Фотоаффинная модификация мРНК-связывающего центра рибосом E. coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи УДК 576.85.96

ЛАВРИК Инна Николаевна

ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ мРНК — СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЦЕНТРА РИБОСОМ Е.соП

02.00.10 — биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1994

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Научные руководители: академик РАН, профессор A.A. Богданов,

кандидат химических наук O.A. Донцова Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Б.П.Готтих,

кандидат химических наук И. В. Бонп.

Ведущая организация: ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится "J " ноября в ££ часов на заседании специализированного Ученого совета Д. 053.05.47 при Московском государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП-3, Москва, Ленинские горы, Институт Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан "23" г.

Ученый секретарь специализированного совета,

/ У

кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

Актуальность проблемы. Во всех живых клетках биосинтез белка осуществляется на рибосомах. Понимание тонких биохимических механизмов, обеспечивающих точность и надежность процесса трансляции требует детального изучения структурной организации ее функциональных центров. В связи с этим, актуальной задачей является исследование функциональной топографии рибосом.

Цель работы состояла в изучении структуры мРНК-связываюшего центра рибосом Е.соН методом фотоаффинной модификации с использованием в качестве аналогов мРНК синтетических матриц, содержащих природные сигналы инициации трансляции, а в качестве фотоаффинной метки-фотоактивируемых производных нуклеотидов: 4-тиоурнднна, 5-йодуриднна, 6-тиогуанозина. Для проведения исследований был выбран метод фотоаффиннон модификации как один из немногих, позволяющих получать информацию о тонкой структуре рибонуклеопротеидного комплекса.

Научная новизна » практическая значимость. В настоящей работе впервые было проведено систематическое изучение расположения 5'-кониевого некодирующего участка мРНК на рибосоме, взаимодействие которого с различными компонентами рибосомного комплекса ифает важную роль на всех этапах белкового синтеза. В результате фотоаффинной модификации рибосомных комплексов аналогами мРНК, содержащими 4-тиоурпдин как фотоаффинную метку, были определены основные контакты 5'-концевого участка мРНК как с 16Б рРНК, так и с белками малой рмбосомной субчастицы, которые вместе с полученными раннее данными послужили основой для построения модели мРНК-связывающего центра рибосомы.

Была показана возможность использования для изучения топографии мРНК на рибосоме таких фотоаффинных реагентов как 5-йодуридин и 6-тиогуанозин. Результаты исследования позволили обнаружить новые особенности в организации мРНК-связывающего центра и рассмотреть возможность широкого применения данных реагентов для изучения топографии яругах компонентов аппарата трансляции.

Апробаиия работы. Материалы диссертации докладывались на Международной конференции "Современная энзимология: проблемы и направления", Москва 1992 г., Международной конференции

"Трансляционный аппарат", Берлин, Германия, 1992 г., 10-ом Советско-немецком симпозиуме, Суздаль 1993 г., Международной конференции "Взаимодействие лигандрв с рибосомой", Москва-Крым, 1994 г., Международной конференции "Трансляционный контроль ", Колд Спрнмг

Харбор, США, 1994 г., 16-ом международном Конгрессе по биохимии и молекулярной биологии, Дели, Индия, 1994г.

Структура и овъем_ря&ГЩ. Диссертационная работа наложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы н методы, выводы. Материал иллюстрирован рисунками и таблицами. Библиографический указатель включает цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Для изучения мРНК-связываюшего центра рибосомы использовался новый вариант метода фотоаффинной модификации.

В качестве фотоаффиннон метки был применен фотореагент, дающий сшивки нулевой длины, 4-тиоур1Шин (s4U). Фотоактивация 4-тиоуридина происходит при длине волны больше 300' нм, в условиях сохранения биологической активности рибосомных комплексов. • Будучи близким структурным аналогом уридина, s4U не вызывает существенных конформационных изменений в структуре рибосомного комплекса. Данный фотоаффинный реагент обладает сравнительно широкой группоспецифичностью: для него характерно образование сшивок "нулевой" длины как с функциональными группами белков, так и с гетероциклическими основаниями нуклеиновых кислот. И наконец, 4-тиоуридин-5'-трифосфат оказался субстратом для РНК-полнмераз бактериофага Т7, что позволило вводить s4U в состав мРНК-анапогов в системе Т7-транскрнпции.

Другой важной особенностью нового варианта фотоаффшшой модификации стало использование коротких мРНК-аналогов, содержащих основные природные сигналы инициации трансляции: последовательность Шаин-Дальгарно и ннициаторный AUG- кодон. Наличие сигналов инициации трансляции в таких матрицах обеспечивало эффективное формирование рибосомного комплекса и исключало неспеаифическое связывание мРНК.

