Исследование сродств некоторых производных пиридина с гербицидной активностью и их комплексов с ионами металлов к липидным мембранам тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

.АКАДЕМИЯ НАУК УЗБЕКСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БМООРГАНМЧЕСКОИ ХИМИИ IM. академика A.C. СЛДЫКОВА

На правах рукописи 110ТИВВСКАЯ Елена Борисовна

ИССЛЕДОВАНИЕ СРОДСТВА НЕКОТОРЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ПИРЦДШ1А С ГЕРБШВДНОИ АКТИВНОСТЬЮ И ИХ КСЛШЛЕКСОВ С НОНАМИ МЕТАЛЛОВ К ДИШДНШ МЕМБРАНАМ

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Ташкент-1991

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академика А.С.Садакова АН УзССР

Научный консультант:

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

член-корр.АН УзССР,профессор А.А.Абдувахабов доктор биологических наук Т.Ф Арипов

кандидат биологических наук Б.А.Салахутданов доктор химических наук А.К.Ташмухамедова доктор биологических наук Ш. И. Салютов

Ордена Ленина Институт химической физики в Черноголовке АН СССР

Защита диссертации состоится " ДО " КД^ЬКоЪ 1931 г.

часов на заседании Специализированного совета

Д 015.21.01 Института биоорганической химии юл.академика А.С.Садакова АН УзССР по адресу: 700143, Ташкент, проспект М.Горького, 83.

С диссертацией мошо ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.академика А.С.Садакова АН УзССР

Автореферат разослан " ^ 9 " ОСУА^^Д. 1991 г.

в

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

С.Н.Мухамедханова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время широкий класс пири-динсодержащих химических соединений вызывает пристальный интерес специалистов различного профиля в связи с тем, что для ряда препаратов из их числа обнаружена уникальная гербицидная активность /Промонешсов, 1988, Карцев И др.,1988 /.

На смотря на то, что к настоящему времени накоплено достаточно экспериментальных данных о проявлении пиридинсодеркащими соединениями фунгицидной и гербщщцюй активности, фундаментальные исследования молекулярного механизма их действия, которые позволяют сформулировать некоторые теоретические и практические предпосылки для создания новнх, эффективных и экологически безопасных средств защити растений нового поколения практически отсутствуют.

По-всбй видимости, одним из важных этапов в общем механизма действия пиридннсодержпщих гербицидов является их взаимодействие с липидной частью биологических мембран. Действительно, соединения, поступающие в организм растений в зависимости от способа введения должны пройти определенный путь через ряд моморянних структур для достижения тех сайтов действия, которые определяют их пестицвдную активность. Не проникающие, но локализованные в мембране молекулы могут вносить существенные структурные нарушения липидной организации Оислоя мембраны, которые могут быть причиной нарушения их барьерных функций и способствовать пассивной диффузии многих катионов и анионов внутрь и из клеточных и субъклеточвдх структур.

Биологическая активность гетерофункциональннх пестицидов (№1), в частности пиридинсодержачдас соединений, может быть связана с их реакционной способностью по отношению к ионам металлов

- Ре2?' Си2? Со2? гпг+и др. и их комплексами с органическими, биоорганическими и неорганическими лигандами / Карцев,1988 а/. Общий молекулярный механизм действия ГФП мокет включать и такой процесс как образование липофилизированшх комплексов с металлсодержащими системами* вне организма, способствуя транспорту металлов в клетки. Не исключена комбинация данного процесса с тем, что молекулы пестицида проникают в биомембраны и внутриклеточные структуры, связывают свободные ионы металлов и, таким образом, нарушают биогенез анзиматических систем /Карцев,1988 в/. И, кроме того, молекулы ГФП могут влиять на общий катионоаниошшй транспорт через мембраны по типу действия ионофоршх молекул, и вносимые гербицидами структурные нарушения , вероятно, могут ин~ гибировать ряд процессов межклеточного и внутриклеточного взаимодействия, таких как агрегация и слияние, протекающих по необходимости на различных этапах роста.

В связи с этим возникает необходимость исследования действия молекул . ГФП и их комплексов с различными ионами металлов на липидные бислои для выяснения индуцирования ими структурных нарушений модальных мембран.

Настоящая работа представляет собой часть фундаментальных исследований, проводимых в лаборатории физико-химических методов исследования Института биооргакической химии им.академика А.С.Садаковз АН УзССР в соответствии с постановлением ГКНТ СССР, АН СССР И 24/15/13 от 13.02.81 по проблеме 074.05.01.Н5 и N 23/13 от 03.0?..87 по проблеме 13.Н2. Б диссертационной работе были изучена мвмбраноакгинше свойства пиридинсодеркащих гербицидных соединений - он$енантролина, ацепокса, а,а-далиридшш, Ж-2,81, а-пиколиновой и хинальдшговой кислот, которые сштензированны и испытанны на гербицидную активность в лаборатории профессора

В.Г.Карцева (ОИХФ АН СССР) согласно программа "Создание и применение регуляторов роста растений" по проблеме 5.1.2.3.

