Исследование нейрорецепторов методом многоточечной фотоаффинной модификации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА

? Г О О Д На правах рукописи

УТКИН ЮРИЙ НИКОЛАЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОРЕЦЕПТОРОВ МЕТОДОМ МНОГОТОЧЕЧНОЙ ФОТОАФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора химических наук

в форме научного доклада

МОСКВА 1996

Работа выполнена в Институте биоорган ической химии им. М.М.Шемякнна и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный консультант:

доктор химических наук В.И.Цетлин

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, академик РАН А.А.Бощанов доктор химических наук, чл.-корр. РАН А.И.Мирошников доктор химических наук, профессор В.М.Степанов

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии им.

В.А.Энгельгардта РАН

Защита состоится " "_ 1996 года

в 10 час. на заседании специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871 ГСП Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Автореферат разослан " "_ 1996 года

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В. А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение процесса передачи нервного импульса на молекулярном уровне является одной из наиболее актульных задач современной нейрохимии. Существенная роль в этом процессе принадлежит ненрорецепторам (НР), представляющим собой трансмембранные белки, участвующие в передаче сигнала от одной нервной клетки к другой. Знание пространственной организации НР и, в особенности структуры лиганд-связывающих участков, является ключевым моментом в установлении механизма их функционирования. Использование для установления структуры НР физико-химических методов, таких как рентгеноструктурный анализ или ядерный магнитный резонанс, ограничено как природой рецепторов (трансмембранные белки, редко поддающиеся кристаллизации), так и их размерами (молекулярная масса от нескольких десятков до сотен килодапьтон). Лишь использование электронной микроскопии позволяет в большинстве случаев установить общую форму молекулы или взаимное расположение ее достаточно крупных доменов.

Таким образом,встает задача получения информации о структуре НР с помощью иных методов. Большой объем информации к настоящему времени получен с использованием методов иммунохимии, генетической инженерии (направленный мутагенез и конструирование химерных белков) и аффинной модификации. Фотоаффинная модификация, при проведении которой высокореакционные соединения генерируются непосредственно в комплексе лиганд-рецептор, позволяет в принципе идентифицировать не только определенные фрагменты аминокислотной последовательности НР, формирующие его функциональные домены, но также установить отдельные аминокислотные остатки, принимающие участие в связывании лиганда. Следует отметить, что фотоаффинная модификация широко используется для исследования взаимодействия макромолекул. Однако, в случае беяок-белковых взаимодействий это исследование как правило ограничено использованием одного типа метки, расположение которой в аминокислотной последовательности не всегда точно установлено. При использовании фотоактивируемых производных низкомолекулярных лигандов непептидном природы в ряде случаев удалось установить расположение функциональных доменов в аминокислотной последовательности НР, однако такие лиганды доступны не для всех типов рецепторов. Более рациональным представляется использование для этих целей пептидно-белковых лигандов НР, содержащих фотоактивируемые группы в строго определенных положениях аминокнслотной

последовательности. Следует отметить, что к настоящему времени идентифицирован целый ряд немропептидных рецепторов, к которым в частности относятся С-белок-зависимые рецепторы тахикининов. Введение фотоактивируемых групп в различные положения эндогенных пептидов позволяет не только идентифицировать функциональные домены рецептора, но и установить нх взаимное расположение. В этом плане особый интерес представляют полипептидные нейротоксины, широко использующиеся для исследования различных НР. Так, постсинаптические нейротоксины змей, являющиеся конкурентными антагонистами никотинового ацетилхолннового рецептора, представляют собой небольшие белки (60-75 аминокислотных остатков) с жесткой структурой, стабилизированной 4-5 дисульфидными связями. Использование фотопроизводных этих токсинов, содержащих метки в различных положениях, может дать ценную информацию о структуре лиганд-связывающего участка рецептора.

В настоящей работе предложен подход к установлению структуры активных центров нейрорецепторов, основанный на использовании фотоактивируемых производных белково-пептндных лигандов, содержащих фотометки различного типа в идентифицированных положениях молекулы, и локализации образующихся высокоспецифичных ковалентных связей лиганд-рецептор. Предложенный подход использован для исследования рецепторов различных типов: олигомерных лиганд-управляемых ионных каналов, С-белокзависимых рецепторов, а также рецепторов, состоящих из субъединиц различного размера.

Исследование никотинового ацетилхолннового рецептора проводилось совместно с лабораторией проф. Ф.Хухо (Свободный университет Берлина), а масс-спектрометрический анализ продуктов пришивки токсина к рецептору выполнен совместно с лабораторией проф. Р.Кауфмана (Университет Генриха Гейне, Дюссельдорф). Автор выражает свою глубокую признательность проф. Хухо и проф. Кауфману.

Цель и задачи работы. Основной целью исследования явилась разработка метода многоточечной фотоаффинной модификации для изучения структуры нейрорецепторов. Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Осуществить синтез фотоактивируемых производных лигандов, содержащих фотоактивируемые группы различного типа в идентифицированных положениях аминокислотной последовательности, и разработать метод введения радиоактивной метки, не затрагивающий лабильные аминокислотные остатки.

2. Для каждой серии производных разработать оптимальные условия образования ковалентных поперечных сшивок лиганд-рецептор.

3. Разработать условия расщепления ковапентного комплекса и выделения пептидов, содержащих ковалентно связанные фрагменты лиганда и рецептора.

4. С использованием современных аналитических методов установить структуру выделенных пептидов.

Предложенный подход был использован для исследования следующих рецепторов: никотинового ацетилхолинового рецептора электрического органа ската Torpedo californica, рецептора вещества Р мозга крысы, а также потенциалзависимого натриевого канала мозга крысы.

Научная новизна и практическая значимость работы. Разработан подход к установлению структуры функциональных доменов НР с применением фотоактивируемых производных пептидно-белковых лигандов, содержащих фотометки различного типа в идентифицированных положениях аминокислотной последовательности. Получено большое число производных нейротоксинов змей и скорпионов, а также тахикининового пептида вещества Р, и исследовано их взаимодействие с соответствующими рецепторами.

В случае никотинового ацетилхолинового рецептора впервые установлено, что характер лечения субъединиц зависит не только от положения метки в молекуле токсина, но и от природы выбранной метки. С использованием различных производных токсина показано, что лигандсвязывакицие участки рецептора находятся в областях контакта субъединиц.

Впервые показано наличие в ацетилхолиновом рецепторе двух участков связывания а-конотоксина 01, при этом участок, обладающий высоким сродством к конотоксину, включает у-субъединицу, а низкоаффинный - 5-субъединицу.

Предложен метод локализации фотоактивируемых групп в молекуле лиганда с использованием масс-спектрометрии. Метод МА1ЛЭ1-масс-спектрометрии использован также для установления структуры кросс-сшитого пептида рецептора, при этом установлено включение метки в остаток 5-субъдиницы А1а2б8, входящий в предполагаемый трансмембранный фрагмент М2.

На основании полученных данных установлено расположение молекулы токсина в одном из участков связывания на расстоянии не менее 40 А от экстрацеллюлярной поверхности рецептора.

Предложенный метод может применяться для исследования различных рецепторов соединений пептидно-белковой природы. Полученная информация о структуре активных центров рецепторов может быть использована для конструирования лигандов с заданными свойствами и создания на их основе лекарственных препаратов, обладающих высокой специфичностью.

Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: VI СССР-ФРГ симпозиуме по химии пептидов и белков (Гамбург, 1987), V Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Рига, 1988 ), II Пептидном форуме (Нанси, 1988), Коллоквиуме UCLA "Синтетические пептиды: подходы к биологическим проблемам" (Парк Сити, 1988), IX Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений (Рига, 1989), I Советско-японском симпозиуме "Рецепторы: структура и функции" (Москва, 1989), Конференции "Нейропептвды и иммунопептвды: передатчики в нейроиммунной системе" (Нью-Йорк, 1989), Международном симпозиуме по рецепторам и ионным каналам (Западный Берлин, 1989), IX Европейском симпозиуме по животным, растительным и микробным токсинам (Лоохусалу, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (Таллинн, 1990), IV СССР-ФРГ симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Москва, 1991), X Всемирном конгрессе по животным, растительным и микробным токсинам (Сингапур, 1991), II Российско-израильском симпозиуме по пептидам и белкам (Москва, 1992), Международном симпозиуме "Структура и функции регуляторных полипептидов" (Москва, 1992), Международном симпозиуме "Синапсы и рецепторы. Молекулярные перспективы" (Кембридж, 1992), 9 Конференции Европейского общества нейрохнмнн (Дублин, 1992), 14 Бланкенезской конференции "Модуляция сигналов в нервных системах" (Гамбург, 1994), Конференции "Нейрональные никотиновые рецепторы: разнообразие, функции и патология" (Страсбург, 1994), Конференции "Холинергическин синапс: структура, функция и регуляция" (Балтимор,

1994), 23 Конференции Федерации европейских биохимических обществ (Базель, 1995), 21 Симпозиуме ЕМВО (Европейской организации молекулярной биологии) "Структура и функции белков" (Гейдельберг,

