Новые полипептиды из яда кобры Naja kaouthia для исследования нейрорецепторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Введение.

1 .Мускариновый ацетилхолиновый рецептор как мишень действия токсинов змей.

2. Мускариновые токсины.

2.1 Структура мускариновых токсинов.

2.2 Биологическая активность мускариновых токсинов.

3.Никотиновый ацетилхолиновый рецептор как мишень действия токсинов змей.

4. Слабые нейротоксины.

В последнее время с применением методов генной инженерии идентифицировано большое количество белков, представляющих собой новые типы и подтипы рецепторов и ионных каналов [1, 2]. Однако их функциональная характеристика зачастую затруднена отсутствием специфических лигандов. Яды змей являются уникальными источниками полипептидных соединений, высокоспецифически воздействующих на различные типы рецепторов и ионных каналов жизненно важных систем организма. Возможности ядов как источников нейротоксинов использованы лишь в небольшой степени.

Содержание отдельных компонентов в яде змей порой не превышает долей процента, вследствие чего большое количество минорных компонентов не изучено. В настоящее время работа с минорными компонентами стала возможной благодаря развитию эффективных методов разделения белков (ВЭЖХ), и их анализа (МА1Л)1-масс-спектрометрия). Высокая чувствительность МА1Л)1-масс-спектрометрии позволяет обнаруживать минорные компоненты сложных белковых смесей и устанавливать молекулярные массы этих белков на всех этапах их выделения и очистки.

Ряд компонентов ядов змей оказывает воздействие на рецепторы холинергической системы нервной передачи [3, 4]. Токсические компоненты в качестве высоко специфичных лигандов используются при изучении холинергической передачи, ее роли в физиологических процессах и при патологиях [5]. Новые обнаруживаемые в ядах змей токсины могут служить для установления фармакологических различий между вновь идентифицированными подтипами рецепторов и для определения их локализации и физиологической роли в организме.

Холинорецепторы различных типов и подтипов широко представлены практически во всех частях периферической и центральной нервной системы и участвуют в регуляции жизненно важных процессов организма. В частности в ЦНС холинорецепторы участвуют в таких процессах, как двигательный контроль, поведение, сознание, эмоции, обучение и память [6, 7]. Нарушения в холинергической передаче отмечены при ряде паталогий: болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, хореи Хантингтона, шизофрении и миастении, и являются в некоторых случаях основной причиной заболевания [8, 9, 10, 11].

Холинергические нейроны для своего развития и дальнейшего выживания требуют присутствия фактора роста нервов (ФРН) [12]. ФРН также содержится в ядах змей и может быть выделен из него в препаративных количествах. Однако данные о возможности использования ФРН змей для поддержания жизнедеятельности нейронов отсутствуют. 6

Цель данной диссертационной работы - идентификация и выделение ранее неизвестных белковых токсинов из яда кобры Naja kaouthia, которые могут служить инструментами при исследовании рецепторов различных типов.

Использование MALDI-масс-спектрометрии для анализа фракций, полученных в результате разделения яда кобры Naja kaouthia методами жидкостной хроматографии, позволило достаточно легко идентифицировать уже известные соединения (среди них нейротоксины, цитотоксины, фактор роста нервов), а также обнаружить новые.

Впервые были обнаружены и выделены из яда кобры полипептиды, взаимодействующие с мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами; установлена их полная аминокислотная последовательность. В яде кобры нами был идентифицирован слабый нейротоксин, содержащий остаток триптофана, и установлена его пространственная структура, впервые было показано, что слабый нейротоксин является блокатором нейрональных а7 холинорецепторов.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Введение

Одним из первых обнаруженных нейромедиаторов был ацетилхолин, который связывается с рецепторами, названными ацетилхолиновыми рецепторами [13]. По различию связывания с двумя алкалоидами: никотином и мускарином холинорецепторы делятся на два фармакологических класса. При этом по своей структуре они очень сильно отличаются друг от друга. Никотиновый рецептор представляет собой лиганд-управляемый ионный канал, и сходен с такими рецепторами как ОАВАд, глициновый, серотониновый 5-НТз, [14]. Все эти рецепторы состоят из пяти субъединиц, расположенных вокруг псевдооси симметрии пятого попядка; трансмембранные домены (М2) субъединиц образуют ионный канал. При связывании агониста рецептор претерпевает аллостерические изменения в результате которых происходит открывание канала, и через него проходят ионы (катионы в случае ацетилхолинового рецептора) [15]. Мускариновый холинорецептор является рецептором, сопряженным с О-белком, сходным с адренергическими, допаминергическими, ОАВАв рецепторами [16]. Рецепторы, сопряженные с О-белком, состоят из семи трансмембранных доменов. После связывания агониста они взаимодействуют с соответствующим О-белком, что запускает каскад реакций, в конечном итоге приводящим к различным физиологическим ответам [17].

Никотиновые холинорецепторы, расположенные в нервно-мышечном соединении, и рецепторы ЦНС и ПНС структурно и фармакологически различаются между собой [3; 18]. Установленные пять подтипов мускаринового рецептора также относятся к двум разным группам: Мь Мз, М5 рецепторы, связываясь с а-субъединицей Оч/ц белка, активируют фосфолипазу Ср, вызывая образование вторичного посредника инозитол-1,4,5-трифосфата, Мг, М4 рецепторы после связывания с О^/О, белком ингибируют аденилатциклазу, снижая в итоге уровень цАМФ[19].

Мускариновые холинорецепторы расположены в постсинаптической мембране клеток эффекторных органов у окончаний большинства постганглионарных парасимпатических холинергических нейронов (т. е. в синапсах глаз, сердца, легких, желудка, кишечника) и некоторых постганглионарных симпатических нейронов (например, в синапсах потовых желез и сосудов скелетных мышц), в ЦНС: в коре головного мозга, стриатуме, гиппокампе, мозжечке, ретикулярной формации, стволе. Нейрональные никотиновые холинорецепторы находятся в постсинаптической мембране клеток у окончаний всех преганглионарных симпатических и парасимпатических нейронов, в хромаффинной ткани мозгового слоя надпочечников, в синокаротидной зоне; в ЦНС: в коре, ядрах таламуса, гипоталамусе. Мышечные никотиновые холинорецепторы располагаются в концевых пластинках скелетных мышц [20].

В ЦНС холинорецепторы участвуют в таких процессах, как двигательный контроль, поведение, сознание, эмоции, обучение и память [6, 7]. Нарушения в холинергической передаче отмечены при ряде паталогий: болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, хореи Хантингтона, шизофрении, миастении и являются в некоторых случаях основной причиной заболевания [8, 9, 10, 11].

Так как холинорецепторы широко распространены в организме и участвуют во многих его важных функциях, а нарушение их функционирования вызывает ряд серьезных заболеваний, то необходимы высокоселективные лиганды для локализации, изучения структуры и установления физиологической роли различных подтипов рецепторов.

Никотиновый рецептор Torpedo (и высоко гомологичный ему мышечный рецептор) являются на сегодняшний день наиболее полно охарактеризованными рецепторами в силу стечения двух обстоятельств: обнаружения в электрическом органе ската Torpedo высокой плотности никотиновых холинорецепторов и открытия а-нейротоксинов змей, связывающимися высокоспецифично и высокоэффективно с этими рецепторами [21]. Нейрональный ацетилхолиновый рецептор (АХР) и его подтипы охарактеризованы несколько хуже [22].

Можно выделить несколько типов нейротоксинов змей, взаимодействующих с холинорецепторами. Длинные а-нейротоксины связываются и с мышечным, и с некоторыми подтипами нейронального АХР (а7, а8 и а9 рецепторами) [23, 24], к-бунгаротоксины - с подтипами а3(32 и а4(32 нейронального рецептора [25; 26], короткие а-нейротоксины - с мышечным АХР [21].

Для мускариновых рецепторов высокоселективные лиганды долгое время известны не были, лишь сравнительно недавно в яде мамб были обнаружены токсины, специфично взаимодействующие с различными подтипами мускаринового рецептора, и названные мускариновыми токсинами [27].