Дель и задачи исследования. Осноеой целью настоящей работа было изучение взаимодействия некоторых, пиридинсодеркащих соединений, обладающих гербицидной активностью, а также их комплексов с ионами металлов с модельным! мембранами различного химического состава.

В ходе исследования решались следующие задачи:

-Определение ксжшвксоооразования пиридинсодеркащих гербицидов с некоторыш ионами металлов.

-Установление участков локализации исследованных молекул гербицидов в липидных мембранах в зависимости от их химической структура.

-Волуэмпирические расчеты коэффициента распределешш в системе мембрвна-вода исследованных гербицидов.

-Исследование влияния гербицидов, их комплексов с ионами металлов на межмембранные взаимодействия (процесса слияния мембран).

Для изучения мембранотропннх свойств гербицидов, в основном, применяли метода 1Н и 31Р-ЯМ? , дифференциальную сканирующую микрокалориметрию. Процессы комплексообразоЕания гербицидов с металлами регистрировали методами 1Н-ЯМР, ИК-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа.

Научная новизна и практическая значимость результатов исследования.

Впервые методом ДСК, 1Н и 31Р-ЯМР спектроскопии изучено взаимодействие ряда ГФП - о-<ренаятролинэ, а.а-дигшридшш, ацепокса, Ж-281, а-пиколиновой и хинальдшювой кислст с модельными мембранам и влияние этих гербицидов на процессу слияния мембран, т-

дуцируемых температурой, двухвалентными ионами металлов и мембра-ноактивными полипептидами.

Методом ИК-сшктроскопии изучена комллексоойразувдая способность ацепокса с ионами Сог+ и показано, что в комплексе1 с центральным ионом через атомы азота связаны две молекулы лиганда'. Методом 1Н-ЯМР изучена также комплэксообразущая способность наследуемых соединений с ионами Рг3+, используемых в качестве сдвигающих агентов. Показано, что только кислые гербицидные соединения - могут эф£ективно образовывать. комплексы с данным ионом.

На основании анализа химической: структуры ТФП и экспериментальных данных определена локализация молекул. ГФП в липидной мембране .

На основании полуэмпирических расчетов с использованием калориметрических данных оценены коэффициенты распределения молекул ГФП в системе мембрана-вода.

Установлено, что молекулы о-фенантролина, ацепокса, а.а-дшшридила и ЛК-281 при определенных концентрациях уменьшают барьер проницаемости мембран для некоторых ионов .

На образцах смеси двух популяций липосом показано, что молекулы исследованных ГФП при определенных концентрациях ингибируют процессы межмембранного обмена лшшдним материалом, индуцируемого квтионат Сог+, Сиг+, Мпг+ и Саг+, а также при определенных концентрациях полностью ингибируют <5ыозогешше свойства некоторых мсмбраюактивных иашпвптщов.

Нолучешще в работе результаты позволяют выявить некоторые структурно-Функщюнальнш аспекты механизма меморанотрогшого действия различных шридинсодержащих гербицидных соединений, что ргобмшо ышго .чрд изучения общего механизма их горОицидного

действия. Эти результаты представляют практическую значимость но только при создании функциональной базы данных о мембранотрсшюм действии гербицидов, но и полезны для химиков-синтетиков при создании высокоэффективных и экологически безопасных препаратов.

Материалы диссертационной работы используются при чтении лекций по спецкурсу " Молекулярная биофизика " на кафедре биофизики ТашГУ им. В.И.Ленина.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (1389>, на Всесоюзной конференции по химии и технологии пиридин-содержащих пестицидов (1989, 1990) и на XIV Менделеевском'съезде по общей и прикладной химии (1989), обсуждались в лаборатории физико-химических методов исследования ИБОХ АН УзССР (1990).

Публикации.По теме диссертации опубликованы 3 статьи в журналах и 4 тезиса докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация представляет собой рукопись на 15"? страницах, включая ¿3 рисунков и -Ц таблиц. Список литературы содершга ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

В данной главе проведен анализ результатов работ, посвященных изучению взаимодействия гербицидов, имеющие различную химическую структуру и обладающих гербицидной активностью, с лнпидной частью биологических мембран.В обзоре приведены также данные, свидетельствующие о том, что молекулы гербицидов могут приводить к нарушению функциональной активности мембраносвязанных белковых компонент и изменение физических характеристик липидов. Дается обоснование необходимости исследования взаимодействия гербшдадных сое-

динений с липидаыми системами. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В качестве объекта исследования был взят ряд пиридинсодержа-щих химических соединений, обладающих гербицидной активностью:

0-0

4 N Н"

о^-ы-дипиридид

Н о-фенянтролин

л-пиколиноюя кислота

U-0H

рцепокс хкняльдиковая кислота ЛК-281

В работе использованы основные структурообразующие липиды: яичный фосфатидалхолпн (ФХ), и кардиолшшн (КЛ) - производства завода бактериальных препаратов (г.Харьков); фосфатидаая кислота (ФК) получена в Институте тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова; дишристоилфосфатидолхслш (ДОФХ), дилальмитоил-фосфатидилхолин (ДПФХ), димиристоилфосфатидная кислота (ДМФК) <ínpMK"SIGMA" (США). Все липиды очищены колоночной хроматографией на сшеткагеле.