1995), 3 IUPAC симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 статей в отечественных и зарубежных журналах и сборниках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Метод фотоаффинной модификации наряду с методами генетической инженерии является в настоящее время одним из основных инструментов исследования нейрорецепторов. Большой объем информации при этом получен с применением низкомолекулярных лигандов, которые однако доступны не для всех типов рецепторов. Фотоактивируемые производные пептидно-белковых лигандов использовались в основном для идентификации субъединиц рецепторов, участвующих в их связывании. При этом как правило не ставилась задача установления положения метки как в лиганде, так и рецепторе. Исследования механизма лигакд-рецепторного взаимодействия помимо идентификации субъединиц включают в себя и другие этапы, среди которых следует отметить установление взаимоотношений между участками связывания различных лигандов, а также определение фрагментов аминокислотной последовательности и отдельных аминокислот, принимающих непосредственное участие в формировании активного центра рецептора. Следует отметить также, что зачастую исследования проводились с использованием фотоактивируемой метки одного типа. Это также существенно ограничивает возможности метода. Как известно, способность претерпевать превращения под действием света присуща практически всем органическим соединения, при этом лишь немногие нашли применение в качестве фотоактивируемых групп. В белковой химии для этой цели используются соединения на основе арилазидов (генерирующие при облучении нитрен), диазосоединения и дназирины, дающие карбены, а также производные бензофенона, генерирующие при облучении реакционноспособный триплетньш бирадикал. Наиболее широко используемыми в настоящее время являются арилазвдные метки, что обусловлено легкостью синтеза этих соединений и сравнительно высокой реакционной способностью образующегося при облучении нитрена.

В настоящей работе проведено систематическое исследование метода фотоаффинной модификации в приложении к нейрорецепторам различных типов: никотинового ацетихолинового рецептора Torpedo califomica, рецептора вещества Р мозга крысы и потенциалзависимого натриевого канала мозга крысы. Эти рецепторы различаются не только по структуре, но также и по представленности в ткани: от десятков фемтомолей на миллиграмм белка для рецептора вещества Р до наномолей на миллиграмм для ацетилхолинового рецептора.

Синтез фотоактив ируемых производных вещества Р и исследование их взаимодействия с рецепторами мозга крысы.

Вещество Р (БР) представляет собой ундекапептид ЯРКРС^ЕРСЬМ с амидированной С-концевой карбоксильной группой и принадлежит к семейству тахикининов. К настоящему времени в центральной нервной системе млекопитающих идентифицированы по крайней мере 3 типа рецепторов (ЫК 1, ИК1 и ЫК 3), имеющих различное сродство к веществу Р и другим тахикининам. При этом сродство 5Р к рецепторам типа МК 1 на несколько порядков выше, чем к двум другим. В качестве источника тахикининовых рецепторов в работе были использованы плазматические мембраны мозга крысы.

Поскольку БР является достаточно коротким пептидом, любая его модификация в принципе может приводить к изменению активности. В последовательности этого пептида отсутствуют остатки тирозина, удобные для введения радиоактивного иода. В настоящее время для исследования рецепторов N{(.-1 типа используется производное БР, модифицированное радиоактивным реагентом Болтона-Хантера по остатку ЬуэЗ (ВН-БР). Это соединение имеет такую же активность и специфичность, что и БР, однако в нем доступны для введения фотоактивируемой группировки лишь Ы-концевая а-аминогруппа и [уанидиновая группа А^ 1. Так как образующиеся при модификации гуанидиновой группы продукты недостаточно устойчивы, более подходящей для введения заместителя представлялась аминогруппа. Для того, чтобы сохранить заряд на модифицированной аминогруппе, мы использовали реакцию восстановительного алкилирования л-азидобензальдегидом в присутствии боргидрида натрия. Следует отметить, что чрезвычайно низкое содержание тахикининовых рецепторов в ткани (десятки фемтомолей на мг белка) предъявляет высокие требования к удельной радиоактивности производных, а это в свою очередь приводит к необходимости работать с очень малыми количествами соединений. Использование малого количества высокорадиоактивного ВН-БР для реакции модификации потребовало больших избытков реагента для достижения удовлетворительного выхода продукта. В результате разделения продуктов реакции методом обращенно-фазной ВЭЖХ получено фотоактивируемое производное вещества Р с удельной активностью ~2000 Ки/ммоль. Анализ "темнового" взаимодействия этого фотопроизводного с мембранами мозга крысы показал, что параметры связывания фотоаналога (Кй 0,34 нМ и Втах 20 фмоль/мг белка) близки таковым не содержащего фотометки лиганда (0,7 нМ и 60 фмоль/мг белка).

Следует, однако, отметать, что уровень неспецифического связывания в присутствии нативного БР был довольно высоким и снижался в несколько раз в присутствии аналога, содержащего две оксифенилпропионильные группы. Анализ связывания этого соединения в присутствии различных нейрокининов и их аналогов позволил предположить, что в его связывании принимает участие не только рецептор ЫК 1 типа, но и еще один рецептор с неустановленной специфичностью.

При изучении продуктов мечения компонентов мембран мозга крысы этим фотопроизводным было обнаружено включение радиоактивности в несколько полипетидов. При этом нативный пептид не оказывал практически никакого влияния на картину мечения, и лишь диоксифенилпропионильное производное предотвращало мечение полипептида с молекулярной массой 59 кД.

Чтобы получить фотоактивируемый аналог, по структуре наиболее близкий к ВН-БР, были приготовлены производные азидосалициловой кислоты, позволяющие ввести радиоактивный иод в фото активируемую

Рис. 1. Выделение азидосалицильных производных вещества Р обращеино-фазной ВЭЖХ на колонке Ultrasphere ODS (4,6x250 мм) в градиенте концентрации ацетонитрила.

группировку. С этой целью пептид вводили в реакцию с Ы-оксисукцинимидным эфиром л-азидосалициловой кислоты. Продукты

реакции разделяли обращенно-фазной ВЭЖХ (Рис. 1). По данным УФ-спектроскопии фракции 1, 2 и 3 содержат остатки азидосалициловой кислоты. Данные N-концевого анализа соединения 2 (Рис. 1) свидетельствуют о наличии свободной а-аминогруппы аргинина. Следовательно, в этом производном азидосалицильная группа находится на остатке Lys 3. Соединение 1 имеет свободную е-аминогруппу Lys 3, что свидетельствует о модификации N-концевой аминогруппы Arg 1. Соединение 3 не содержит свободных аминогрупп и является дипроизводным.

Полученные монопроизводные иодировали лактопероксидазным методом при рН 8,5. Эти условия, как было показано ранее в случае холецистокинина, не приводят к окислению остатка метионина. Исследование взаимодействия азидосалицильных производных SP с мембранами мозга показало наличие специфического связывания, однако обнаружило еще более высокий уровень неспецифического связывания. Для этих соединений не удалось обнаружить специфического мечения ни одного из компонентов мембран.

При дальнейшем исследовании выяснилось, что арилазидные метки имеют ряд существенных недостатков, среди которых можно отметить множественность продуктов сшивки, нестабильность их в процессе очистки и некоторые другие. С аналогичными проблемами сталкивались и другие авторы, использовавшие арилазидные метки (Brunner J., 1993). В последнее время появились сообщения о том, что n-бензоилбензойные производные дают существенно более высокие степени пришивки. Для синтеза таких производных SP нами использовалась дкухстадийная схема модификации. На первой стадии получали монопроизводное пептида, содержащее остаток реагента Болтона-Хантера на Lys 3 (для введения радиоактивного иода), а затем по N-концевой аминофуппе вводили остаток бензоилбензойной кислоты. Для введения фотоактивируемой группировки по Lys 3 пептид сначала модифицировали N-оксисукцинимидным эфиром бензоилбензойной кислоты, и лишь затем в полученное и очищенное монопроизводное вводили остаток реагента Болтона-Хантера. Все промежуточные и конечные соединения очищали методом обращенно-фазной ВЭЖХ, а их структуру подтвержали данными масс-спектрометрии и N-концевого анализа. Фотоактивируемые производные затем иодировали хлорамнновым методом и использовали для исследования рецептора.

При изучении бензоилбензойных производных проявились те же самые проблемы, что и с описанными выше аналогами. Хотя параметры "темнового" связывания этих производных также были близки величинам,

характеризующим связывание радиоактивного SP, уровень неспецифического связывания в присутствии нативного пептида был черезвычайно высоким. Однако в этом случае при исследовании мечения мембран удалось обнаружить подавление мечения одного из компонентов нерадиоактивным димодифицированным продуктом. Молекулярная масса этого компонента составила по данных! электрофореза в полнакриламидном геле 79 кД. Эта величина соответствует молекулярной массе гликозилированного рецептора SP, экспресированного в СНО клетках (Kage et al., 1995).

Полученные данные свидетельствуют о том, что ни одна из использованных нами фотоактивируемых групп не обладает какими-либо существенньши преимуществами перед остальными.

