Пространственная структура цитотоксина II из яда кобры Naja naja oxiana в растворе и в системе, моделирующей биологическую мембрану тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Введение.

Глава I. Цитотоксины (кардиотоксины) из яда змей семейства Elapidae (аспидов): структурно-функциональные -jq аспекты (Литературный обзор).

Первичные структуры цитотоксинов.

Эволюция цитотоксинов внутри семейства и с другими токсинами.

Пространственная структура цитотоксинов.

Механизм биологической активности.

Лизис клеток.

Деполяризация возбудимых клеток.

Влияние на активность ферментов.

Антибактериальная активность.

Синергизм действия с фосфолипазой А2.

Клеточные мишени и модели связывания.

Взаимодействие с липидами.

Белковые и углеводные мишени.

Актуальность и перспективы структурно-функциональных исследований цитотоксинов.

Глава II. Результаты и обсуждение.

1.Конформационная гетерогенность и пространственная структура цитотоксина ЦТМ из яда кобры N. п. oxiana в 45 водном растворе.

Отнесение сигналов основной и минорной компонент спектров ЯМР.

Константы спин-спинового взаимодействия.

Вторичная структура.

Соотношение и обмен основной и минорной конформаций.

Прочно связанные молекулы воды.

Данные для расчета и характеристики качества полученных пространственных структур. gl

Пространственная структура основной формы.

Пространственная структура минорной формы. 70 Организация гидрофильных и гидрофобных боковых цепей на поверхности молекулы. У

II.Комплекс цитотоксина ЦТИ с мицеллами додецилфосфохолина.

ЦТН образует комплекс с мицеллами ДФХ.

Влияние гидрофобного аниона (тозилата) на связывание ЦТП с мицеллой ДФХ.

Данные для расчета и характеристики качества полученной пространственной структуры ЦТИ в комплексе с мицеллой ДФХ. gQ

Пространственная структура цитотоксина ЦТИ в комплексе с мицеллой ДФХ. gg

Эффект 5- и 16-доксилстеаратов на сигналы протонов ЦТП, связанного с мицеллой ДФХ. g^

Конформационные особенности петли I ЦТП, важные для его связывания с мицеллой ДФХ.

Модель комплекса ЦТП/[мицелла ДФХ].

Глава III. Материалы и методы.

ЦТИ, ДФХ и другие материалы: получение и характеристики.

Приготовление ЯМР образцов.

Спектроскопия ЯМР.

Сбор данных для расчета пространственной структуры.

Определение конформации пролиновых колец.

Боковые цепи в процедуре вычисления пространственной структуры. дд

Прочно связанные молекулы воды: процедура поиска и включения в расчеты пространственной структуры. ^ qq

Расчет и анализ пространственной структуры.

Построение модели комплекса ЦТП/[мицелла ДФХ].

ВЫВОДЫ.

Среди огромного числа токсинов природного происхождения одно из центральных мест занимают животные яды, или зоотоксины, - уникальная по химической природе и физиологическому действию группа соединений. Зоотоксины применяютя как инструменты исследования в молекулярной биологии, нейрофизиологии, медицине; с их помощью создаются лекарственные и диагностические средства.

Особый интерес представляют змеиные яды - сложный комплекс биологически активных соединений - ферментов, главным образом гидролаз, токсических полипептидов, ряда белков со специфическими биологическими свойствами (фактор роста нервов, антикомплементарный фактор), а также неорганических компонентов. Содержание токсинов различных групп в ядах змей весьма неравномерно. Так, в яде змей семейства Elapidae, или аспидов, насчитывающем около 180 видов (среди них кобры, бунгарусы, австралийские тигровая змея и тайпан и т. д.), в основном, представлены и имеют наибольшее патогенетическое значение пост- и пресинаптические токсины (нейротоксины) и мембраноактивные полипептиды (МАП).

В связи с трудностями сравнительного анализа функциональных и структурных особенностей различных неэнзиматических токсических полипептидов, прежде всего из-за недостаточной степени их очистки, на первых этапах изучения химического состава ядов различные авторы присваивали разные наименования полипептидам, которые впоследствии оказались близкими, а подчас и идентичными по своей химической структуре и фармакологическим эффектам. Так, МАП исторически получали либо буквенно-цифровое обозначение (токсин у, пик 12В и т. д.), либо название исходя из проявленного патофизиологичексого эффекта (кардиотоксин; цитотоксин; прямой литический фактор; фактор, деполяризующий скелетную мускулатуру) или исходя из присущего им основного характера (кобрамин). Позднее было установлено близкое сходство в химической структуре этих полипептидов. Были получены доказательства, что гемолитическая, цитотоксическая, кардиотоксическая и другие виды активности присущи большинству этих токсинов. Поэтому в 70-е годы группу основных полипептидов из ядов семейства Elapidae, не обладающих специфической нейротоксической активностью, но эффективно воздействующих на биологические мембраны, было предложено называть мембраноактивными полипептидами - МАП. Однако, этот термин не прижился, и эти полипептиды называют - цитотоксинами - как правило, в русскоязычной литературе, и -кардиотоксинами - в зарубежной.

Среди токсических полипетидов яда аспидовых змей наиболее полно изучены нейротоксины постсинаптического действия. "Короткие" представители нейротоксинов постсинаптического действия и цитотоксины - белки с небольшой молекулярной массой (6.5 - 7.0 кДа) имеют по четыре дисульфидных мостика в идентичных позициях их аминокислотных последовательностей. "Короткие" нейротоксины и цитотоксины имеют большую гомологию и являются (3-структурными белками. Несмотря на эти общие черты они демонстрируют различную биологическую активность. Нейротоксины блокируют нервную передачу, избирательно связываясь с никотиновым ацетилхолиновым рецептором. В отличие от нейротоксинов, цитотоксины показывают целый перечень биологических активностей, таких как:

Ш лизис различных типов клеток, таких как эритроциты, клетки эпителия, эмбриональные клетки легких и определенных типов опухолевых клеток;

Ш деполяризация мышечных клеток гладкой, поперечно-полосатой и сердечной мускулатуры, вызывающая мышечные сокращения;

Ш влияние на активность ферментов, например, таких как протеинкиназа С, Na^-K~ АТФ-аза, фосфатидилинозитная киназа;

Ш антимикробная активность - против некоторых грам-положительных бактерий. Для различных цитотоксинов характерна также разная степень проявления той или иной активности.