Применение данного подхода в серии предыдущих работ дало возможность получить ряд важных данных по структуре мРНК-связывающего центра, однако, сравнительно небольшое внимание было уделено изучению расположения на рибосоме 5'-концевой некодирующей части мРНК, несмотря на то, что ориентация данного участка мРНК на рибосоме, как на стадии инициации, так и на последующих этапах трансляции вызывает повышенный интерес. В связи с этим, первой задачей работы было систематическое

изучение топографии 5'-некодирующего участка мРНК на рибосоме с использованием 4-тиоуридина в качестве фотоаффинного реагента.

Для получения дополнительном информации о контактах мРНК с рибосомой а процессе биосинтеза белка с целью более детального изучения мРНК-связываюшего центра во второй части работы была проведена фотоаффинная, модификация рибосом аналогами мРНК, содержащими другие аналоги нуклеотндов такие как б-тиогуанознн и 5-нодуриднн.

Полученные данные дают возможность представить модель структурной организации мРНК-связываюшего центра рибосомы.

ИЗУЧЕНИЕ РАСПОЛОЖЕНИЯ НА РИБОСОМЕ 5'-КОНЦЕНОГО ПЕКОДИРУЮЩЕГО УЧАСТКА мРНК.

Структура и получение фотоаффинных аналогов мРНК.

Задача выбора структуры модельных матриц для изучения топографии 5'-некодируюшей части мРНК на рибосоме осложнена тем фактом, что расстояние между инициаторным А1ГС-кодоном и последовательностью Шанн-Дальгарно отличается для разных мРНК. По этой причине в работе были изучены мРНК с различными размерами спейсорного участка.

Во-первых, была проведена фотоаффинная модификация рибосом короткими аналогами мРНК Сго-белка бактериофага к длиной 35 нуклеотидных остатков (рис.1 А). Первичная структура их 5'-концевой части, является полностью идентичной природной и содержит последовательность БО, отделенную от иннциаторного АиС-кодона и-богатым спейсором длиной в 4 нуклеотидных остатка. Название данные мРНК получили по положению остатка уридина после иннциаторного кодона, если А в АиО-кодоне считать за +1. Наличие трех остатков уридина в спейсорном участке позволило, при замещении их на 4-тиоуридин, проанализировать топографию фактически всего данного участка мРНК.

Во-вторых, для проведения фотоаффинной модификации были использованы модельные мРНК. Данные аналоги имеют длину около 45 нуклеотидных остатков и содержат основные инициаторные сигналы: последовательность Шайн-Дальгарно и инициаторный Аив-кодои (рис.!Б,В). В работе было использовано два типа подобных мРНК-аналогов со спейсорными участками длиной в 4 и 8 нуклеотидов. Изучение мРНК-аналогоз с расстоянием между последовательностью Шайн-Дальгарно ¡5 инициаторным кодовом в 8 нуклеотидных остатков было обусловлено тем, что именно такое

г

расстояние является наиболее эффективным в системе трансляции in vitro. Название данных матриц отражает расстояние между последовательностью SD и инициаторным кодовом и положением в данном участке остатка уридпна. Так, название мРНК "8N,-2" обозначает мРНК с S-нуклеотидным спейсором и уридином в положении -2.

A. GGGAAQQAfiQUUGUALIQGAAUACGAUAAAGGACAG (+7.+12) Б. GGGAGAAGGAGGAAAL'AliGGACACGAUAAAGAAAAAA (4N.-1)

Рис.1. Основные типы перннчнмх структур мРНК-аналотв, исполыоиаппых в раГклс. (A). Аналоги cro-мРНК. (Б). Модельные мРНК (4N,-N). (В).Молельные мРНК (8N.-N).

Для получения мРНК-аналогов использовалась система Т7-транскрипции in vitro. В качестве матрицы были использованы синтетические олигодсзокс при бону клеотпды. Система Т7-транскрипции помимо обычных компонентов содержала также 4-тпоуриднн-5'-трифосфат как источник фотоаффинной метки; как источник радиоактивной метки был использован а-[12Р]-уршиН1-5'-трпфосфат. Соотношения между трифосфатамн было подобрано таким образом, чтобы в одну молекулу мРНК, в среднем, включался один остаток 4-тиоуридина.

Полученные фотоаффшшые аналоги мРНК очишали электрофорезом в 89с полиакриламидном геле и использовали для фотоаффннной модификации рибосом.

Образование рибосолшых комплексов и проведение фотоаффинной модификации.

Фотоаффинная модификация рибосом аналогами мРНК проводилась в составе следующих рибосомных комплексов. 1.70S*mPHK бинарный комплекс

2. 70S*mPHK*tPHK гМс| тройной иницнаторный комплекс • •

3. 70S*MPHK+TPHKf Мс'*аа-тРНК комплекс с двумя тРНК

4. 70S*MPHK*fMet-TPHKf Mc,*aa-TPHK*EF-G-GTP

посггранслокашюнный комплекс Образование комплексов проводили в условиях обеспечивающих эффективное связывание лигандов с рибосомами в системе in vitro. Чтобы

избежать неспецпфпческого связывания мРНК при образовании ининиаторны.ч комплексов использовался двухкратный избыток рибосом над матрицей.