По-видимому, трудности идентификации специфически меченых полипептидов связаны с чрезвычайно низким содержанием рецепторов в ткани. Весьма вероятно, что вьщеление тахикининовых рецепторов в индивидуальном состоянии, или хотя бы в обогащенном виде позволило бы решить эту проблему. С этой целью мы попытались разработать метод выделения рецептора NK 1 типа из мозга крысы. Сложность задачи заключалась в необходимости перевести этот мембранный белок в солюбилизированное состояние с сохранением рецепторной активности. Среди всех использованных нами детергентов наиболее подходящим оказался CHAPS, предложенный для этой цели группой японских авторов (Nakata et al., 1988). Однако и в этом случае лиганд-связывающая активность быстро уменьшалась при хранении (практически полное исчезновение за 20 часов при 4° С). В качестве метода очистки мы использовали иммуноаффинную хроматографию на антителах, полученных к синтетическим пептидам, соответствующим фрагментам 55-64, 182-192, 225-236 и 236-245 аминокислотной последовательности рецептора SP из мозга крысы. Поскольку ни одно из полученных антител не ингабировало связывание радиоактивного лиганда, для контроля за процессом очистки мы использовали ковалентный комплекс SP-рецептор, полученный с использованием бифункцинального реагента дисукцинимндилсуберата. При этом антитела к SP узнавали пептид в составе ковалентного комплекса. Очистка этого комплекса примерно в 10 раз осуществлена высокоэффективной гель-хроматографией с последующим выделением на белок-А-сефарозе с использованием антител х SP. Достигнутая таким образом степень очистки явно недостаточна для дальнейшей работы. Учитывая имеющиеся в литературе данные (Weiland et al., 1987) о влиянии SP на связывание а-бунгаротоксина с АХР, мы попытались обнаружить

взаимодействие нейротоксинов с тахикининовыми рецепторами с тем, чтобы в дальнейшем использовать аффинную хроматографию на иммобилизованных токсинах для очистки рецептора SP. В результате проведенных исследований обнаружено, что постсинаптические нейротоксины имеют низкое сродство к тахикининовым рецепторам (ICjo ~ 10"5 -10"4 М) и не могут быть использованы для очистки последних. Следует отметить, что до сих пор задача выделения тахикининовых рецепторов из природных источников не решена. Более рациональным путем представляется использование для этой цели клеток-сверхпродуцентов с искусственно встроенными генами рецепторов (Takeda et al., 1991).

Таким образом, с использованием фотоактивируемых производных SP, содержащих метки различного типа в N-концевом фрагменте пептида, показано наличие контакта этого фрагмента с рецептором. Сравнение наших результатов с литературными данными для производных SP, содержащих метки в цетральной части молекулы пептида (Boyd et al., 1991), свидетельствует о менее тесном контакте (выходы кросс-сшивок ниже) N-концевого фрагмента пептида с рецептором. Однако низкая представленность рецептора и, как следствие этого, высокий уровень неспецифического мечения не позволили полностью реализовать возможности метода в случае тахикининовых рецепторов мозга крысы.

Синтез фотоактивируемых производных нейротоксинов скорпионов и исследование их взаимодействия с натриевым каналом мозга крысы.

10 20 30

VRDGYIADDKDCAYFCGRNAYCDEECKKGAESG

40 50 60

KCWYAGQYGNACWCYKLPDWVPIKQKVSGKCN

10 20 30

GVRDGYIAQPHDCVYHCFPGSGGCDTLCKENGA

40 50 60

TQGSSCFILGRGTACWCKDLPDRVGVIVDGEKCH

10 20 30

KEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSSG

40 50 60

YC AWP AC YC YGLPNW V KVWDRATNKC

М,0

В. eupeus

OS-3 О. scrobiculosis

токсин y Т. serrulatus

Рис. 2. Аминокислотные последовательности токсинов скорпионов.

Азндобензоильные производные токсинов скорпионов Мю Виг/им еиреиз и ОБ-З Orth.roch.irus ¡сгоЫсиЫ'ч (Рис. 2) были приготовлены реакцией с Ы-оксисукцинимидным эфиром л-азвдобензойной кислоты. В результате разделения реакционной смеси методом обращенно-фазной ВЭЖХ (Рис. 3) получена серия фотоактивируемых аналогов токсинов а-типа. Для

Рис. 3. Разделение п-азвдобензоильных производных нейротоксина Мю (А) и ОБ-З (В) на колонке МискоэИ 7С8 (4x250 мм) в градиенте концентрации ацето нитрила.

производных, образующихся с максимальными выходами (заштрихованные фракции на Рис. 3), установлено положение меток на Lys 59 в Мю и Lys 65 в OS-3.

Следует отметить, что в некоторых случаях потеря заряда при модификации аминогруппы может вызывать снижение биологической активности лигаада. Для того, чтобы сохранить заряд на модифицированной аминогруппе, мы воспользовались реакцией восстановительного

Рис. 4. Выделение фотоактивируемых производных токсина у. Условия хроматографии те же, что и на рис. 3. •

алкилирования л-азидобензальдегидом в присутствии боргцдрида натрия. В реакцию с азвдобензальдегидом вводили токсин у Пуш зетгиШиз и после восстановления боргидридом образующиеся продукты разделяли методом обращенно-фазной ВЭЖХ (Рис. 4). В результате хроматографии получено преимущественно одно производное с выходом около 17% (Фр. 2, Рис. 4).

Мономеченые производные токсинов ОБ-З и у иодировали лактопероксидазным методом и использовали для дальнейших исследований.

Эксперименты по связыванию иодированных фотопроизводных 08-3 и токсина у с синаптосомами мозга крысы в темноте свидетельствуют о специфическом и насыщаемом взаимодействии токсинов с каналом. При этом для модифицированного токсина у параметры связывания (К<1 ~ 5-Ю"10 М, Вщм ~ 2,3 пмоль/мг белка) практически не отличаются от таковых для исходного токсина.

В экспериментах по мечению синаптосомы инкубировали с производными (30 мин, 37° С), облучали (5 мин, Хта* 254 нм) и

денатурировали (3% додецилсульфат натрия, 5% р-меркаптоэтанол). Продукты сшивки анализировали методами электрофореза в полиакрил амидном геле или ВЭЖХ (Рис. 5). При этом обнаружено, что фотопроизводное токсина у метит а-суб-ьединицу ( ~ 250 кД) натриевого канала. В случае OS-3 наблюдалось мечение как высоко-, так и низкомолекулярного компонентов. Однако, лишь мечение последнего полностью подавлялось избытком нативного OS-3, что позволяет рассматривать мечение компонента 40 кД как специфическое. Отсюда можно сделать вывод о том, что С-концевой участок токсинов этого типа в комплексе с каналом контактирует с короткой субъединицей (Р1 или Р2),

Аяо 200 70 50 7кД распУмнвхЮ"3

Рис. 5. Анализ ковапентного комплекса, образованного Lys 65-азидобензоильным производным OS-3 и натриевым каналом мозга крысы, методом высокоэффективной гель-хроматографии на колонке TSK 4000SW (7,5x600 мм). Заштрихован пик, исчезающий при пришивке в присутствии избытка OS-3.

а принимая во внимание данные других авторов (Tejedor & Catterall, 1988) об участии а-субъединицы в связывании токсинов этого типа, можно заключить, что участок связывания a-токсинов скорпионов расположен на границе между сс-субъединицей и одной из р-субьединиц.

Следует отметить, что хотя содержание натриевого канала в ткани мозга примерно на порядок выше, чем тахикининовых рецепторов, и достигает нескольких пикомолей на миллиграмм белка, эта величина при современном состоянии методов анализа структуры белков все еще недостаточна для локализации места сшивки токсин-канал на определенных аминокислотных остатках рецептора.

Наиболее полно возможности метода фотоаффинной модификации реализованы в данной работе при исследовании никотинового ацетилхолинового рецептора из электрического органа Torpedo californica.

Синтез фотоактивируемых производных постсинаптических нейротоксинов змей и исследование их взаимодействия с никотиновым ацетилхолиновым рецептором.

Среди постсинаптических нейротоксинов выделены два структурных типа: короткие (60-62 аминокислотных остатка, 4 дисульфидные связи) и длинные (70-74 аминокислотных остатка, 5 дисульфидных связей). Два этих типа различаются также по устойчивости токсин-рецепторного комплекса, при этом длинные нейротоксины образуют более прочные комплексы. Исследованные в работе нейротоксины принадлежат как к короткому (ИТ II), так и длинному (ИТ I, БТХ) типам (Рис. 6).

10 20 30

ЬЕСНЫ(2<355(2РРТТКТС5 СЕТМСУККШ\У5 ОН1ЮТ ЫТ II

40 50 «0

1ШЯССССРКУКРСУКЬМСС1ШЖСШ N. п. охшпа

10 20 30

1ТСКТР1Р1Т5ЕТСАРСдЫЬСУТКТЛУС0А\УСС5110 ОТ I

40 50 60 70

КУШЬССААТСРТУЕ5УСШ1КСС8ТООС№НРКС!ККР N. п. охшпа

10 20 30

тсрттатБ КДСРКСН усутктлусоарсб кя БТХ

40 50 «О 70

УРЬССААТСРТУКТСУО^ССЗТОЫСЫРРРТЯКЯР N. п. яатеюи

Рис. 6. Аминокислотные нейротоксинов змей.

