Изучение топографии мРНК-связывающего центра рибосомы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

'VI а'ч 1 03 91'

НМОСЗВ:ОВ¥ЖИИ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ' РЕВОЛЮЦИИ, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ДОНЦОВА Ольга Анатольевна

УДК 576.85.48

ИЗУЧЕНИЕ ТОПОГРАФИИ мРНК-СВЯЗЬГВАЮЩЕГО ЦЕНТРА РИБОСОМЫ

02.00.10 - биоорганическпя химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой Степени кандидата химических наук

Москва - 1991 г.

Работа выполнена на кафедра химии природных соединений Химического факультета МГУ им.М.В,Ломоносова

Научные руководители

Официальные оппоненты

доктор химических наук,

профессор

А. М. Кош лов

кандидат химических наук,

старашй научнцд струдник

Е.А.Скршшш

доктор химических наук,

профессор

Э.И.Будовский

Ведущая организация

кандидат химических наук, М.Ф.Турчинский

Институт молекулярной биологии АН ССС: им.В.А.Энгельгардта

Защита состоится "¿6 "июрТО-' 1591 г. в 4б часов на засе, специализированного совета Д 053.05.47 но химическим наукам Московском Государственном Университете им.Ы.В,Ломоносова но ад ГСП 119899, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный ю "А", аудитория 601.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химиче I факультета ИГУ

Автореферат разослан 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

.jeaj'

Г.И.Лаврено]

Общая характеристика работы. r.'iVKijHfttuccTii теш. В течении длительного врчшш /силин риопп ледовагелей сосредоточеш на изучения мвхшп&ин био-тиг'ззэ белка, ако, до настоящего временн, двталыша мегонигм ipstrniiunr егч" из ят. Молекулярные механизмы этого процесса нельзя т"fioimг?, без чения пространстввшюго взаиморасположения копт'-;;гок "wr тезпруюией системы. Если к настоящему времени зпэти

ьное количество данных о структуре субчастиц рийксч. пр:-л.солен структурных моделей малой субчастши и расяола^еляя из ней тШ, положение мРНК остается наименее изучении». Swmie расположения К на рибосоме, определение функциональных и структурных де-терми-т мРНК на рибосоме вайю us только с точки зрения понимания меха-мэ трансляции, но и с прикладной точки зрения - для обеспечения экой эффективности трансляции чувародиых генов в бактериальных тках.

Цель раОогн - исследование топографии на рибосоме фуикциоиаль-участков мРИК - шициаторшго aug-кодонз и последовательности ш-Дальгарно (so) различных шгшщаторнцх комплексах, а также педовагош влияния факторов инициации трансляции на кон^ормацию деатсршх комплексов методом (1отозф{шшой модификации.

Научная новизна и практическая значимость. В отличие от боль-"гбэ выполненных ранее работ по топографии мН1К на рибосоме с ис->зснанкем либо короткзгх аналогов мРНК, гомополш.'.еров, либо длин-no лицис тронных матриц, данная работа выполнена с использованием ютруирсваштых в нашей лаборатории мшш-мРНК, 5'-концевая область )рых идентична соответствующей области природной мРЛК гена -бежа фага а. Эти мРНК закодированы в плазмлдах и способны эф-'ивно с них транскрибироваться и накапливаться в клетках к.соИ, позволяет получать их в препаративных количествах. П^-У'ииеея в м распоряжении конструкции позволяют легко видоигменять рогулн-ые участки мРНК. В работе использованы две таких мшш-мГНК, на 5'-кепке одноп и.) находится шпшиаторшй aug-кодои. на 5'-конце другой - г:ос,п.»дальность so. После введения на 5'-конец таких мИ1К -j.->iн»»п пи и сборки иницизторных комплексов, проьедека t.ii£Ki;tf\ut«a флгэн^жш'л! производными эшх Ml'iW. Т«коа подход :ь-;!:<..;л!. ы,г-

fljixb белки малой субчастицы рибосом, сближенные с функционально эн чимыми для процесса инициации участками MIHK, такими, как последов телыюсть so, и расположенный в декодирукщем участке инициаторн

auö-кодон.

Полученные результаты позволили сделать заключениние о возмо; wo« топографии 5'-концевой области природной мРНК на малой .субчаст: да -рибосом и могут быть использованы при построении моделей распол пения мРКК на рибосоме.

Использованный в работе подход может быть применен и для иссл! доьаыия других рибонуклеопротеидных комплексов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Bei союзном биохимическом съезде, Киев, 1986; Всесоюзной конферещ "Новые направления в биотехнологии", г.Пущино, 1988; Конгрессе : биотехнологии, Гавана (Куба), 1989; Международном симпозиуме "Per; ляция трансляции", Рига, 1989; симпозиуме embo/febs/iub "Механизм контроль трансляции", Ноордвикераут. (Нидерланды), 1990; Всесоюзной иколе-сешшаре "Перспективные направления и новые мего, в молекулярной биологии", Рига, 1990.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разде, введение, обзор литературы (посвящен современным представлениям структуре малой субчастицы рибосом и расположению на ней мРНК и тР; обсуждение результатов, материалы и метода, вывода. Матер иллюстрирован $ таблицами и 5И рисунками. Библиографичес] указатель включает цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

ß качестве модельных мРНК для исследования топограс t>' -концевых участков мРНК в иници а торных комплексах использованы ; uiiiüt-uFHK, являющиеся производными природной мРНК cro-белка фага одна нз которых имела на 5'-конце последовательность so (м127), spji-iia - aug-кодон (u52). Эти мРНК закодированы в плаэмидах рММ 12г,

uG aA С A C-G С A

A-U .