Вместе с тем, для цитотоксинов до сих пор нет полной ясности в определении мишен(и)/(ей) и механизма действия. С недавнего времени ведутся интенсивные исследования структурных основ всего многообразия биологических свойств, демонстрируемых цитотоксинами.

Для понимания молекулярного механизма действия цитотоксинов необходимы, прежде всего, пространственные структуры высокой точности, установленные в различных средах.

Основные виды биологической активности цитотоксинов связаны с их способностью взаимодействовать с клеточной мембраной. Некоторые липидные, белковые, углеводные и другие компоненты биологических мембран рассматриваются как потенциальные мишени цитотоксинов. Связывание с фосфолигшдами, составляющими основу биологических мембран, несомненно, важное звено в механизме действия этих полипептидов. На сегодняшний день установление пространственной структуры цитотоксинов, связанных с фосфолипидным бислоем, невозможно, поэтому особый интерес представляют структурные исследования этих токсинов в системе, моделирующей липидное мембранное окружение - мицеллах детергента.

В Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН ранее была определена первичная структура и проведены исследования взаимодействия с модельными мембранами цитотоксина II из яда кобры Naja naja oxiana (ЦТП). Данная диссертационная работа, выполненная в лаборатории ядерного магнитного резонанса (ЯМР) Института, является продолжением структурно-функциональных исследований ЦТП.

Современное развитие метода ЯМР позволяет получать необходимые данные для установления высокоточных пространственных структур, подвижности и стехиометрии макромолекул в водном растворе и некоторых других средах. Детергент додецилфосфохолин (ДФХ) образует мицеллы, которые в отличие от мембран пригодны и традиционно используются для ЯМР исследований структурных и других основ взаимодействия с липидами мембранных и мембраносвязывающих белков. Это позволило использовать ДФХ в качестве среды, имитирующей биологическую мембрану, для исследования пространственной структуры ЦТП.

Задачами данной работы являлось: определение пространственных структур ЦТП в водном растворе и мицеллах ДФХ; установление участков ЦТП, участвующих во взаимодействии с мицеллой ДФХ, и выявление их структурных особенностей; получение модели комплекса ЦТП/[мицелла ДФХ]. В процессе работы было разработано несколько новых методик и подходов, которые могут использоваться в расчетах пространственных структур и моделей связывания с мицеллами других белков.

В Главе I, являющейся Литературным обзором, обсуждаются современные представления о цитотоксинах (кардиотоксинах), с точки зрения структуры, функции и их взаимосвязи. В основной части работы, изложенной в Главе II и состоящей из двух разделов, представлено структурно-функциональное исследование ЦТП в водном растворе и среде, моделирующей фосфолипидное мембранное окружение. Первый Раздел Главы II посвящен установлению конформационной гетерогенности ЦТП и определению пространственной структуры двух форм ЦТП в водном растворе. Второй Раздел посвящен установлению пространственной структуры и построению модели связывания ЦТП в комплексе с мицеллой ДФХ. В Главе III, Материалы и Методы, приведены сведения об использованных в диссертационной работе веществах, образцах для экспериментов ЯМР, экспериментальных, расчетных, теоретических методах определения и анализа пространственной структуры и параметров связывания с мицеллой, стратегии получения модели связывания ЦТП в комплексе с мицеллой. Основные результаты работы суммированы в Выводах. В Приложении приведены некоторые дополнительные сведения и список использованных сокращений.

Выводы.

1. Получены и проанализированы спектры 'Н-ЯМР высокого разрешения для ЦТП в водном растворе и в среде имитирующей мембранное окружение - мицеллах ДФХ. Данные ЯМР позволили определить с высокой степенью точности пространственные структуры ЦТП в двух средах и положение ЦТП на мицелле ДФХ.

2. Главными структурными элементами ЦТП являются два Р-слоя, состоящие из двух и трех антипараллельных [3-тяжей, а укладка всей полипептидной цепи представляет собой три протяженные петли, благодаря однонаправленному загибу которых ЦТП приобретает выпуклую форму.

3. Обнаружено две прочно связанные с ЦТП молекулы воды, одна из которых образует водородную связь с белком в окончании средней петли и участвует в организации структуры этого участка ЦТП.

4. Гидрофильные и гидрофобные боковые цепи организованы на поверхности ЦТП в отдельные "пояса", чередующиеся по ходу полипептидной цепи трех протяженных петель. Большой гидрофильный пояс вокруг центральной части петель и большой гидрофобный пояс в их окончании создают обширный амфифильный регион.

5. В водном растворе ЦТП представлен двумя конформационными состояниями (формами) в соотношении 6:1. Две формы различаются конфигурацией пептидной связи Val7-Pro8 (тринс/цис), конформациями Р-изгиба (остатки 6-10) и боковых цепей Val7, Leu9, Phel 0 из окончания петли I и Arg36 из окончания петли II.

6. ЦТН образует с мицеллами ДФХ комплекс, состоящий из ~2 несвязанных друг с другом молекул ЦТП и ~66 ДФХ на одну агрегированную единицу. При связывании с мицеллой ЦТП принимает единственную форму, близкую к основной в водном растворе, небольшие конформационные различия с которой наблюдаются в окончаниях трех протяженных петель.