Отделение рнбосомных комплексов от несвязанных мРНК и тРНК осуществляли центрифугированием в градиенте плотности сахарозы в буфере, содержащем 10 мМ Выход связывания мРНК с рибосомой в такой

системе можно легко оценить по распределению радиоактивности, поскольку меченой является лишь молекула мРНК (рнс.2А). Обычно связывание составляло 80-90%.

Рис.2. Распределение радиоактивности по фракциях сахарозного радиента после ультраиешрифугировамия рнбосомных комплексов. (А). Отделение 70S комплексов от мссгопавшсйся мРНК. (Б). Разделение модифицированных 70S комплексов на 30S и 50S субчастицы. (В). Разделение 30S с)<5частиц на I6S рРНК и белки.

Облучение проводилось с помощью ртутной лампы низкого давления с фильтром, не пропускающим УФ-свет с длиной волны ниже 300 им.

После облучения для разделения модифицированных 70S рнбосомных комплексов на 30S и 50S рибосомные субчастицы было использовано центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы с низкой концентрацией ионов Mg2+ (0.5мМ), при этом происходило отделение несшитых молекул мРНК. Следует отметить, что мРНК во всех случаях оставалась связанной только с 30S рнбосомной субчастицей (рис.2).

С целью разделения модифицированных 16S рРНК и белков малые рибосомные субчастицы с пришитой мРНК подвергали центрифугированию в градиенте концентрации сахарозы в буфере, содержащем додецилсульфат натрия (ДСН) и ЭДТА, в условиях полного разрушения нековалентных РНК-белковых комплексов (рис.2В). Относительное распределение радиоактивной

метки между фракциями позволяло оценить выход пришивки к рРНК и белкам. Выход пришивки к рРНК составляй от 10 до 40% в зависимости от типа рибосомного комплекса и структуры мРНК.

Методология анализа коеалентных сшивок.

На первом этапе определяли участок в 16Б рРНК, в котором происходит модификация, с точностью до района в несколько десятков нуклеотндов. Для этой цели был применен метод направленного гидролиза РНКазой Н. Фермент РНКаза Н осуществляет гидролиз РНК цепи в РНК-ДНК дуплексе. При расщеплении молекулы 165 рРНК в присутствии двух олигодезоксирпбонуклеотидов, комплементарных определенным участкам 165 рРНК, образуются три фрагмента рРНК, при этом радиоактивно меченым будет являться фрагмент, содержащий ковалентно сшитую мРНК. Определение модифицированного фрагмента 16Б рРНК осуществляется при разделении продуктов расщепления РНКазой Н с помощью электрофореза в 4% полиакриламидном геле. Использование пар олигодезоксирпбонуклеотидов, расположенных на расстоянии 150-200 нуклеотндов друг от друга по всей длине 16Б рРНК, позволяет последовательно выявить все участки ковалентных сшивок в молекуле 165 рРНК с точностью, задаваемой расстоянием между двумя олнгодезоксирибонуклеотндами. Для более точного определения участка пришивки, применялся набор олигонуклеотидов, участок связывания которых расположен на расстоянии 20-30 нуклеотндов друг от друга на молекуле 165 рРНК.

На втором этапе для локализации ковалентной сшивки с точностью до нуклеотидного остатка в 165 рРНК применялся метод остановки обратной транскрипции. Основной принцип этого подхода состоит в том, что фрагмент 165 рРНК, содержащий ковалентно сшитую мРНК, гибридизуется с олигодезоксирибонуклеотидом, комплементарным участку РНК, расположенному в З'-сторону от исследуемого района. Фермент обратная транскриптаза (РНК-зависимая ДНК-нолимераза), используя в качестве затравки шбриднзованнын олигодезоксирнбонуклеотид, осуществляет синтез ДНК-цепи, до тех пор пока не доходит до нуклеотида, участвующего в образовании ковалентной сшивки с молекулой мРНК, за один нуклеотидный остаток до места образования пришивки, синтез ДНК-цепи прекращается, что можно проследить по появлению на радиоактивном геле соответствующей полосы, так называемого "стоп"-снгнала.

Д.1Я определения положения 4-тиоуридина в молекуле мРНК, из которого произошло образование тон или иной ковалентной сшивки, был разработан подход, основанный на применении пиролиза ферментом РНКазой

Т1, получивший название метол Т1-фингсрпрш1тов. Если подвергнуть исчерпывающему гидролизу РНКазой Т1 ковалентное соелнненпе I6S рРНК с мРНК, то в результате образуются фрагменты РНК, соответствующие растеплению по остаткам G. После разделения двумерной хроматографией на РШ-целлюлозе с помощью ралпоавтографиа можно установить положение на такой хроматофамме всех фрагментов мРНК, являющихся радиоактивно мечеными. Исчезновение одного из пятен на хроматофамме указывает на наличие пришивки из данного района мРНК.