A-U A

U-A A-U C-G

5 pppAUGUACUAAGGA- G~°AAUGCGCUWGGGCAAACCAAGACACCUAAAGAUC. - G—С

м52

MI27

sd lu-a

G С A U A U G-C

G-Ccu G-CUA

G-C

5 ' pppAAGG^ _TfGGGAU°~GUA ■ . .

Ïg-C SDIg-c »u-a

u-a r-

g-u б

"A

■Г

G С

A t. г. A

A c A .

Рис.1. Вторичные структуры 5'-концевых областей м52 (А.) и м127

3), инициаторные кодоны aug и последовательности sd подчеркнуты.

•

Вторичные структуры 5'-концевых районов м52 и MI27 приведет! на ю. I.

' 5'-конец м52 полностью идентичен 5'-концу мРНК белка его. м52 тнаегся с кодона aug, за которым через один триплет следует стоп-)Дон, далее расположена последовательность sd длиной 9 пуклеогипоп, i которой через 3 нуклеотида располагается истинный иницичторшП >дон au g cro-белка. Начиная с этого aug, м52 колирует 22 н-кошкгчпе танокислогы белка cro-белка фага х, осталыш* 4 гмтаокпояотч г <■■■;-

чаШюй последовательности. Значащая часть мРНК оканчивается да; стоп- кодонамп, таким образом м52 кодирует полипептид длиной в аминокислот с молекулярной массой около 3000.

м127 - это укороченный на 7 нуклеотидов вариант м52, то ее: она начинается непосредственно с последовательности so, далее вд 7 триплетов гена белка его и 45 триплетов аминокислот случайной п< ледовательности и оканчивается стоп-кодоном, таким образом, м127 ¡ дирует помше-птид длиной. 52 аминокислоты с молекулярной массой оке 7000.

В каждой mPHIí последовательность so частично находится в ода тяжевых участках, а инициаторши кодоны Aua расположены в neTJ шпилек. Хотя вторичные структуры матриц отличаются, основные инит горные сигналы расположен« в однотяжеЕых участках и доступны j взаимодействия с рибосомой и, таким образом, могут обеспечивать s Отливную инициацию трансляции.

Для решения поставленной задачи по локализации инициагорг сигналов MF1IK на малой субчастице рибосом е.coli в настоящей рабе били выполним следующие этапы: выделение, " очистка мРНК; введеь на 5'~кон<зц мРНК радиоактивной метки и фэтоаффшшей группы с coxj пением трансляционной активности модифицированной мРНК? сборка ш. iraeiopirax комплексов и фотоаф&шная модификация; идентификация mo,j Ударов энных компонентов рибосом.

I. Транскрипция мРНК в клетках е.coli. мПШ наделяли из клеток E.coil, трансформированных соотвзтс вугцей плээмщпй, когда синтез РНК происходит in vivo. При этом случае плазмид рММ 52. и р!.М 127 транскрипция мРНК обеспечивается л личием в плазмидах сильного промотора pr фэга а, термкнация транс рипшти обеспечивается тандемом из двух терминаторов фэга fd. Налич прух терминаторов приводит к синтезу с каждой из плазмид двух мРН длине которых г эличается па 100 нуклеотидов. В работе использова. г^лре короткие мГНК.

Uno логическую активность выделенных мРНК проверяли по •Mi^o*!WTW к та>т>сляш1и в беекпеточной системе,

2. Синтез фотоаффтшого производного мТНК.

Модификацию 5'-конца мРНК фотоа>№шлнм реагентом просодит* вме, представленной на рис.2.

На первой стадии проводили дефзсфорилированиа мПШ обработкеи ктериалыгай щелочной фэсфагззой в присутствии плацентарн^'О т'\ и гора РНКаз для уменьшения деградации РНК. На второй столик m -конец мРНК вводили радиоактивный фосфатный остаток с помочи.ю но туклеотидкиназы фага Т4 и [y-32r]ATF также в присутствии mtrucuun РНКаз. Чтобы осуществить более полное фосфоридированпе ГЗ'-кошр Ж. (необходимое для повышения выхода химических реакций на следуя' с стадиях), в реакционную смесь добавляет избыток ЛТР и допо-п1" тьную порцию полшуклеотид-юшаэы.

Введение на третьей стадии на 5'-фосфат мРНК карбодт'Шфязидгк>» ?ппы за счет образования фосфамидной связи в присутствии ^растворимого карбодиимида осуществляли в условиях, когда в р?пг j вступает только '5'-концевой фосфатный остаток, нежнуклаепш>"-:фаты при этом не затрагиваются. Выход оценивали анализом )ННой смеси с помощью высокоэффективной жидкостной хроматтр-т''1"' Ш) после исчерпывающего гидролиза мРИК РНКазой Л (рис.?). Mar nt 1ышй выход реакции наблюдался при инкубации реакционной CT^emi i!j:n 'С в течение 18 час. (80%), при 8-ми часовой инкубации при од снижался до 60-70%.