Короткие а-нейротоксины состоят из 60 - 62 аминокислотных остатков и содержат четыре внутримолекулярных дисульфидных связи. Характерной особенностью их структуры является наличие трех полипептидных петель, ограниченных дисульфидными связями. Длинные а-нейротоксины состоят из 66 - 75 остатков и содержат пять дисульфидных связей. Пятая дисульфидная связь расположена во II полипептидной петле [28]. к-Бунгаротоксины и мускариновые токсины занимают как бы промежуточное положение между короткими и длинными а-нейротоксинами. к-Бунгаротоксины содержат подобно длинным а-нейротоксинами пять дисульфидных связей, состоят из 66 остатков [26], а мускариновые токсины подобно коротким а-нейротоксинам содержат четыре дисульфидных связи, но состоят из 65 - 66 аминокислотных остатков [29]. Еще один тип токсинов является промежуточным, это так называемые «слабые токсины». Они состоят из 62 - 68 аминокислотных остатков и подобно длинным а-нейротоксинам и к-бунгаротоксинам содержат пять дисульфидных связей, однако, пятая дисульфидная связь в слабых токсинах располагается в I петле [30].

В настоящем обзоре будут рассмотрены структура и свойства токсинов, относящихся к «промежуточному типу»: мускариновых токсинов и слабых токсинов, а также особенности рецепторов, с которыми взаимодействуют данные токсины: мускариновых и никотиновых холинорецепторов.

ВЫВОДЫ

1. С использованием MALDI-масс-спектрометрии проведен скрининг молекулярных масс (в диапазоне 6-25 кДа) фракций, полученных в результате разделения яда кобры Naja kaouthia методами традиционной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Проведенный скрининг позволил легко идентифицировать наряду с известными белками: нейротоксинами, цитотоксинами, фактором роста нервов (ФРН) - целый ряд минорных компонентов.

2. Для ФРН яда змей впервые показано существование двух взаимопревращающихся форм. Впервые показано также, что ФРН яда змей предотвращает гибель клеток PC 12 в бессывороточной среде, причем обе формы способствуют выживанию клеток.

3 В результате скрининга идентифицированы четыре новых белка (MTLP-1, MTLP-2, MTLP-3 и WTX) с молекулярными массами в диапазоне 7200 -7700 Да. Аминокислотные последовательности этих белков установлены методами деградации по Эдману и MALDI-масс-спектрометрии.

4. Сравнение установленных последовательностей с первичными структурами известных белков показало, что три выделенных белка (MTLP-1, MTLP-2, MTLP-3) имеют высокую степень сходства с мускариновыми токсинами, выделявшимися до сих пор только из ядов мам б. Для одного из белков кобры (MTLP-1) обнаружено взаимодействие с Мз подтипом мускаринового холинорецептора.

5. WTX относится к семейству слабых нейротоксинов и представляет собой первый триптофан-содержащий нейротоксин такого типа, выделенный из яда кобр.

6. Исследование биологической активности WTX показало, что этот токсин взаимодействует с никотиновыми мышечными холинорецепторами и а7 нейрональными холинорецепторами. Нейрональные холинорецепторы как мишень действия слабых нейротоксинов идентифицированы впервые.

Заключение

Полипептидные нейротоксины яда змей оказали и продолжают оказывать существенную помощь при исследовании структуры и механизма функционирования холинергических рецепторов. Однако возможности ядов змей как источников нейротоксинов используются далеко не полностью. В связи с этим идентификация новых компонентов, селективно воздействующих на те или иные подтипы холинорецепторов, является перспективным направлением исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор рациональной схемы выделения минорных компонентов при помощи разных видов хроматографии

При выборе схемы разделения яда кобры Naja kaouthia мы ориентировались на молекулярные массы компонентов яда, и в качестве первого этапа использовали гель-фильтрацию. Мы предполагали обнаружить новые к-бунгаротоксины, мускариновые токсины или их аналоги, которые возможно содержатся в ядах всех змей семейства Elapidae, но в разных соотношениях. Нейрональные бунгаротоксины (выделенные из яда крайта) и мускариновые токсины (из яда мамб) имеют молекулярные массы в интервале 7200 -7700 Да, что отличает их от основных компонентов яда кобр: цитотоксинов (М< 7000 Да), "коротких" (М< 7000 Да) и "длинных" (М> 7800 Да) нейротоксинов.

С учетом этой характеристики интересующих нас соединений мы и проводили фракционирование ядов. В результате гель-фильтрации яда кобры N. kaouthia на колонке с сефадексом G-50 sf нами были получены четыре фракции (Рис. 7). Фракция 1 содержала высокомолекулярные компоненты (М 50-100 кДа), и ее состав не исследовался, фракция 4 состояла из в основном соединений нуклеотидной природы и для данной работы интереса не представляла, фракция 3, содержащая основные токсические компоненты, и фракция 2 подвергались дальнейшему разделению и подробному анализу состава.

Идентификация новых полипептидов с М 7200 - 7700 Да представлялась довольно сложной, поскольку эти соединения имеют весьма близкие свойства (масса, гидрофобность, распределение заряженных остатков) с основными токсическими компонентами яда (постсинаптические нейротоксины и цитотоксины). Для анализа фракций полипептидов с близкими свойствами полученную после гель-фильтрации фракцию 3 (М 6 - 13 кДа) разделяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на катионообменной колонке НЕМА BIO 1000СМ с использованием широкого диапазона молярности (5 мМ -1 М) аммоний-ацетатного элюирующего буфера (Рис. 8).

Для всех видов ионообменной хроматографии нами применялся аммоний-ацетатный буфер, так как он удаляется из полученных фракций в процессе лиофилизации. Буферная емкость ацетата аммония минимальна при нейтральном значении pH, а буферы с низкой емкостью часто дают лучшее разрешение, чем с высокой. Так, ацетат дает лучшее разрешение, чем хлорид [67].

Полученные в результате разделения гельфильтрационного пика 3 фракции анализировали с помощью MALDI-масс-спектрометрии. При этом наряду с известными соединениями (а-кобратоксин СТХ, Л/7831 Да; "короткий" нейротоксин NXS1, М6982 Да;

А 2-5 230

2,01,5 -1,0 0,50,0--0,Е 0 гОССМ? Л 1

50-100 кДа

13-26 к Да

1 к Да

50

100

150

200

Номер фракции

Рисунок 7. 200 -300 мг высушенного яда N. ксюШМа фракционировали на колонке (2.5 х 90 см) с сефадексом 0-50 81" в 0.1 М аммоний-ацетатном буфере, рН 6.2, при скорости потока 10 мл/час. Отмечены собранные фракции.

Рисунок 8. Разделение компонентов фракции 3, (рис. 1) ионообменной ВЭЖХ на колонке НЕМА ВЮ 1000 СМ (8 х 250 мм) в линейном градиенте концентрации аммоний-ацетатного буфера, рН 7.5, (5мМ -» 1М за 100 мин) при скорости потока 1.4 мл/мин цитотоксины СХ5, СХЗ и СХ2, М 6654, 6717 и 6745 Да соответственно) были обнаружены также неизвестные ранее полипептиды (MTLP-3, MTLP-1, WTX), имеющие молекулярные массы в интересующем нас диапазоне. Эти соединения подвергали дополнительной очистке с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac Ci8, и определяли молекулярные массы полипептидов с помощью MALDI-масс-спектрометрии.

С целью увеличения выхода новых соединений мы решили применить иную схему выделения и использовать на первом этапе вместо гель-фильтрации фракционирование на катионообменной смоле Bio-Rex 70 (полимер метакриловой кислоты, кросс-сшитой дивинилбензеном), разделение проводили в градиенте увеличивающейся молярности (0.05 М ->0.5 М) аммоний-ацетатного буфера (Рис. 9). Этот метод ранее применялся для получения а-кобратоксина [153]. Полученные фракции проанализировали методом MALDI-масс-спектрометрии, в результате чего был обнаружен новый полипептид с М 7295 Да, названный MTLP-2. Мы смогли получить только этим методом. Дальнейшую очистку MTLP-2 проводили при помощи катионообменной ВЭЖХ на колонке TSK CM-3SW (Рис. 10). Этот способ позволил также получать в препаративных количествах новый полипептид WTX, его окончательная очистка проводилась катионообменной ВЭЖХ на колонке TSK SP-5PW (рисунки не приведены). Выход WTX был примерно одинаков при использовании обоих методов.

Выход MTLP-1 составил -0.2% от массы цельного яда, MTLP-2 -0.2%, MTLP-3 -0.02% и WTX -5.0 - 6.0%.