Таким образом, комбинация данных подходов позволяет определить с точностью до нуклеотидного остатка положение пришивки к 16S рРНК и одновременнно положение остатка урнднна в мРНК, участвующего в образовании данной ковалентиой сшивки, что дает возможность выявить непосредственные контакты между отдельными нуклеотидами мРПК и 16S рРНК в процессе белкового синтеза.

Анализ топографии на рибосоме 5'-концевой части мРНК с коротким спсйсорньш участком.

Для анализа пришивок из 5'-концевой части мРНК-аналогов к 16S рРНК был последовательно применен двухступенчатый подход.

На первом этапе исследования при помощи метода направленного гидролиза РНКазой H были установлены основные районы модификации в 16S рРНК в нескольких функциональных типах рибосомных комплексов. Для всех аналогов cro-мРНК, а также для синтетических матриц "4N.-N" в составе бинарного комплекса (мРКК* 70S) наблюдалось наличие двух пришивок: к району 660-840 16S рРНК и к З'-концу 16S рРНК- (рис.3, дорожки 3 и 8). Существенно, что образование данных пришивок происходило для всех матриц независимо от нуклеотидной последовательности их З'-концевоГ; части. Принимая во внимание идентичность структуры 5'-концевой части аналогов cro-мРНК было сделано предположение о том, что образование данных ковалентных сшивок происходит из спенсорного участка мРНК, что было впоследствии подтверждено с помощью метода Т1-фингерпринтов.

Для более детального анализа райоца модификации 660-840 был предпринят дополнительный гидролиз РНКазой H с помощью пар олигодезоксирибонуклеотидов, располагающихся на расстоянии- 20-40 нуклеотидов друг от друга, комплементарных ко всему участку 660-840, в результате чего было получено, что участок модификации располагается в районе 660-690 (рис. 4, дорожка 1). Используя аналогичный подход, удалось

А.

1 2 3 4 5 6 7 8 Л*?

Н» Т —'

ез

Б.

1 2 3 4 5 6 7 8

«*<МЗ*Эг

ю.

3»» 1*П \

МП (.к К 2

»К з

ил »»* 4

__»Н_ 5

_ИМ 131»_ ^

_1311 1« «у

Рис.3. Электрофоре! ичссхос разделение после пшрлппа РНКалой Н фрагментов. 165 ррЦК, сшиюй в составе бинарного комплекса с аналогами сго-мРНК +4(А) и +12(5). Набор олшомуклеотидо», применявшихся для пщрчлша. представлен на схеме.

более точно установить район пришивки к З'-концу 163 рРНК. В результате было показано, что район сшивки располагается в окрестности 4-х нуклеотидных остатков от положения 1530. Поэтому, в дальнейшем, пришивка к З'-концу будет условно обозначаться как пришивка к положению 1530.

Анализ с помошью РНКазы Н 165 рРНК, модифицированной в составе тронного иннцнаторного комплекса (мРНК*705*тРНКг 1с|), показал некоторое ослабление интенсивности коваленгнои сшивки с районом 660-690, а в некоторых случаях и полное ее исчезновение, в то время как интенсивность сшивки с положением 1530 фактически не менялась. При добавлении второй тРНК в А-участок характер модификаций 16Б рРНК из 5-концевого района мРНК был аналогичен характеру модификаций в случае тройного комплекса.

12 3 4

500

1000

16Б

1

2

3

4

Рис. 4. Определение более точного положения сшипки с районом 660-840 165 рРНК с помощью гилролиш РНКачой Н в нрисуктиии сосп кстствуюте! о набора олмгоиуклеотидов.

Однако, после одного шага транслокации происходило заметное изменение в характере пришивок. Во-первых, наблюдалось некоторое увеличение интенсивности сшивки с районом 660-690, во-вторых, некоторое ослабление пришивки к З'-концу 16Б рРНК, и наконец, появление в посттранслокационном комплексе новой сшивки с районом 1340-1380 (рис.5).

Для точной локализации участков модификации к районам (660-690) и (1302-1380) 16Б рРНК был использован метод остановки обратной транскрипции. Для реакции обратной транскрипции были использованы фрагменты 16Б рРНК 620-790 и 1302-1380 с ковалентно сшитой мРНК, полученные в результате гидролиза РНКазой Н соответствующими олигонуклеотидами. В качестве контроля были использованы фрагменты 16Б рРНК, подвергнутые гидролизу теми же олигонуклеотидами, что и модифицированные. Характерный сигнал остановки обратной транскриптазы, отсутствующий в контрольном эксперименте, наблюдается на нуклеотиде 1361, (рис.бА). Согласно правилам метода, данный "стоп" соответствует наличию ковалентной сшивки с нуклеотидом 1360. Можно отметить также остановку обратной транскрипции на нуклеотиде 666, которая соответствует сшивке с

12 3 4

I

85

-70

500

1000

16Б

1П

1

2,3,4

1302 И«7

Рис.5. Электрофорстическое разделение после гидролиза РНКазой Н фрагментов 165 рРНК, сшитой с аналогом сго-мРНК +7.+ 12 в еостаис бинарного комплекса (дорожка 2), тройного комплекса (дорожка 3), поеггранелкациошюго комплекса (дорожки 1,4). Набор олигонуклестидоЕ, применявшихся яля расщепления 165 рРНК, представлен на схеме.