На последней стадии на 5'-конец мТНК вводили фотоэт.тириру"'. г-ппу путем образования амидной связи между амино-грунпоП кпр:''.чш разидного остатка и 4-<1-ази-2,2,2-трифторзтил)беизойной (иг-с , активированной м-оксисукциттмдшм эфиром. В результате р<?г>пшм азуется 5'-диазирильное производное мРНК. Выход реакции г0ГГ-Рг|. мерно 90%.

мРНК в процессе химической модафикэщш практически гг л'чрт-и

т.

Суммарный выход реакции составил около 60% от исхчгн.'« >■

чае модификации карСодашмидом в течение 18 час. п ДО г>п» ч -т ■[■■■■ яфикации в тэчешш 8 час.

Способность к трансляции модифицированной мРНК npof«r"4" " г " сочной системе на основе лязатэ клеток c.coil мнк поп, iimir

0 0 о

" о-р-о-р—о-р-о- (мРНК.) |_ I. I. ООО

фосфатаза

но-(мРНК)

1 132р)атр

о

~<ьн>-0-1МРШС) о"

кар бодаишд

о о

о"

•ч

о

-с-о-и ]

Г

8 » «Я

|рс- (О) МРНК)

Рис.2, Схема синтеза диазирильного производного ыРЩ.

матриц проводили с предаарительньш образованием тройного комплекса содержащего нормальные или модифицированные мРНК, активированные рг босомц, 13^)тРНКм^1, фактор инициации 1гз, после чего добавляли экстракт июо или бзо и другие стандартные компоненты бесклеточной

I II

Рис.3.Разделение продуктов реакции на разных стадиях модификации РНК методом ВЭЖХ после исчерпывающего гидролиза панкреатической НКазой; а - после реакции фосфоршшрования МРНК, б - после введения арбодигидразидной группы, в - после введения диазирильной группы. - неорганический фосфат, и - продукт гидролиза фосфорилировэююй РНК, ш - продукт гидролиза карбодигидразидного производного ыГ(!К, v - продукт гидролиза диазирильного производного мРНК.

—' 8h,----18h)

uuü'ióí/ü. Матрица, модифицированная в присутствии водорастворимо: карбодшшида с выходом 80%, практически утрачивает способность трансляции, тогда при модификации с выходом 60-70% ее способное?) трансляции практически fie отличается от нешдифицированной мРНК. ] терн матрицей способности к трансляции связана с возможной модафш цией карбодшшвдом как. ыежнуклеотидных фосфатных групп, так и фу] ционалышх груш гетероциклических оснований в цепи РНК, поэтому дальнейшем ш использовали ыРНК, модифицированную на 60-70%.

Для модификации рибосом фотоаффинныш производными мРНК собвд ли комплексы, содержащие модифицированную мРНК, малые субчастици . бо целые рибосомы, либо так называемые "tight couples" рибосо» ("tight couples" рибосомы - это рибосомы, которые не диссоцщвд н<а суочастшщ при низкой концентрации ионов магшя (5 мМ мд2+), условиях, когда все другие ("обычные") рибосомы практически полис ты) диссоциируют, "tight couples" рибосомы не содержат факто! инициации, субчасти да, входящие в их состав, наиболее активны в бе коьом синтезе), гРНКм®ь и, в ряде случаев, фактор инициации тра! лящш if3 .

Эффективные концентрации компонентов инициаторных комплекс подбирали в отдельных экспериментах.

Сформированные инициаторше комплексы облучали УФ-светом с ду ной волны > 300 нм во льду в течение 10 ыин, в условиях, когда да зирильное производное успевает полностью прореагировать. При эт диазирильше производное разлагается с образованием активной пром жуточно» частицы - карбена, способного неспецифически реагировать любой химической связью (включая С-Н) при непосредственном контакт

3. Анализ модифмцировашшх компонентов рибосом.

ÍLcjio облучения комплексы осаждали этанолом, малые субчасти ьил^лялл центрифугированием в градиенте концентрации раствора сах розы при mrsb-.oii концентрации ионов магния в условиях диссоциации р босом на субчаспгцы. В случае комплексов с малыми субчастицами цен И'.тчцоныш не проводили.

2!ля анализа модификации íes рРШ проводили Фенольную депроте: нсзыда K'.'U.'iôKcoïî. РНК разделяли электрофорезом в 4% ПЛАГ в ирису

С! nos ?!! Ю1?1>>!1\Ы.

А

S2 , S3

S2 53

«s S4

» S4

S6

S8

S12

S13/14 . , S15/Í6/17 c<c

S9/11

S10

S17/15 S19/20/21 >16 ' 518

S16 •

S19/20/21

4.Двумерная, злектрофореграша разделения белков малой субчастицы !осом в системе Метца и Богорада, после окрашивания раствором Кума г bbr 250 (А) и после модификации фотоаффинным производным м127 в :омплексе с зоэ, инициаторной тРНК и фактором инициации IF3 (В).