2. Выделение фактора роста нервов (ФРН) из яда кобры N. kaouthia

При анализе фракции 2, полученной в результате гельфильтрации (М 13-26 кДа) нами был обнаружен фактор роста нервов (ФРН). Поскольку ФРН необходим для выживания и развития холинергических нейронов [12], а данные о влиянии ФРН змей на выживаемость клеток отсутствуют, мы выделили этот белок в препаративных количествах для исследования его биологической активности. Из цельного яда белок выделяли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 sf с последующей высокоэффективной катионообменной хроматографией в аммоний-ацетатном буфере на колонке НЕМА 1000 BIO СМ (Рис. 11). Анализ полученных фракций методом MALDI-масс-спектрометрии позволил идентифицировать фракцию, содержащую ФРН с М 13062 Да.

Для окончательной очистки применялась обращенно-фазовая ВЭЖХ на колонке Vydac С18, в ходе которой было получено две формы ФРН, имеющие одинаковую молекулярную массу (в пределах ошибки измерения), но различающиеся по времени удерживания на

Номер фракции

Рисунок 9. 200 - 300 мг высушенного яда N. kaouthia разделяли на колонке Bio-Rex 70 (1.5 х 35 см) в градиенте аммоний-ацетатного буфера, pH 6.5 (0.05 М (500 мл) 0.5 М (500 мл)) при скорости потока 38 мл/час.

20 40 Ш ® МИН

Рисунок 10. Разделение компонентов фракции, содержащей МТЪР-2, (рис. 3) ионообменной ВЭЖХ на колонке Т8К СМ-ЗЗ1^ в градиенте аммоний-ацетатного буфера, рН 7.5, (5мМ —» 1Мза 100 мин) при скорости потока 1 мл/мин.

Рисунок 11. Разделение компонентов фракции 2, (Рис. 7) ионообменной ВЭЖХ на колонке НЕМА ВЮ 1000 СМ (8 х 250 мм) в линейном градиенте концентрации аммоний-ацетатного буфера, рН 7.5, (5 мМ —> 1М за 100 мин) при скорости потока 1.4 мл/мин. ФЛ22 -фосфолипаза 22, ФЛ23 - фосфолипаза 23, ФРН - фактор роста нервов. обращенно-фазовой колонке. При рехроматографировании в тех же условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ каждая из фракций давала по два пика, элюирующихся при той же концентрации буфера, что и исходные фракции. Молекулярные массы обеих изоформ M (13048.0 ± 15.0 Да и 13063.0 ± 9.0 Да) очень близки молекулярной массе, вычисленной на основании аминокислотной последовательности (13058.0 Да) [154, 155]. Выход ФРН составил ~0.1 %. Обращенно-фазовая хроматография не вызывала инактивации ФРН кобры (см. ниже).

Полученные нами данные впервые показали наличие двух взаимопревращающихся форм ФРН кобры в условиях обращенно-фазовой хроматографии. Объяснить присутствие двух форм ФРН можно тем, что одна из них представляет собой ФРН, подвергающийся обратимому разворачиванию в условиях обращенно-фазовой хроматографии. Ранее подобное поведение в условиях ВЭЖХ было обнаружено для рекомбинантного нейротрофического фактора мозга человека (BDNF) [156]. При дальнейшем более тщательном исследовании поведения BDNF в условиях ВЭЖХ [157] показано, что этот белок подвергается денатурации в кислых условиях (рН 2.1), а денатурированную форму (элюирующуюся позже) можно рассматривать как мономерное компактное состояние, не обладающее третичной структурой, но сохраняющее в значительной степени вторичную структуру.

Имеющиеся в литературе данные [158] о поведении рекомбинантного ФРН человека в условиях ВЭЖХ свидетельствуют о практически полном отсутствии денатурированной формы, значительное количество которой появляется лишь после предварительной инкубации белка (более одного дня) в денатурирующих условиях (хлоргидрит гуанидина в концентрации более ЗМ). Кроме того, в отличие от ФРН человека, ФРН кобры возвращается в исходное состояние значительно медленнее. Это различие в конформационной подвижности можно объяснить отличиями аминокислотных последовательноятей ФРН кобры и человека. В частности ФРН кобры содержит на один остаток пролина больше. Таким образом, по хроматографическому поведению ФРН кобры более близок BDNF, а не ФРН человека.

3. Исследование влияния ФРН на выживаемость клеток PC 12

Аминокислотные последовательности ФРН млекопитающих (мыши и человека) и ФРН кобры достаточно близки (60 % идентичных а. о.), однако имеющиеся отличия затрагивают участки, которые являются существенными для взаимодействия с рецепторами Trk А и р75 [159, 160]. Было показано, что нейротрофический фактор из мозга человека (BDNF) и нейроторофин-3 (NT3) имеют такой же процент сходства с ФРН (-60 %), однако проявляют при этом разную биологическую активность, взаимодействуя с разными видами рецепторов Trk [161]. Отличия в аминокислотных последовательностях между ФРН кобры и ФРН мыши могут также обусловливать различия в их биологическом действии, и эти различия могут способствовать пониманию молекулярного механизма, обусловливающего активность ФРН.

При исследовании влияния ФРН из яда N. kaouthia на клетки феохромоцитомы крысы PC 12, обладающих свойствами адренальных медуллярных клеток и симпатических нейронов

162], нами было установлено, что обе формы ФРН в коцентрации 100 нг/мл стимулировали дифференцировку (появление нейритоподобных отростков) клеток, культивировавшихся в бессывороточной среде. Клетки PC 12 имеют преимущество перед изолированными нейронами, так как они являются достаточно гомогенным материалом и не требуют присутствия ФРН для выживания в среде, содержащей эмбриональную сыворотку коров FSC

163]. Действие ФРН на клетки РС12 превращает их из популяции делящихся хромаффино-подобных клеток в неделящиеся клетки, обладающие свойствами симпатических нейронов [162]. Если из среды сыворотка удаляется, клетки PC 12 погибают с полупериодом менее двух дней. Ранее было показано, что если 78-ФРН мыши добавлялся к такой бессывороточной культуре клеток PC 12, гибель не наступала, и у клеток PC 12 развивались нейрито-подобные отростки [164]. В литературе не было данных о влиянии на выживаемость клеток ФРН из яда змей. Нашей целью было выяснить предотвращает ли ФРН из яда кобры N. kaouthia гибель клеток PC 12 в бессывороточной среде и проверить, есть ли разница в биологической активности между двумя полученными формами ФРН.

Для изучения влияния ФРН на выживаемость клеток обе формы ФРН были протестированы на праймированных клетках PC 12 в концентрации 1 - 200 нг/мл. В качестве контроля использовали праймированные клетки PC 12 без добавок. Оценка количества выживших клеток проводилась спектрофотометрически по образованию окраски под действием МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромид) [165]. При этом было обнаружено, что обе формы ФРН способствовали выживанию праймированных клеток РС12 в бессывороточной среде (Рис. 12). Таким образом, нами было установлено, что действие ФРН из яда кобры сопоставимо с влиянием 78-ФРН из подчелюстных желез мыши, максимум воздействия отмечался при концентрации 100 нг/мл. Интересно, что вторая форма, соответствующая развернутой конформации белка, способствовала выживанию клеток в меньших концентрациях (рис. 12В), по сравнению с первой неденатурированной формой (рис. 12А).

Наши данные показали, что влияние 78-ФРН мыши и ФРН кобры на клетки PC 12 очень похожи. Однако, необходимо отметить, что не все нейротрофические факторы оказывают о? Ц

300 и к о к н о

250 о а 200 л н о о о св со

К *

13 га

150

100

§ 350 о а. о 300 н о

Ь250 и о н ю ь: м л н о о § к * Ю

200

150

100

50 100 150

Концентрация нг/мл I

200 В

50 100 150 200

Концентрация нг/мл

§ 300' о в

§ 250н о

§ 200

150"

100

50 100 150 200

Концентрация нг/мл

Рисунок 12. Зависимость выживаемости клеток РС12 от концентрации ФРН кобры (А и В) и 78-ФРН мыши (С). А - ФРН кобры, элюирующийся первым пиком в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ, В - второй пик при ВЭЖХ. Каждая точка представляет данные (среднее ± Б.Е.М.) восьми независимых экспериментов. сходное воздействие на клетки РС12. Например, NT3 не предотвращает гибели клеток, вызванной удалением ФРН из культуры дифференцированных клеток [166]. Это различие в биологических эффектах нейроторофинов объясняется их связыванием с разными типами рецепторов. Рецепторы TrkA, TrkB и TrkC имеют наибольшее сродство к ФРН, BDNF и NT3, соответственно [167].