последовательности постсинаптических

В работах, выполненных ранее в ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, были получены азидобензоильные производные NT II Naja naja oxiana. При этом весьма сложным и трудновоспроизводимым оказалось разделение аналогов, содержащих метки на остатках Lys 44 и Lys 46, а также на N-концевой a-аминогруппе и Lys 25. Эта проблема была успешно решена использованием ионообменной ВЭЖХ (Рис. 7). Проверку

индивидуальности полученных производных проводили с использованием высокоэффективной обращенно-фазной хроматографии. Положения модифицированных остатков установлены с помощью ферментативного расщепления полученных производных и определения структуры пептидов, содержащих фотоактивируемую группировку. Таким образом, установлено, что в полученных 5 производных фотоактивируемые группировки связаны с остатками Lysl5, Lys25, Lys26, Lys44 и Lys46.

Для идентификации участков связывания нейротоксинов длинного типа реакцией с N-оксисукцинимидным эфиром n-азидобензойной кислоты синтезированы азцдобензоильные производные нейротоксина I (NT I) Naja naja oxiana и токсина 3 (STX) Naja naja siamensis. В результате разделения продуктов модификации STX методом высокоэффективной ионообменной

Рис. 7. Разделение смеси производных с азидобензоильными метками на Lys 44 (В) и Lys46 (А) методом ионообменной ВЭЖХ на колонке НЕМА BIO 1000СМ в градиенте молярности ацетата аммония (pH 6,5).

хроматографии получено с хорошим выходом одно производное (Фракция А, Рис. 8), индивидуальное по данным обращенно-фазной ВЭЖХ. Положение метки на остатке Lys 23 установлено в результате анализа пептидов, полученных после гидролиза восстановленного карбоксиметилированного фотопроизводного трипсином. Интересно

отметить изменение специфичности трипсина после введения метки на Lys 23 STX, при этом обнаружено расщепление связи Туг 21-Thr22. Подобное же расщепление ранее наблюдалось при трипсиновом гидролизе STX, ацетилированного по остатку Lys 23 (Balasubramanîam et al., 1983).

Разделение производных NT I проводили методом ионообменной хроматографии на СМ-целлюлозе. Для идентификации мономеченых производных использовали метод масс-спектрометрии.

Идентифицированные таким образом производные подвергали разделению методой обращеннофазной высокоэффективной хроматографии. В результате получено 4 индивидуальных мономодифицированных азвдобензоильиьк производных нейротоксина I. Интерсно отметить, что при проведении модификации в одинаковых условиях NT I и STX дают различные наборы производных. Так, STX дает преимущественно одно производное, a NT 1-4 производных с близкими выходами. Этот факт можно объяснить, по-видимому, различным микроокружением аминогрупп в исследованных токсинах.

Агго

1,0 "

0,5

15

30

45

60

75 мин.

Рис. 8. Разделение продуктов модификации токсина 3 Naja siamensis высокоэффективной ионообменной хроматографией на колонке НЕМА BIO 1000СМ. Условия те же, что и на Рис. 7 (время хроматографии увеличено в три раза).

Однако, как обсуждалось выше, арилазидным меткам присущ ряд недостатков. Возможной причиной такого поведения арилазидов может бьггь превращение вследствие расширения цикла арилнитрсна в дегндроазепин, вступающий затем в реакции с находящимися рядом нуклеофилами. Для предотвращения этого процесса было предложено использовать (Кеапа & Са1, 1990) перфгорарилазиды, практически не подвергающиеся расширению цикла.

В результате реакции ЫТ П с И-оксисукцинимидным эфиром тетрафгоразидобензойной кислоты в неденатурирую щих условиях и последующего разделения продуктов методом ионообменной ВЭЖХ получено производное, индивидуальное по данным обращенно-фазной

номер фракции

Рис. 9. Разделение НДФУ-производных нейротоксина П инообменной хроматографией на Bio Rex 70. Дополнительная очистка фракции С на колонке НЕМА BIO 1000СМ (А) и фракции Е на колонке Nucleosl Си (В).

ВЭЖХ и содержащее по данным масс-спектрометрии одну п-азидотетрафторбензоильную группу. Поскольку при синтезе азидобензоильных производных в аналогичных условиях получается в основном аналог, модифицированный по остатку Lys 26, вполне вероятно, что и тетрафторазидобензоил ьное производное содержит метку на Lys 26. Для синтеза других фотоактивируемых производных нейротоксина И, лишенных недостатков, присущих азидобензойной группе, были использованы N-оксисукцинимидные эфиры 4-бензоилбензойной (ББ) и {2-нитро-4-[3-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил]фенокси} уксусной (НДФУ) кислот. Полученные производные разделяли с помощью ионообменной хроматографии на катионообменнике Bio Rex 70 с последующей дополнительной очисткой методом высокоэффективной ионообменной или обращенно-фазной хроматографии (Рис. 9). Следует отметить, что при разделении бензоилбензойных производных как на Bio Rex 70, так и методами ВЭЖХ получены аналогичные хроматографические профили, хотя НДФУ-производные синтезировали в неденатурнрующих условиях. Аналогично, 5 мономоднфицированных производных NT II были получены ранее в результате его реакции с N-ацетоксисукциннмидом в неденатурнрующих условиях. Эти данные отражают различную реакционную способность N-оксисукцинимидных эфиров ароматических или алифатических карбоновых кислот по отношению к остаткам лизина NT И.

Структуру полученных нитродиазиринильных производных подтверждали

Таблица 1. Данные масс-спектрометрии для NT-II и нитродиазиринильных производных.

Молекулярная масса

Соединение Расчетная Измеренная

NT II 6876 6876

Lys 46-НДФУ^Т II 7163 7163.2Ю.4

[IJLys гб-НДФУ-NT II 7415 7415.Ш.4

[I2]Lys гб-НДФУ-NT II (после облучения) 7405.4±0.6

методом масс-спектрометрии (Табл. 1). Так, например, для производного СЗ установленная молекулярная масса составила 7163,2 Д. Так как для природного токсина по данным масс-спектрометрии эта величина равна 6876, этот результат подтверждает наличие одной фотоактивируемой фуппы в молекуле (расчетная молекулярная масса 288).

В НДФУ-производных ОТ II установлено положение метки в аминокислотной последовательности токсина. С этой целью производные, в которых фотоактивная группа была предварительно инактивирована облучением УФ-светом (Хц,« 350 нм), восстанавливали, карбоксиметшшровалн и подвергали триптическому гидролизу. Полученные пептиды разделяли методом обращенно-фазной ВЭЖХ и анализировали методом масс-спектрометрии (Табл. 2), что позволило локализовать метку во всех производных.

Для того, чтобы изучать взаимодействие фотоактивируемых производных с рецептором, в них вводили радиоактивный [1251]иод. Продукты иодирования разделяли методом обращенно-фазной ВЭЖХ и анализировали методом масс-спектрометрии (Табл. 1). Для мечения

Таблица 2. Масс-спектроыетрнческое определение положения метки в нитродиазириновых производных ОТ II.

Соединение Установленная Фрагмент Положение

(фракция) масса NT II метки

С2 1595.1±0.0 45-55 Lys 46

СЗ 2256.8±0,1 39-55 Lys 44

D 1291,1±0,2 26-32 Lys 26

Е2 3236,2±0,2 1-25 Lys 15

3364,2±0,4 1-26 Lys 15

F 1626,0±0,2 16-26 Lys 25

рецептора использовали индивидуальные радиоактивные производные. Анализ радиоиодированных продуктов методом автоматической деградации по Эдману позволил установить, что в NT II включение иода происходит в основном в остаток His 31 и в меньшей степени в His 4 и Туг 24. Эти

данные в дальнейшем позволили выбрать оптимальный вариант расщепления ковалентного комплекса лиганд-рецептор.

В процессе локализации сшивок присоединенный фрагмент токсина существенно осложняет идентификацию меченого пептида. Эта проблема может быть решена использованием расщепляемых поперечно-сшивающих реагентов. При применении таких меток после образования сшивки фрагмент токсина отщепляется с сохранением радиоактивной части реагента в месте его внедрен«« на поверхности рецептора. С этой целью NT II вводили в реакцию с N-оксисульфосукциннмидным эфиром 2-л-азидосалнциламидоэтил-1,3 '-дитиопропионовон кислоты, предварительно проиодированным Na[12îI], После обессоливания производные разделяли методом высокоэффективной ионообменной хроматографии. Подтверждение структуры синтезированных производных, а также локализацию меток проводили, как и в случае НДФУ-производных, методом масс-спектрометрин. В результате синтеза получили 5 мономодифицнрованных моноиодированных производных, содержащих остаток

[1231]иодазицосалицилам1щоэтил-1,3'-дитиопропионовон кислоты (АСТП) на остатках Lys 15, Lys 25, Lys 26, Lys 44 и Lys 46.

Таким образом были приготовлены серии производных NT II, содержащие фотоактивируемые группы различного типа в идентифицированных положениях аминокнслотной последовательности.