нуклеотидом 665 (рис.бБ). На данной радиоавтограмме представлены результаты анализа по трем независимым экспериментам, и во всех трех случаях наблюдается "стоп-сигнал" на нуклеотнде 666, отсутствующий в контроле.

Положение остатков 4-тиоурвднна, участвующих в образовании ковалентных сшивок было определено методом Т1-фингерпринтов (рис.7). Для этой цели соответствующие фрагменты 16Б рРНК с пришитой радиоактивно-меченой мРНК были элюированы из геля после гидролиза РНКазой Н и подвергнуты действию РНКазы Т1. В случае гидролиза мРНК (+7) без пришитой 165 рРНК, можно увидеть 4 характерных гштна, соответствующих фрагментам мРНК: 1-Ср, 2-ШОр, 3-иА1Юр, 4-СААиАССр (рис.7А). При пшролизе мРНК, содержащих пришивки к нуклеотндным остаткам 665 и 1530 (рис.7Б) наблюдается исчезновение пятна 2, соответствующего олигонуклеотиду 1ЛГСр, что показывает, что данная сшнвка происходит из положения мРНК -3,-4. Анализ сшивки с районом 1360 после одного шага транслокацни показал, что в данном случае также происходит исчезновение пятна 2, то есть образование ковалентной сшивки происходит из фрагмента мРНК 1ЛЮр. Поскольку после одного шага транслокашш положение -3,-4 перемешается на 3 нуклеотида, то данная сшивка происходит из положения -6,-7 (относительно кодона в Р-участхе) соответственно.

ю

А.

X. к, XI к»

® «» о

а ■в» •

_ — — —

• Ф

»Л

Б.

я- 1л.,. л~>

в • ^ •

Рис. 6. Определение точною положения сшивки с районам» 1.Ю2- 1.ШКА) н 660-690(Б) методом остановки реакции обратной транскрипции. (А).А.С.С.Т-спквснс рРНК но Сэнгеру. X ■-анализ 165 рРНК. модифицированной в составе тронного комплекса. Х2-анализ 165 рРНК. модифицированной в составе комплекса с двумя зРНК. К1, К2-контрольные образцы. (Б). Х1,Х2,ХЗ-апализ 165 рРНК, модифицированной в составе бинарного комплекса в трех независимых экспериментах. К-контрольный образец.

+7

СССААСОАСО ИШ НАШ й , 1 2 3

А. >1 V: ; Я"; в .....

¥

Л

Ъщ.

4

САААСОАСАО

г;;

> -

Г;.

к •

2ч

Рис.7.0прслеление положения в мРНК. участвующего в образовании ковалентной сшивки с 16Б рРНК. методом Т1-фишсрпринтов. (А). мРНК +7 в свободном состоянии. (Б). Гидролиз мРНК +7, образующей ковалеитную сшивку с З'-концом 163 рРНК.

Полученные данные показывают наличие трех основных пришивок из 5'-концевой части сго-мРНК: к нуклеотидным остаткам 665, 1360, и 1530 в 16Б рРНК. Все три пришивки присутствуют в 168 рРНК, модифицированной в

рибосомном комплексе после одного шага транслокашш. В шшцнаториых бинарном и тронном комплексах наблюдается наличие только двух пришивок к нуклеотидным остаткам 665 и 1530.

Анализ расположения на рибосоме S'-концевого участка мРПК со спейсором длиной в 8 нуклеотидов.

Для анализа ковалентных сшивок мРНК-аналогов со спсисорным участком длиной в 8 нуклеотидов с 16S рРНК также использовали двухступенчатый подход. Было установлено, что после проведения фотоаффииной модификации происходит образование трех пришивок к нуклеотидам 665, 1360 и 1530 в 16S рРНК . Применяя метод остановки обратной транскрипции, было показано, что положения данных пришивок совпадают с аналогичными для cro-мРНК, а анализ пришивок с помощью метода Т1-фингерпринтов подтвердил, что все эти пришивки происходят из спейсорного участка. В то же время, характер пришивок из мРНК со спейсором длиной в 8 нуклеотидов заметно отличается.

На рисунке 8 представлены результаты гидролиза РНКазой Н 16S рРНК, модифицированной в составе бинарного (mPHK*70S) и тройного (MPHK*70S*TPHK|Mel) комплексов. В качестве мРНК использовалась мРНК III (8N,-7), содержащая остатки уридина в положениях -7, +2( в инициаторном AUG-кодоне) и в положении +11.

Сшивка с нуклеотидом 665 наблюдается лишь при проведении фотомоднфикации в составе комплекса mPHK*70S (рис.86, дорожка 2), причем интенсивность ее гораздо ниже чем для мРНК со спейсорным участком длиной в 4 нуклеотида.