Аминокислотными остатками, определяющими специфичность ФРН человека по отношению к рецептору TrkA являются Pro5, Phe7 (проксимальная часть N-конца), Val48, Phe49 и Gln96 (две верхние (З-петли NGF) [159]. Важное значение N-концевой последовательности 2 - 13 в ФРН человека для связывания с рецептором TrkA было недавно подтвержденно данными по кристаллической структуре комплекса ФРН с лиганд-связывающим доменом рецептора TrkA [160]. Большинство аминокислотных остатков этого участка консервативны среди ФРН млекопитающих, однако ФРН кобры имеет некоторые замены в этом участке, например, His вместо Phe7 и Туг вместо Phe49. Тем не менее эти различия не вызывают отличий между 7S-OPH мыши и ФРН кобры в поддержании жизнеспособности клеток PC 12 в бессывороточной среде. Это означает, что либо на взаимодействие ФРН с рецептором TrkA не влияют подобные замены в аминокислотной последовательности, либо механизм выживания клеток более сложен и включает в себя не только активацию рецептрора TrkA.

4. Установление полных аминокислотных последовательностей полипептидов MTLP

Для установления аминокислотных последовательностей пиридилэтилированные производные полипептидов MTLP-1, MTLP-2 и MTLP-3 были подвергнуты деградации по методу Эдмана, и таким образом установлены N-концевые последовательности: 43 а. о. для MTLP-1, 36 а. о. (с пробелами в 28, 34 и 35 положениях) для MTLP-2 и 39 а. о. для MTLP-3 (Рис. 13). Для установления первичной структуры С-концевого фрагмента полипептида MTLP-1 был проведен гидролиз его пиридилэтилированного производного а-химотрипсином, полученные пептиды разделены обращенно-фазовой ВЭЖХ и секвенированы. Секвенирование перекрывающихся химотриптических пептидов позволило установить полную аминокислотную последовательность MTLP-1 (Рис. 13). Молекулярная масса, рассчитанная по аминокислотной последовательности (7359 Да), хорошо согласуется с таковой, установленной MALDI-масс-спектрометрией (7361 Да).

Полная аминокислотная последовательность полипептида MTLP-2 была установлена секвенированием триптических пептидов и пептидов, полученных в результате гидролиза бромцианом (Рис. 13). Молекулярная масса, рассчитанная по аминокислотной

МТЪР-З

СЪу

СЬу

Прямое секвенирование

СЬу

1 10 20 30 40 50 60

МТЬР-1 ЫСУКЕЮГЪЕ ЗЕТТЕТСРБв 0ЫУСЕ№АНЬ 1УРвКУКИТК вСААТСРКЬО ЫШЭ-У1ЕССЗТ БКСЫЬ

МТЪР-2 ЬТСУКЕК31Е (ЗУТТЕВСРОв ОНЬСЕККЮНМ ГУРвКУККТИ вСААТСР1АЕ ШЮ-У1ЕССЗТ БКСЫЬ

Прямое секвенирование

Тгу

Тгу

Тгу

ВгСЫ

Т1СУКНЬТ11Т ЗЕТТЕ1СРБЗ теУЕСУК13ЬА ВаМО-УШКВ. ССТЕТСРЕЬИ РТС1УУУССН11 БКСЫО -► -►

Прямое секвенирование

С1и-С —►

Тгу

Рисунок 13. Установление аминокислотных последовательностей МТЬР-1, МТЬР-2 и МТЬР-3. Стрелками показаны ]Ч-концевые аминокислотные последовательности, определшные деградацией го методу Эдмана пиридилэшлированных производных целых полипепгидов. С-концевые фрагменты усшновлшы в результате секвенирования покрывающихся пепщдов, полученных в результате расщепления химогрипсином (СИу), трипсином (Тгу), бромцианом (ВгОМ) и эндопротеиназой Ои-С из 81арку1ососсих аигшч (Ои-С). споследовательности (7291 Да), также хорошо согласуется с установленной MALDI-масс-спектрометрией (7293 Да). Полная аминокислотная последовательность полипептида MTLP-3 установлена секвенированием триптических пептидов и пептидов, полученных гидролизом эндопротеиназой Glu-C из Staphylococcus aureus (Рис. 13). Молекулярная масса, рассчитанная по аминокислотной последовательности (7615 Да), совпадает с установленной MALDI-масс-спектрометрией (7615 Да).

Каждый из трех выделенных полипептидов состоит из 65 а. о., имеет четыре дисульфидных связи и по своей структуре относятся к семейству "трехпетельных токсинов".

5. Сопоставление аминокислотных последовательностей полипептидов MTLP с последовательностями известных токсинов

Сравнение установленных нами аминокислотных последовательностей MTLP с первичными структурами известных белков выявило, что наибольшее сходство наблюдается с мускариновыми токсинами мамб.

Токсины, взаимодействующие с мускариновым ацетилхолиновым рецептором, впервые были обнаружены в яде зеленой мамбы Dendroaspis angusticeps в 1988 году [27]. К настоящему времени установлены полные аминокислотные последовательности девяти токсинов, взаимодействующих с мускариновыми рецепторами (подтипы Mi - М5) с различным сродством (см. Табл. 1 и Табл. 2 литературного обзора) [29, 62]. Среди них присутствуют как агонисты, так и антагонисты, но все они были выделены из яда мамб. Также к этой группе можно отнести два токсина синергического типа из яда мамб [93, 168]. Мускариновые токсины представляют собой гомологичную группу, имеющую более 60 % идентичных аминокислотных остатков.

Сравнение установленных нами аминокислотных последовательностей полипептидов MTLP-1 {Р82462- номер в базе данных SWISS-PROT) и MTLP-2 (Р82463) с токсинами, приведенными в Табл. 1, показало примерно такую же степень подобия (Рис. 14). Между собой аминокислотные последовательности MTLP-1 и MTLP-2 идентичны на 71 % (46 а. о./65 а. о.) (Табл. 6). MTLP-2 проявил особенно яркое сходство с мускариновыми токсинами. Он обладает наибольшим сходством с мускариновым токсином |3 (Р80495) из яда черной мамбы D. polylepsis (неселективным лигандом для М3, М4 и М5 подтипов мускаринового рецептора) [77] (73 % идентичных а. о.) и тремя другими токсинами (Р80970, Р25518 и Р81031), имеющими 72 % одинаковых а. о. с MTLP-2 [65, 93, 169]. MTLP-1 обладает наибольшим сходством с токсином ml (другое название: МТ7) (Р80970) из яда зеленой мамбы D. angusticeps (совпадает -58% а. о.), токсин ml на сегодняшний день

10 20 30 40 50 60 ысукекеце зет!|е':'ср:.с оышгхдян:. нурскукити ссаатсркь<2 ы-кбу1ессэ тбксиъ мтьр-1 (Р82462) ьтсукбывш у?т|е|ср:<з ОЫЬСЕКШС^ ррцмурети ссаатсркае -укбушссс токсык мускариновый токсин 7 (Р80970) ьтсукекбiе сутшецсрбс ¡¡урскукктк ссаатср1ае ык-бу1ессз тбксыь МТЬР-2 (Р82463) ьтсутбк31е СТТТЕОСРВС дыьсркяину ссуатсрiре ыу-обшсск тбксые мускариновый токсин Р (Р80495) т1сушь|кт зетше 'српз 1яуесук13ъа бсшу-кши сстетсреьк ртиущусск КБКСЫО МТЬР-З (Р82464)

ТЮУШЪБКТ рет§Е1СРБЗ л'УЬ'СУКГЗ^А ГКК СЗСТ?ТСРЕ1.К РТОЖУрУССН Р.ОКСЫО нейротоксин-подобный белок (С>9!Г727)

Рисунок 14. Аминокислотные последовательности мускариновых токсинов. Последовательности МШР-1, МПР-2 и МПР-З определены в данной работе. В скобках указаны номера пептидов в базах данных ТгЕМВЬ и 5Ш88-РЯОТ. Каждый голипепщц МШР соотнесен с известным белком, облад ающим с ним наибольшим сходством: мускариновым токсином 7 из яда зеленой мамбы Л щд^йсеръ, мускариновым токсином (3 ю ада чфюй мамбы Г). рЫукря, нейрогоксин-подобным белком из яд а крайгаЯ пгиШапсЛш. Инвариантные остатки показаны жирным шрифтом, консервативные - курсивом.