Идентификация субъединиц, участвующих в связывании лигандов. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор (АХР) электрического органа ската Torpedo californica, попользованный в данной работе, состоит из 5 субъединиц: а^Зуб, и имеет два участка связывания агонистов и конкурентных антагоннстов, к последним принадлежат также и исследуемые нами постсинаптические ненротоксины. Для идентификации субъединиц АХР, участвующих в связывании нейротоксинов, использованы радиоактивные [1251]иодированные фотопронзводные, синтез которых описан в предыдущем разделе. Анализ связывания иодированных фотопроизводных с АХР в темноте показал, что они способны взаимодействовать с обоими токсин-связывающими участками рецептора. Следует отметить, что исследование взаимодействия азидобензоильных производных NT II с солюбилизированными препаратами АХР было выполнено ранее в ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (Tsetlin et al., 1983). Нами для этих целей бьши использованы мембранные препараты, в которых АХР находится в природном мембранном окружении.

Результаты электрофоретического анализа фотоиндуцированных спшвок между АХР и азидобензоил-Lys 46-производиым NT II (Рис. 10) обнаружили наличие лишь одной меченой полосы с кажущейся молекулярной массой 47 кД, что соответствует суммарной массе а-субъединицы (40 кД) и NT II (7 кД) и свидетельствует о мечении а-субъдиницы. Аналогично, с использованием производного гомологичного токсина Naja naja nigrlcollis, содержащего азидобензоильную группу на остатке Lys 47, было показано (Chatrenet et al., 1990) мечение а-субъединицы.

«7

• 7

4}

30-

1 2 3 4 5

Рис. 10. Радиоавтография субъединиц АХР после фотомечения Lys 46-производным NT П и электрофореза в полиакриламидном геле: (1) пришивка к мембрано-связанному АХР; (2) пришивка в присутствии избытка природного токсина; (3) пришивка к АХР, солибилизировакному 1% Тритоном Х-100; (4) пришивка к солюбилизированному рецептору в присутствии немодифицированного токсина; (5) окрашивание субъединиц АХР Кумасси.

Радиоавтография продуктов мечения АХР азвдобензоил-Lys 26-производным NT П выявила наличие полос с молекулярной массой 61 и 70 кД (Рис. 11), что свидетельствует о мечении этим аналогом у и 5-субъединиц.

Определение выхода пришивок показало, что для мембранного АХР в а-субъединицу включается около 7% радиоактивности, нанесенной на гель, в 5-субьединицу - 4-5% и в у-субъ единицу - 3-4%.

Для того, чтобы проверить насколько адекватно эти данные отражают реальное участие субъединиц рецептора в связывании токсинов, мы использовали также и другие фотоактивируемые производные

нейротоксинов. При этом оказалось, что тетрафторазидобензоильное производное NT П, также как и азидобензоильное Lys 2б-производное селективно метит у и 6-субъединицы АХР с весьма близким уровнем включения радиоактивности. Исследование азидобензоильного производного STX, содержащего фото активируемую группу на Lys 23, находящемся в положении, гомологичном Lys 26 в NT П, также обнаружило мечение у и 5-субъединиц. Однако, в этом случае включение радиоактивности было суще-

ir— _

12 3 4 S

Рис. 11. Радиоавтография субъединиц рецептора после мечения Lys 26-производным NT II и электрофореза в полиакриламидном геле: (1 и 3) мечение в присутствии избытка природного токсина; (2) пришивка к мембрано-связанному АХР; (4) пришивка к солюбилизированному рецептору; (5) окрашивание субъединиц АХР Кумасси.

ственно выше и составило ~10% для у-субъединицы и ~14% для 5. Возможно, более высокое включение радиоактивности отражает большую устойчивость комплекса АХР с STX, принадлежащим к семейству длинных токсинов.

Следует отметить, что если для азидобензоильных производных условия облучения были разработаны ранее (Tsetlin et al., 1983), для других аналогов потребовался специальный подбор условии для достижения максимального включения метки в рецептор. Так, для расщепляемой метки на основе азидосалициловой кислоты возникла проблема высвобождения радиоактивного иода при облучении. Изучение условий облучения показало, что, в отличие от рекомендуемых во многих протоколах длительных периодов облучения, для оптимальной активации метки в случае NT П требуется короткое (30 секунд) интенсивное облучение. При этом происходит полное фотопревращение метки, но даже в этом случае высвобождается около 25% иода, увеличение же времени облучения

приводит к потере до 50% радиоактивности. Введение второго атома иода в ароматическое ядро с целью увеличения удельной радиоактивности приводит к практически полному выходу изотопа даже при коротких временах облучения.

Интересная зависимость времени фотоактивации метки от ее положения в молекуле токсина была обнаружена для НДФУ-производных. Так, для полного фотопревращения производного, содержащего метку на Lys 46, бы-

Рис. 12. Анализ фотопревращения НДФУ-производных NT II методом обращеннофазкой ВЭЖХ.

ло достаточно 20 мин (Рис. 12А), в то время как Lys 25-аналог не инактивировлся полностью даже после 60 мин облучения (Рис. 12В). Этот факт может бьпъ объяснен структурными особенностями NT II. Согласно данным ЯМР, вблизи остатка Lys 25 находится карбоксильная группа с аномально низким значении рК ~ 1,5, а также индольное кольцо Tip 27. Возможно, эти факторы стабилизируют диазосоединение, образующееся при альтернативном пути фоторазложения и являющееся более устойчивым к УФ-излучению.

Анализ мечения субъединиц АХР при использовании разработанных условий обнаружил, что полученная картина пришивки нитродиазиринильных и азидосалицильных производных отличается от таковой для азидобензоильных аналогов нейротоксина.

Так, для расщепляемых азидосалицильных производных наиболее интенсивное мечение наблюдается для Lys 15- и Lys 25-аналогов (Табл. 3),

»

M lu

в то время как влючение метки в рецептор для Lys 26- и Lys 46-производных на порядок меньше, чем в случае азидобензоильных производных.

Исследование мечения АХР НДФУ-производными NT II показало, что Lys 26 аналог дает наименьший выход пришивки (0,2%) и метит ниболее заметно 8-субъединицу (Рис. 13). В то же время для НДФУ-Lys 46-произ-

Таблица 3. Выходы сшивок расщепляемых азидосалицильных производных NT II с АХР.

Производное Выход радиоактивности, ковалентно связанной с

субъединнцами рецептора (%)

а Р У б

АСТП-Lys 15 3,7±0,4 3,9±0,5 1,6±0,5 1,1±0,2

АСТП-Lys 25 0,5±0,2 1,2±0,2 0,8±0,2 4,2±0,1

АСТП-Lys 26 0,310,1 0,4±0,1 0,6±0,1 0,6±0,2

АСТП-Lys 44 0,4±0,1 0,5±0,2 0,6±0,2 0,6±0,2

АСТП-Lys 46 0,2±0,1 0,5+0,2 0,9±0,2 0,9±0,2

водного наблюдалось мечение всех четырех субъединиц в отличие от азидобензоильного аналога, метившего предпочтительно а-субъединицу. Различия наблюдались также и между производными, содержащими метку на Lys 44, при этом только НДФУ-пронзводное в заметной степени метило Р и 6-субъединицы. Для НДФУ-Lys 25-производного, как и для АСТП-аналога, наблюдалось предпочтительное мечение 5-субъединицы.

Несмотря на кажущиеся противоречия с данными по азвдобензоильным меткам, все эти результаты могут быть интерпретированы в рамках одной модели: один из участков связывания нейротоксинов включает а и у субъединицы, a другой участок - а и 5-субъединнцы. В то же время эти участки в свете полученных данных должны иметь достаточно сложную конфигурацию, охватывая относительно плоскую молекулу токсина с противоположных сторон.

Наши данные об участии а-субъединицы в связывании нейротоксинов подтверждают результаты, полученные ранее при исследовании взаимодей-

Рис. 13. Радиоавтография субъединиц АХР после мечения НДФУ-прогаводными ИТ II и электрофореза в полиагриламидном геле.

ствия радиоиодированного а-бунгаротоксина с изолированными субъединицами рецептора (СегеЬош е1 а1., 1983; Тгайов & Ош^еих, 1983). Однако, при этом не только а, но также и другие субъединицы АХР принимают участие в формировании нейротоксин-связывающих участков.

Установление взаимоотношений между участками связывания различных лигандов. Для многих рецепторов в настоящее время известен целый ряд различных лигандов. Для никотинового ацетилхолинового рецептора известны, по крайней мере, 4 типа лигандов, среди которых можно отметить два типа агонистов, а также конкурентные и неконкурентные антагонисты. Выяснение структурной зависимости между участками связывания этих лигандов представляет достаточно сложную и интересную задачу, которая может быть решена с использованием фотоактивируемых производных.

Для указанной цели наиболее подходящими являются фотопроизводные, метящие несколько различных субъединиц рецептора. Так, азидобензоил-Ьуэ 26 производное ИТ П, как уже обсуждалось выше, метит у и 5-

субъединицы. Следует отметить, что два лиганд-связываюших участка в АХР не эквивалентны. Так, для d-тубокурарина величины Kd двух участков связывания различаются примерно на два порядка (Neubig and Cohen, 1979). При экспрессии различных наборов субъединиц бьио обнаружено (Blount & Merlie, 1989), что участок высокого сродства к d-тубокурарину образуется при одновременной экспрессии а и у-субъединиц, а низкоаффинный - а и 6. Аналогичные результаты получены при фотомечении АХР d-тубокурарином.

