.Б., Корнева Н.В. Химия и фармакология змеиных ядов. // Фармакология и токсикология. 1979. № 42. - С. 182-190.

7. Barchan D., Kachalsky S., Neumann D., Vogel Z., Ovadia M., Kochva E., Fuch S. How the mongoose can fight the snake: the binding site of the mongoose acetylcholine receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992. 89. - P. 7717-7721

8. Tsetlin, V.I. Snake venom a-neurotoxins and other «three-finger» proteins. // Eur. J. Biochem. -1999.-V.264.-P. 281-286.

9. Tabata Т., de Perrot M., Keshavjee S., Liu M., Downey G.P., Waddell Т.К. Accomodation after lung xenografting from hamster to rat. // Transplantation. -2003. -V. 75. P. 607-612.

10. Peng M.H., Meng K.W., Yang D.H. The effect of Chinese cobra venom factor on guinea pig to rat cadiac xenotransplantation. // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. -2001. -V. 15. -P. 240-243.

11. Li X.B., Chen M.J., Lei D.Q. et al. Bioactivities of nerve growth factor from Chinese cobra venom. // J. Nat. Toxins. 1999, Oct. -V. 8. P. 359-362.

12. Aird S.D. Ophidian envenomation strategies and the role of purines. // Toxicon. 2002. — V. 40. -P. 335-394.

13. Dufion M.J., Hider R.C. Structure and pharmacology of elapid cytotoxins. Pharmacol. Ter. -1988.-V. 36.-P. 1-40.

14. Jolkkonen M., van Giersbergen P.L., Hellman U., Wernstedt C., Oras A., Satyapan N., Adem A., Karlsson E. Muscarinic toxins from the black mamba Dendroaspis polylepis. // Eur. J. Biochem. — 1995.-V.234.-P. 579-585.

15. Selective Neurotoxicity. Editors H. Herken, F. Hucho. Ch. 16. Peptide Toxins Acting on the Nicotinic Acetylcholine Receptor. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992. - P. 577-598.

16. Low B.W., Corfield P.W. Erabutoxin b. Structure/function relationships following initial protein refinement at 0.140-nm resolution. Eur J. Biochem. 1986. V. 161. - P. 579-587.

17. Bradley K.N. Muscarinic toxins from the green mamba. // Pharmacology and Therapeutics. — 2000.-V. 85.-P. 87-109.

18. Nirthanan S., Gopalakrishnacone P., Gwee M.C.E., Khoo H.E., Kini R.M. Non-conventional toxins from Elapid venoms.// Toxicon. -2003. V.41. - P. 397-407.

19. Adem A., Karlsson E. Muscarinic receptor subtype selective toxins. // Life sci. -1997. -V. 60. P. 1069-1076.

20. Kukhtina V.V., Weise C., Muranova T.A., Starkov V.G., Franke P., Hucho F., Wnendt S., Gillen C., Tsetlin V.I., Utkin Y.N. Muscarinic toxin-like proteins from cobra venom. //Eur. J. Biochem. -2000. -V. 267. P. 6784-6789.

21. Pu X.C., Wong P.T., Gopalakrishnakone P. A novel analgesic toxin ( hannalgesin ) from the venom king cobra ( Ophiophagus hannah ). // Toxicon. -1995. -V. 33. P. 1425-1431.

22. Tan N.H., Tan C.S. A comparative study of cobra (Naja) venom enzymes. // Сотр. Biochem. Physiol. 1988. -V. 90. - P. 745-750.

23. Tan N.H., Saifuddin Hj M.N. Enzymatic and toxic properties of Ophiophagus hannah (King cobra) venom and venom fractions. // Toxicon. 1989. -V. 27 (b). - P. 689-695.

24. Tan N.H., Swaminathan S. Purification and properties of the L-amino acid oxidase from monocellate cobra (Naja naja kaouthia ) venom. // Int. J. Biochem. 1992. -V. 24. - P. 967-973.

25. Li Z.Y., Yu T.F., Lion E.C. Purification and characterisation of L-amino acid oxidase from king cobra ( Ophiophagus hannah ) venom and its effects on human platelet aggregation. // Toxicon. -1994.-V. 32.-P. 1349-1358.

26. Ahn M.Y., Lee B.M., Kim Y.S. Characterization and cytotoxicity of L-amino oxydase from the venom of king cobra (Ophiophagus hannah). // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1997. -V. 29. - P. 911-919.