1. Changeux J.-P., Edelstein S.J. Allosteric receptors after 30 years. Neuron. 1998. V. 21. P. 959980.

2. Jan L.Y., Jan Y. N. Cloned potassium channels from eukaryotes and prokaryotes. Annu. Rev. Neurosci. 1997. V. 20. P. 91-123.

3. Utkin Yu.N., Tsetlin V.I., Hucho F. Structural organization of nicotinic acetylcholine receptors. Membr. Cell Biol. 2000. V. 13. № 2. P. 143-164.

4. Hucho F., Tsetlin V.I. Structural biology of key nervous system proteins. J. Neurochem. 1996. V.66. № 5. P. 1781-1792.

5. Hucho F. Toxins as tools in neurochemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995. V. 34. P. 3950.

6. Holladay M.W., Dart M.J., Lynch J.K. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors as targets for drug discovery. J. Med. Chem. 1997. V. 40. № 26. P. 4169-4194.

7. Caulfield M.P., Muscarinic receptors characterization, coupling and function. Pharmac. Ther. 1993. V. 58. P. 319-379.

8. Guan Z.-Z., Zhang X., Ravid R., Nordberg A. Decreased protein levels of nicotinic receptor subunits in the hippocampus and temporal cortex of patients with Alzheimer's Disease. J. Neurochem. 2000. V. 74. № 1. P. 237-243.

9. Lindstrom J.M. Acetylcholine receptors and myasthenia. Muscle & Nerve. 2000. V. 23. P. 453477.

10. Eglen R.M., Choppin A., Dillon M.P., Hegde S. Muscarinic receptor ligands and their therapeutic potential. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V. 3. № 4. P. 426-432.

11. Candel E.R., Schwartz J.H., Jessell T.M. Essentials of neural science and behaviour. Norwalk, Connecticut Appleton & Lange, 1995.

12. Dale H.H. The action of certain esters and esters of choline and their relation to muscarine. J. Pharmacol. 1914. V. 6. P. 147-190.

13. Stroud R.M., McCarthy M.P., Shuster M. Nicotinic acetylcholine receptor superfamily of ligand-gated ion channels. Biochemistry. 1990. V. 29. № 50. P. 11009-11023.

14. Changeux J.-P. The nicotinic acetylcholine receptor: an allosteric protein prototype of ligand-gated ion channels. TiPS. 1990. V. 11. P. 485-492.

15. Kostenis E., Zeng F.-Y., Wess J. Structure-function analysis of muscarinic acetylcholine receptors. J. Physiology (Paris). 1998. V. 92. № 3-4. P. 265-268.

16. Felder C.C. Muscarinic acetylcholine receptors: signal transduction through multiple effectors. FASEB J. 1995. V.9. P. 619-625.

17. Role L.W., Berg D.K. Nicotinic receptors in the development and modulation of CNS synapses. Neuron. 1996. V. 16. P. 1077-1085.

18. Felder C.C. Signal transduction pathways activated by muscarinic receptors subtypes. In: Molecular mechanisms of muscarinic acetylcholine receptor function. Ed. Wess J. 1995. P. 3346. R.G. Landes Company.

19. Taylor P., Brown J.H. Acetylcholine. In: Basic neurochemistry: molecular, cellular and medical aspects. Ed. Siegel J. et al. 1999. P. 211-242. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia.

20. Уткин Ю.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. а-Нейротоксины и а-конотоксины -блокаторы никотиновых холинорецепторов. Биоорган. Хим. 1999. Т. 25. № 11. С. 805-810.

21. Lindstrom J. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors. In: Ion channels. V. 4. Ed. Narahashi T. 1996. P. 377-450. Plenum Press, New York.

22. McGehee D.S., Role L.W. Physiological diversity of nicotinic acetylcholine receptors expressed by vertebrate neurons. Annu. Rev. Physiol. 1995. V. 57. P. 521-546.

23. Loring R.H. The molecular basis of curaremimetic snake neurotoxin specificity for neuronal nicotinic receptor subtypes. J. Toxicol. 1993. V. 12. № 2. P. 105-153.

24. Tsetlin V. Snake venom a-neurotoxins and other "three-finger" proteins. Eur. J. Biochem. 1999. V. 264. P. 281-286.

25. Bradley K.N. Muscarinic toxins from the green mamba. Pharmacology&Therapeutics. 2000. V. 85. P. 87-109.

26. Chang L., Lin S., Wang J., Hu W.-P., Wu B., Huang H. Structure-function studies on Taiwan cobra long neurotoxin homolog. Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1480. P. 293-301.

27. Hulme E.C., Birdsall N.J.M., Buckley N.J. Muscarinic receptor subtypes. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1990. V. 30. P. 633-673.

28. Wess J. Molecular basis of muscarinic acetylcholine receptor function. Trends Pharmacol. Sci. 1993. V. 14. P. 308-313.

29. Strader C.D., Fong T.M., Tota M.R., Underwood D., Dixon R.A. Structure and function of G protein-coupled receptors. Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 101-132.

30. Savarese T.M., Fraser C.M. In vitro mutagenesis and the search for structure-function relationships among G protein-coupled receptors. Biochem. J. 1992. V. 283. P. 1-9.

31. Clapman D.E., Neer E.J. New roles for G protein (3y-dimers in transmembrane signalling. Nature. 1993. V. 365. P. 403-406.

32. Bonner T.I., Young A.C., Brann M.R., Buckley N.J. Cloning and expression of the human and rat m5 muscarinic acetylcholine receptor genes. Neuron. 1988. V. 1. № 5. P. 403-410.

33. Caulfield M P., Birdsall J.M. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacological Reviews. 1998. V. 50. № 2. P. 279-290.

34. Harvey A.L., Bradley K.N., Cochran S.A., Rowan E.G., Pratt J.A., Quillfeldt J.A., Jerusalinsky D A. What can toxins tell us for drug discovery? Toxicon. 1998. V. 36. № 11. P. 1635-1640.

35. Levey A.I., Kitt C.A., Simonds W.F., Price D.L., Brann M.R. Identification and localization of muscarinic acetylcholine receptor proteins in brain with subtype-specific antibodies. J. Neorosci. 1991. V. 11. P. 3218-3226.

36. Levey A. Immunological localizationof ml-m5 muscarinic acetylcholine receptors in peripheral tissues and brain. Life Sci. 1993. V. 52. P. 441-443.

37. Max S.I., Liang J.S., Potter L.T. Purification and properties of ml-toxin, a specific antagonist of ml muscarinic receptors. J. Neurosci. 1993. V. 13. № 10. P. 4293-4300.

38. Jerusalinsky D., Kornisiuk E., Alfaro P., Quillfeldt J., Ferreira A., Rial V.E., Duran R., Cervenansky C. Muscarinic toxins: novel pharmacological tools for the muscarinic cholinergic system. Toxicon. 2000. V. 38. P. 747-761.

39. Bahouth S.W., Wang H.Y., Malbon C.C. Immunological approaches for probing receptor structure and function. Trends. Pharmacol. Sci. 1991. V. 12. P. 338-343.

40. Baldwin J.M., Schertler G.F., Unger V.M. An alpha-carbon template for the transmembrane helices in the rhodopsin family of G-protein-coupled receptors. J. Mol. Biol. 1997. V. 272. P. 144-164.

41. Wess J. Mutational analysis of muscarinic acetylcholine receptors: structural basis of ligand/receptor/G protein interactions. Life Sci. 1993. V. 53. № 19. P. 1447-1463.

42. Wess J., Liu J., Blin N., Yun J., Lerche C., Kostenis E. Structural basis of receptor/G protein coupling selectivity studied with muscarinic receptors as model systems. Life Sci. 1997. V. 60. № 13-14. P. 1007-1014.

43. Nordvall G, Hackell U. Binding-site modeling of the muscarinic ml receptor molecular interactions with agonists and antagonists. In: Molecular mechanisms of muscarinic acetylcholine receptor function Ed. Wess J. 1995. P. 19-32. R.G. Landes Company.

44. Baldwin J.M. The probable arrangement of the helices in G protein coupled receptors. EMBO J. 1993.V. 12. P. 1693-1703.