Для анализа модификации рибосомннх белков проводили исчерпываю-i гидролиз РНК смесью РНКаз А и TI, рибосомные Оелки анализировали ктрофорезом в ПААГ в одномерном варианте по Лэммли в присутствии : или в двумерном по Метцу и Богораду. При этом с модифицированным ком остается связанным моно- или олигонуклеотид, содержащий ради-тивный фосфатный остаток, что позволяет идентифицировать модифи-ованный белок радиоавтографией: предварительно окрашенного геля, ако, по этой же причине подвижность модифихировашюго белка в ге-несколъко ниже подвижности соответствующего немодафицированного ка (окраска). При двумерном электрофорезе подвижность модифяциро-ного белка снижается в обоих направлениях, что приводит к диэго-ьному сдвигу. Как правило, величина сдвига увеличивается при зыяении молекулярного веса бежа. Такие сдвиги несколько затруд-г идентификацию и в ряде случаев не позволяют однозначно соотнес-жрашенвую и радиоактивную зону, особенно в грушах белков с Оли-i электрофорегической подвижностью, например: S9 и su; si3 и si-519, s2o и S2i. В этих случаях приводятся все члены этой группы

isa/n, si3/i4, S19/20/21). На рис.4 приведен пример идентифика! модифицированных Оелков после двумерного электрофоретического раз! пения.

4. Модификация рибосом фотоаффшшым производным м52.

Модификацию рибосом фотоаффинным производным м52 проводили i составе следующих комплексов: I 303*П.52*ТРНКИ®Ь XI 30S*m52*TPHKj*IF3

III 70S*ni52*TPffii j

IV "tight couples" 70Б*т52*ТРНКМ£Ь

Ранее в нашей лаборатории А.Г.Балакиным методом ингибирова£ обратной транскрипции было показано, что в комплексах i-ni в участке рибосомы (малой субчасгицы) располагается инициаторный koî белка его (90- 95% комплексов), тогда как в комплексе iv в декад рущем участке находится 5'-концевой кодон aug. Таким образом, комплексах i-ni 5'- конец мРНК модифицирует белки, находящиеся значительном удалении от декодирующего участка рибосомы, а в кок лексе IV модифицируются компоненты декодирующего участка.

Следует отметить, что модификация рибосом фотоаффинным прои

водным м52 в комплексах i-ni происходит с низкой эффективность

суммарный выход модификации составляет менее 0,5%, что не удивнтел

но, так как размер участка мРКК от 5'-конца до инициаторного кодо о

составляет около 90А (включая размер фотоаффинной группы) и моя выходить за пределы рибосомы.

В комплексах i-ui в наибольшей степени модифицируются белки H S19/20/21, модифицируются ТЭКЖв S4, S3, S13/14, S9/11, S7 (бвЛ перечислены в порядке убывания степени модификации). В присутств фактора IF3 модифицируются те же рибосомные белки, что и в его оту ствии, и,в значительной степени, сам фактор. Общий выход модификац при этом нескол..со повышается, по-видимому, за счет лучшего связыв ния мРНК в инициаторный комплекс.

В cj[y4ae комплексов ш и iv (комплексы с целыми рибосомами "tight couples") большая субчастица рибосом практически не модифиц руатся, так как при центрифугировании в градиенте концентрации рас вора сахарозы в условиях'диссоциации рибосом на субчастицы вся рад

эктивность связана с пиком малой субчастяцы.

Таким образом, в комплексах i - ш (в декодирующем участке ри )сомы находится пницаторный кодон гена его), спектры модифицирован и белков практически на отличаются.

В комплексе rv (в декодирующем участке 5'-концевой aug-кодон) зблюдается ^другой спектр модифицированных бежов: в основном мода щируется белок s7, остальные белки реагируют значительно слабее и г набор не отличается от остальных типов комплексов (рис.5). Следу-с отметить, что суммарный, выход модификации в комплексе iv значи ¡льно выше и составляет около 2%.

Таким образом, наблюдаются существенные различия в спектре мода щированных белков между комплексом iv и остальными типами комплек

)В. КОМПЛеКС iv - ЭТО КОМПЛеКС С рибосомами "tight couples", кото

je, по-видимому, не диссоциируют в процессе сборки инициаторног-змплекса (в отсутствие фактора if3). При этом aug-кодон, расположен di в одногяжевом участке м52 непосредственно на 5'-конце, занимает ¡кодирующий участок рибосомы (подтверждено методом ингибирования об зтной транскрипции). Тагам образом, модификация S7 в комплексе iv сражает его сближенность с декодирующим участком рибосомы, причем юисходит именно aug-зависимая сборка, а не просто посадка рибосом з 5'-конец мРНК, поскольку как в случае м127, на 5'-конце которой !т кодона Aug, модификации рибосом не происходит. Не наблюдается заимодействия м127 с "tight couples" и методом ингибирования обрат-)й транскрипции.

Относительно топографии декодирующего центра рибосомы в дотера фе высказываются противоречивые точки зрения. Одни овторы помещают 'о недалеко от З'-конца i6s ргж, т.е. рядом с белком S7, Другие, ¡новываясь на данных иммунной электронной микроскопии, размещают его ¡ некотором удалении от общепринятого места расположения S7. Наши ¡зультаты, показывающие что белок S7 и декодирующий центр рибосомы делены друг от друга не более, чем на 14 А, можно примирить со вто->й точкой зрения только в том случае, если допустить, что форма бел-I S7 отличается от сферической и он доеет больше размеры, чем это ¡ычно предполагается.

В наших экспериментах наблюдалась в основном модификация S7 из ¡кодирующего участка рибосомы. Наличие слабой модификации других

QuiiKou в комплексе с "tight couples" рибосомами может объяснять* небольшим количеством дассодаацвдрованных рибосом и образование нормального ишщиаторного комплекса с кодоном aug в декодирунце участке гена его.