7. Полученная модель комплекса ЦТП/[мицелла ДФХ] хорошо согласуется с результатами анализа различных данных ЯМР (отличиями в химических сдвигах сигналов протонов и в конформациях ЦТП между двумя средами, степенью уширения сигналов погруженных в мицеллу протонов ЦТП под действием различных релаксационных меток). Согласно модели, связывание ЦТП в комплекс с мицеллой ДФХ происходит окончаниями трех протяженных петель и носит амфифильный характер - участки петель гидрофобного пояса углублены в углеводородное ядро мицеллы, а гидрофильного - расположены на ее полярной поверхности; поверхность мицеллы в области связывания с ЦТП имеет вогнутую форму.

1. Dufton, M.J. and Hider, R.C. (1988) Structure and pharmacology of Elapid cytotoxins. Phcirmac. Ther. 36. 1-40.

2. Breckenridge, R. and Dufton, M.J. (1987) The structural evolution of cobra venom cytotoxins. J. Mol. Evol. 41.

3. Hseu. Т.Н., Jou, E.D., Wang, C. and Yang, C.C. (1977) Molecular evolution of snake venom toxins.,/. Mol. Evol. 10, 167-182.

4. Dayhoff. M.O. (1979) (ed) Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 3, Suppl. 3. National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.

5. Strydom, D.J. (1979) The evolution of toxins found in snake venoms. Snake Venoms, Handbook of Experimental Pharmacology, V. 52, 258-275, Lee, C. Y. Ed. Springer Verlag, Berlin.

6. Dufton, M.J. (1984) Classification of Elapid snake neurotoxins and cytotoxins according to chain length. J. Mol. Evol. 20, 128-134.

7. Kumar, Т. K. S., Lee, C. -S. and Yu, C. in Natural Toxins II (1996) A case study of cardiotoxin III from the Taiwan cobra (Naja naja atra). Solution structure and other physical properties. 114-129, Tu. A. and Singh, B.R. Eds. Plenum Press, NY.

8. Mebs. D. (1985) List of Biologically Active Components from Snake Venoms. University of Frankfurt.

9. Kumar. T.K.S., Jayaraman, G., Lee, C.S., Arunkumar, A.I., Sivaraman, Т., Samuel, D. and Yu.C (1997) Snake venom cardiotoxins structure, dynamics, function and folding. J. Biomol. Struct. & Dyn. 15, 431-463.

10. Rees. В. Bilwes, A., Samama, J.P., & Moras, D. (1990) Cardiotoxin V"4from Naja mossambica mossambica: the refined crystal structure. J. Mol. Biol. 214, 281-297.

11. Bilwes. A. Rees, В., Moras, D., Menez, R., & Menez, A. (1994) X-ray structure at 1.55 E of toxin g, a cardiotoxin from Naja nigricollis venom. Crystal packing reveals a model for insertion into membranes. J. Mol. Biol. 239, 122-136.

12. O'Connell, J.F., Bougis, P.E. Wuthrich, K. (1993) Determination of the nuclear-magnetic-resonance solution structure of cardiotoxin C'TX lib from Naja mossambica mossambica. Eur. J. Biochem. 213. 891-900.

13. Singhal, А.К., Chien, K.-Y., Wu, W. & Rule, G.S. (1993) Solution structure of cardiotoxin V from Naja naja atra. Biochemistry 32, 8036-8044.

14. Jahnke. W., Mierke, D.F., Beress, L., & Kessler, H. (1994) Structure of cobra cardiotoxin CTXI as derived from nuclear magnetic resonance spectroscopy and distance geometry calculations. J. Mol. Biol. 240, 445-458.

15. Bhaskaran, R., Huang, C.-C., Tsai, Y.-C., Jayaraman, G„ Chang, D.-K., & Yu, C. (1994) Cardiotoxin II from Taiwan cobra venom, Naja naja atra. Structure in solution and comparison among homologous cardiotoxins. J. Biol. Chem. 269, 23500-23508.

16. Bhaskaran, R„ Huang, C.-C., Chang, D.-K. & Yu, C. (1994) Cardiotoxin III from Taiwan cobra (Naja naja atra). Determination of structure in solution and comparison with short neurotoxins. J. Mol. Biol. 235, 1291-1301.

17. Jang, J.Y., Kumar, T.K.S., Jayaraman, G. and Yu, C. (1997) Comparison of the hemolytic activity and solution structures of two snake venom cardiotoxin analogues which only differ in their N-terminal amino acid. Biochemistry 36, 14635-14641.

18. Argos P, Rossman M.G., Grau U.M., Zuber H., Frank G., Tratschin J.D. (1979) Thermal stability and protein structure. Biochemistry 18, 5698-5703

19. Adams M.W. (1993) Enzymes and proteins from organisms that grow near and above 100 degrees C. Amu Rev Microbiol 47, 627-658.

20. Johnson C.M., Fersht A.R. (1995) Protein stability as a function of denaturant concentration: the thermal stability of barnase in the presence of urea. Biochemistry 34, 67956804.

21. Yu, W.T., Jo, B.H. and O'Shea, D.C. (1973) Laser Raman scattering of cobramine В, a basic protein from cobra venom. Arch. Biochem. Biophys. Acta 156, 71-79.

22. Williams. R.J. P. (1979) The conformation properties of proteins in solution. Biol. Rev. Camb Philos Soc. 54, 389-437.

23. Hider, R.C. and Harvey, A.L. (1982) The structure and actions of cardiotoxin isolated from cobra venoms. X Afr. J.Sci. 78, 350-356.

24. Karlsson. E. (1986), Chemistry of protein toxins in snake venoms. In: Handbook of Experimental Pharmacology 52, pp. 159-172 Lee, C. Y. Ed., Springer Verlag, Berlin.