<

Мембранные полипептиды цитотоксины Vc1 и Vc5 выделены из цельного яда среднеазиатской кобры tiaja naja oxiana по методике (Grishln et.al, 1974).

Образцы озвученных липосом и мультиламеллярных дисперсий готовили по стандартным методикам. Н полученным образцам добавляли с помощью микрошприца исслодуемне ГФП или их спиртовые растворы.

Определение термодинамических параметров фазовых превращений гядратированных лилидов проведены на дифференциальном

сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 при скорости записи 1°С/мин.

Спектры ШЛР регистрировали па спектрометре ХЬ-200 "VARIAN" (США) с использованием импульсной методики накопления /Фаррар,Беккер,1973 / с последующим Фурье-преобразованием сигнала свободной индукции.

Использованный в качестве бифункционального агента - димэтил-суберимидат (ДМОJ фирмы "SERVA", представляющий собой диимидо-эфир, имел линейный размер мэжду химически активными группами порядка 11,5-12 2 . Действие бифункционального агента осуществляется реакцией мекду функциональными кмидоэфирными группами и e-аминогруппами лизинов, входящих в состав белка.

белок - нна * сн3о - с - с сна эе -с - осн3 ♦ nh2 -белок пн nh

белок -NH - с - с см2 - с - г:н - белок + г сн3сн nh nh

Для получения димеров полипептидов Vc1 и Vc5 20 мг препаратов растворяли в 0,2 мл боратного буфера (рН 9,0) при комнатной температуре. 12 мг бифункционального агента -ДМС добавляли прибли зительно шестью равными порциями через каждые 5 мин.Инкубацию вели 30 мин. на магнитной мешалке, рН поддерживали титрованием 0,IM NaOH. После предписанного времени реакции непрореагировав-ший реагент был "погашен" добавлением ацетата аммония. Разделение полученных производных проводили на колонке Septiadex G-50 (0,9 х 200 см), элюировали 0,05 M уксусной кислотой.Скорость элю-ции 18 мл/ч .

Идентификацию полученных производных проводили методом электрофореза в 15S полкакрилаьидном геле.

Масс-спектры регистрировали па,масс-спектрометре фирмы "VA-PIAN" МАТ—311 при ионизирующей энергии электронов 70 эВ, иогоши-

рущой силе тока 30D тА, температуре испарителя 270°С .

Спектры ИК регистрировались на спектрометре "SPBCORD" -75IR в диапазона от 400 до 4000 см Использовалась техника приготов-леши образцов в вазелиновом масле и хлороформе, в кювете из КВг с толщиной 0,128 мм, в качестве кошенсации использовалась аналогичная кювета.

ГЛАВА 3. ЫЕМБРАИОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА }«ДА ИИРИДИНСОДЕРШЩ: ПЕСТИЦИДОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ С ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ.

Биологические мембраны - это сложные,гетерогенные образования, и поэтому для исследования взаимодействия гербицидов только с лшшдной их частью удобно использовать модельные системы, которыми являются липосош и мульгиламеллярные фосфолшшднив дисперсии.

_В разделе 3.1 представлены результаты собственных

экспериментальных исследований, а также литературные данные о комплексообразовашш соединений -ацепокса, о-фенантролина, а,а-дипиридила, а-пиколиновой и хинальдиновой кислот с различными ионами переходных металлов. Известно, /Регг1п,1979, Slllen,1964, Marten, 1982/, что о-фенантролин, а,а-доширидил, а-пиколиновая и хкнальдашовая кислоты в водных и водно-этанольных растворах образуют устойчивые комплексы с такими ионами, как Мпг+, Сиг+, Сог+, ?ег+, Ni2+, Zn2+.Структура комплексов этих соединений с указанными ионами представляет собой ,в основном, бидентантные октаэдрические комплексы, в которых с центральным ионом связаны две молекулы лиганда.

Из всех исследованных в данной работе соединений структура комплексов ацепокса с ионами переходных металлов в настоящее вре-мд оказалась. наименее изученной. В связи с этим методами ИК-ст.октроскопии и 1Н-ЯМР была исследована комплексообразующая спо-

собность ацепокса с ионами Кпг+н Со2+ в водных растворах.