Пришивка Lys 2б-фотопроизводного к АХР в присутствии возрастающих концентраций d-тубокурарина обнаружила, что при низких концентрациях предотвращается мечение у-субъедииицы, лишь при более высоких - 5-

включенис радиоактивности (% от хоетрсля)

IgtCl

Рис. 14. Зависимость включения [mI]Lys 2б-азидобензоилпроизводного NT II в у-(+) и 5-субъединицы(в) АХР от концентрации d-тубокурарина.

субъединицы (Рис. 14). Величины ICjo для ингибирования мечения составили 63б±74 нМ для у-субъединицы и 4121138 мкМ для б-субъединицы. Аналогичные эксперименты были проделаны с производными содержащими азидосалицильную метку на остатках Lys 15 и Lys 25. Полученные результаты, вместе с приведенными выше данными других авторов о связывании d-тубокурарина, позволяют сделать вывод о том, что в формировании участка, обладающего высоким сродством к тубокурарину и, возможно, низким к нейротоксину, принимают участие а-, у- и, по-видимому, р-субъединицы. В то же время в состав участка, связывающего

■в 'ТА -Г -в.5 -в -J.S •« -4.5 -4 -ЗА -3 -2.5 -2

тубокурарин с низким, а нейротоксин с высоким сродством, входят а и 5-субъединицы.

Среди большого набора разнообразных лигавдов ацетилхолиновых рецепторов весьма перспективными в качестве инструментов исследования рецептора представляются полипептидные а-конотоксины. Для изучения участков связывания этих токсинов на ацетилхолиновом рецепторе Torpedo нами было использовано производное NT П, содержащее азидобензоильную группу на остатке Lys26. С этой целью пришивку радиоактивного Lys26-производного к рецептору проводили в присутствии возрастающих концентраций конотоксина G1 (Рис. 15). При этом обнаружено, что увеличение концентрации конотоксина в первую очередь предотвращает мечение у-субъединицы, и лишь затем 5-субединицы (ICjo 0,76 и 5,01 мкМ

включение ришоисттаности

Рис. 15. Зависимость ингибирования мечения у (Д) и 5 (О) субъединиц рецептора от концентрации конотоксина 01.

соответственно). Из этих данных следует, что в АХР имеются два различных участка связывания конотоксина. При этом токсин-связывающий участок, включающий а- и у-субъединицы, имеет, как и в случае (1-тубокурарина, более высокое сродство к конотоксину по сравнению с участком, включающим а- и 5-субъединицы.

Таким образом, использование фото активируемого производного ОТ П позволило не только выяснить взаимосвязь между участками связывания

различных лигандов, но и впервые обнаружить наличие двух участков связывания а-конотокснна.

Локализация аминокислотных остатков рецептора, связывающихся с токсином. Эта задача не только представляется наиболее интересной, так как она позволяет получить детальную информацию о структуре рецептора, но и является весьма сложной. Следует отметить, что для АХР с использованием направленного мутагенеза и аффинной модификации установлен ряд аминокислотных остатков, расположенньсх в участке связывания лиганда или вблизи него (см. обзоры Galzi & Changeux, 1994; Karlin & Akabas, 1995). Практически все идентифицированные остатки находятся на а-субъединице. С применением синтетических пептидов, соответствующих различным фрагментам последовательности этой субъединицы, показано, что участок a(lS0-200) является существенным для связывания агонистов и конкурентных антагонистов (Donelly-Roberts & Lentz, 1991; McCormic el al., 1993). Однако этот фрагмент не является единственным токсин-связывающим участком а-субъдиницы. Мы показали, что синтетический фрагмент а( 125-145) также связывает нейротоксины. Использование фотоактнвируемых производных нейротоксинов, обладающих сравнительно жесткой структурой, позволяет не только существенно дополнить эту информацию, но и определить внутримолекулярные расстояния в токсин-связывающем участке рецептора.

Для идентификации токсин-связывающего участка на 5-субъединице мы использовали Lys 26 азидобензоильное производное NT 11. После облучения комплекса АХР с иодированным азидобензонл-Lys 26 NT II продукты разделяли с помощью препаративного электрофореза. Объединенную радиоактивную фракцию, отвечающию крое-сшитой 5-субъединице и содержащую значительное количество немеченой субъединнцы, расщепляли с помощью LysC-эндопротеиназы и разделяли пщролизат методом обращенно-фазной ВЭЖХ (Рис. 16). Профиль радиоактивности имеет два основных широких пика (пик I, фракции 52-57, и пик II, фракции 60-63). Вещества, соответствующие пикам I и II, разделяли в трициновом геле и переносили на иммобилон. Радиоавтография блота пика II обнаружила лишь слабые полосы, поэтому этот образец в дальнейшем не анализировали. Радиоавтография пика I выявила три основные радиоактивные полосы, отвечающие веществам с молекулярными массами ~ 16, 10 и 8 кД. Деградация по Эдману дала для всех них последовательность фрагмента 5-

Иошр фракции

Рис. 16. Разделение продуктов катализируемого ЬузС-протеиназой гидролиза кросс-сшитого комплекса ОТ II с 5-субъединицей на колонке Уу<1ас С4 (4,6x250 мм) в градиенте ацетонитрила от 0 до 80% (80 мин), скорость элюции 0,5 мл/мин, объем фракции 0,5 мл.

субъединицы, начинающегося с РЬе 148. Таким образом в этих полосах радиоактивность связана с пептидами, имеющими идентичный Ы-концевой остаток (РЬе 148), но различающимися по молекулярной массе - по-видимому, из-за неполноты ферментативного расщепления. Следует отметить, что ферментативное расщепление мембранных белков является не простой задачей из-за присутствия детергентов (в частности, вББ) в солюбилизированных препаратах белков.

Изложенные результаты могли бы рассматриваться как свидетельство в пользу локализации сшивки АХР-нейротоксин на пептиде 5-субъединицы, начинающемся с РЬе 148. Однако нам не удалось обнаружить в комплексе последовательность, отвечающую фрагменту нейротоксина. При дальнейшем расщеплении радиоактивной фракции в геле с помощью А$рЫ-протеиназы и последующей обращенно-фазной хроматографии радиоактивный пик элюировался в условиях, близких условиям элюции единственного радиоактивного пептида 30-44, получающегося при последовательном расщеплении иодированного Ш1 II Ьу5С/А$р1^-протеиназами (Рис. 17). Этот результат указывает на присутствие соответствующего фрагмента нейротоксина в образце, в котором была обнаружена приведенная выше последовательность рецептора.

Так как в радиоактивных продуктах кросс-сшивок не были обнаружены последовательности нейротоксина, в модельных опытах на пикомольном

40 60

манер франции

Рис. 17. ВЭЖХ радиоактивных пептидов, полученных в результате последовательного расщепления с помощью ЬузС- и АврК-протеиназ восстановленного карбоксиметилированного азидобензоил-ЬуБ 26 ИТ Ц (а) и кросс-сшитого комплекса этого производного с 5-субъединицей АХР (б). Колонка №гс1ео$11 Си (4,6x250 мм). Скорость элюции 0,5 мл/мин, объем фракции 0,5 мл. 1 - профиль радиоактивности, 2 - профиль интегрирования апюируемой радиоактивности, 3 - градиент ацетонитрила.

уровне исследована деградация по Эдману нейротоксина П, его фрагментов, а также влияние на деградацию л-азидобензоильной группы и ее фотоактивации. В целом секвенирование нейротоксина и его фрагментов, содержащих фотомеченый и иодированный остатки, проходит с крайне низкими начальными выходами; дальнейшее падение выходов наблюдается при деградации облученньгх фотомеченьгх пептидов. Полученные результаты объясняют трудности в детектировании последовательностей нейротоксина в продуктах кросс-сшивок, доступных в количествах 10-20 пмоль. Для однозначной идентификации участков связьгвания нейротоксина на

субъдиницах АХР необходим поиск иных вариантов фотоаффинной модификации.

А:15 сн,сл. ч

мин

, выход радиоактивности, %

имп/иннх10"

Рис. 18. Разделение продуктов трипткческого гидролиза кросс-сшивки АСТП-Ьуз 25 КГ П с 5-субъединицей АХР методом обращенно-фазной ВЭЖХ на колонке Ууйас С18 (4,6x250 мм). Скорость элюирования 0,6 мл/мин. А - профиль поглощения при 215 ни, В - профиль радиоактивности.

Одним из подходов может бьпъ использование расщепляемых фотометок, обсуждавшееся выше. Для реализации этого подхода использовали АСШ-Ьуз 25 производное ЫТ II, селективно метящее 5-субъединицу АХР. Очистку токсин-рецепторного комплекса начинали с препаративного электрофореза в невосстанавливающих условиях, при этом

кросс-сшнтын продукт находился в основном в форме димеров вследствие наличия дисульфидной связи между 5-субъединицами соседних молекул рецептора. Это позволило отделить основную массу немеченых субъединиц рецептора. Димерный продукт подвергали повторно электрофорезу, но уже в восстанавливающих условиях. Полосу, содержащую меченую субъединицу (а также избыток немеченой), вырезали и подвергали триптическому гидролизу непосредственно в геле. После экстракции и разделения продуктов гидролиза методом обращенно-фазной ВЭЖХ были получены два основных пика радиоактивности (Рис. 18). Эти фракции подвергали дальнейшему анализу методом MALDÍ-масс-спектрометрии.