25. Grognet, J.-M., Menez, A., Drake, A. Hayashi, K., Morrison, I.E.G. & Hider, R.C. (1988) Circular dichroic spectra of elapid cardiotoxins. Eur. J. Biochem. 172, 383-388.

26. Illangasekare, M.P. and Woody, R.W. (1986) The circular dichroism of twisted beta sheets. Biophys. J. 49, 296a.

27. Joubert, F.J. and Taljaard, N. (1978) Naja haje haje (Egyptian cobra) venom. Some properties and the complete primary structure of three toxins (CM-2, CM-11 and CM-12). Eur. J. Biochem. 90, 359-367.

28. Kelly. R M„ Peeples, T.L., Halio, S.B., Rinker, K.D. and Duffaud, G.D. (1994) Ann. N. Y. Acad. Sci. 745, 409-425.

29. Dufton. M.J. and Flider, R.C. (1980) Lethal protein conformations. Trends Biochem. Sci. 5, 53-56.

30. Hodges, S.J., Agbaji, A.S., Harvey, A.L. and Hider, R.D. (1987) Cobra cardiotoxins: Purification, effects on skeletal muscle and structure-activity relationships. Eur. J. Biochem. 165,1. ТТЛ ООП1. J / J-JSJ.

31. Lauterwein, J., Lazdunski, M. and Wuthrich, K. (1978) The 1H nuclear-magnetic-resonance spectra of Neurotoxin I and cardiotoxin V"4 from Naja mossambica mossambica. Eur. J. Biochem. 92. 361-371.

32. Dufton. M.J. and Hider. R. С (1983) Conformational properties of the neurotoxins and cytotoxins isolated from Elapid snake venoms. CRC Crit. Rev. Biochem. 14, 113-171.

33. Vincent, J. P., Balerna, M. and Lazdunski, M. (1978) Properties of association of cardiotoxin with lipid vesicles and natural membranes. A fluorescence study. FEBS Lett. 85, 103108.

34. Grognet, J. M. (1984) Etude de la structure antigenique d'une cardiotoxine de venin de cobra: La toxine gamma de N. nigricollis. D. de Зете Cycle Thesis, Universite Paris V.

35. Kumar. T.K.S., Nagarjuna Rao, Ch. and Reddy, R. in Recent Advances in Toxinology, Gopalakrishnakone. P. Ed., pp. 514-520, Venom and Toxin Res. Group, Singapore.

36. Richardson, J.S. (1981) The anatomy and taxonomy of protein structure. Adv. Protein Chem. 34, 167-339.

37. Condrea. E. (1974) Membrane-acive polypeptides from snake venom: Cardiotoxin and haemocytotoxins. Experientia 30, 121-129.

38. Sandblom, J. and Diaz E. (1984) Cardiotoxin-induced channels in lipid bilayer membranes. Proc. Int. Union Pure Appl. Biophys., 8th Int. Congr., p. 60.

39. Chen. Y. H., Lai, M.Z. Kao, L.S. (1981) Destruction of liposome vesicles by Taiwan cobra cardiotoxin. Biochem. Int. 3, 385-390.

40. Dufourcq, J. and Faucon. J.F. (1978) Specific binding of a cardiotoxin from Naja mossambica mossambica to charged phospholipids detected by intrinsic fluorescence. Biochemistry 17, 1170-1176.

41. Dufourcq, J., Faucon, J.F., Bernard, E., Pezolet, M., Tessier, M., Bougis, P., Van Rietschoten. J., Delori, P., Rochat, FI. (1982) Structure-function relationships for cardiotoxins interacting with phospholipids. Toxicon 20, 165-174.

42. Ксенжек, О.С., Гевод, B.C., Омельченко, A.M., Семенов, С.Н., Сотниченко, А.И. и Мирошников, А.И. (1978) Взаимодействие кардиотоксина из яда кобры Naja naja oxiana с модельными фосфолипидными мембранами. Молекулярная Биология 12(5), 1057-1064.

43. Vyas. A. A., Pan, J.-J., Himatkumar, V.P., Vyas, К.A., Chiang C.-M., Sheu Y.-C., Hwang J.-K., & Wu, W. (1997) Analysis of binding of cobra cardiotoxins to heparin reveals a new b-sheet heparin-binding structural motif. J. Biol. Chem. 272, 9661-9670.

44. Hider. R.C., & Khader, F. (1982) Biochemical and pharmacological properties of cardiotoxins isolated from cobra venom. Toxicon 20, 175-179.

45. Lo, C.-C., Hsu, J.-H., Sheu, Y.-C., Chiang, C.-M., Wu, W., Fann, W. and Tsao, P.-H. (1998) Effect of D57N mutation on membrane activity and molecular unfolding of cobra cardiotoxin. Biophysical Journal 75,2382-2388.

46. Chiang, C.-M. Chang, S.-L., Lin, H. and Wu, W. (1996) The role of acidic amino acid residues in the structural stability of snake cardiotoxins. Biochemistry 35, 9177-9186.

47. Batenburg, A.M., Bougis, P.E., Rochat, H., Verkleij A.J., & de Kruijff, B. (1985) Penetration of a cardiotoxin into cardiolipin model membranes and its implication on lipid organization. Biochemistry 24, 7101-7110.

48. Bougis. P. Rochat, H., Pieroni, G., & Verger, R. (1981) Penetration of phospholipid monolayers by cardiotoxins. Biochemistry 20, 4915-4920.

49. Carbone, M.A., Macdonald, P.M. (1996) Cardiotoxin II segregates phosphatidylglycerol from mixtures with phosphatidylcholione: P and 2H NMR spectroscopic evidence. Biochemistry 35,3368-3378.

50. Patel. H.V., Vyas, A.A., Vyas, K.A., Liu, Y.-S., Chiang, C.-M., Chi, L.-M., & Wu, W. (1997) Heparin and heparan sulfate bind to snake cardiotoxin. Sulfated oligosaccharides as a potential target for cardiotoxin action. J. Biol Chem. 272, 1484-1492.