Анализ экспериментальных данных показал, что в процессе кошлзксообразования участвуют атомы азота оксимного фрагмента и атош азота пиридинового кольца. Сопоставление данных, метода 1Н-®.'Р и, метода рентгеноструктурного анализа *, однозначно свидетельствуют, что в состав комплекса входят две молекулы ацепокса. Комплекс ацепокса с конами Мл2* является Оидентантным, поскольку кавдая кз двух молекул ацепокса двумя атомами азота связана с центральным атомом. Две другие координационные связи образуют атомы С1, причем ион металла находится в искажянном октаэдрическом окрукешш (рис.1).

АЦЕПОКС

рис.1. Строение комплекса

оттеаттлтл^и г»

ацепокса с ионом Мп'

О" • Н

«Реятгеноструктурныэ исследования молекулы ацепокса были проведены сотрудника™ лаборатории ФХДО ИБОХ АН УзССР Салахутди-навнм Б.А. и "Гагатовым С.А.

При сравнительном изучении ПК-спектров ацепокса и его комплекса с Со2+ наблюдается смещение в низкочастотную область полосы валентных колебаний С=Н, увеличивается частота колебаний связи N-0 в спектре комплекса по сравнению со спектром лиганда ( табл.)).

Таблица 1.

Отнесение полос в ИК-спектрах ацепокса и его комплекса с ионом Со2+(в см-1), ацапокс IЕцепонз+Со2+1 отнесение полос

3550 3550 свободные г>он

3230 3230 связанные уон

1650 1625 vc=n

1590 1590

1560 1550 колебания пиридинового кольца

14-90 1485 баз СЕ

1360 ' 1365 баз СН

1150 1165

1110 1100 1

1040 1050 1 плоскостные бен ароматики

1005 1005 ]

930 960 V ш

785 790 неплоскост. бен 1,2 замещенной

ароматики

Сохранение в спектре комплекса полосы ОН-группы свидетельствует о том, что координация иона Со2+ с оксимшм фрагментом

происходит по схеме I: Со3» ^

ОН Л /

II

Л ✓ / N

Я м - с

с

i

✓ ч I сн3 II

Такая схема объясняет изменение частот поглощения связей СМ и N0. Наблюдаемые в спектре изменения полос поглощения плоскостных и неплоскосгных деформационных колебаний связи СН ароматического кольца свидетельтвуют об участии атома азота в координации с ионом Сог+по схеме II.

леот

состав 1:2. В этом ке разделе методом 11I-ЯМР проведет исследования комплексообразующей способности ГФП с ионами Рг3+, используемого в качестве сдвигающего реагента в ЯМР спектроскопии лтаосом. Полученные результаты позволяют заключить, что в водных растворах комплексы с ионами Рг3+образуют а-отколиковая и хинальдиновая кислоты, в то время как а,а -дияиридил, о-фенантролин и ацепокс игле ют слабую реакционную способность по отношению к ионам Рг3+. Предполагается, что необходимым условием образования комплексов с ионами Рг3+ является наличие атома кислорода в карбоксильном фрагменте, который несет отрицательный заряд и способствует электростатическому взаимодействию с центральным атомом Рг34".

Локализации в бислое молекул о-фенантролина , ацепокса, а,а-дипиридила, а-пиколиновой и хинальдиновой 'кислот и их комплексов с ионами Сог+посвяцен раздел 3.2. Данные задачи решались методом ЯМР на ядрах 1Н и 31Р и ДСК.

Для изучения методом 1Н-ЯМР взаимодействия №1 с лшшд-ными бислоями в образцах лтагосом из ФХ и смеси ФХ+30мол.%КЛ были

измерена значения времен спин-решеточной релаксации Т1 протонов исследуемых соединений.характеризующие как подвижность мэмбрано-активных молекул, так и свойства их микроокруяения (табл.2).Результаты измерения Г, протонов различных ГФП в образцах ФХ липосом приведены в табл.2.

Таблица 2.

Наименование соэдине-! Измерения 1ТХ ВаО/Тхлип

ния I------------------------1

! в Бя0 !в липосомах!