Эффективную модификацию фактора инициации if3 в комплексе моашо объяснить тем, что фактор в ннвдиаторном комплексе располоа так, что он находится в пределах доступности 5'-конца МРНК, либо в посредственно взаимодействует с 5'-концом ыРНК вне рибосомы. Наибол вероятным нам гщедставляется второе объяснение, т.к. м52 на 5'-кон имеет кодон aug, а фактор инициации m имеет повышенное сродство кодоцу aug. Следует отметить, что в случае м127, 5'-конец которой : содержит aug-кодона, модификации фактора не происходит.

5. Модификация рибосом фотоаКшным производным м127.

Как ужа отмечалось выше, м127 начинается непосредственно ( sD-шследоватвльносиг, поэтому нашей задачей на этом этапе рабой било определение положения 5'-конца sD-последовательности на шало1 субчасище рибосом.

Модификации рибосом 5'-концевым фэтоаффинным производным ы12г< проводили в следующих комплексах:

V ml27*30S

VI шгтазовлгРНК*1^ (аналогично i для ш52)

VII ml27*3qs*rPHKm|t*xf3 (аналогично II)

vin и127*7оз*тРШМ£ (аналогично иг).....

IX nl27*Btigtit couples" 70S*TÎffitM|t (аНЭЛОГИЧНО IV)

Следует также отметить, что в комплексах vi-vin в декодирующем участке рибосомы находится ишщиаторный кодон гена его, что было показано методом ннгибирования обратной транскрипции, а в комплексах v и IX не происходит фиксации определенного кодона мРНК в декодирующем участке.

В бинарном комплесе mi27*30s (V) наиболее активно модифицируются белки S19/20/21, а также в значительной степени S3, S4, 315/16/17; si3/i4, S2, S9/ii( s7, а таоте si. В тройном комплексе с •тРНКн®*" (VI) число модифицированных белков значительно меньше. Наи-болаа интенсивно модифицируются белки S19/20/21 и S3, в меньшей степени белки. S4, S13/14, S15/16/17, S2. В ПРИСУТСТВИИ фЭКТОра IF3

IE

Ряс.5. Радиоавтограмма геля после двумерного разделения белков юй субчастицд рибосом, модифицированных фотоаффинным производным : в комплексе с "tight couples" рибосомами.

мплекс vu) в основном модифицируются два белка S4 и si3/i4, эна ельно слабее - S3, SI9/20/21, S15/16/17 (рис.4).

Таким образом, в более полном инциаторном комплексе происходит только уменьшение количества модифицированных белков, но и язме-тся распределение .радиоактивности между белками,модифицированными азных комплексах, го есть, при наличии тРНК, по-видимому, проис-ит некоторая фиксация положения 5'-конца последовательности sd, орое могет изменяться при сборке комплекса в присутствии фактора циацин IF3. Возможность конформационных изменений мРНК на рибосо-в присутствии фактора инициации 1рз отмечалась и ранее. Кинети-кие эксперименты Гвалерци свидетельствуют в пользу того, что сутствие фактора инициации IF3 способствует дестабилизации комп-за, облегчая тем самым выбор мРНК правильного расположения в ри~ эме. •

В комплексе с "tight couples" (ix) модификации- рибосом не щю •• здат. Отсутствие фиксации мРНК в декодирующем участке в таком мексе подтверждено экспериментами по иягибировашш обратной

транскрипции. В комплексе с 7os рибосомами (viu) модифицируете только малая субчастида, как и в случае комплексов ш и iv.

Данные по модификации белков фотоаффинным производным м127 различных инициаторных комплексах суммированы в таблице I и предста лены графически на модели пространственного расположения белков мал субчастицы рибосом (рис.7).

Бинарный комплекс v представляет собой продукт первичного свя зывания мРНК с малой субчастицей рибосом. В образовании подобног комплекса могут принимать участие sD-взаимодействия между. З'-концо i6s pPHK и 5'-концом мРНК, а также белок si. В таком комплекс 5'-конец sD-госледовательности может обладать значительной подвив ностью и модифицировать большую грушу бежов. Комплекс vi преде тавляет собой тройной комплекс, в который входят малая субчастиц рибосом, мРНК и инициаторная тРНК^1. В этом комплексе модифицирует ся меньше белков, чем в бинарном (v). Наблюдается преимущественна модификация двух белков s19/20/21, зз, в меньшей степени белков s4 : s13/14. Это связано, вероятно, с фиксацией инициаторного кодона ли в декодирующем участке малой суСчастицы рибосом, подвижность дуплек са 5'-конца мРНК с З'-концом i6s-pPHK при этом может снижаться.

Если собирать тройной комплекс в присутствии фактора инициаци трансляции IF3 (комплекс vn), то в основном модифицируются толь» два белка - s4 и s13/14, в значительно меньшей степени бз :

s19/20/21.

• В настоящее время мы не можем точно определить причины тако: изменения спектра модификации по сравнении с комплексом в отсутств: фактора. Оно может быть связано как с изменением ориентации 5'-кок мРНК при сборке комплекса в присутствии iF3, участок связывания кои poro расположен в области контакта субчастиц вблизи района связывай: мРНК, область связывания IF3 частично перекрывается с местом связ] вания аналога SD-последовательности на малой субчастице. Так: образом, if3 при связывании может "вытеснять" дуплекс so - энти-sd i его участка связывания, так что 5'-конец'sd-последователъности орие] тируется преимущественно в сторону белков s4 и s3 или s13/14. Друп возможным, объяснением существенного изменения спектра модификации присутствии фактора инициации IF3 является возможность индуцированы фактором конформационных изменений самой малой субчастицы. О сущес:

аблица 1. Белки, модифицированные фотоаффинными производными мРНК в различных иницизторных комплексах.