51. Gatineau. E., Toma, F., Montenay-Garestier, Т., Takechi, M., Fromageot, P. and Menez, A. (1987) Role of tyrosine and tryptophan residues in the structure-activity relationships of a cardiotoxin from Naja nigricollis venom. Biochemistry 26, 8046-8055.

52. Faham. S., Hileman., R.E., Fromm, J.R., Linhardt, R.J. and Rees, D.C. (1996) Heparin structure and interactions with basic fibroblast growth factor. Science 271, 1116-1120.

53. Dauplais, M., Neumann, J.M., Pinkasfeld, S., Menez, A., & Roumestand C. (1995) An NMR study of the interaction of cardiotoxin у from Naja nigricollis with perdeuterated dodecylphosphocholine micelles. Eur. J. Biochem. 230, 213-220.

54. Carlsson. F.H.H & Louw, A.I. (1978) The oxidation of methionine and its effect of the properties of cardiotoxin V", from Naja melanolenca venom. Biochim. Biophys. Acta 534, 322330.

55. Bougis. P., Tiessie, J., Rochat, H., Pieroni, G. and Verger, R. (1987) Mixed phospholipid-cardiotoxin monomolecular films studied by intrinsic polarized surface fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 143, 506-511.

56. Degrado, W.F., Musso, G.F., Lieber, M., Kaiser, E.T. and Kezdy, F.J. (1982) Kinetics and mechanism of hemolysis induced by melittin and by a synthetic melittin analogue. Biophys. J. 37, 329-338.

57. Schroeter, R., Damerau, B. and Vogt, W. (1973) Differences in binding of the direct lytic factor (DLF) of cobra venom (Naja naja) to intact red cells and ghosts. Nawnyn. -Schmied. Arch. Pharmacol. 280, 201-207.

58. Chen, Y.H., Ни, C.T. and Yang, J.T. (1984) Membrane disintegration and hemolysis of human erythrocytes by snake venom cardiotoxin (a membrane-disruptive polypeptide). Biochem. Int. 8, 329-338.

59. Irmscher, G. and Jung, G. (1977) Die hamolytischen Eigenschaften der membranmodifizierenden Peptidantibiotika Alamethicin, Suzukacillin und Trichotoxin. Eur. J. Biochem. 80, 165-174.

60. Орлов. Б.Н., Гелашвили, Д.Б. (1985) Зоотоксинология. Ядовитые животные и их яды. Москва, Высшая школа.

61. Kaneda, N., Hamaguchi, М., Kohma, К., Kaneshima, Н. and Hayashi, К. (1985) Action of cobra venom cardiotoxin on chick embryonal fibroblast transformed with a temperature-sensitive mutant of Rous sarcoma virus. FEBS Lett. 192, 313-316.

62. Gasanov. S.E., Alsarray, M.A., Gasanov, N.E., Rael, E.D. (1997) Cobra venom cytotoxin free of Phospholipase A2 and its effect on model membranes and T leukemia cells. J. Membr. Biol. 155, 133-142.

63. Passow, H. (1986) Molecular aspects of band 3 protein-mediated anion transport across the red blood cell membrane. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 103, 61-203.

64. Hunter. M.J. (1977) Human erythrocyteanion permeabilities measured under conditions of net charge transfer. J. Physiol. 268, 35-49.

65. Thelestram, M. and Mollby, R. (1979) Classification of microbial, plant and animal cytolysins based on their membrane-damaging effects of human fibroblasts. Biochem. Biophys. Acta SSI, 156-169.

66. Harvey, A.L., Hider, R.C. and Khader, F. (1983) Effect of phospholipase A2on action of cobra venom cardiotoxins on erythrocytes and skeletal muscle. Biochem. Biophys. Acta 728, 215221.

67. Dufton. M.J. and Hider, R.C. (1991) in Snake Toxins Harvey, A. L. Ed., pp 259-302, Pergamon Press, New York.

68. Lin Shiau, S.Y., Huang, M.C. and Lee, C.Y. (1976) Mechanism of actions of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle.,/. Pharmacol Exp. Therap. 196, 758-770.

69. Schwartz, L.M., McCleskey, E.W. and Aimers, W. (1985) Dihydropyridine receptors in muscle are voltage-dependent but most are not functional calcium channels. Nature (London) 314, 747-751.

70. Pumplin, D.W., Reese, T.D. and Lllinas, R. (1981) Are the presynaptic membrane particles the calcium channels? Proc. Natn. Acad. Sci. U.S.A 78, 7210-7213.

71. Dunant, Y. and Israel, M. (1985) The release of acetylcholine. Sci. Am. April, 40-48.

72. Mazurek. N., Schindler, H., Schiirholz, Th. and Pecht, I. (1984) The chromolyn binding protein constitutes the Ca ' channel of basophils opening upon immunological stimulus. Proc. Natn. Acad. Sci. U.S.A. 81. 6841-6845.

73. Hollenberg. M.D. (1986) Mechanisms of receptor-mediated transmembrane signalling.1. Experientia 43. 718-727.

74. Irvine. R. F. and Moor, R. M. (1986) Micro-injection of inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate activates sea urchin eggs by a mechanism dependent on external Ca2+. Biochem. J. 240, 917-920.

75. Lo. T.N. Eng, S.P., Joseph, L.A., Beaven, M.A. and Lo, C.S. (1988) Cardiotoxin from cobra venom increases the level of phosphatidylinositol 4-monophosphate and phosphatidylinositol kinase activity in two cell lines. Biochim. Biophys. Acta 970, 51-60.

76. Ishiura. S. (1981) Calcium-dependent proteolysis in living cells. Life Sci. 29, 1079-1087.

77. Llados. F.T. (1985) Muscle damage, induced by the ionophore A 23187 can be prevented by prostaglandin inhibitors and leupeptin. Experientia 41, 1551-1552.