а,а -дшшридил (а)З.ОН (а)0.413 (а)7.298

(7,Р*)3.365 (р)0.747 (Р)5.254

ф)3.925 (7)0.929 (7)3.622

(Р*)0.846 (р' )3.978

о -фениптролин (а)1.893 (а)0.527 (а)3.592

ф)2.161 (Р,7)0.569 (§)3.798

(7)2.182 (д)0.575 (7)3.795

(0)2.012 (0)3.536

о -штколшовая (а)1.234 (а)0.447 (а}2.712

кислота ф)2.905 (0)1 .903 (Р)1 .527

(7)2.584 (7)2.312 (7)1.118

ф1)2.8Тб (Р') 1.954 (Р')1.472

яцепокс (а)2.692 (а)1.771 (а)2.923

(¡3)5.912 (Р)1.693 (Р)3.492

(7)4.183 (7)1.613 (7)2.593

ф' )4,535 (Р' )1.679 (Р')2.731

ишлияшовая (А)1.748 (А)1 .347 (А)1.298

дг.-лота (В,С)?.128 (В,С)1.96^ (В,С)1.084

Сравнение величины Т1 протонов молекул ГФЯ о зодшх образцах н образцах лотосом свидетельствует о том, что в присутствии липи-днах систем имеет место уменьшение значения Т1, которое наиболее значительно для о-фокантролина , ацепокса я а.а-дипирлдила (более, чей в 3 раза). Это связано с уменьшением подвижности молекул ГФП, обусловленного их взаимодействием с молекулами фосфо-липидов.

Результаты измерения Т1 молекул ГФП в образцах ляписом, сформированных из ФХ+30мол.ЖЛ, практически мало отличаются от данных, полученных на образцах ФХ лштосом.

с целью определения уровня локализации ГФП в липидпом бис.тое была использована методика ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО). Наиболее статистически достоверные результаты ЯЭО получены для о-фенантролкна и ацепокса, из которых следует, что определенные фрагменты данных молекул располагаются вблизт углеводородных сегментов ацилышх цепей фосфолипидов. Из сопоставления значений величины отклика ЯЭО для этих двух молекул в ФХ липосомах следует, что уровень локализации о-фенантролина располагается низке уровня ацепокса относительно глицеринового остова молекул липпдов бислоя (рпс.З).

Это подтверждается и тем фактом, что добавление о-фзнантролкна к образцам ФХ липосом приводят к сдвигу сигналав 1Н-ЯМР протонов СКг-фрагментов , связанных непосредственно с ацильнцм участком углеводородной цепи фосфолипидов за счет возмущающего действия мембраноактивной молекулы. Подобный сдвиг е случае ацепокса не был зарегистрирован.

Приведенные сиаоопигаге екгперимвнтн показали, что молекул! а.а-дшлгр-идшла лжалкзуятся на уровне гявцертювого остова лзши-дов. Молекулы г«? к-гиколпюзоЯ и хинаиогаковоЯ кислот

распологаются в основном в полярной области головок молэкул фосфолипидов.

Измерение значения Т1 протонов молекул Ш1 в составе комплексов с ионами переходных металлов Сог+, Мпг+и т.д. в образцах ли-посом затруднено из-за сильного уширения при комнатной температуре сигналов 1Н-ЯМР как самих ГФП, так и сигналов холинового фрагмента ФХ. В связи с этим для получения информации о характере взаимодействия и участках локализации комплексов ГФП использован метод ЯМР на ядрах 31Р. Кроме того данный метод позволяет регистрировать возможные полиморфные превращения в КЛ-содержащих мембранах, которые могут индуцироваться и комплексами ГФП. Анализ измерения спектральных параметров Дг>э$ф и (Ивков и Берес-

товский,19'79) показал, что при добавлении комплексов о-фзнантролина, ацепокса и а,а-дипиридила с ионами Со2+ молекулярные система вызывают лабилизацию Сислойной структуры, приводящей к увеличению подвижности фосфолипидов относительно нормали к бислою, по сравнению с исходным образцом. Совокугшость полученных данных позволяет заключить, что определенная часть липо-фильгшх комплексов данных молекул внедряется на начальные участки межцепочечного пространства фосфолипидов в бислое. Любая из двух молекул ГФП, входящих в координационную сферу центрального иона, имеет вероятность проникновения в липидный бислой при соответствующей ориентации относительно мезкфазной границы. Комплексы а-пиколиновой и хинальдиновой кислот обладают меньшей проникающей способностью из-за внесения каждым лнгандом отрицательного заряда, создающего дополгштельный электростатический барьер.

В разделе 3.2.3 изучена взаимосвязь химической структуры всех исследуемых ГФП и их комплексов с ионами Млг+и участка их

локализации в лшшдном бислое. Предложенные модели (рис.3)

локализации предполагают, что термодинамические параметры модельных состава Судет незначительным.

их влияние на мембран различного

Рис.З.

локализации ацепокса в

Сислоо.

Схема

молекулы лилидном

ДСК эксперименты на ДО>Х+10мол.ЗДЫ£К и

Действительно,проведенные методом мультиламоллярных дисперсиях ДМФХ, даИ+4мол.%Щ] показали, что ни одно из исследуемых соединений и их комплексов с ионами металлов не приводило к существенному изменению термодинамических параметров фазового перехода. Отсутствие изменений значений параметра АН подтверждают данные ЯМР о том, что эти соединения локализуются, в основном, в приповерхностной области лштидного бислоя, находящегося в гелевом состоянии.