Моди - Ш52 Ш127

фици -

рован-ные ЗОБ*1РЗ* 703*ТРНК* ЗОБ* зов*тРНК* ЗОЭ*1РЗ*

белки ТРНК*т52 ГО52 П>127 П127 тРНК* П1127

1ГЗ +++

31 + + Н- +

52 ++ + +

53 ++ + +++ +++ ++

Э4 ++ + ++ ++ +

Б5 + +

Эб +

Б7 + + +

БЭ/И + + +++ +

Б12 + + +

313/14 ++ +++ ++ +++

Э15/16/17 +++ ++ ++

318 - +

319/20/21 +++- ++ +++- +++ +

эваниш таких изменений свидетельствует ряд литературных данных, чедовательно, в результате возможных движений в зоб субчастице рибо-ж в процессе сборки инициаторного комплекса может происходить сбли-энне 5'- конца мРНК с белками малой субчастицы рибосом, подвер-пощихся модификации фотоаффюзным производным 5'-конца м127 ш-последовательности). Кроме того, возможно полное или частичное

разрущение дуплекса sd - анти-sd в присутствии фактора.

Как уже отмечалось выше, суммарный выход модификации в слу1-фотоаффинного производного м127 существенно вше по сравнению с ai логичным производным м52, за исключением комплексов с "tight cov les» рибосомами. Кроме того, в комплексах с м127 наблюдается силы ^различие в спектрах модифицированных белков в разных типах компле сов. На наш взгляд, это связано с тем, что последовательность м52 S'-конца до инишаторного дш-кодона на 7 нуклеотидов длиннее соо ветсгвуицей последовательности м127, в результате чего 5'-конец ы обладает большей подвижностью и может выходить за пределы участ связывания мРНК с рибосомой, что, естественно, приводит к снижен выхода реакции модификации в случае м52. Дополнительным свидетельс вом является значительная модификация рРНК фотоаффинным производи м127, которая практически отсутствует в случае м52.

В пользу специфичности изучаемой нами фотоаффиной модифика] белков свидетельствует отсутствие модификации большой субча'ся рибосом обеиш матрицами во всех типах комплексов с 70s рибосома; Значительная разница в степени модификации малой субчастида рибо! двумя матрицами с разной структурой 5'-концевого района также гово] о специфичности связывания использованных нами мРНК в функционалы тройных комплексах и отсутствия неспецифического участка связыва! мРНК с малой субчастицей в области белков ез и s4. Дополнителы аргументом в пользу отсутствия такого неспецифического участка свяе вания мРНК с рибосомой слукат результаты, полученные в зксперимеш с "tight couples" рибосомами. При этом, в случае матрицы м52, у roi рой на 5'-конце располояйГкодон aug, занимающий декодирующий участ рибосомы, происходит эффективная модификация белка s7, тогда как случае м127, которая не содержит инициаторного кодона aug 5'-конце, модификации рибосом не происходит, хотя белки S3 и S4 закрываются большой субчастицей и остаются доступными для связывай мРНК и модификации ее Б'-концом. Эксперименты ш ингибированию обра ной транскрипции таете свидетельствуют об отсутствии комплекса м127 "tight couples" рибосомами. При добавлении к комплексу с "tig. couples" 70s рибосомами фактора инициации if3 образуется нормальа инициаторный комплекс, в котором в декодирующем участке рибосом pai положен инициаторный'кодон'aug (эксперименты по ингибирования обра1

ной транскрипции), при этом 5'-конец м127 модифицирует те же белки, что и в комплексе vn.

Наши данные по модификации малой субчастицы рибосом 5'-концаыл1

производным м127 в различных инициаторних комплексах позволяют

высказать ряд предположений о топография мРНК на рибосоме. Е.ига

учесть, что в малой субчастице рибосом декодирующий участок

расположен в районе 1400 нуклеотида, (т.е. гам связывается aug-ко.дон

мРНК). причем ближе к 5'-концу aug-кодона расположен белок s;, tí)

5'-конец sd-последовательности мРНК должен находится на расстоянии но о

более 14 А от белков эз и S4. Объяснить модификацию белков S3 и si, можно только если предположить, что цепь мРНК делает поворот в района aug-кодона. При этом 5'-конец мРНК может располагаться либо с тшюегй части представленной на рис.7 проекции модели малсй субчастипп рибосом Р.Бримакомба, либо с ее лицевой части (между субчастицами).

При расположении 5'-конца мРНК с лицевой части (между субчасш цами) представленной на рис.7 проекции малой суОчастицы, он может модифицировать белки sa, S4, S20, si4, находясь в дуплексе! с антя-so-noс ле дов ателъностъю 3'-конца íes рРНК.