78. Lee. C.Y. (1972) Chemistry and pharmacology of polypeptide toxins in snake venoms. Amu. Rev. Pharmacol. 12, 265-286.

79. Schanne. F.A.X., Kane, А.В., Young. E.E. and Farber, J.L. (1979) Calcium dependence of toxic cell death: A final common pathway. Science 206, 700-702.

80. Gasanov. S.E., Gasanov, N.E. and Rael, E.D. (1995) Phospholipase A2 and cobra venom cytotoxin Vc5 interactions and membrane structure. Gen. Physiol. Biophys. 14, 107-123.

81. Davidson, F.F., Dennis, E.A. (1990) Evolutionary relationships and implications for the regulation of phospholipase A2 from snake venom to human secreted forms. J. Mol. Evol. 31, 228-238.

82. Kelley, M.J., Crowl, R.M., Dennis, E.A. (1992) Renaturation of cobra venom phospholipase A, expressed from a synthetic gene in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 1118,107-115.

83. Shier, W.T. (1980) Activation of self-destruction as a mechanism of action for cytolytic toxins. In: Natural Toxins, 193-200, Eaker, D. and WadstrOm, T. Eds. Pergamon Press, Oxford.

84. Fletcher, J.E., Jiang, M.-S., Gong, Q.-H. and Smith, L.A. (1991) Snake venom cardiotoxins and bee venom melittin activate phospholipase С activity in primary cultures of skeletal muscle. Biochem. Cell. Biol. 69, 274-281.

85. Fourie. A.M., Meltzer, S., Berman, M.C. and Louw, A.L (1983) The effect of cardiotoxin on (Ca2+-Mg2 ' )-ATPase of the erythrocyte sarcoplasmic reticulum. Biochem. Int. 6, 581-591.

86. Bougis. P.E., Khelif, A. and Rochat, H. (1989) On the inhibition of Na+,K+.-ATPases by the components of Naja mossambica mossambica venom: evidence for two distinct rat brain [Na+,K+]-ATPase activities. Biochemistry 28, 3037-3043.

87. Rivas, E.A., Le Maire, M. and Gulik-Krzywiski, T. (1981) Isolation of rhodopsin by the combined action of cardiotoxin and phospholipase A2 on rod outer segment membranes. Biochim. Biophys. Acta 644, 127-133.

88. Rothman, J.E. and Lenard, J. (1977) Membrane asymmetry. Science 195, 743-752.

89. Harvey. A.L. (1985) Cardiotoxins from cobra venoms: Possible mechanism og actions. J. Toxicol.-Toxin Reviews 4, 41-69.

90. Jayaraman, G., Kumar, T.K.S. and Yu,C. (1999) Binding of nucleotide triphosphates to cardiotoxin analogue II from the Taiwan cobra venom (Naja naja atra). J. Biol. Chem. 274, 17869-17875.

91. Mollmann, U., Gutsche, W. Maltz, L. and Ovadia, M. (1997) Activity of cytotoxin P4 from the venom of the cobra snake Naja nigricollis on gram-positive bacteria and eukaryotic cell lines. Arzneim.-Forsch./Drug Res. 47, 671-673.

92. Oron. U., Chaim-Matyas, A., Ovadia, M. (1992) Histopathological changes in WEHI-3B leukemia cells following intoxication by cytotoxin P4 from Naja nigricollis nigricollis venom. Toxicon 30, 1122-1126.

93. Dressier, V., Schwister, K., Haest, C.W.M. and Deuticke (1983) Dielectric breakdown of the erythrocyte membrane enhances transbilayer mobility of phospholids. Biochim. Biophys. Acta 732, 304-307.

94. Condrea. E., Barzilay, M. and de Vries, A. (1971) Action of cobra venom lytic factor on sialic acid-depleted erythrocytes and ghosts. Naunyn Schmied. Arch. Pharmak. 268, 458-461.

95. Takechi. M. Tanaka, Y. and Hayashi, K. (1986) Binding of cardiotoxin analogue III from Formosan cobra venom to FL cells. FEBS Lett. 205, 143-146.

96. Sun. J.J. and Walker, M.J.A. (1986) Action of cardiotoxins from the Southern Chinese cobra (Naja naja atra) on rat cardiac tissue. Toxicon 24, 233-245.

97. Tonsing, L., Potgieter, D.J.J., Louw. A.I. and Visser, L. (1983) The binding of snake venom cardiotoxins to heart cell membranes. Biochim. Biophys. Acta 732, 282-288.

98. Picard, F., Pezolet, Bougis, P.E & Auger, M. (1996) Model of interaction between a cardiotoxin and dimyristioylphosphatidic acid bilayers determined by solid-state 3,P NMR spectroscopy. Biophys. J. 70, 1737-1744.

99. Aripov, T.F., Gasanov, S.E., Salakhutdinov, B.A., Rozenstein, I.A. & Kamaev, F.G. (1989) Central asian cobra venom cytotoxins-induced aggregation, permeability and fusion of liposomes. Gen. Physiol. Biophys. 8, 459-474.

100. Hsia, J.C., Er, S.S. and Lee, C.Y. (1978) Effects of Ca2+ and membrane surface charge on the direct lytic activity of cobra cardiotoxin-A membrane spin assay. Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, 472-476.

101. Sue. S.-C., Rajan, P.K., Chen, T.-S., Hsieh, C.-H. and Wu, W.-g. (1997) Action of Taiwan cobra cardiotoxin on membranes: binding modes of a b-sheet polypeptide with phosphatidylcholine bilayers. Biochemistry 36, 9826-9836.

102. Bougis, P., Rochat, H., Pieroni, G., & Verger, R. (1982) A possible orientation change of carditoxin molecule during its interaction with phospholipid monolayer. Toxicon 20, 187-190.