Степень кооперативное™ фазового перехода зависит от мольной доли мембраноактивных молекул в лшщдной фазе и, следовательно, определяется коэффициентом распределения исследуемых веществ в системе мембрана-вода. На основании данных, полученных методом ДСК с использованием термодинамического соотношения

Гиббса-Гельмгольца для системы липидный бислой - мембраноактив-ная молекула, были проведены полуэмпирические расчеты коэффиииен-та распределения молекул ГФП, который оказался равным 0,15. Таким образом, на основании этих расчетов модели показано, что

из-за малого аначэния коэффициента распределения в система мембрана-вода лить только 15% от общего количества молекул Ш1 аффективно взаимодействуют с мембраной в процессе Фазового перехода гель-жидкяа кристалл. Значение коэффициента распределения для комплексов Ш1 с ионами металлов сравнимо с таковым для самих соединений.

Локализация молекул о-фенантролина, ацвшка и а,а-дипиридила на определенной глубине липидного Сислоя должна приводить, по-всей видимости, к образованию в нем структурных дефектов , которые в свою очередь могут изменять барьерные свойства лииидноЕ мембраны. В разделе 3.3 методом 1Н-ЯМР представлены результаты изучения изменения проницаемости модельных мембран для ионов Рг3+ и Мпг+.

Полученные результаты показали,что молекулы .ацепокса, о-фенантролина, а,а-дипиридила и ЛК-281 индуцируют увеличение проницаемости липидного Оислоя, в то время как кислые соединения а-пиколиновая и хинальдиновая кислоты во всем исследованном концентрационном диапазоне не изменяют барьерных свойств липидного бислоя .

Поскольку по данным 1К-ЯМР молекулы кислых ГШ , особенйо а-пиколиновая кислота, с большой эффективностью образуют в водных растворах комплексы с ионами Рг3? а молекулы о-феаантролина, ацепокса и а,а-дшшридала слабо координируются с этим центральным ионом, но предполагается, что ионы Гг3+ проникают во внутренний объем липосом, главным образом, через дефекты. индуцируемые локализованными в липидном бислое молекулами ГШ, не входящими.в состав комплексов. Комплексы а-шпсолиновой и хинальдиновай кислот с ионами Рг3+ не обладают в необходимой степени лшюфилъностью , позволяющей им эффективно взаимодействовать.

с лишдшм бислоем, и, соответственно, как свободные молокулы ГФП, индуцировать дефекты в структурной организации бнслоя, через которые могут проходить свободные ионы металла.

Из эксперименталышх данных следует, что часть комплексов о-фонантролина, ацепокса и а,а-дшшридила с Мп2+могут внедряться

в липидннй бнслой

проницаемости для

а-пиколиновая кислоты г+

и индуцировать свободных ионов практически не

увеличение пассивной Мпа + .Хинальдшювая и изменяли проницаемости

мембран для Мп'

Целью раздела 3.4 является изучение методом ДСК влияния молекул ГФП на межмембрашшй обмен липидами, ипдуцтфуешй двухвалентными ионами 0а2+, Шг¥, Сиг+ Сог4в эквимолярной смеси двух популяций липосом ДМФХ+1 Омол.% ДМФК и ДПФХ-МОмол.ЗДМФК, тлеющие на исходной термограмме индивидуальные пики плавления (рис.4а).

Бис.4.Термограмма плавления эквимолярной смеси липосом (ДМФХ+1С1%даФК) + (ДПФХ+1СВДМФК) а) контроль ;Ь)при добавлении смеси хшшльдшовой кислоты + Са ,с)ионов Са , с1)11ри добавлении к образцу , содэржащзму хкналь-диновая кислота Са полипептида Уо5, е) при

добавлении к образцу, содержащему хинальдиновая кислота + Са полипептида с1?с5. Молярное соот-

нопение ГФП:лшшд=1:1

гч.5

42.0

г,°с

/0°

Если в первоначальную механическую смесь липосом добавить ионы Саг+ в концентрации 1 иоп Саг+ на 10 молекул липида, то в отличие от исходной терглограмш (рис.5), кривая плавления представляет собой суперпозицию по крайней мере, трех кривых плавления. Основной шш III с максимумом при Тп = 34,5° С соответствует фосфолипидщм структурам, образовавшимся в

результате интенсивного обмена липидным материалом между двумя популяциями липосом. Пикам I и II при Тп=24,5° С и Тп=40° С соответствуют часть липидов, не включенных в процесс обмена. Полученные результаты полностью подтверждают ранее полученные методом ДСК данные работы (РарайасЦорои1оз е1; а1., 1978). При добавлвтш в образцы липосом, содержащих молекулы Г01 ионов Са2+, наблюдается существенное ингибирование процесса межмембранного переноса молекул липида.

