Структурно-функциональная топография рибосом человека по данным аффинной модификации реакционноспособными производными олигорибонуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Зб

На правах рукописи

ГРАЙФЕР ДМИТРИЙ МАРАТОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТОПОГРАФИЯ РИБОСОМ ЧЕЛОВЕКА ПО ДАННЫМ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОРИБОНУКЛЕОТИДОВ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Новосибирск - 2008

003458559

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Карпова Галина Георгиевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, член-корреспондент РАН,

профессор Габибов Александр Габибович

доктор биологических наук, профессор Локтев Валерий Борисович

доктор биологических наук Бунева Валентина Николаевна

Ведущая организация: Московский государственный университет

имени М.В.Ломоносова, химический факультет

Защита состоится « 26 » декабря 2008 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « $/_» ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного со кандидат химических наук, доцент

Коваль В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В клетках всех организмов - от бактерий до человека -реализация генетической информации происходит на рибосомах, где последовательности тринуклеотидов-кодонов мРНК, скопированные с ДНК, транслируются в аминокислотные последовательности синтезируемых белков. Рибосома - это уникальный рибонуклеопротеид, обладающий сложнейшей четвертичной структурой и состоящий из большой и малой субчастиц, каждая из которых содержит рРНК и несколько десятков белков. Синтез белков на рибосомах является одним из ключевых процессов жизнедеятельности организмов, поэтому установление молекулярных механизмов, лежащих в его основе, и строения функциональных центров рибосомы является одной из важнейших проблем молекулярной биологии. Эта проблема особенно актуальна в случае рибосом млекопитающих, в частности, человека, поскольку природа многих болезней связана с нарушениями в механизмах регуляции функционирования белок-синтезирующей системы. Знание особенностей устройства функциональных центров эукариотической рибосомы является принципиально важным для понимания не только молекулярных механизмов трансляции у эукариот, но и природы тех регуляторных процессов, которые обеспечивают эффективность и точность белкового синтеза.

Рибосомы прокариот к настоящему времени детально изучены с применением различных методов, но наиболее впечатляющие успехи в расшифровке структуры рибосомы достигнуты на рубеже XX и XXI столетий благодаря рентгеноструктурному анализу (РСА), который позволил установить с высоким разрешением строение рибосом и выйти на новый уровень биохимических исследований, касающихся изучения молекулярных аспектов функционирования рибосомы. Однако метод РСА до сих пор неприменим для изучения эукариотических рибосом, поскольку кристаллы рибосом, пригодные для такого анализа, пока не получены. Метод крио-электронной микроскопии, интенсивно используемый для изучения эукариотических рибосом в последнее время, пока остается непригодным для определения структуры одного из важнейших функциональных центров рибосомы - мРНК-связывающего центра, поскольку разрешение, которое удается получить на эукариотических рибосомах, не позволяет "видеть" кодоны мРНК. Кроме того, с помощью этого метода не могут быть картированы рибосомные белки, не имеющие прокариотических гомологов. Наконец, методы, основанные на реконструкции рибосомных субчастиц из белков и рРНК (например, сайт-направленный мутагенез рРНК и сайт-направленное введение сшивающих групп в рРНК или белки), неприменимы для исследования рибосом высших эукариот, потому что до сих пор не найдено подходов к сборке активных субчастиц рибосом эукариот in vitro. Представлялось перспективным использовать для изучения мРНК-связывающего центра рибосом человека один из известных методов биоорганической химии - метод аффинной модификации (аффинного химического сшивания), который оказался очень продуктивным для изучения структурно-функциональной топографии прокариотических рибосом (Карпова, Кнорре, 1991; Сергиев и др., 2001) и остается на сегодняшний день одним из наиболее приемлемых методов, способных давать детальную информацию о молекулярном окружении мРНК на эукариотической рибосоме.

Цель и задачи работы. Основной целью настоящей работы являлось установление структурной организации мРНК-связывающего центра рибосомы человека, а именно,

выявление нуклеотидов рРНК и рибосомных белков, принимающих участие в формировании этого центра, с помощью аффинной модификации рибосом реакционноспособными аналогами мРНК. В качестве таких аналогов использован набор производных олигорибонуклеотидов, различающихся длиной, последовательностью и типом сшивающей группы, а также положением и природой нуклеотида, несущего эту группу. Одно из таких производных применено в качестве зонда для изучения структурно-функциональной топографии уникальной для рибосом эукариот 5.8S рРНК. В ходе исследования решались следующие задачи:

• разработать методологию получения модельных комплексов аналогов мРНК с рибосомами, в которых расположение аналога мРНК можно было бы задавать с помощью тРНК, узнающей определенный кодон мРНК в отсутствие факторов трансляции;

• изучить фотоаффинную модификацию 80S рибосом человека аналогами мРНК длиной около 50 нт, несущими остатки 4-тиоуридина, и определить нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с этими аналогами;

• изучить аффинную модификацию 80S рибосом производными олигорибонуклеотидов, несущими алкилирующую или п-азидотетрафторбензоильную группу, в составе комплексов, различающихся расположением модифицированного нуклеотида аналога мРНК относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке;

• определить нуклеотиды рРНК и рибосомные белки, сшивающиеся с указанными аналогами мРНК, и тем самым получить информацию о структурных элементах 80S рибосомы, соседствующих с мРНК в области кодон-антикодоновых взаимодействий и в районах, прилегающих к кодонам в Е и А-участках;

• на основании полученных результатов охарактеризовать основные черты структурной организации мРНК-связывающего центра рибосомы человека и, сопоставив эти результаты с данными по структурно-функциональной топографии прокариотической рибосомы, выявить элементы сходства и различия в структурной организации этого центра у прокариот и млекопитающих;

• показать возможность использования реакционноспособных производных олигорибонуклеотидов в качестве зондов для изучения доступности и молекулярного окружения определенных последовательностей в рРНК на разных стадиях процесса трансляции.

Научная новизна и практическая значимость работы. Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование структурно-функциональной топографии рибосомы человека. В ней использован уникальный набор производных олигорибонуклеотидов, несущих сшивающую группу на определенном нуклеотидном остатке, в качестве аналогов мРНК и зондов для изучения топографии функционально значимых участков рРНК в рибосоме. Продемонстрирована результативность метода аффинной модификации применительно к рибосомам млекопитающих. Впервые получена информация о молекулярном окружении мРНК на 80S рибосоме на уровне нуклеотидов рРНК и рибосомных белков, а в случае одного из ключевых белков декодирующего центра, S15, - на уровне олигопептидной последовательности. Выявлены общие черты в структурной организации мРНК-связывающего центра рибосом всех организмов и характерные особенности устройства этого центра в

рибосоме млекопитающих. Показано, что нуклеотиды рРНК малых субчастиц, соседствующие с мРНК, составляют консервативный "кор" (сердцевину) рибосомы, структурно идентичную в рибосомах всех организмов. Установлено, что у млекопитающих белки играют большую роль в организации мРНК-связывающего центра рибосом, чем у прокариот, и обнаружены значительные различия в белковом окружении мРНК на рибосомах про- и эукариот. Эти различия касаются в основном окружения кодона в декодирующем центре и части мРНК с 5'-стороны от него, тогда как белковое окружение мРНК с З'-стороны от этого кодона сходно в рибосомах всех царств. Получены данные о расположении центральной части 5.8S рРНК в 60S субчастице рибосомы и степени ее экспонированности на разных стадиях трансляции, позволившие понять, каким образом эта уникальная для эукариот рРНК может участвовать в процессе трансляции.

Результаты работы имеют фундаментальное значение для понимания принципов структурно-функциональной организации эукариотических рибосом, механизмов их функционирования и молекулярных основ взаимодействий, обеспечивающих регуляцию трансляции у высших организмов, и могут быть использованы для решения прикладных задач, связанных с созданием антибактериальных агентов, минимально затрагивающих белок-синтезирующую систему человека.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертационной работы опубликованы в 32 статьях (включая 2 обзора) и представлены на следующих международных и российских конференциях: Второй съезд биохимического общества Российской академии наук (Москва, июнь 1997), Конференция, посвященная 30-летию журнала «Молекулярная биология» (Москва, ноябрь 1997 г.), 25lh Silver Jubilee FEBS Meeting (Copenhagen, Denmark, July 1998), «RNA'99. The Fourth Annual Meeting of the RNA Society (Edinburgh, UK, June 1999), Конференция, посвященная памяти З.А.Шабаровой (Москва, ноябрь 2000 г), «Protein Synthesis. International Conférence in Honour of Alexander Spirin» (Пущино, август 2001), International Conférence "RNA as Therapeutic and Genomic Target" (Новосибирск, август 2001), III Съезд Биохимического общества (Санкт-Петербург, июль 2002), "Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference" (Новосибирск, июнь 2003), "Chemical & Biological problems of proteomics" (Новосибирск, июль 2004), International Conférence on Chemical Biology (Новосибирск, июль 2005), International workshop "Biosphere Origin and Evolution" (Новосибирск, июнь 2005), Конференция по физико-химической биологии, посвященная 80-летию со дня рождения академика Д.Г.Кнорре (Новосибирск, 30 июля - 4 августа 2006), 8th International Engelhardt Conférence on RNA-protein interactions (Московская обл., август 2006), Российско-французский симпозиум по супрамолекулярной химии в рамках XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (Москва, сентябрь 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, май 2008 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 279 стр. машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (223 ссылки) и содержит 74 рисунка и 31 таблицу.