45. Pittel Z., Wess J. Intramolecular interactions in muscarinic acetylcholine receptors studied with chimeric m2/m5 receptors. Mol. Pharmacol. 1994. V. 45. P. 61-64.

46. Spalding T.A., Birdsall N.J.M., Curtis C.A.M., Hulme E.C. Acetylcholine mustard labels the binding site aspartate in muscarinic acetylcholine receptors. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 4092-4097.

47. Hulme E C., Curtis C.A., Page K.M., Jones P.G. The role of charge interactions in muscarinic agonist binding, and receptor-response coupling. Life Sci. 1995. V. 56. P. 891-898.

48. Matsui H., Lazareno S., Birdsall N.J.M. Probing of the location of the allosteric site on ml muscarinic receptors by site-directed mutagenesis. Mol. Pharmacol. 1995. V. 47. P. 88-98.

49. Wess J., Gdula D., Brann M.R. Structural basis of the subtype selectivity of muscarinic antagonists: A study with chimeric m2/m5 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 1992. V. 41, P. 369-374.

50. Wess J., Nanavati S., Vogel Z., Maggio R. Functional role of proline and tryptophan residues highly conserved among G protein-coupled receptors studied by mutational analysis of the m3 muscarinic receptor. EMBO J. 1993. V. 12. № 1. P. 331-338.

51. Karlsson E., Jolkkonen M., MutulgetaE., Onali P., Adem A. Snake toxins with high selectivity for subtypes of muscarinic acetylcholine receptors. Biochimie. 2000. V. 82. № 9-10. P. 793806.

52. Jerusalinsky D., Harvey A.L. Toxins from mamba venoms: small proteins with selectivities for different subtypes of muscarinic acetylcholine receptors. Trends. Pharmacol. Sci. 1994. V. 15. P. 424-430.

53. Max S.I., Liang J.S., Potter L.T. Stable allosteric binding of ml-toxin to ml muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 1993. V. 44. № 6. P. 1171-1175.

54. Carsi J.M., Potter L.T. mi-Toxin isotoxins from the green mamba (Dendroaspis angusticeps) that selectively block ml muscarinic receptors. Toxicon. 2000. V. 38. P. 187-198.

55. Carsi J.M., Valentine H.H., Potter L.T. m2-Toxin: a selective ligand for M2 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 1999. V. 56. P. 933-937.

56. Jolkkonen M., van Giersbergen P.L., Hellman U., Wernstedt C., Karlsson E. A toxin from the green mamba Dendroaspis angusticeps: amino acid sequence and selectivity for muscarinic m4 receptors. FEBS Lett. 1994. V. 352. P.91-94.

57. Liang J.S., Carsi-Gabrenas J., Krajewski J.L., McCafferty J.M., Purkerson S.L., Santiago M.P., Strauss W.L., Valentine H.H., Potter L.T. Anti-muscarinic toxins from Dendroaspis angusticeps. Toxicon. 1996. V. 34. № 11-12. P. 1257-1267.

58. Miyoshi S., Tu A T. Phospholipase A2 from Naja naja sputatrix venom is a muscarinic acetylcholine receptor inhibitor. Arch. Biochem. Biophys. 1996. V. 328. № 1. P. 17-25.

59. Miyoshi S., Tu A.T. Muscarinic acetylcholine receptor (mAChR) inhibitor from snake venom: interaction with subtypes of human mAChR. Arch. Biochem. Biophys. 1999. V. 369. № 1. P. 114-118.

60. Miyoshi S., Tu A.T. A snake venom inhibitor to muscarinic acetylcholine receptor (mAChR): isolation and interaction with cloned human mAChR. Arch. Biochem. Biophys. 2000. V. 377. № 2. P. 290-295.

61. Rauch B., Colvin R.A., Katz A.M., Messineo F.C. Effect of exogenous phospholipase A2 treatment on cardiac muscarinic receptors of highly purified canine sarcolemmal vesicles. J. Mol. Cell. Cardiol. 1987. V. 19. P. 569-580.

62. Rauch B., Niroomand F., Messineo F.C., Weis A., Kubler W., Hasselbach W. Effect of phospholipid hydrolysis by phospholipase A2 on the kinetics of antagonist binding to cardiac muscarinic receptors. Biochem. Pharmacol. V. 48. P. 1289-1296.

63. Czerwiec E., de Backer J.P., de Potter W., Vauquelin G. Selective masking of Ml-receptors in calf retina membranes by the venom of the marine snail Conus tessulatus. Neurochem. Int. 1993. V. 23. № 1. P. 79-85.

64. Ducancel F., Rowan E.G., Cassar E., Harvey A.L., Menez A., Boulain J.C. Amino acid sequence of a muscarinic toxin deduced from the cDNA nucleotide sequence. Toxicon. 1991. V. 29. №4-5. P. 516-520.

65. Nasman J., Jolkkonen M., Ammoun S., Karlsson E., Akerman K.E. Recombinant expression of a selective blocker of M(l) muscarinic receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 271. №2. P. 435-439.

66. Jolkkonen M., van Giersbergen P.L., Hellman U., Wernstedt C., Oras A., Satyapan N., Adem A., Karlsson E. Muscarinic toxins from the black mamba Dendroaspis polylepis. Eur. J. Biochem. 1995. V. 234. P. 579-585.

67. Kornisiuk E., Jerusalinsky D., Cervenansky C., Harvey A.L. Binding of muscarinic toxins MTxl and MTx2 from the venom of the green mamba Dendroaspis angusticeps to cloned human muscarinic cholinoceptors. Toxicon. 1995. V. 33. № 1. P. 11-18.

68. Waelbroeck M., De Neef P., Domenach V., Vandermeers-Piret M.C., Vandermeers A. Binding of the labelled muscarinic toxin 125I-MT1 to rat brain muscarinic Ml receptors. Eur. J. Pharmacol. 1996 V. 305. № 1-3. P. 187-192.

69. Adem A., Jolkkonen M., Bogdanovic N., Islam A., Karlsson E. Localization of Ml muscarinic receptors in rat brain using selective muscarinic toxin-1. Brain Res. Bull. 1997. V. 44. № 5. P. 597-601.

70. Adem A., Karlsson E. Muscarinic receptor subtype selective toxins. Life Sci. 1997. V. 60. № 13-14. P. 1069-1076.

71. Menez A. Functional architectures of animal toxins: a clue to drug design? Toxicon. 1998. V. 36. № 11. P. 1557-1572.

72. Jerusalinsky D., Kornisiuk E., Bernabeu R., Izquierdo I., Cervenansky C. Muscarinic toxins from the venom of Dendroaspis snakes with agonist-like actions. Toxicon. 1995. V. 33. № 4. P. 389-397.

73. Jolkkonen M., Adem A., Hellman U., Wernstedt C., Karlsson E. A snake toxin against muscarinic acetylcholine receptors: amino acid sequence, subtype specificity and effect on guinea-pig ileum. Toxicon. 1995. V. 33. № 4. P. 399-410.

74. Jerusalinsky D., Cervenansky C., Walz R., Bianchin M., Izquierdo I. A peptide muscarinic toxin from the green mamba venom shows agonist-like action in an inhibitory avoidance learning task. Eur. J. Pharmacol. 1993. V. 240. № 1. P. 103-105.

75. Olianas M.C., Adem A., Karlsson E., Onali P. Rat striatal muscarinic receptors coupled to the inhibition of adenylyl cyclase activity: potent block by the selective m4 ligand muscarinic toxin 3 (MT3). Br. J. Pharmacol. 1996. V. 118. № 2. P. 283-288.

76. Olianas M.C., Ingianni A., Maullu C., Adem A., Karlsson E., Onali P. Selectivity profile of muscarinic toxin 3 in functional assays of cloned and native receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999. V. 288 № 1. P. 164-170.

77. Jerusalinsky D., Kornisiuk E., Alfaro P., Quillfeldt J., Alonso ML, Verde E.R., Cervenansky C., Harvey A. Muscarinic toxin selective for m4 receptors impairs memory in the rat. Neuroreport. 1998. V. 9. P. 1407-1411.

78. Potter L.T., Krajewski J.L., Dickerson I.M. Cloning and expression of the cDNA for an ml-toxin. Life Sci. 1997. V. 60. P. 1205.

79. Krajewski J.L., Dickerson I.M., Potter L.T. Expression of recombinant ml-toxin 1 in yeast. Life Sci. 1999. V. 64. P. 558.