Далее показано, что процесс обмена липидным материалом индуцируют и ионы Со2+, Мп2+ и Си£+. Однако, эффективность переноса липидов значительно уменьшается в случае добавления в образцы липосом комплексов ацепокса, о-фенантролина, а,а-дхширидила, хинальдиновой и а-пиколиновой кислот с ионами Со2+, Си2+ и Мпг+ .

На основании анализа собственных и литературных данных /БауеП. ,1988/, предполагается, что для исследованных ГФП и их комплексов механизм ингибирования межмембранного обмена липидами заключается в модификации свойств популяций как доноршх , так и акцепторных липосом. Это происходит при внедрении ГФП и их комплексов в липидный бислой, в результате чего изменяются, во-первых, физические свойства мембран, во-вторых, уменьшается количество вакантных мест в мембране для внедрения молекул фосфо-липида-гостя.

Процессы слияния мембран контролируются на только двухвалентными катионами, но также эндогенными и экзогенными фьюзогенами белковой природы /Не КийЗГГ,1985/. Большинство природных фьюзо-генов являются периферическими белками. Однако ряд интегральных белков также могут инициировать слияние мембран /БгоИЪ ot.al.1983/. Выделение подобных интегральных белков сопряжено с

определенными трудностями и выход продукта в обычно незначительный.

Мембраноактивше полипептиды УС1 и vc5, выделенные из яда среднеазиатской кобры, моделирующие на модельных мембранах ряд основных свойств интегральных белков /Аршов, 1988/, являются чрезвычайно полезными инструментами в исследованиях мембранных взаимодействий. Детальные исследования /Гасанов, 1989/ показали, что данные полипептида являются эффективными фьюзогенами липосом, содержащих кислые липиды.

Получение мембргноактивных полипептидов со свойствам! периферических белков оказалось возможным в случае химической ковалентной сшивки двух йУс1 и «IV 5 или более единиц полипептидов р7с1 и с помощью бифункционального агента - диметил-суберимидата.

В рззделе 3.5 методам! ДСК и ЭПР проведено сравнительное исследование мембраномодифицируюцих свойств мономерных, димерных и олигомерных форм молекул полипептидов на образцах мультиламел-лярных дисперсий из смеси ДМ1>Х+10мол.%ДОФК., ДМФХ+2мол.% КЛ и ориентированных лшшдных пленках из смеси ДМФХ+10 мол.ЖФК. Показано, что различная степень олигомеризации мембраноатстивного полипептида позволяет получить популяцию белков с принципиально различными мембраноактивными свойствами. Если мономерная форма полипептида погружается в мембрану на глубину одного монослоя и мокет моделировать свойства интегрального мембранного белка, то димарная форма взаимодействует с мембраной на уровне углеводородных сегментов в приполярной области бислоя, в то время как олигоморная форма, взаимодействующая с мембраной па границе раздела, отражает свойства классического периферийного белка. Следовательно, использование различных форм полюгап-

тидов позволяет исследовать широкий спектр липид-белковых взаимодействий, а также влияния на них ГШ и их комплексов с ионами металлов.

В разделе а.6 изложены результаты изучения методом ДСК и 1Н-ШР влияния комплексов ГФП с различными ионами металлов на процессы лшшдного обмена между двумя типами лнпосом ДЫФХ+10мол.й ДМФК и ДПФХ+Юмол.% Д5Ш, индуцируемых мономерами, димерами и олигомарамл полипептида Ус5.

Согласно данным ДСК в контрольных образцах молекулы Ус5 уже при первом сканировании индуцируют фактически полное смешивание лнпидов, в основном за счет слияния липосом (Аршгав,1988). Молекулы с№с5 и рУс5также вызывают интенсивный процесс обмена лишдшм материалом меаду двумя популяциями липо-сом (рис.5), причем эффективность их действия распологается в ряду: Ус5 > дасб > рУс5.

рис.5.Термограмма плавления смеси двух популяций липосом без (а) и при добавлении (с), рУс5 (й)

Ус5 (Ь)ДУС5

Однако в смеси липосом, содержащих молекулы ГФП, ситуация совершенно иная. Каждое из исследуемых соединений ацепокс в от-' носительной концентрации 1:10 существенно исключают способность Ус5 вызывать слияние мембран . Далее показано, что и комплексы молекул о-фенантролшш, ацеиокса и хинальдижгаой кислоты с ко-

нами Сог\ Си2+и Мп2+ оказали аналогичный пшткйфущий эффект на действие 7С5, как и комплекс ацепоксв . Экспериментальные результаты , полученные для димеров с!Ус5 и олигомеров рУс5 однозначно свидетельствуют о том , что присутствие ГФИ и их комплексов, с ионами металлов в образцах мембран , препятствуют протеканию процессов мэзмембранного обмена липидным материалом, кото-рай индуцировался ими в чистых линидных системах (рис.6).