103. Bougis, P., Tessier, M., Van Rietschoten, J., Rochat, H., Faucon, J.F. and Dufourcq, J. (1983) Are interactions with phospholipids responsible for pharmacological activities of cardiotoxins? Mol. Cell Biochem. 55, 49-64.

104. Lauterwein, J. and Wuthrich, K. (1978) A possible structural basis for the different modes of action of neurotoxins and cardiotoxins from snake venoms. FEBS Lett. 93, 181-184.

105. Wu. W. Li., Y. and Szabo, G. (1993) FASEBJ. 7, A1235.

106. Bretscher, M.S. (1972) Asymmetrical lipid bilayer structure for biological membranes. Nature (London) 236, 11-12.

107. Michaelson, D.M., Batrai, G. and Barenholz, Y. (1983) Asymmetry of lipid organization on cholinergic synaptic vesicle membranes. Biochem. J. 211, 155-162.

108. Schroeter, R., Lankisch. P.G., Lege, L., Vogt, W. (1972) Possible role of glutathione reductase El-1.6.4.2. for the action of direct lytic factor from cobra venom on erythrocytes of various species. Nawnyn. -Schmied. Arch. Pharmacol. 274, R103.

109. Vogt, W„ Petzea, P., Lege, L., Oldings, H.D. and Willie, G. (1970) Synergism between phospholipase A and various peptides and SH-reagents in causing haemolysis. Naunyn-Schmiedebergs. Arch. Pharmakol. 265, 442-454.

110. Viitala, J. and Jarnefelt, J. (1985) The red cell surface revisited. Trends Biochem. Sci. 10, 392-395.

111. Wolff, J., Salabe, H., Ambrose, M. and Larsen, P. R. (1968) The basic proteins of cobra venom. II. Mechanism of action of cobramine В on thyroid tissue. J. Biol. Chem. 243, 12901296.

112. Harvey, A.L., Marshall, R.J. and Karlsson, E. (1982) Effects of purified cardiotoxins from the Tailand cobra (Naja naja siamensis) on isolated skeletal and cardiac muscle preparations. Toxicon 20, 379-396.

113. Cabantchik, Z.I. and Rothstein, A. (1974) Membrane proteins related to anion permeability of human red blood cells. I. Localization of disulfonic stilbene binding sites in proteins involved in permeation. J. Membr. Biol 15, 207-226.

114. Hargreaves, W. R., Griedd, K.N., Verkleij, A. and Branton, D. (1980) Reassociation of ankyrin with band 3 in erythrocyte membranes and in lipid vesicles. J. Biol. Chem. 255, 1196511972.

115. Van Hoogevest, P., Du Maine, A.P.M., De Kruiiff, B. and De Gier, J. (1984) The influence of lipid composition on the barrier properties of band 3-containing lipid vesicles. Biochim. Biophys. Acta 111, 241-252.

116. Kopito, R.R. and Lodish, H.F. (1985) Primary structure and transmembrane orientation of the murine anion exchange prtotein. Nature (London) 316, 234-238.

117. Vyas. K.A., Patel, H.V., Vyas, A.A. & Wu, W. (1998) Glycosaminoglycans bind to homologous cardiotoxins with different specifity. Biochemistry 37, 4527-4534.

118. Lindahl, U., Lidholt, K„ Spillman, D. and Kjellen, L. (1994) More to "heparin" than anticoagulation. Thromb. Res. 75, 1-32.

119. Yanagishita, M. and Hascall, V.C (1992) Cell surface heparan sulfate proteoglycans. J. Biol. Chem. 267, 9451-9454.

120. Fletcher, J.E. and Jiang, M.-S. (1993) Possible mechanisms of action of cobra snake venom cardiotoxins and bee venom melittin. Toxicon 6, 669-695.

121. Dennis, E.A. (1987) The regulation of eicosanoid production: role of phospholipases and inhibitors. Bio-Technology 5, 1294-1300.

122. Chang, L.S., Wu, P.F. and Lin, J. (1996) cDNA sequence analysis and expression of cardiotoxins from Taiwan cobra. Biochem. Biophys. Res. Commitn. 219, 116-121.

123. Kumar. Т. K. S., Yang, P.W., Lin, S.H., Wu, C.Y., Lei, В., Lo, S.J., Tu, S.C. and Yu, C. (1996) Cloning, direct expression and purification of a snake venom cardiotoxin in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 219, 450-456.

124. Jeyaseelan, K., Armugam, A., Lachumanan, R., Tan., C.H., Tan, N.H. (1998) Six isoforms of cardiotoxin in Malayan spitting cobra (Naja naja sputatrix) venom: cloning and characterization of cDNAs. Biochimica et Biophysica Acta 1380, 209-222.

125. Lachumanan, R., Armugam, A., Tan., C.H., Jeyaseelan, K. (1998) Structure and organization of the cardiotoxin genes in Naja naja sputatrix. FEBS Lett. 433, 119-124.

126. Otting, G. & Wiithrich, K. (1989) Studies of protein hydration in aqueous solution by direct NMR observation of individual protein-bound water molecules. J. Am. Chem. Soc. Ill, 1871-1875.

127. Гришин. E.B., Сухих, А.П., Адамович, Т.Б., Овчинников, Ю.А. (1976) Выделение, свойства и аминокислотная последовательность двух цитотоксинов из яда среднеазиатской кобры Naja naja ох'шпа. Биоорг. Хим. 2, 1018-1034.

128. Wiithrich, К. (1986) NMR of proteins and nucleic acids. N.Y.: Wiley.

129. Wiithrich K., Billeter M., Braun W. (1984) Polypeptide secondary structure determination by nuclear magnetic resonance observation of short proton-proton distances. J. Mol. Biol. 180, 715-740.