В дорожках 3-8 представлены результаты гидролиза З'-концевой части 16S рРНК. В инициаторном комплексе с тРНКгМс| (рис. 8а) можно отметить наличие пришивок к районам 1360 и 1530 (дорожкиЗ-7). Важным отличием от расположения 5'-концевого участка cro-мРНК является появление пришивки к нуклеотиду 1360 уже в составе инициаторного комплекса.

Суммируя представленные данные, можно сделать вывод о .том, что для мРНК со спейсором длиной в 8 нуклеотидов образование ковалентной сшивки с нуклеотидом 665 в 16S рРНК наблюдается в составе бинарного комплекса, с 1360-при добавлении инициаторной тРНК, а образование ковалентной сшивки с районом нуклеотида 1530 наблюдается в-обоих типах комплексов.

Д. 1 234 5678 ■ «.■»■яиц..... "

Б. 1 2 3 4 5

6 7

«у»

&

■ .

о

1308

2.

Рис-Х. Элек трофоретическое разделение после гидролиза РНКазой Н фрагментов 163 рРНВС. модифицированной модельной мРНК(КМ.-2) в составе трошюпЧА) и бинарноп)(Б) комплексов- Набор илитдезокснрибонуклеотндов. применявшихся для растепления 165 рРНК мрелставлен на схеме.

Структура мРНК-связыватщего центра.

Результаты, полученные по топографии 5'-концевого участка мРНК в данной работе в сочетании с данными по топографии З'-конневого участка, полученными раннее, дают возможность рассмотреть структуру мРНК-связываюшего центра. Полный набор данных, полученных на настоящий момент,представлен на рисунке 9.

Свойства пришивок из 5'-концевой и З'-конневой части заметно отличаются друг от друга. Образование пришивок из З'-концевон части является тРНК-зависимым « происходит из строго определенной позиции в мРНК. Совершенно другими свойствами характеризуются пришивки из 5'-концевого района. Образование данных пришивок происходит как в присутствие, так и в отсутствие тРНК, и на выход ни одной из них не влияет наличие второй тРНК в А-санте. Более того, образование пришивок происходит фактически из всех позиций внутри спейсорного участка (для

аналогов сго-мРНК наблюдается некоторая специфичность, и пришивки образуются, в основном, из положении -3, -4).

Описанные свойства прншнвок из 5'-концевой части, вероятно, соответствуют тому, что матрица имеет две основных точки фиксации на рибосоме в составе инициаторного комплекса: последовательность Шайн-Дальгарно и иннциаторный кодон. Ориентация спейсорного участка между этими двумя точками зависит от его длины. Для мРНК с длинным спейсором

и-а

Рис. 9, Суммарные данные по сшивкам из З'-концсвого и З'-концевого участков мРНК с различной длиной, спейсора. Элементы вторичной структуры 165 рРНК, изображенные над структурой мРНК относятся к "голове" малой рибосомной субчастицы, а -под структурой 165 рРНК -относятся к "телу".

основными точками контакта являются нуклеотиды 1360 и 1530, а для мРНК с коротким спейсором основными являются контакты с нуклсотидами 665 и 1530. Положения контактов данного участка изменяется в зависимости от функционального состояния рпбосомного комплекса.

Полученные данные также дают новую информацию о пространственной структуре 16S рРНК. Можно сделать вывод о том, что положения 665 (спираль 22), 1360 (петля шпильки 43), 1530 (основание шпильки 45) должны находиться в непосредственной близости в структуре 16S рРНК, что вполне согласуется с моделями, псшученнымп с помощью метода иммуно-электронной микроскопии.

Филогенетические данные об этих пришивках показывают, что все основания к которым происходят пришивки из З'-концевой кодирующей части относятся к консервативным элементам в структуре I6S рРНК, а все пришивки из 5'-концевой части к универсальным элементам во вторичной структуре 16S рРНК. Следовательно, можно сделать вывод о том, что установленные контакты являются универсальными для всех видов рибосом и отражают контакты между мРНК и рРНК в процессе белкового синтеза.

Изучение рибосомных белков, модифицирующихся из 5'-концевого района мРНК .

Для идентификации рибосомных белков применялась комбинация различных подходов. Первой стадией анапиза модифицированных рибосомных белков было фракционирование электрофорезом в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия и мочевину. На следующем этапе анализа для точного определения модифицированных белков использовалась идентификация с помощью индивидуальных антител. И наконец, положение в мРНК) из которого осуществлялась та или иная сшивка, определяли с помощью метода Tl-фингерпрннтов.

Было выявлено 4 основных белка, образующих ковалентные сшивки с 5'-концевой частью мРНК: S2, S7, S18, S21. Белки S18, S21 модифицируются из положений мРНК от -4 до +2, белок S2- из положений мРНК от -4 до +9, белок S7 из положении -3,-4.