24 Ь ЩО ¿,"0

и '

ГС

рис.7» Тормограмма плавления смеси лшосом. а)контроль,-в)при добавлении о-фенант-ролина (Сгфп/Слип - 1:1), с)при одновременном добавле-гаш Са2++о-фенштролина (1:2),д)при добавлении к смэ-

о I

си Са +о-фэнантролина Чс5, е) [Са2++о-фенантролин)+с1Ус5 1)С Са2++о-фенвнтролин]+р7с5.

Поскольку,как было показано, молекулы йУс5 и а особенности р7с5 моде:шруют свойства периферийных белков,

предполагается,что комплексы с ионами металлов нарушают физические свойства полярной части мембран.

Таким образом, на основании экспериментальных данных можно сделать вывод, что молекулы ГФП способны нарушать процессы меж-

а

маморзнгого обмена и слияния, которые могут контролироваться двух валентными катионами и белковыми фыозогенами.

В—Заключении дается краткое резюме основных данных, полученных в диссертационной работе.

ВЫВОДЫ.

1. На основании собственных и литературных данных -было установлено, что изученные пиридинсодертацие соединения образуют в водных растворах устойчивые комплексы с ионами Со2+,Сиг+и Шг*, в которых с центральным ионом связаны две молекулы литанда.

2. Установлено, что глубина проникновения гербицидов <в литад-ный Сислой зависит от химической структуры препаратов, "йехакизм взаимодействия с липидами определяется состоянием -атомов азота Пиридинового кольца, а также атомов азота или кислорода различных заместителей. Соотношение размеров полярной и гидрофобной областей молекул гербицидов определяет их локализацию по профилю мембраны.

3. На модельных мембранах, методами ЛМР и ДСК изучены мембра-нотропные свойства различных по структуре пиридинсодержащих гербицидов - о-фенантролина,а,а-дшшридила, ацепокса и а-пиколиновой к хинальдиновой кислот. Показано, что действие гербицидов на модельные мембраны проявляется в модификации ими структурной упаковки участков фосфолипидов, примыкающих к области глицеринового остова.

4. Показано, что возмущение молекулами гербицидов, но содержащих карбоксильные остатки, исходной упаковки мембр^.ш приводит к образованию дефектов в ламеллярной структуре, проницаемых для ионов Рг3+.

5. Установлено, что при определенных концентрациях все изученные соединения ингибируют межмемСранныЙ обмен липидными моле-

кулами в процессе слияния липосом, индуцируемых температурой и двухвалентными катионами Ga2+,Cu2+,Iöi£+n Соа+. Показано, что комплексы гербицидов с ионами металлов ингибируют фьюзогегаше свойства мембраноактивных полшгелтидов, моделирующих свойства интегральных и периферических белков.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Природа возмущенной липидной фазы, индуцируемая мембраноактивнкми полипвптидами в бислойных фосфолипидных мембранах /Арипов Т.Ф., Потиевская Е.В., Розенштейя И.А., Салахутдинов Б.к.//В кн."Проблемы и перспективы развития химии природных и физиологически активных веществ" -Ташкент. -ФАН -1388 -С. 338-359.

2. Исследование возможности сближения цитотоксинов яда кобры в плоскости липидного бислоя /Арипов Т.Ф., Бекназаров У.М., Потиевская Е.Б. и др.//ДАН .УзССР. -1983 ~М. -С. 51-52.

3. Влияние молекул пестицидов на процессы слияния и агрегации липосом, индуцируемые мембрана-активными полипептидами /Потиевская Е.Б., Салахутдинов Б.А., Арипов Т.Ф.//Рефераты докладов и сообщений xiv Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. -М.:Наука. -1989. -Iii. -2.89.

4. Исследование методами магнитного резонанса образование небислойных структур в кардиолипин-содержащих мембранах, индуцируемое катионными агентами/ Гасанов С.Э., Потиевская Е.Б., Абдрашитова и.и., Арипов Т.Ф.//Тезисы докладов vii Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине". -Звенигород. -1989. -С.220-223.

5. Влияние гетерофункциональннх пестицидов на мешембранннй липидный обмен/ Потиевская Е.Б., Салахутдинов Б.А., Карцев Б.Г., Арипов Т.Ф.// Тезисы всесоюзного совещания по

пестицидам.-Черноголовка -1930 -C.I05.

6. Структурные особенности взаимодействия некоторых пиридан-карбоноЕЫХ кислот с липосомами/ Камаев Ф.Г., Потиавская Е.Б., Салахутдшюв Б.А., Карцев В.Г., Арипов Т.Ф., Павлюченко А.И.// Тезисы всесоюзного совещания по пестицидам. -Черноголовка -1990 -0.103.

Подписано к печати 13.08.91г. Заказ J.229_____ОбьемЛ.п^____

Отпечатано на ротапринта ФБАНУзССР г.Ташкент ул.Муминова 13