27. Tu A.T. Venoms: chemistry and molecular biology. New-York, John Wiley & Sons, Inc., 1977. - 559 p.

28. Василенко С.К., Райт В.К. Метод выделения высокоочшценной рибонуклеазы из яда среднеазиатской кобры Naja oxiana. // Биохимия. 1975. № 40. — С. 578-583.

29. Mahalakshmi Y.V., Pandit M.W. A new ribonuclease from cobra venom (Naja naja) showing specificity towards cytidylic acid. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. - V. 145. - P. 740748.

30. Lowman N.B., Draper D.E. On the recognition of helical RNA by cobra venom VI nuclease. // J. Biol. Chem.-1986. -V. 261. P. 5396-5403.

31. Mahalakshmi Y.V., Jagannadham M.V., Pandit M.W. Ribonuclease from cobra snake venom: purification by affinity chromatography and further characterization. // IUBMB Life. 2000. - V. 49.-P. 309-316.

32. Kreil G. Hyaluronidases a group of neglected enzymes. // Protein Science. - 1995. - V. 4. - P. 1666-1668.

33. Сорокин B.M., Нигматов 3., Юкельсон Л .Я. Характеристика холинэстеразы яда среднеазиатской кобры. // Химия природных соединений. — 1972. № 6. С. 783-789.

34. Duhaiman A.S., Alhomida AS., Rabbani N., Komal M.A., al Jafari A.A. Purification and characterization of acetylcholinesterase from desert cobra (Walterinnesia aegyptia) venom. // Biochimie. 1996. -V. 78. - P. 46-50.

35. Cousin X, Bon C. Acetylcholinesterase from snake venom as a model for its nerve and muscle counterpart. // J. Nat. Toxins. 1999. - V. 8. - P. 285-294.

36. Weise C., Kreienkamp H.J., Raba R., Aaviksaar A., Hucho F. The active site and partial sequence of cobra venom acetylcholine esterase. // J. Protein. Chem. -1990. -V. 9. P. 53-57.

37. Boumrah D., Suckling C.J., Dufton M.J. Characteristics of the peptidase activity contained in Taiwan cobra (Naja naja atra) venom. // Toxicon. 1993. - V. 31. - P. 1293-1303.

38. Yukelson L.Ya., L'vov V.M., Shkinev A.V., Sultanalieva N. The kallikrein, kininase and related peptides activities in central Asian snake venoms. // Agents Action Suppl. 1992. -V. 38. - P. 430-440.

39. Zupunski V., Kordis D., Gubensek F. Adaptive evolution in the snake venom Kunitz/BPTI protein family. // FEBS Lett. 2003. - V. 547. - P. 131-136.

40. Shafqat J., Beg O.U., Yun S.J., Zaidi Z. H., Jornvall H. Primary structure and functional properties of cobra (Naja naja naja) venom Kunitz-type trypsin inhibitor. // Eur. J. Biochem. -1990.-V. 194.-P. 337-341.

41. Shafqat J., Zaidi Z.H., Jornvall H. Purification and characterization of a chymotrypsin Kunitz inhibitor type of polypeptide from the venom of cobra (Naja naja naja). // FEBS Lett. 1990. - V. 275. - P. 6-8.

42. Chen C., Hsu C.H., Su N.Y., Lin Y.C., Chiou S.H., Wu S.H. Solution structure of a Kunitz-type chymotrypsin inhibitor isolated from the elapid snake Bungarus fasciatus. // J. Biol Chem. -2001. V. 276. - P. 45079-45087.

43. Lee W.H., Zhang y., Wang W.Y. Isolation and properties of a blood coagulation factor X activator from the venom of king cobra (Ophiophagus hannah ). // Toxicoa 1995. - V. 33. - P. 1263-1276.

44. Gerads I., Tans G., Yukelson L. Ya. Activation of bovine factor V by an activator purified from the venom of Naja naja oxiana. // Toxicoa 1992. - V. 30. - P. 1065-1079.

45. Ward C.M., Vinogradov D.V., Andrews R.K., Berndt M.C. Characterization of mocarhagin, a cobra venom metalloprotease from Naja mocambique mocambique., and related proteins from other Elapidae venom. // Toxicoa 1996. -V. 34. - P. 1203-1206.