Если предположить, что 5'-конец мРНК расположен с "тшювой' части (вне области контакта субчастиц) представленной на рис.? проекции модели малой суОчастицы рибосом, то в дуплексе с 3'-концом 16s рРНК он легко может модифицировать белки бз, si4, si3, ззо, если учесть возможность'подвижности дуплекса. Чтобы объяснить модификации S4, необходимо принять во внимание большой размер белка S4, а такье тот факт, что его форма может отличаться от сферической, приведенной на модели. Кроме того, положение белка S4 на модели может несколько отличаться, он может располагаться на малой субчастице ее центру, что не противоречит данным по фугпринтингу. С другой стороны, 5' -конец монет модифицировать s4 в том месте, где он расположи hj «одели, если предположить, что в присутствии фактора инициации iti происходит полное или частичное разрушение дуплекса sD-последователыюсги мРНК с анти-во-последоватильностьй iós рМ'.к, зри этом увеличивается дл1ша 5'-концевого участка ыРНК. Вознесен, диссоциации дуплекса соответствует кинетическим дапнн.ч. Пополнительным свидетельством в пользу расположения 5'-ьсц;:з i.:H!K а^ знешней стороне малой суОчастицы являются даишь по. юдл.^эска

Рис.7. Модель третичной структуры малой субчастицы рибосом.

▼ - белки модифицированные 5'-концом Аив-кодана из декодирующего участка малой субчастида (м52, комплекс XV)

в - белки модифицированные 5'-концом Бо-носледовательности из тройного комплекса (м127, комплекс VII)

■ - белки модифицированные 5'-концом Бо-последовэтельности из ин циаторного комплекса, собранного в присутствии фактора инициации 1Т

малой субчастицы рибосом фотоаффинным дезокси-аналого бп-последовательности, когда в основном модифицируется белок 35 антигенные детерминанты которого локализованы на внешней сторон малой субчастицы. Такое расположение 5'-концевой области мРН кажется более вероятным.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют в полы предположения, что в инициаторных комплексах с малой субчастиц рибосом 5'-конец мРНК повернут в сторону белков вз и вд и обладав значительной подвижностью.

Следует заметить, что рассмотренную здесь модель (рис.?) 11,1 1 коей мере нельзя считать окончательно доказанной, и в оудущьм она .очти наверняка подвергнется серьезным изменениям.

6. Модификация малой субчастицы рибосом мРНК, содержащей фотоаффинное тио-производное уридина.

Для более точного определения белков малой субчастицы рибосом, асположенных в непосредственной близости от эо-последовательности и иа-кодона мРНК использовали укороченные мРНК, инициаторная область оторых идентична м12?.

-4 и

ссослаосассииспаирсаасаасссаи м53

-4 +1

сссаасоассиисиа1гссаисаасссаааисасай м23

Синтез мРНК проводили с помощью Т7-РНК-полимеразы с ссотьетсьу-цих ДНК в присутствии стандартного праймера в системе Уленбека. Фс-эаффшшую метку вводили в процессе транскрипции мРНК с использсса-аем Б4-итр. В качества источника радиоактивности использовали -(32р]итр, В результате получал! мРНК, содержащие вместо и в своей эследовательности либо радиоактивный и, либо э4-и. Включение тиоу-адина не превышало 20-30%, т.е. каждая мРНК содержала 1-2 модифи-фованных основания,

Очищенные электрофорезом в ПААГ мРНК вводили в комплекс с мало;: /бчастицей рибосом и инициаторной тРНК как описано выше. Посль шстки комплексов гель-фильтрацией через биогель Р 200 их облучали 1гким УФ-светом с х > 300 нм в течение 15 мин, после чего проездиил шделение модифицированных РНК и белков центрифугированием ь задиенте концентрации сахарозы в буфере, содержащем ДСН и ЭДГА, а ;ловиях полного разрушения нековалентных РНК-бедкоЕых комплексен, ¡акцию белков очщалн от избытка неиришитой мР1Ш и подьергалн ютичному разделению электрофорезом в 10% ПААГ в присутствии ДСП и Левины. Белки, ковалентно сшитые с мРНК, элюировали из геля и ;ентифицировали по их способности взаимодействовать с Ен-лм-влагл ютив индивидуальных рибосомнкх белков. В случае о о с ¡о; цРНН.

CFH J 500

1000

500

--l_

12 3

JL

I .. I .

S 7 6 8 9 11 12 13 14 10 15 16 17 18 19 20 21

Пю.8. Идентификация белков, модифицированных м23, с помощью реакции с антителами против индивидуальных рибосомных белков.

основными белками, сшивающимися с мРНК, являлись s7, sie, s2i, а также si в случае м23 (рис.8).

Для анализа места пришивки мРНК к белкам индивидуальные белки с прилитой мРНК выделял! с помощью антител против рибосомных белков, связанных с вгарозой, после чего освобождали мРНК путем гидролиза белка с помощью протеиназы К, мРНК подвергали исчерпывающему гидролизу РНКазой TI, полученные олигонуклеотиды анализировали двумерной хроматографией на рех-целлюлозе. Исчезновение одного из пятен на друмерной хроматограмме соответствует наличию сшивки этого олигонук-д'':0тидэ с белком.

Результаты анализа показывают, что белки S7, sis, S21 сшиваются с 5'~ко1шввой частью MP1IK (в случае обеих мРНК). Белок S7 специфичес-кл сшивается сив положении -3 и -4, причем в основном -3 (исчезно-íviiíue uug пятна на хроматограмме и сохранение g пятна, рис. 9). Сщив-мРНК с sie и 521 менее специфична, она образована всеми и л не сбиваются (умепывеше интенсивности с, uug и uaug пятен на

O

CAI)

HADO

0

¡.9. P9fli!c>aBT0fpa$ /iByMapHoft xix)f.faTorpaM!.',n nociie uc m i«)»» v.: (pomsa TI m53 b cboOoíhdm cocTosraim (A) it noojre cincjfh up«n iejncy s; c nounni-n gura-s? annixe^ (B).