Интересным оказался характер модификации в зависимости от типа рибосомного комплекса. В составе бинарного комплекса (mPHK*70S) модифицируются, в основном, белки S18 и S21. При добавлении иницнаторной TPHKfMcl также появляются пришивки к рибосомным белкам

S2 п S7, причем происходит заметное ослабление степени модификации белков S18 и S2I. При добавлении второй тРНК основным модифицированным белком становится белок S7, в то же время, происходит значительное уменьшение выхода пришивок к остальным белкам. После одного шага транслокацин белок S7 остается основным модифицируемым белком, кроме того, вновь наблюдается появление пришивок к белкам S2, S18, S21.

ИЗУЧЕНИЕ ТОПОГРАФИИ мРНК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДРУГИХ ФОТОЛФФ11ННЫХ РЕАГЕНТОВ.

Для получения полной информации о структуре мРНК-связывающего центра интерес представляет использование различных фотоаффинных аналогов нуклеотидов, имеющих фотореакционные группы в разных положениях гетероциклического кольца и фотопревращения которых протекают по различным механизмам. По этой причине мы решили не ограничиваться в наших исследованиях применением одного 4-тиоуридина, а использовать и другие фотореагенты, такие как 5-йодуриднн и 6-тиогуанозин. 5-йодуриднн н 6-тиогуанознн являются очень перспективными реагентами для фотоаффинной модификации рибонуклеопротеидных комплексов. Для них характерно образование сшивок "нулевой" длины, активация УФ-светом при длине волны больше 300 нм, в условиях сохранения биологической активности рибосомных комплексов. Благодаря не очень большим размерам фотореакционных групп, 5-йодурндин и 6-тиогуанозин не вносят существенных изменений в структуру полинуклеотида. Задачей данной части работы было разработать методы включения 5-йодуридиновых и 6-тиогуанозиновых производных в молекулы мРНК и показать возможность принципиального использования их для изучения функциональной топографии рибосом.

Изучение топографии мРНК на рибосоме с помощью 5-йодуридина.

Благодаря структурным свойствам 5-йодуридин-5'-трифосфат оказался эффективным субстратом для РНК-полимеразы фага Т7. Более того, субстратная активность 5-йодуршшн-5'-трифосфата в реакции, катализируемой Т7-РНК-полимеразон, была сравнима с субстратной активностью уридин-5'-трифосфата, что обеспечило получение 5-йодуридин-содержащих аналогоь мРНК с достаточно высоким выходом.

А

СООААСОАССТЛгаиАШиАССАААОААААООАСАО

.....

Б

ССОААСОАССгиисиАиОСАиСААСОСААСиСССАС

9 32 53 84 Б5 3 ? 3 39 Э10 Я! Б12 Э13 Э14 Я5 Я6 Э17 Я8 Э19 Е20

Рис. 10. Определение модифицированных рибосомных белков с помощью антител против индивидуальных белков. м

А. Анализ белков, модифицированных в составе тройного комплекса (мРНК*705*тРНК, ) с аналогом сго-мРНК+4,+10. Б. Анализ белков, модифицированных в составе комплексов: - тройного (мРНК*705*тРН1Сг ) и - после одного шага транслокации с аналогом сго-мРНК+6,+16.

В работе были использованы аналоги сго-мРНК +4,+10 и +6,+16. Для сравнения свойств йодуридпна и тноурндина были выбраны матрицы именно такой структуры, поскольку ранее было показано, что тноуридин-содержащие мРНК образуют сшивки с рРНК из положений +4 и +б.

Фотоаффинная модификация рибосом аналогами мРНК, содержащими остатки 5-йодуриднна, была проведена в составе тройного комплекса MPHK*70S*TPHKfMcl, а также после одного шага транслокации. Для облучения использовали ртутную лампу низкого давления при длине волны больше 300 нм. Разделение модифицированных белков и рРНК осуществлялось с помощью системы сахарозных градиентов. В результате такого разделения выяснилось, что уровень пришивки из мРНК к рибосомнон 16S рРНК составил всего лишь 0.59Ь, однако, уровень пришивки к рибосомным белкам был значительно выше и составил около 6%. Дальнейшее исследование было ограничено анализом модифицированных рибосомных белков.

Было показано, что из иннциаторного комплекса с мРНК +4, +10 модификации подвергались, в основном, белки S3, S5, S7, SU, а также, в незначительной степени, белки S18, S21 (рис.ЮА). Для мРНК +6, +16 набор модифицируемых белков отличался. В составе иннциаторного комплекса происходило образование сшивок с белками S2, S7, S18, S21 (рис.1 ОБ). После одного шага транслокации наблюдалось также образование сшивки с белком Sil, модификация которого, по-видимому, осуществлялась из двух положений в мРНК: район нуклеотидных остатков +3 и +4, а также из спейсорного участка мРНК. Полученные пришивки к рибосомным белкам соответствуют спектру модифицированных белков, полученных с использованием 4-тиоуридин-содержащих аналогов мРНК. Существенно, что при применении 5-йодуридина был обнаружен новый белок, входящий в состав декодирующего центра.