46. Hamako J., Matsui T., Nishida S. Purification and characterization of kaouthiagin, a von Willebrand factor-binding and cleaving metalloprptease from Naja kaouthia cobra venom. // Thromb. Haemost. 1998. - V. 80. - P. 499-505.

47. Evans H.J. Purification and properties of a fibrinogenase from the venom of Naja nigricollis. // Biochimica et Biophysica Acta. 1984. - V. 802. - P. 49-54.

48. Kini R.M., Evans H.J. Inhibition of platelet aggregation by a fibrinogenase from Naja nigricollis venom is independent of fibrinogen degradatioa // Biochimica et Biophysica Acta. 1991. - V. 1095.-P. 117-121.

49. Tambourgi D.V., dos Santos M.C., Furtado M. de F., de Freitas M.C., da Silva W.D., Kipnis T.L. Pro-inflammatory activities in elapid snake venoms. // Br. J. Pharmacol. 1994. — V. 112. - P. 723-727.

50. Jagadeesha D.K., Shashidhara murthy R., Girish K.S., Kemparaju K. A non-toxic anticoagulant metalloprotease: purification and characterization from Indian cobra (Naja naja naja) venom. // Toxicoa 2002. - V. 40. - P. 667-675.

51. Bjarnason J.B., Fox J.W. Snake venom metalloendopeptidases: reprolysins. // Methods Enzymol. 1995.-V. 248.-P. 345-368.

52. Tan N.H., Sauffuddin M.N. Isolation and characterisation of a hemorrhagin from the venom of Ophiophagus hannah ( king cobra ). // Toxicoa -1990. -V. 28. P. 385-392.

53. Zhang Y., Lee W.H., Xiong Y.L., Wang W.Y., Zu S.W. Characterisation of OhSl, an arginine / lysine amidase from the venom of king cobra (Ophiophagus hannah). // Toxicon. -1994, May. -V. 32.-P. 615-623.

54. Gomes A., De P. Hannahpep: A novel fibrinolytic peptide from the Indian king cobra (Ophiophagus hannah) venom // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. -V. 266. - P. 488491.

55. Ren S.D., Huang S.J., Sun J.J., Zhu Z.G. Protective effect of cobra venom factor on pulmonary injury induced by oleic acid. // Int. J. Immunopharmacol. 1994. - V. 16. - P. 969-77.

56. Vogel C.W., Smith C.A., Miller-Eberhard H.J. Cobra venom factor: structural homology with the third component of human complement. // J. Immunol. 1984. - V. 133 (b). - P. 3235-3241.

57. Van der Berg C.W., Aerst P.S., Van Djyk H. In vivo anti-complementary activities of the cobra venom factors from Naja naja and Naja haje. // J. Immunol. Methods. 1991. - V. 136. - P. 287294.

58. Rawal N., Pangburn M.K. Functional role of the noncatalytic subunit of complement C5 convertase. // J. Immunol. -2000. V.164. - P. 1379-1385.

59. Eggertsen G., Lind P., Sjoquist J. Molecular characterization of the complement activating protein in the venom of the indian cobra (Naja n. siamensis). // MoL Immunol. 1981. - V. 18. - P. 125133.

60. Muller-Eberhard H.J., Fjellstrom K.-E. Isolation of the anticomplementary protein from cobra venom and its mode of action on C3. //J. Immunol. 1971. - V. 107. - P. 1666-1672.

61. Takahashi H., Hayashi K. Purification and characterization of anticomplement factor (cobra venom factor) from the Naja naja atra venom. // Biochim. Biophys. Acta. 1982. - V. 701. - P. 102-110.

62. Von Zabern I., Przyklenk H., Vogt W. Chain structure of cobra venom factor from Naja naja and Naja haje venom. // Scand. J. Immunol. 1982. -V. 15. - P. 357-362.

63. Gowda D.S., Davidson E. A. Structural features of carbohydrate moieties in snake venom glycoproteins. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - V. 182. - P. 294-301.

64. Gowda D.S., Schultz M., Bredehorst K., Vogel C.M. Structure of the major oligosaccharide of cobra venom factor. // Mol. Immunol. 1992. - V. 29. - P. 335-42.

65. Grier A.H., Schultz M., Vogel C.W. Cobra venom factor and human C3 share carbohydrate antigenic determinants. //J. Immunol. 1987. - V. 139. - P. 1245-1252.