G

O

UUÜ

n 'o

IM(№

A A A (.'<!

O

' O

^ 1 A tí

IÍUG ti AUCi

L,

6

A

JO, PaJwoaBToipaí) jroywapHoH xpoM3Torr»*«t nocí? wr№i:-< TOJtHsa TI 1.123 b cboíohrom cociomno» (A) n ñor;« owfn-w : -JIKy 8J1 C nONCÍIH? ¡?hth-s2l ntlTHTS.l (F).

5'-концевой области. Остатки и, расположенные за aug-кодоном с этш хроматограмме, рис.Ю). Модификация si с помощью м23, го-видимом; неспецифична.

Эти данные хорошо согласуются с приведенными выше результатам!

по модификации рибосом фотоаффинным производным м52 в комплексе <

"tight couples» рибосомами, когда в основном модифицировался бело!

« о

s7, причем размер реагента (14 А) соответствует расстоянию о'

+1 в AUG-кодоне до положения -3, -4 в мРНК.

Модификация s21 и sie м23 и м53 также хорошо согласуется с данными по модификации рибосом 5'-концевыми фотоафинными производным m52 и mï27.

Таким образом,, белок s? расположен в районе декодирующего участка рибосомы в непосредственной близости от нуклеотвдов -з, -4 ] последовательности мРНК в тройном инивдэторном комплексе, белки su и S21, по-видимому, взаимодействуют с 5'-концевой областью мРНК неспецифически.

ВЫВОДЫ

1. В клетках е.coli, трансформированных плазмидами со встроенным] 5'-концевыми фрагментами гена его бактериофага х, синтезируются i накапливаются активные в процессе трансляции мини-мРНК, которые можно выделить в количествах, достаточных для получения их фотоактиви-руемых производных.

2. Методом фотоаффинной модификации показано, что мРНК-связывавдй участок с 5'-стороны от инициаторного кодона расположен на мало! субчастице рибосом и его размеры не превышают 19 нуклеотидньс остатков.

3. С 5'-стороны AUG-кодона мРНК в декодирующем Р-участке малой суб-частивд рибосом находится белок S7, в непосредственной близости о! нуклеотидов -3 и -4 в последовательности мРНК в тройном инициаторно! комплексе. -

4. Белки sie и S2i взаимодействуют неспецифически с инициаторно] областью мРНК в тройном инициа торном комплексе.

5. Положение 5'-конца последовательности Шайн-Дальгарно мРЫ отличается в бинарном комплексе (в отсутствии инициаторной тРНК) и тройном инвдиаторном ко(щлексе малой .субчастицей рибосом с мРНК

яициаторной тРНК.

i. Положение 5'-конца последовательности Шайна-Дальгарно мРНК в ройном инициаторном комплексе зависит от присутствия фактора лициации IF3: в отсутствии фактора он сближен с белками S19/20/21 и з, а в присутствии фактора - с белками S4 и S13/14.

Список работ, опубликованных по теме диссертации. I. Копылов A.M., Скрипкш Е.А., Богданова С.Л., Донцова 0.А., огдаяов А. А. Экспрессия коротких РНК с плазмид в . coi i. //Всесоюзный. бгохишческий съезд. Тезисы стендовых ообщений. Москва.- 1986.-Т.2,-С.432-433

2. Скршпшн Е.А., Балакин А.Г., Донцова О.А., Богданова С.Л., опылов A.M.» Шатский И.Н., Богданов А.А. Подхода к дизайну мРНК// сесоюзная конф. "Новые направления в биотехнологии". -1988. Пущино. - Тезиса. - С.105-106.

3. Донцова 0.А., Копылов A.M., Богданова С.Л. Синтез в клетках .ecii коротких РНК, закодированных в плазмидах.//Биохимия.- 1989.-.54, № 4,- €.870-877.

4. Kopylov А.И., Dontsova О.A., Rosen K.V., Bogdanova S.L., cripkin E.A., Skrjabin G.A., Balakin A.G., Evstafieva A.G., Shatsky .N., Bogdanov A.A. Efficiency of translational initiation of proca-Lotic mRNA // 3rd Cuban and International Seminar on Interferon, id Cuban and Intern. Seninar on Biotechnology, 1st Iberoamerican mgress on Biotechnology. - 1989. - Habana, Cuba. - P.7-10.

5. Skripkin E.A., Dontsova 6.A., Rosen K.V., Bogdanova S.L., jpylov A.M., Bogdanov A.A. Upon location of mRNA initiation signals 1 procarioti© ribosomes.//EMBO/FEBS/IUB Advanced course "Mechanism id control of translation" the Netherlands.-1990. -P. 62.

6. Донцоьа O.A., Богданова с.JI., Розен К.В., Скрябин Г.А., :ришсин Е.А., Копылов АЛ!., Богданов А.А. Фото аффинная модификация лой субчастицы рибосом E.coii диазирильшага производными НК.//Д0КЛ. АН СССР,- 1990.-Т.313, N3.- С.730-733.

7. Донцова О.А., Розен- К.В., Скршкнн Е.А., Копылов А.И. дификация рибосом E.coii фото аффинными производными MPHK.//IV есоюзная школа-семинар молодых ученых "Перспективные направления и вые методы в молекулярной биологии".- 1990.- Рига,- Тезисы.- С.29.