Масс-спетроскопическин анализ радиоактивных фракций показал, что они не являются гомогенными. При этом во фракциях 127, 128 и 142 один из наиболее интесивных пиков с массой 2278,2, не подходящий ни одному из триптических пептидов АХР, прослеживается параллельно профилю радиоактивности, что свидетельствует о принадлежности его молекуле, содержащей радиоактивную метку. Вычитание массы восстановленной метки из зарегистрированной массы дает 1942,2 для гипотетического пептида. Так как эта величина не соответствует ни одному из триптических пептидов 5-субъединицы, был проведен компьютерный поиск всех возможных аминокислотных фрагментов, соответствующих этой массе. Следует отметить, что в литературе описаны случаи неспецифического расщепления белков трипсином (Keil, 1977; Schrattenholz et al., 1993). Из 11 возможных вариантов наиболее полно всем критериям поиска удовлетворял фрагмент 6(260-277). Последующий аналнз (Табл. 4) продуктов распада (post-source decay) пика с массой 2278.2 подтвердил это предположение и позволил установить положение метки на остатке Ala 268. Этот остаток расположен в верхней части предполагаемого канал-образующего трансмембранного фрагмента М2.

Максимальный размер фотометкн, присоединенной к Lys 25, может составлять 16,5 А. Если добавить длину боковой цепи остатка лизина (~7 А), то можно прийти к выводу о том, что С3 атом, расположенный вблизи центра трехмерной структуры NT II, должен находиться на расстоянии не более -23 А от 5А1а 268.

Данные электронной микроскопии (Unwin, 1993; 1995) описывают молекулу АХР следующим образом: 60 А из общей длины 120 А выдается в синаптическую щель. Входная часть канала имеет диаметр 20-25 А. В

Таблица 4. Анализ продуктов распада иона 2278.

Масса Идентифицированный фрагмент

Определенная Вычисленная аминокислотной последовательности

595,9 596,4

623,1 623,4

744,1 743,5

1076,0 1076,8

1147,1 1147,8

1203,8 1202,7

1301,3 1301,5

1346,0 1347,0

1399,5 1398,9

1457,9 1456,9

1482,9 1482,6

1561,9 1561,7

1570,8 1570,0

1673,8 1675,0

AISYLLAQAVFLLLTSQR AISVLLAQAVFLLLTSQR AISVLLAQAVFLLLTSQR AISYLLAQA VFLLLTS QR

AISVLLAQAVFLLLTSQR* AISYLLAQAYFLLLTSQR*

aisvllaqayfllí.tsqr

AISVLLAQAVFLLI.TSQR

AISVI.LAQAVnXI.TSOR*

AISVÍ.LAOAVFLLI.TSOR AIS VT Л. APA VFI J Л .TSOR*

* фрагмент, содержащий метку на остатке Ala в положении 9.

трансмембранной области АХР образует воронку, сужающуюся до 11,5 Á в участке связывания хлоропромазина и трифенилметилфосфония и до 6,5 А в месте ионных ворот, которые не могут бьггь обнаружены электронной микроскопией при современном разрешении (9 А).

В свете этих данных нахождение центра молекулы нейротоксина на расстоянии ~ 23 А от 5А1а 268 означает расположение этого центра на глубине не менее -40 А от входа в канал (или не более ~20 А от мембранного бислоя).

Этот результат имеет принципиальное значение для характеристики структурно-функциональной организации АХР. Следует отметить, что крноэлектронно-микроскопическое исследование АХР (Un win, 1993) выявило в а-субъединицах структурные участки ("карманы") на расстоянии ~ 30 А от поверхности бислоя. При этом было высказано предположение, что эти участки являются лиганд-связывающими центрами. Единственным основанием для такого предположения служили данные флуоресценции

«ь

ан

У

Рис. 19. Структурная организация лиганд-связывающих центров АХР. сц. и ац - субъединицн, входящие в низко- и высокоаффинные участки связывания ё-тубокурарина соответственно. Ш" - схематическое представление молекул нейротоксина.

(•Ышбоп е1 а!., 1993), согласно которым на таком расстоянии от бислоя связываются низкомолекулярные агонисты. Полученный нами результат

является независимым подтверждением заглубленности по-крайней мере одного из двух лиганд-связывающих центров в АХР Torpedo.

На рис. 19 суммированы полученные нами выводы о структурной организации лиганд-связывающих центров АХР. Общая форма молекулы (разрез и вид сверху) представлена на основании данных электронной микроскопии. На виде сверху указано расположение двух молекул нейротоксинов на границе раздела а/у и а/5 субъединиц. Основанием для такого расположения является анализ фотосшивок, образуемых различными фотопроизводными нейротоксинов с идентифицированньгми субъединицами АХР. Как показано в настоящем исследовании, высокоаффинный участок связывания d-тубокурарнна на поверхности раздела ан/у субъединиц является также и высокоаффинным по отношению к а-конотоксину, тогда как ctiJ5-участок имеет меньшее сродство как к d-тубокурарину, так и к а-конотоксину.

Следует также отметить, что порядок расположения субъединиц в АХР (у или р между двумя а-субъединицами) дискутировался до недавнего времени. В настоящее время большинство исследователей склонятся в пользу aya , однако различить ayaSp и aya[35 варианты не представлялось возможным.

Анализ идентифицированной нами сети фотоиндуцированных сшивок позволил сделать выбор в пользу расположения субъединиц ануа[.5р. На виде сбоку проиллюстрировано заглубленное расположение токсинов (наши данные подтверждают такое расположение для токсина, занимающего область контакта между ai, и 5 субъединицами). Расположение лиганд-связывающих участков, во-первых, в областях контакта a-субъединиц с их соседями, и, во-вторых, в достаточной близости к канал-образующей части рецептора, по-видимому, является ключевым элементом, облегчающим протекание аллостерических превращений, в результате которых связывание лигандов приводит к открыванию канала и физиологическому ответу.

Выводы

1. Предложен подход к установлению структуры лиганд-связывающих центров нейрорецепторов, основанный на образовании высокоспецифичных ковалентных связей лиганд-рецептор с последующей их локализацией. При этом устанавливаются аминокислотные остатки рецептора, находящиеся в контакте с лигандом. Для достижения этой цели применяли набор фотоактивируемых производных белково-пептидных лигандов, содержащих метки в различных идентифицированных положениях молекулы. Предложенный подход использован для изучения различных типов рецепторов: олигомерных лиганд-управляемых ионных каналов (на примере никотинового ацетилхолинового рецептора), С-белок-завнсимых рецепторов (на примере тахикининовых рецепторов), а также рецепторов, состоящих из субъединиц различного размера (на примере потенциал-зависимого натриевого канала). Картирование лиганд-связывающих центров рецепторов методом фотоаффинной модификации выполнено с применением серий производных, несущих фотоактивируемые группировки различной химической природы в одних и тех же положениях молекулы, а также с использованием наиболее чувствительных методов установления структуры продуктов фотоиндуцированных сшивок.

2. Синтезированы серии фотоактивируемых производных постсннаптичес-ких нейротоксинов змей короткого и длинного типа, токсинов скорпионов а- и Р-типа, а также нейропептида вещества Р, содержащих нитрен- и карбен-генернрующие фотоактивируемые группы. Разработан общин метод разделения производных с использованием различных видов жидкостной хроматографии, а также метод локализации меток с использованием масс-спектрометрии.

3. С использованием фотоактивируемых производных ЭР проведено мечение тахикининовых рецепторов мозга крысы и установлено наличие контакта Ы-концевого фрагмента пептида с рецептором.

4. С помощью фотопроизводных токсинов скорпионов Т1гуи5 вегги1ашх (токсин у) и ОпНгосЫгш ¡сгоЫси^и (токсин 05-3) осуществлено мечение а- и р-субъеднннц натриевого канала из мозга крыс и показано расположение участка свзывания ОБ-З в месте контакта субъеднниц.

5. С использованием трех серий мономодифицированных производных нейротоксина II Naja naja oxiana, содержащих на различных остатках лизина л-азидобензоильную, нитродиазиринильную или расщепляемую азидосалициламидоэтилдитиопропильную группировки показано, что в связывании нейротоксинов в ацетилхолиновом рецепторе Torpedo принимают участие не только а-, но и остальные (ß, у, 5) субъединицы, при этом характер мечения зависит от природы фотоактивируемой группы и её расположения в молекуле токсина.

6. На основании избирательного фотомечения а-субъединицы рецептора Torpedo азидобензоил-Ьу84б-производным нейротоксина II и анализа мечения 5- и у-субъединиц азндобензоил-Ьу$2б-производным нейротоксина II в присутствии d-тубокурарина показано, что один участок связывания нейротоксинов включает область контакта а/у субъединиц (участок высокого сродства к d-тубокурарину), а другой - а/5 субъединиц (низкоаффинный участок для d-тубокурарина).

7. С применением аз1щобензоил-Ьуз2б-производного NT II обнаружено наличие в АХР двух центров связывания а-конотоксина Gl, при этом участок, обладающий высоким сродством к конотоксину, включает у-субъединицу, а низкоаффинный - 8-субъединицу.