Работа выполнена в период с 1990 по 2007 год. На разных этапах в ней принимали участие сотрудники и аспиранты Лаборатории структуры и функции рибосом НИБХ СО РАН (с 2003 г. ИХБФМ СО РАН) - М.А. Зенкова, А.А. Малыгин, К.Н. Булыгин, Н.А. Демешкина и М.В. Молотков, а также д-р П. Воллензиен (США), д-р И. Шталь

(Германия) и работавшие под руководством автора студенты НГУ. Автор приносит им искреннюю благодарность. Личный вклад автора заключался в непосредственном участии на всех этапах исследования - от постановки задач и проведения экспериментов до обсуждения полученных результатов и их обобщения (кроме синтеза олигорибонуклеотидов и их производных с реакционноспособной группой на остатках уридина, полученных в лаборатории химии РНК ИХБФМ СО РАН под руководством к.х.н. А.Г. Веньяминовой, которой автор также очень благодарен).

Особую признательность автор выражает д.х.н. профессору Г.Г. Карповой, которая была инициатором работы и уделяла ей первоочередное внимание на всех стадиях - от постановки задач до представления результатов в виде статей, тезисов докладов и настоящей диссертации. Автор также очень признателен академику Д.Г. Кнорре за постоянную поддержку и интерес к данной работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследования мРНК-связывающего центра рибосомы Е. coli с помощью аффинной модификации реакционноспособными производными олигорибонуклеотидов показали, что результаты модификации зависят как от типа комплекса (т.е. от расположения аналога мРНК на рибосоме и ее функционального состояния), так и от природы сшивающей группы. Поэтому в настоящей работе для получения полной и достоверной информации о строении мРНК-связывающего канала рибосомы человека использован широкий набор аналогов мРНК с различными типами сшивающих (алкилирующих или фотоактивируемых) групп. Фотоактивируемое производное одного из олигорибонуклеотидов использовано также как зонд для изучения топографии 5.8S рРНК в рибосоме.

1. Методология аффинной модификации 80S рибосом

Для изучения мРНК-связывающего центра рибосом человека использованы производные олигорибонуклеотидов длиной от 6 до 12 нуклеотидных остатков, несущие алкилирующие или фотоактивируемые группы (рис. 1) и синтетические мРНК длиной около 50 нуклеотидов с остатками 4-тиоуридина (s4U) (табл. 1).

RCI, 10 А _11_А_

С1СН2СН^_

_CH2N - |j> - 5'-Олигонуклеотид J—^

СН, «—« СН3 ¿- Nf\ /~СО-Ш-СН2-СН-Ж-р-5'-Олигонуклеотид RCI.11Ä_

АТВ (R"N3)

Олигонуя1вотид^~^СН—^ * 11 А

г о

F F

íx>

Р—р НМ' yNH-CH.-CH.-NH-S-Q.N,

X. JJ F F

О N

^ е е

HN

H.N—n'^N' ATB(R"N3)

Олигонуклеотид ^ ^

Олигонуклеотид

Рис. 1. Типы производных олигорибонуклеотидов с алкилирующей группой на 5'-фосфате (в) или на З'-концевой рибозе (б) и с фотоактивируемой группой на 5'-фосфате (в), атоме С5 остатка урацила (г), или атоме N7 остатка гуанина (<3), использованных в настоящей работе.

Алкилирующие производные олигорибонуклеотидов и 54и-содержащие аналоги мРНК применяли ранее в опытах по сшивкам с 70S рибосомами Е coli; АТВ-производные использованы для аффинной модификации рибосом впервые. Для введения АТВ группы в различные положения олигорибонуклеотида к выбранному нуклеотиду присоединяли спейсер с алифатической аминогруппой, по которой затем путем ее бензоилирования N-гидроксисукцинимидным эфиром и-азидотетрафторбензойной кислоты селективно вводили АТВ группу. В случае 5'-фосфата (рис.1, в) проводили конденсацию олигорибонуклеотида с этилендиамином или пропилендиамином в присутствии трифенилфосфина и дипиридилдисульфида. Для присоединения спейсера к остатку гуанина (рис.1, д) олигорибонуклеотид с единственным остатком G алкилировали 4-[(К-2-хлорэтил-1Ч-метиламино)]бензиламином, при этом происходило присоединение группировки, содержащей алифатическую аминогруппу, селективно по атому N7 остатка гуанина. Производные, несущие АТВ-группу на остатке уридина (рис. 1, г), получены с помощью подхода, основанного на использовании 5-бромуридина вместо уридина при химическом синтезе олигорибонуклеотида на той стадии, где происходит включение соответствующего остатка в олигонуклеотидную цепь; по окончании синтеза атом брома замещали на остаток этилендиамина (Репкова и соавт., 1999). Синтетические мРНК с остатками s4U были получены с помощью Т7-транскрипции.