66. Fritzinger D.S., Bredehorst R., Vogel C.W. Molecular cloning and derived primary structure of cobra venom factor. // Proc. NatL Acad. Sci. U.S.A. 1994. - V. 91. - P. 12775-12779.

67. Шойбонов Б.Б., Козлов Л.В., Антонов В.К. Кислые факторы яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana, ингибирующие комплемент. // Биохимия. 1989. № 54. - С. 2054-2060.

68. Козлов Л.В., Шойбонов Б.Б. Фактор яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana, инактивирующий компонент С4 комплемента человека. // Молекулярная биология. 1989. №23.-С. 372-378.

69. Козлов Л.В., Соляков Л.С., Зинченко А.А. Новый низкомолекулярный белковый эффектор комплемента человека из яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana. // Биоорганическая химия. 1984. № 10. - С. 323-332.

70. Козлов J1.B., Шойбонов Б.Б., Антонов В.К. Мажорные комплемент-ингибирующие факторы из яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana. // Биохимия. 1989. № 54. - С. 1919-1926.

71. Von Zabern I., Przyklenk H., Damavau В., Zimmermann B. Isolation and properties of a complement inhibitor from Naja venom, distinct from known anticomplementary factors venom. // Scand. Journal of Immunology. 1981. -V. 14. - P. 109-120.

72. Kostiza Т., Meier J. Nerve growth factors from snake venoms: chemical properties, mode of action and biological significance. // Toxicon. 1996, - V. 34. - P. 787-806.

73. Oda Т., Ohta M., Inoue S. Amino acid secuence of nerve growth factor purified from the venom of the Formosan cobra Naja naja atra. // Biochem. Int. 1989. - V. 19. - P. 909-917.

74. Selby M.J., Edwards R., Sharp F., Rutter W.J. Mouse nerve growth factor gene: structure and expression. // Mol Cell Biol. 1987. - V. - P. 3057-3064.

75. Yamazaki Y., Koike H., Sugiyama Y., Motoyoshi K., Wada Т., Hishinuma S., Mita M., Morita T. Cloning and characterization of novel snake venom proteins that block smooth muscle contraction. // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269. - P. 2708-2715.

76. Yamazaki Y., Brown R.L., Morita T. Purification and cloning of toxins from elapid venoms that target cyclic nucleotide-gated ion channels. // Biochemistry. 2002. - V. 41. - P. 11331-11337.

77. Yamazaki Y., Hyodo F., Morita T. Wide distribution of cysteine-rich secretory proteins in snake venoms: Isolation and cloning of novel snake venom cysteine-rich secretory proteins. // Arch. Biochem. Biophys. 2003. -V. 412. - P. 133-141.

78. E1-Saadani MA, El-Sayed MF. A bradykinin potentiating peptide from Egyptian cobra venom strongly affects rat atrium contractile force and cellular calcium regulation. // Сотр. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 2003. - V. 136. - P. 387-395.

79. Gowda D.S., Davidson E.A. Isolation and characterization of novel mucin-like glycoproteins from cobra venom. // J. Biol. Chem. -1994. -V. 169. P. 20031-20039.

80. Антонов C.M., Антонова H.B., Магазаник Л.Г. Влияние нейротоксинов на высвобождение медиатора из двигательных нервных окончаний личинки дрозофилы Drosophila melanogaster. // Ж. Эвол. Биохим. Физиол. 1979. № 15. - С. 623-625.

81. Deitmer, J.W., Primor, N., Zlotkin, E. The effect of cobra venom cardiotoxin on locust skeletal muscle. // J. of Invertebrate Pathology. 1977. - V. 30. - P. 232-236.

82. Ramaswamy, R., Khole, V. Toxicity of central asian cobra (Naja naja oxiana Eichwald) venom and its components to the larvae of blowfly Parasarcophaga ruficornis Fabr. // Indian J. Exp. Biol. 1988.- V.26.-P. 99-104.

83. Klowden, M.J., Vitale, A.J., Trumble, M.J., Wesson, C.R., Trumble, W.R. A bioassay for cobra cardiotoxin activity using semi-isolated cockroach heart. // Toxicon. 1992. - V. 30. - P. 295301.