130. Maigret, В., Perahia, D. & Pullman, B. (1970) Molecular orbital calculations on the conformation of polypeptides and proteins. IV. The conformation of the prolyl and hydroxyprolyl residues.,/. Theor. Biol. 29, 275-291.

131. Ramachandran, G.N. & Sasisekharan, V. (1968) Conformation of polypeptides and proteins. Advan. Protein Chem. 23, 283-437.

132. Stewart, D.E., Sarkar, A. & Wampler, J.E. (1990) Occurrence and role of cis peptide bonds in protein structures. J. Mol. Biol. 214, 253-260.

133. Otting, G., Liepinsh, E. Wuthrich, K. (1991) Protein hydration in aqueous solution. Science 254. 974-980.

134. Chou, P.Y. & Fasman, G.D. (1977) Beta-turns in proteins. J. Mol. Biol. 115, 135-175.

135. Richardson. J.S., Richardson D.C. (1989) Prediction of protein structure and the principles of protein conformation. G.D. Fasman Ed. N. Y., L.: Plenum Press, 1-99.

136. Pervushin, К. V. & Arseniev, A. S. (1995). NMR spectroscopy in the study of the spatial structure of membrane peptides and proteins. Bioorg. Khim. 21, 83-111.

137. Bechinger, B. (1996) Towards membrane protein design: pH-sensitive topology of histidine-containing polypeptides. J. Mol. Biol. 263, 768-775.

138. Brown, L.R. (1979) Use of fully deuterated micelles for conformational studies of membrane proteins by high resolution 'H nuclear magnetic resonance. Biochim. Biophys. Acta 557, 135-148.

139. Дубинный, M.A., Дубовский, П.В., Уткин, Ю.Н., Симонова, Т.Н., Барсуков, Л.И., Арсеньев, А.С. (2001) Изучение методом ЭПР взаимодействия цитотоксина II с модельными мембранами. Быорг. хим. 27, 102-113.

140. Brown, L.R., Bosch, С. & Wtithrich. К. (1981) Location and orientation relative to the micelle surface for glucagon in mixed micelles with dodecylphosphocholine: EPR and NMR studies. Biochim. Biophys. Acta 642, 296-312.

141. Brown, L.R., Braun, W., Kumar, A. & Wtithrich, K. (1982) High resolution nuclear magnetic resonance studies of the conformation and orientation of melittin bound to a lipid-water interface. Biophys. J. 37, 319-328.

142. Franklin, J.C., Ellena, J.F., Jayasinghe, S., Kelsh, L.P. & Cafiso, D.S. (1994) Structure of micelle-associated alamethicin from 'H-NMR. Evidence for conformational heterogeneity in a voltage-gated peptide. Biochemistry 33, 4036-4045.

143. Papavoine, C.H., Konings, R.N., Hilbers, C.W. & van de Ven, F.J. (1994) Location of M13 coat protein in sodium dodecyl sulfate micelles as determined by NMR. Biochemistry 33, 12990-12997.

144. Lauterwein, J., Bosch, C. Brown, L.R. & Wiithrich, K. (1979) Physicochemical studies of the protein-lipid interactions in melittin-containing micelles. Biochim. Biophys. Acta 556, 244264.

145. Hristova, K„ Wimley, W.C., Mishra, V.K., Anantharamiah, G.M., Segrest, J.P. & White, S.H. (1999) An amphiphatic a-helix at a membrane interface: a structural study using a novel X-ray diffraction method. J. Mol. Biol 290, 99-117.

146. Efremov. R.G., Volynsky, P.E., Nolde, D.E., Dubovskii, P.V. & Arseniev, A.S. (2001) Unpublished results.

147. Plotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. (1992) Gradient tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. J. Biomol. NMR 2, 661-665.

148. Sklenar. V. (1995) Suppression of radiation dumping in multidimensional NMR experiments using magnetic field gradients.,/. Magn. Reson. A 114, 132-135.

149. Altieri, A.S., Hinton, D.P. & Byrd, R.A. (1995) Association of biomolecular systems via pulsed field gradient NMR self-diffusion measurements. J. Am. Chem. Soc. 117, 7566-7567.

150. Orekhov, V.Yu., Korzhnev, D.M., Pervushin, K.V. & Arseniev, A.S. (1999) Sampling of protein dynamics in nanosecond time scale by i3N NMR relaxation and self-diffusion measurements. J. Biomol. Struct. Dyncim. 17, 157-174.

151. Eccles, C„ Xia, Т. H„ Billeter, M„ & Wuthrich, K. (1991) Efficient analysis of protein 2D NMR spectra using the software package EASY. J. Biomol. NMR 1, 111-130.

152. Guntert, P., Mumenthaler, C. & Wuthrich, K. (1997) Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with new program DYANA.,/. Mol. Biol. 273, 283-298.

153. Jaravine, V. A., Nolde, D. E., Reibarkh, M. J., Korolkova, Y. V., Kozlov, S.A., Pluzhnikov, K. A., Grishin, E. V. & Arseniev A.S. (1997) Three-dimensional structure of toxin OSK1 from Orthochirus scrobiculosus. Biochemistry 36, 1223-1232.

154. Cai, M., Huang, Y., Liu, J. & Krishnamoorthi, R. (1995) Solution conformations of proline rings in proteins studied by NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR 6, 1230128.

155. Meiering, E. M., Wagner. G. (1995) Detection of long-lived water molecules in complexes of human dihyfrogolate reductase with methotrexate and NADPH. J. Mol. Biol. 247, 294-308.

156. Schaumann, Т., Braun, W. & Wuthrich, K. (1990) The program FANTOM for energy refinement of polypeptides and proteins using a Newton-Raphson minimizer in torsion angle space. Biopolymers 29, 679-694.

157. Koradi, R., Billiter M„ Wutrich, К (1996) MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures. J. Mol. Graphics 14, 51-55.