Таблица 1. Нуклеогидные последовательности синтетических мРНК, содержащих s4U, использованных для аффинной модификации рибосом человека. Отмечены тринуклеотиды-кодоны, направлявшиеся в Р-участок, а также остатки U, замещенные на s^U, и их положение на рибосоме при связывании отмеченного кодона (в случае двух отмеченных кодонов, первого из них) в Р-участке.

Обозначение** Последовательность

мРНК 8' 1-20.......->-26 5 GGCAGAGCGGCACAGGAGCGCAAC GGGAC'CGCACAGCCGAGAGUCUGUCI^ Gly Tili

мРНК 9е' -20... -16 5 &GCACACrAVcrGCACAGGAGCGCAACGGGAC'C'GCACAGCCGAGAGCCAGACGA.V Glv Till

мРНК 10 -3 -1 +4+6 5 GGCAGA&C&GCACA&GAGCGC l"Al*GGGl-*GrGCACAGCCGAGAGCCAGACGA3 Glv

мРНК Юс -3 -1 5 ÜGCAGAGCGGCACAGGAGCGCl'ArGGGACCüCACAGCCGAGAGCCAGACGA3 Glv Thr

мРНК 10Ь +6 5 GGCAGAGCGGCACAGGAGCGCCACGGGUGI'GCACAGC CGAGAGC СAGACGA3 Glv

мРНК 1с* 5 GGGAAAGCUCl"CACGCCi."CCI"Cl.'AI"GGVCt4XI'ACl*AGCCUCCT 1 GAl"C'CAGGGAI"C3 Plie

мРНК 7* 5 GGGAA.\GCfCAGrGGl CGfAGI CGAt GrGGI'AGIT'GCCGt CGtX l GAl CCAGGAt C3' Trp

""Остатки и были замещены на 54и не полностью, а статистически. Содержание ь4и составляло от 3,5 до 7 моль на моль мРНК,

"Сохранены обозначения, использованные ранее для этих же аналогов мРНК в работе (ВИаг^и & \Vollenzien, 1992).

1.1. Модельные комплексы рибосом с аналогами мРНК

Сшивки аналогов мРНК с рибосомами изучали в модельных комплексах, полученных при 20°С неэнзиматически, т.е. без участия факторов трансляции в буфере с 13 мМ Mg2t (в отдельных экспериментах - в буфере с 4 мМ Mg2+, содержащем спермин и спермидин). Для проверки функциональной корректности комплексов рибосом использовали поли(Ц) или (pU)6 в качестве аналогов мРНК и TPHKphe человека или Е. coli в форме [14C]Phe-TPHKphe или N-Ac[14C]Phe-TPHKphe, а также деацилированную [5'-32Р]тРНКРЬе дрожжей. При низких концентрациях N-Ac[14C]Phe-TPHKphe, когда степень ее связывания была менее 1 моль тРНК на моль активных рибосом, более 80% связанных с рибосомой остатков N-Ac[14C]Phe было способно реагировать с пуромицином в случае тРНК человека или Е. coli, что свидетельствовало о связывании в Р-участке. Связывание РЬе-тРНК е и N-AcPhe-TPHKphe с 80S рибосомами практически полностью зависело от присутствия матрицы, при этом активные рибосомы связывали до двух молекул тРНК (одну в А-, а другую - в Р-участке). Сопоставление уровней связывания Phe-TPHKphe и синтеза (Phe)2 позволило заключить, что большая часть РЬе-тРНКРНс, связанной с 80S рибосомами, способна участвовать в транспептидации. Таким образом, образующиеся комплексы были функционально корректными. Количественные и качественные характеристики связывания тРНКРЬе человека и Е. coli с 80S рибосомами человека оказались почти одинаковыми, поэтому для получения модельных комплексов 80S рибосом человека с аналогами мРНК и тРНК, узнающими определенные кодоны в этих аналогах, использовали намного более доступные индивидуальные тРНК Е. coli.