Изучение структуры мРНК-связывающего центра с помощью 6-тиогуанозина.

Для введения 6-тиогуанозина в . молекулы мРНК-аналогов была использована система Т7-транскрипции. Однако оказалось, что эффективность включения 6-тиогуанозин-5'-трифосфата РНК-полимеразой бактериофага Т7 крайне низка. Несмотря на этот факт, нам удалось подобрать условия получения б-тиогуанозин-содержащих мРНК-аналогов б необходимых для проведения экспериментов количествах.

В результате проведения фотоаффинной модификации рибосомных комплексов аналогами мРНК был. получен существенный выход пришивки к рРНК (около 80% по распределению радиоактивной метки), что заметно больше, чем в случае использования 4-тиоуридин-содержащих аналогов мРНК,

для которых выход пришивки в аналогичных экспериментах состаалял от 20 до 40%. При этом, как было показано с помощью метода направленного гидролиза РНКазой Н, для мРНК, содержащих остатки 4-тиоуриднна и 6-тиогуанозина в одних и тех же положениях модификации подвергались одинаковые районы в 16S рРНК, однако выходы пришивок были различны для разных реагентов.

Таким образом, первые исследования по использованию б-тиогуанознна для фотоаффннной модификации рибосом показывают, что с его помощью может быть получена дополнительная информация о структуре мРНК-связывающего центра на рибосоме.

ВЫВОДЫ.

1. Установлено наличие взаимодействия между 5'-концевой частью мРНК и нуклеотидными остатками 665, 1360, а также районом нуклеотидного остатка 1530 в 16S рРНК.

2. Показано, что ориентация спейсорного участка на рибосоме зависит от его длины. Для матриц со спенсором длиной в 4 нуклеотндных остатка основными являются контакты с положениями 665 и 1530 в 16S рРНК, а для матриц со спейсорным участком длиной в 8 нуклеотндных остатков -с положениями 1360 и 1530.

3. Показано, что топография 5'-концевого участка на рибосоме зависит от функционального состояния рибосомного комплекса. Максимальный выход пришивки к нуклеотиду 665 происходит из мРНК в составе бинарного комплекса, максимальный выход пришивки к нуклеотиду 1360 - в составе тройного инициаторного комплекса; пришивка к нуклеотиду 1530. наблюдается во всех типах инициаторных комплексов, а также после одного шага транслокации.

4. Идентифицированы рибосомные белки, взаимодействующие с 5'-концевой частью мРНК, а именно белки S2, S7, SI 1, S18, S21.

5. Разработаны методы введения 5-йодуридиновых и 6-тиогуанознновых остатков в аналога мРНК и показана принципиальная возможность их использования для проведения фотоаффинной модификации рибосом.

6. Найдено, что 5-йодуридин-содержащне аналоги мРНК являются эффективными фотоаффннными реагентами для модификации рпбосомных белков.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. I.Lavrik, A.Bakin, E.Skripkin, I.Shatskii. // International conference -"Translational apparatus".-1992-Berlin.-Abstract book.- p.122.

2. 1. Lavrik, A.Bakin, E.Skripkin, I.Shatskii, A.Bogdanov. The topography of the mRNA on the ribosome by photo-affinity labeling technique.// Modern Enzymology Problems and Trends.-1994-735p.-Nova Science Publishers Incorporation.

3. J.Rinke-Appel, N.Junke, R. Brimacombe, I.Lavrik, S.Dokudovskaya, O.Dontsova, A.Bogdanov. Contacts between 16S ribosomal RNA and mRNA, within the spacer region separating the AUG initiator codon and the Shine-Dalgarno sequence; a. site-directed cross-linking study.// Nucleic Acids Res.-1994-v.22.-p.3018-3025.

4.O. Dontsova, S.Dokudovskaya, S.Bogdanova, P.Baranov, I.Lavrik, R.Brimacombe, A.Bogdanov. Intraribosomal RNA-RNA interactions; a photoaffinity cross-linking study. //Abstracts of papers presented at the 1994 meeting on Translational Control.-1994-Cold Spring Harbor, New York.-p.62.

5. CJl.Богданова, А.И.Дегтярев, П.В.Баранов, С.С.Докудовская, И.НЛаврик, О.А.Донцова, Т.С.Орецкая, Н.Ф.Крынецкая, З.А.Шабарова и А.А.Богданов. Направленное расщепление молекул 16S рРНК по единичной межнуклеотидной связи.// Биохимия. -1994- вып.12.

6. A.Bogdanov; O.Dontsova, J.Rinke-Appel, S.Dokudovskaya, I.Lavrik, K.Alexeeva, O.Shpanchenko, P.Sergiev, P.Baranov, E.Shirokova, R.Brimacombe. Thio-Substituted Derivatives of RNA: Application in Protein Biosynthesis studies.//Nucleic Acids Symp.Ser.-1994-V.25.

им