8. Разработаны условия препаративного вьщеления ковалентного комплекса неГсротоксин-субъеднннца рецептора с использованием электрофореза и обращенно-фазнон хроматографии, а также условия ферментативного гидролиза выделенного комплекса и разделения полученных пептидов. Для Lys25-ACTII-np0H3B0flH0r0 NT II, метящего 5-субъединицу, с использованием метода MALDI-масс-спектрометрии установлена структура кросс-сЩитого пептида рецептора и показано включение метки в остаток Ala 268 6-субъединицы.

9. С помощью фотоактивируемых производных нейротоксинов змей получена новая информация о расположении функциональных доменов в никотиновом ацетилхолиновом рецепторе Torpedo: лигандсвязывающие участки находятся в областях контакта субъединиц, при этом один из двух участков связывания нейротоксинов расположен на расстоянии не менее 40 А от экстрацеллюлярной поверхности рецептора.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Utkin Yu.N., Lasakovich Е.М., Kaydalov A.A., Grishin E.V. and Tseüin V.l. Selectively modified scorpion neurotoxins as probes of sodium channel. - In: Synaptic Transmitters and Receptors, 1987, ed. S.Tucek, ACADEMIA, Praha, p. 422-427.

2. Лазакович E.M., Мутуле И.Э., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И. Взаимодействие циклических аналогов вещества Р с мембранами мозга крысы. Биоорган, химия. 1988, V. 14, с. 313-317.

3. Лазакович Е.М., Уткин Ю.Н., Мутулис Ф.К., Цетлин В.И., Иванов В.Т. Идентификация тахикининсвязывающего полипептида в мембранах мозга крысы. Биологические мембраны 1988, V. 5, с. 233-239.

4. Уткин Ю.Н., Лазакович Е.М., Кашеверов И.Е., Архипова С.Ф., Цетлин В.И. Тахикининовые рецепторы мозга крысы связывают а-бунгаротоксин. Биоорг. химия 1989, V. 15, с. 1030-1036.

5. Utkin Yu.N., Lazakovich Е.М., Kasheverov I.E., Tsetlin V.l. a-Bungarotoxin interacts with the rat brain tachykinin receptors. FEDS Lett. 1989, V. 255, p. 111-115.

6. Tsetlin V.l., Utkin Yu.N., Lazakovich E.M., Kaydalov A.A. Tachykinin and glycopeptide binding sites in rat brain. - In: Second Forum on Peptides, 1989, eds. A.Aubry, M.Marraud, B.Vitoux, Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd., p. 171-174.

7. Utkin Yu.N., Lazakovich E.M., Kaydalov A.A., Andronova T.M., Tsetlin V.l., Ivanov V.T. Synthesis of radioactive and photoactivable derivatives of substance P and GMDP and their binding to rat brain membranes. - In: Chemistry of Peptides and Proteins, Vol. 4, 1989, eds. W.A.Koenig, W. Voelter, Attempto Verlag, Tubingen, p. 205-211.

8. Tsetlin V.I., Utkin Yu.N., Lazakovich E.M. Sensitivity of rat brain tachykinin receptors to nicotinic acetylcholine receptor ligands. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1990, V. 594, p. 423-424.

9. Уткин 10.H., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. Влияние токсических компонентов адов змей на связывание вещества Р с мембранами мозга крысы. Биоорг. химия 1992, V. 18, с. 635-639.

10. Головнина Т.А., Кашеверов И.Е., Плаксин Д.Ю., Якунина Н.Б., Коваленко В.А., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И. Новый нммунохимический метод обнаружения рецепторов вещества Р на основе биотин-стрептавидиновой системы. Биоорг. химия 1992, V. 18, с. 932-941.

11. Utkin Yu.N., Kasheverov I.E., Tsetlin V.I. Effects of purified snake venom toxic components on substance P binding to rat brain membranes. J. Nat. Toxins 1992, V. 1, p. 77-83.

12. Kreienkamp H.-J., Utkin Yu.N., Weise Ch„ Machold J., Tsetlin V.I., Hucho F. Investigation of ligand-binding sites of the acetylcholine receptor using photoactivable derivatives of neurotoxin II from Naja naja oxiana. Biochemistry 1992, V. 31, p. 8239-8244.

13. Hucho F., Weise C., Kreienkamp H.-J., Tsetlin V., Utkin Y„ Machold J. Mapping the functional topography of a receptor. Биоорг. химия 1992, V. 18, с. 1319-1329.

14. Golovanov A.P., Lomize A.L., Arseniev A.S., Utkin Yu.N., Tsetlin V.I. Two-dimentional 'H-NMR study of the spatial structure of neurotoxin II from Naja naja oxiana. Eur. J. Biochem. 1993, V. 213, p. I2I3-I223.

15. Machold J., Mund M., Tritscher E„ Utkin Yu., Weise Ch„ Tsetlin V.I., Hucho F. Mapping the toxin binding site of the nicotinic acetylcholine receptor. Biol Chem. Hoppe-seyler 1993, V. 374, p. 926-927.

16. Костецкий П.В., Архипова С.Ф., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И. Консервативные и вариабельные участки аминокислотных последовательностей в а-субъединицах никотиновых ацетнлхолиновых

рецепторов н а-бунгаротоксин-связывающнх белков. Биохимия 1994, V. 59, с. 206-214.

17. Телякова О. В., Уткин Ю.Н., Цетлнн В.И., Северцова И.В., Звонок Н.М. Экспрессия фрагмента гена а-субъединпцы ацетилхолинового рецептора из Torpedo californica в Saccharomyces cerevisiae. Биоорг. химия 1994, V. 20, с. 546-550.

18. Кашеверов И.Е., Головннна Т.А., Яров А.В., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И. Исследование взаимодействия рецептора вещества Р из мозга крысы с антителами к его синтетическим фрагментам и к веществу Р. Биоорг. химия 1994, V. 20, с. 720-730.

19. Уткин Ю.Н., Вайзе К., Трнтчер Е., Махольд Я., Франке П., Цетлин В.И., Хухо Ф. Структура пептидных фрагментов кросс-сшитого комплекса [Lys(Abz)26jHefip0T0KCHHa II Naja naja oxiana с никотиновым ацетилхолиновым рецептором из Torpedo californica. Биоорг. химия 1994, V. 20, с. 1047-1059.

20. Кашеверов И.Е., Зайцев Д.А., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И. Получение и характеристика третированного производного СР-96.345 - непептидного антагониста рецептора вещества Р - с высокой удельной радиоактивностью. Биоорг. химия 1994, V. 20, с. 1162-1167.

21. Utkin Yu.N., Kobayashi Y., Hucho F., Tsetlin V.I. Relationship between the binding sites for an a-conotoxin and snake venom neurotoxins in the nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica. Toxicon 1994, V.32, p. 11531157.

22. Клукас О., Пешенко И.А., Родионов ИЛ., Телякова О.В., Уткин Ю.Н., Цетлин В.И. Фрагменты 183-198 и 125-145 а-субъеднницы никотинового ацетилхолинового рецептора Torpedo californica связывают а-бунгаротоксин и нейротоксин II Naja naja oxiana. Биоорг. химия 1995. V. 21, с. 152-155.

23. Machold J., Weise Ch., Utkin Yu.N., Franke P., Tsetlin V.I., Hucho F. A new class of photoactivable and cleavable derivatives of neurotoxin II from Naja naja oxiana. Eur. J. Biochem. 1995, V. 228, p. 947-954.

24. Utkin Yu. N., Hatanaka Y., Franke P., Machold J., Hucho F., Tsetlin V.I. Synthesis of nitrodiazirinyl derivatives of neurotoxin II from Naja naja oxiana and their interaction with the Torpedo califomica nicotinic acetylcholine receptor. J. Prot. Chem. 1995, V. 14, p. 197-203.

25. Machold J., Utkin Yu., Kirsch D., Kaufmann R., Tsetlin V., Hucho F. Photolabeling reveals the proximity of the a-neurotoxin binding site to the M2 helix of the ion channel in the nicotinic acetylcholine receptor. Proc. NatL Acad. ScL USA 1995, V. 92, p. 7282-7286.

26. Kaufmann R., Kirsch D., Tourmann J.L., Machold J., Hucho F., Utkin Yu., Tsetlin V. Matrix-assisted laser desorbtion ionization (MALDI) and post-source decay (PSD) product ion mass analysis localize a photolabel crosslinked to the delta-subunit of nAChR protein by neurotoxin II. Eur. Mass Spectrom. 1995, V. 1, p. 313-325.

27. Machold J., Weise Ch., Utkin Yu., Tsetlin V., Hucho F. The handedness of the subunit arrangement of the nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo califomica. Eur. J. Biochem. 1995, V. 234, p. 427-430.

28. Уткин Ю.Н., Мувд M., Хухо Ф., Цетлин В.И. Эффективное связывание а-бунгаротоксина солюбилизированной а-субъединицей ацетилхолинового рецептора Torpedo califomica. Биоорг. химия 1996, V. 22, с 394-396.

Отпечатано на полиграфическом участке Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина и ЮАОвчинникова РАН. Печать офсетная. Усл.п.л. 0,75. Тираж 100 экз. Заказ №110