80. Joubert F.J. The amino acid sequence of protein CM-3 from Dendroaspis polylepis polylepis (black mamba) venom. Int. J. Biochem. 1985. V. 17 № 6. P. 695-699.

81. Henderson C. Making mouse muscle move. Trends Neurosci. 1990. V. 13. P. 39-41.

82. Mulle C., Changeux J.-P. A novel type of nicotinic receptor in the rat central nervous system characterized by patch-clamp techniques. J. Neurosci. 1990. V. 10. P. 169-175.

83. Karlin A., Akabas M.H. Toward a structural basis for the function of nicotinic acetylcholine receptors and their cousins. Neuron. 1995. V. 15. P. 1231-1244.

84. Chiappinelli V.A. Toxins affecting cholinergic neurons. In: Neromethods. V. 12. Drugs as tools in neurotransmitter research. Ed. Boulon A.B., Baker G.B., Juorio A.V. 1989. P. 103-159. The Humana Press, Inc., Clifton, NJ.

85. Chen N., Dang H., Patrick J.W. Contributions of N-linked glycosylation to the expression of a functional a7-nicotinic receptor in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 1998. V. 70. P. 349-357.

86. Gerzanich V., Anand R., Lindstrom J. Homomers of a8 and al subunits of nicotinic receptors exhibit similar channel but contrasting binding site properties. Mol. Pharmacol. 1994. V. 45. P. 212-220.

87. Elgoyhen A.B., Johnson D.S., Boulter J., Vetter D.E., Heinemann S. Alpha 9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 1994. V. 79. № 4. P. 705-715.

88. Claudio T., Ballivet M., Patrick J., Heinemann S. Nucleotide and deduced amino acid sequences of Torpedo californica acetylcholine receptor gamma subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. №4. P. 1111-1115.

89. Deneris E.S., Connolly J., Rogers S.W., Duvoisin R. Pharmacological and functional diversity of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Trends Pharmacol. Sci. 1991 V. 12. № 1. P. 34-40.

90. Galzi J.L., Bertrand S., Corringer P. J., Changeux J.P., Bertrand D. Identification of calcium binding sites that regulate potentiation of a neuronal nicotinic acetylcholine receptor. EMBO J. 1996. V. 15. № 21. P. 5824-5832.

91. Luetje C., Wada K., Rogers S., Abramson S.N., Tsuji K., Heinemann S., Patrick J. Neurotoxins distinguish between different neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit combinations. J. Neurosci. 1990. V. 55. № 2. P.632-640.

92. Sargent P. The diversity of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Annu. Rev. Neurosci. 1993. V. 16. P. 403-443.

93. Role L. Diversity in primary structure and function of neuronal nicotinic acetylcholine receptor channels. Curr. Opin. Neurobiol. 1992. V. 2. P. 254-262.

94. Clarke P.B. The fall and rise of neuronal alpha-bungarotoxin binding proteins. Trends Pharmacol. Sci. 1992. V. 13. № 11. P. 407-413.

95. Jones S., Sudweeks S., Yakel J.L. Nicotinic receptors in the brain: correlating physiology with function. Trends Neurosci. 1999. V. 22. № 12. P. 555-561.

96. Park H.J., Niedzielski AS., Wenthold R.J. Expression of the nicotinic acetylcholine receptor subunit, alpha9, in the guinea pig cochlea. Hear Res. 1997. V. 112. № 1-2. P. 95-105.

97. Unwin N. Nicotinic acetylcholine receptor at 9 A resolution. J Mol. Biol. 1993. V. 229. № 4. P. 1101-1124.

98. Unwin N. Projection structure of the nicotinic acetylcholine receptor: distinct conformations of the alpha subunits. J. Mol. Biol. 1996. V. 257. № 3. P. 586-596.

99. Neubig R.R., Cohen J.B. Equilibrium binding of 3H.tubocurarine and [3H]acetylcholine by Torpedo postsynaptic membranes: stoichiometry and ligand interactions. Biochemistry. 1979. V. 18. №24. P. 5464-5475.

100. Abramson S.N., Li Y., Culver P., Taylor P. An analog of lophotoxin reacts covalently with Tyrl90 in the alpha-subunit of the nicotinic acetylcholine receptor. J. Biol. Chem. 1989. V. 264 № 21. P. 12666-12672.

101. Middleton R.E., Cohen J.B. Mapping of the acetylcholine binding site of the nicotinic acetylcholine receptor: 3H.nicotine as an agonist photoaffinity label. Biochemistry. 1991. V. 30. №28. P. 6987-6997.

102. O'Leary M.E., Filatov G.N., White M.M. Characterization of d-tubocurarine binding site of Torpedo acetylcholine receptor. Am. J. Physiol. 1994. V. 266. (3 Pt 1). C648-653.

103. Corringer P.J., Galzi J.L., Eisele J.L., Bertrand S., Changeux J.P., Bertrand D. Identification of a new component of the agonist binding site of the nicotinic alpha 7 homooligomeric receptor. J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 20. P. 11749-11752.

104. Eisele J.L., Bertrand S., Galzi J.L., Devillers-Thiery A., Changeux J.P., Bertrand D. Chimaeric nicotinic-serotonergic receptor combines distinct ligand binding and channel specificities. Nature. 1993. V. 366. P. 479-483.

105. Ackermann E.J., Taylor P. Nonidentity of the alpha-neurotoxin binding sites on the nicotinic acetylcholine receptor revealed by modification in alpha-neurotoxin and receptor structures. Biochemistry. 1997. V. 36. № 42. P. 12836-12844.

106. Sine S.M. Identification of equivalent residues in the gamma, delta, and epsilon subunits of the nicotinic receptor that contribute to alpha-bungarotoxin binding. J. Biol. Chem. 1997. V. 272. №38. P. 23521-23527.

107. Low B.W., Corfield P.W. Erabutoxin b. Structure/function relationships following initial protein refinement at 0.140-nm resolution. Eur J. Biochem. 1986. V. 161. № 3. P. 579-587.

108. Betzel C., Lange G., Pal G.P., Wilson K.S., Maelicke A., Saenger W. The refined crystal structure of alpha-cobratoxin from Naja naja siamensis at 2.4-A resolution. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. №32. P. 21530-21536.

109. Golovanov A.P., Lomize A.L., Arseniev A.S., Utkin Y.N., Tsetlin V.I. Two-dimensional 1H-NMR study of the spatial structure of neurotoxin II from Naja naja oxiana. Eur. J. Biochem. 1993. V. 213. №3. P. 1213-1223.

110. Hucho F., Tsetlin V.I., Machold J. The emerging three-dimensional structure of a receptor. The nicotinic acetylcholine receptor. Eur. J. Biochem. 1996. V. 239. № 3. P. 539-557.

111. Ackermann E.J., Ang E.T., Kanter J.R., Tsigelny I., Taylor P. Identification of pairwise interactions in the alpha-neurotoxin-nicotinic acetylcholine receptor complex through double mutant cycles. J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 18. P. 10958-10964.

112. Osaka H., Malany S., Molles B.E., Sine S.M., Taylor P. Pairwise electrostatic interactions between alpha-neurotoxins and gamma, delta, and epsilon subunits of the nicotinic acetylcholine receptor. J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 8. P. 5478-5484.

113. Hucho F., Oberthur W., Lottspeich F. The ion channel of the nicotinic acetylcholine receptor is formed by the homologous helices M II of the receptor subunits. FEBS Lett. 1986. V. 205. № 1. P.137-142.

114. Heidmann T., Oswald R.E., Changeux J.P. Multiple sites of action for noncompetitive blockers on acetylcholine receptor rich membrane fragments from Torpedo marmorata. Biochemistry. 1983. V. 22. № 13. P. 3112-3127.

115. Corringer P.J., Le Novere N., Changeux J.P. Nicotinic receptors at the amino acid level. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2000. V. 40. P. 431-458.

116. Betz H. Homology and analogy in transmembrane channel design: lessons from synaptic membrane proteins. Biochemistry. 1990. V. 29. № 15. P. 3591-3599.

117. Galzi J.-L., Revah F., Bessis A., Changeux J.-P. Functional architecture of the nicotinic acetylcholine receptor: from electric organ to brain. Annu. Rev. Pharmacol. 1991. V. 31. P. 3772.