84. Pinnok, R.D., Lummis, S.C., Chiappinelli, V.A., Sattelle, D.B. Kappa-bungarotoxin blocks alpha-bungarotoxin-sensitive nicotinic receptor in the insect central nervous system. // Brain Res, 1988.-V. 458.-P.45-52.

85. Tornoe, C., Bai, D., Holden-Dye, L., Abramson, S.N., Sattele, D.B. Action of neurotoxins (bungarotoxins, neosuragotoxin and lophotoxins) on insect and nematode nicotinic acetylcholine receptors. // Toxicon. 1995. - V. 33. - P. 411-424.

86. Gerschenfeld, H.M. Chemical transmission in invertebrate central nervous system and neuromuscular junctions. // Physiol. Rev. 1973. - V. 53. - P. 2-92.

87. Joubert, F.J., Taljaard, N. Purification, some properties and amino-acid sequences of two phospholipases A (CM II and CM III) from Naja naja kaouthia venom. // Eur. J. Biochem. -1980. -V. 112.-P. 493-499.

88. Karlsson, E, Arnberg, H, Eaker, D. Isolation of the principal neurotoxins of two Naja naja subspecies. // Eur J Biochem. -1971. -V. 21. P. 1-16.

89. Dubovskii P.V., Dementieva D.V., Bocharov E.V., Utkin Y.N. & Arseniev A.S. Membrane binding motif of the P-type cardiotoxin. // J Mol Biol. 2001. - V. 305. - P. 137-149.

90. Kreienkamp H.J., Sine S.M., Maeda R.K. & Taylor P. Glycosylation sites selectively interfere with alpha-toxin binding to the nicotinic acetylcholine receptor. // J Biol Chem. -1994. V. 269. -P. 8108-8114.

91. Mochca-Morales J., Martin B.M., Possani L.D. Isolation and characterization of helothermine, a novel toxin from Heloderma horridum horridum (Mexican beaded lizard) venom. // Toxicon. -1990.-V.28.-P. 299-309.

92. Brown R.L., Haley T.L., West K.A., Crabb J.W Pseudechetoxin: a peptide blocker of cyclic nucleotide-gated ion channels. // Proc. Natl. Acad. ScL USA. 1999. - V. 96. - P. 754-759.

93. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature (London). 1970. - V. 227. - P. 680-685.

94. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database searches program. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 3389-3402.

95. Anumula, K.R. Rapid quantitative determination of sialic acids in glycoproteins by highperformance liquid chromatography with a sensitive fluorescence detection. // Anal. Biochem. — 1995. -V. 230. P. 24-30.

96. Shevchenko A., Wilm M., Mann M. Peptide sequening by mass spectrometry for homology searches and cloning of genes. // J. Protein chemistry. 1997. - V. 16. - P. 481-190.

97. Smith, B.J. Chemical cleavage of proteins. // Walker, J.M. (Ed.). Methods in molecular biology. V. 32. Humana press, Totowa, NJ., 1994. - P. 297-310.

98. Wilkins, M.R., Lindskog, I., Gasteiger, E., Bairoch, A., Sanchez, J.-C., Hochstrasser, D.F., and Appel, R.D. Detailed peptide characterisation using PEPTIDEMASS a World-Wide Web accessible tool. // Electrophoresis. - 1997. - V.l 8. - P. 403-408.

99. Schippers, P. H. & Dekkers, H. P. J. M. Direct determination of absolute circular dichroism data and calibration of commercial instruments. // Anal. Chem. 1981. - V. 53 - P. 778-788.

100. Козлов JI.B., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова H.H. Модифицированные методы функционального исследования факторов комплемента С2, СЗ, С4 и С5. // Биоорганическая химия. -1982. № 8. С. 342-328.

101. Козлов Л.В, Соляков Л.С. Возможное участие зимогенных форм факторов В и D в активации альтернативного пути системы комплемента человека. // Биоорганическая химия. -1982. №8. С. 652-659.

102. Friemel, Н. (Ed.) Immunologische Ardeitsmethoden. Jena: Veb Gustav Fischer Verlag, 1994.

103. Kruger, N.J. Detection of polypeptides on immunoblots using secondary antibodies or protein A. // Walker J.M. Methods in molecular biology. Basic protein and peptide protocols, V. 32. -Humana Press, New Jersey, 1994. P. 215-226.