118. Carlsson F.H.H. Snake venom toxins. The primary structure of protein S4C11. A neurotoxin homologue from the venom of forest cobra (Naja melanoleuca). Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 400. P. 310-321.

119. Joubert F.J., Taljaard N. Snake venoms. The amino acid sequence of two Melanoleuca-type toxins. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1980. V. 361. P. 425-436.

120. Shafqat J., Siddiqi A.R., Zaidi Z.H., Joernvall H. Extensive multiplicity of the miscellaneous type of neurotoxins from the venom of the cobra Naja naja and structural characterization of major components. FEBS Lett. 1991. V. 284. P. 70-72.

121. Qian Y.C., Fan C.Y., Gong ,Y, Yang S.L. cDNA sequence analysis and expression of four long neurotoxin homologues from Naja naja atra. Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1443. № 12. P. 233-238.

122. Danse J.M., Gamier J.M., Kempf J.A. cDNA sequence encoding a neurotoxin-homolog from Bungarus multicinctus. Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. № 4. P. 1045.

123. Chang L.S., Lin J. cDNA sequence analysis of a novel neurotoxin homolog from Taiwan banded krait. Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. V. 43. № 2. P. 347-354.

124. Qian Y., Chunyang F., Yi G., Shengli Y. The cDNA cloning and sequence analysis of neurotoxin homologues from Bungarus multicinctus. Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. V. 46. P. 821-828.

125. Joubert F.J., Taljaard N. Snake venoms. The amino-acid sequence of protein S2C4 from Dendroaspis jamesoni kaimosae (Jameson's mamba) venom. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1979. V. 360. №4. P. 571-580.

126. Joubert F.J. The purification and amino acid sequence of toxin CM-13b from Naja haje annulifera (Egyptian cobra) venom. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1975. V. 356. P. 19011908.

127. Aird S.D., Womble G.C., Yates J.R. 3rd, Griffin P.R. Primary structure of y-bungarotoxin, a new postsynaptic neurotoxin from venom of Bungarus multicinctus. Toxicon. 1999. V. 37. № 4. P. 609-625.

128. Inoue S., Oda T., Koyama J., Ikeda K., Hayashi K. Amino acid sequences of nerve growth factors derived from cobra venoms. FEBS Lett. 1991. V. 279. P. 38-40.

129. Oda T., Ohta M., Inoue S., Ikeda K., Furukawa S., Hayashi K. Amino acid sequences of nerve growth factor purified from the venom of the Formosan cobra Naja naja atra. Biochem. Int. 1989. V. 19. P. 909-917.

130. Karlsson E., Arnberg H., Eaker D. Isolation of the principal neurotoxins of two Naja naja subspecies. Eur. J. Biochem. 1971. Y. 21. № 1. P. 1-16.

131. Rosenfeld R., Benedek K. Conformational changes of brain-derived neurotrophic factor during reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. 1993. V. 632. № 1-2. P. 29-36.

132. Narhi L.O., Rosenfeld R., Wen J., Arakawa T., Prestrelski S.J., Philo J.S. Acid-induced unfolding of brain-derived neurotrophic factor results in the formation of a monomeric "a state". Biochemistry. 1993. V. 32. № 40. P. 10819-10825.

133. De Young L.R., Burton L.E., Liu J., Powell M.F., Schmelzer C.H., Skelton N.J. RhNGF slow unfolding is not due to proline isomerization: possibility of a cystine knot loop-threading mechanism. Protein Sci. 1996. V. 5. № 8. P. 1554-1566.

134. Kullander K., Kaplan D., Ebendal T. Two restricted sites on the surface of the nerve growth factor molecule independently determine specific TrkA receptor binding and activation. J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 14. P. 9300-9307.

135. Wiesmann C., Ultsch M.H., Bass S.H., de Vos A.M. Crystal structure of nerve growth factor in complex with the ligand-binding domain of the TrkA receptor. Nature. 1999. V. 401. P. 184188.

136. Memberg S.P., Hall A.K. Proliferation, differentiation, and survival of rat sensory neuron precursors in vitro require specific trophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 1995. V. 6. № 4. P. 323335.

137. Greene L.A., Tischler A.S. Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73. № 7. P. 2424-2428.

138. Thoenen H., Barde Y.A. Physiology of nerve growth factor. Physiol. Rev. 1980. V. 60. № 4. P. 1284-1335.

139. Greene L.A. Nerve growth factor prevents the death and stimulates the neuronal differentiation of clonal PC12 pheochromocytoma cells in serum-free medium. J. Cell. Biol. 1978. V. 78. №3. P. 747-755.

140. Shearman M.S., Ragan C.I., Iversen L.L. Inhibition of PC12 cell redox activity is a specific, early indicator of the mechanism of beta-amyloid-mediated cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994.V. 91. № 4. P. 1470-1474.

141. Rowan E., Ducancel F., Doljansky Y., Harvey A., Menez A., Boulain J.-C. Nucleotide sequence encoding a 'synergistic-like' protein from the venom glands of Dendroaspis angusticeps. Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 1639.

142. Karlsson E., Jolkkonen M., Satyapan N., Adem A., Kumlin E., Hellman U., Wernstedt C. Protein toxins that bind to muscarinic acetylcholine receptors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. V. 710. P. 153-161.

143. Chang L.S., Lin J. cDNA sequence analysis of a novel cardiotoxin-like protein from Taiwan banded krait. Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. V. 40. P. 1271-1276.

144. Cheng Y., Prusoff W.H. Relationship between the inhibition constant (Kl) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (150) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 1973.V. 22. № 23. P. 3099-3108.

145. Sawada R., Ohashi K., Anaguchi H, Okazaki H., Hattori M., Minato N., Naruto M. Isolation and expression of the full-length cDNA encoding CD59 antigen of human lymphocytes. DNA Cell Biol. 1990. V. 9 № 3. P. 213-220.

146. Buisson B , Bertrand D. Allosteric modulation of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. J. Physiol. Paris. 1998. V. 92. № 2. P. 89-100.

147. Fleming T.J., O'hUigin C., Malek T.R. Characterization of two novel Ly-6 genes. Protein sequence and potential structural similarity to alpha-bungarotoxin and other neurotoxins. J Immunol. 1993. V. 150. № 12. P. 5379-5390.

148. Miwa J.M., Ibanez-Tallon I., Crabtree G.W., Sanchez R., Sali A., Role L.W., Heintz N. lynxl, an endogenous toxin-like modulator of nicotinic acetylcholine receptors in the mammalian CNS. Neuron. 1999. V. 23. № 1. P. 105-114.

149. Lukas R.J., Morimoto H., Hanley M.R., Bennett E.L. Radiolabeled alpha-bungarotoxin derivatives: kinetic interaction with nicotinic acetylcholine receptors. Biochemistry. 1981. V. 20. №26. P. 7373-7378.

150. Utkin Y.N., Zhmak M.N., Methfessel C., Tsetlin V.I. Aromatic substitutions in alpha-conotoxin Iml. Synthesis of iodinated photoactivatable derivative. Toxicon. 1999. V. 37. № 12. P. 1683-1695.

151. Greene L.A., Rukenstein A. 1989. In: Nerve Growth Factors. Ed. Rush R.A. IBRO Handbook series: Methods in the Neurosciences. V. 12. P. 139-147. Wiley-Interscience, New York.

152. Schiebler W., Lauffer L., Hucho F. Acetylcholine receptor enriched membranes: acetylcholine binding and excitability after reduction in vitro. FEBS Lett. 1977. V. 81. № 1. P. 39-42.

153. Richards D. 1998. In: ELISA and other solid phase immunoassays. Ed. Kemeny D.M., Challacombe S.J. P. 345-346. John Wiley & Sons Ltd., New York.93

154. Gullik W.J. 1994. In: Methods in molecular biology: basic protein and peptide protocol. Ed. Walker J.M. V. 32, P. 389-399, Humana Press, Totowa, NJ.

155. Karlsson E., Risinger C., Jolkkonen M., Wernstedt C., Adem A. Amino acid sequence of a snake venom toxin that binds to the muscarinic acetylcholine receptor. Toxicon. 1991. V. 29. № 4-5. P. 521-526.

156. Joubert F.J., Taljaard N. Naja haje haje (Egyptian cobra) venom. Some properties and the complete primary structure of three toxins (CM-2, CM-11 and CM-12). Eur. J. Biochem. 1978. V. 90. P. 359-367.