Связывание коротких аналогов мРНК - олигоуридилатов длиной от 6 до 13 звеньев с 80S рибосомами практически полностью зависело от присутствия тРНКр|1е; при насыщающей концентрации TPHKphe рибосома могла связывать не более одной молекулы аналога мРНК (рис. 2), а сродство олигоуридилатов к рибосоме возрастало с увеличением их длины. Триуридилат, содержащий единственный кодон UUU, также мог связываться с 80S рибосомами в присутствии тРНКр|к. Однако для достижения уровня его связывания,

близкого к 1 молю на моль рибосом, требовались высокие концентрации аналога мРНК и тРНК. Связывание олигоуридилатов с 80S рибосомами мало зависело от того, была ли аминоацилирована тРНКРЬе.

Рис. 2. Связывание [5'-32P](pU)„ с 80S рибосомами. Реакционные смеси содержали в 20 мкл буфера 3 пмоль рибосом, 20 пмоль Phe- тРНКр|* и меченый аналог мРНК. Светлые значки - связывание в отсутствие тРНК. v, степень связывания (моль/моль 80S рибосом, активных в связывании РЬе-тРНК)

Таким образом, в отсутствие факторов трансляции можно получать комплексы, в которых (pU)n фиксирован на рибосоме кодон-антикодоновым взаимодействием либо в Р-участке (при п<6), либо одновременно в А- и Р-участках. Очевидно, что однозначная фиксация данных аналогов мРНК на 80S рибосомах происходит только при п = 3 или 6. При п = 3 кодон UUU и молекула тРНКРЬе располагаются в Р-участке, а при п = 6 — как в Р, так и в A-участке. В случае других олигоуридилатов может происходить неоднозначная посадка в участке декодирования, в результате чего получается гетерогенная смесь комплексов. Поскольку тРНК связывается в первую очередь в Р-участке, для получения комплексов с однозначным расположением аналогов мРНК в

настоящей работе использовали олигорибонуклеотиды, несущие разные кодоны, что позволяло фазировать их на 80S рибосоме с помощью тРНК, узнающей единственный кодон, направляемый в Р-участок.

Введение рсакционноспособной группы в олигорибонуклеотид в большинстве случаев не приводило к существенному изменению его сродства к рибосомам, а кривые связывания гетерогенных олигорибонуклеотидов, содержащих кодон Phe, были очень схожи с кривыми связывания олигоуридилатов соответствующей длины (рис. 2). Исключением являлись лишь производные с модифицированными остатками U во втором или третьем положении кодона UUU, направляемого в Р-участок (эти производные связывались с 80S рибосомами гораздо хуже, чем соответствующие немодифицированные олигорибонуклеотиды).

Таким образом, реакционноспособные производные олигорибонуклеотидов, использованные в настоящей работе, в целом удовлетворяли общепринятым требованиям к аффинным реагентам для получения адекватной информации о молекулярном окружении мРНК на рибосоме. Типы модельных комплексов с аналогами мРНК приведены на рис. 3. Во всех случаях контролем служили бинарные комплексы аналогов мРНК с 80S рибосомами.

а б

Рис. 3. Примеры комплексов 80S рибосом с производными олигорибонуклеотидов, состоящими из двух различных кодонов Выделены нуклеотидные остатки, несущие сшивающую группу, указаны положения модифицированных нуклеотидов относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке. А, Р, Е - участки связывания тРНК.

1.2. Аффинная модификация рибосом н анализ модификации рнбосомных субчастиц

Для аффинной модификации использовали аналоги мРНК, меченные 32Р по 5'- или, реже, по З'-концу. Для сшивки рибосом с алкилирующими аналогами мРНК соответствующие комплексы выдерживали при 20-25°С в течение времени, соответствующего 3-5 периодам

полупревращения алкилирующей группы в

активный интермедиат — этилениммониевый катнон. В случае фотоактивируемых аналогов мРНК соответствующие комплексы облучали мягким УФ-светом (Х>290 нм в случае АТВ-производных или в интервале от 320<Х<365 нм в случае з4и-содержащих мРНК).

Распределение сшивки между рибосомными субчастицами анализировали центрифугированием в градиенте плотности сахарозы в условиях диссоциации 80S рибосом на субчастицы (3 мМ Mg2+, 300-500 мМ КС1 в отсутствие полиаминов). Для анализа распределения сшивки между 18S рРНК и белками модифицированные субчастицы денатурировали с помощью SDS и ЭДТА, после чего рРНК и белки разделяли либо центрифугированием в градиенте плотности сахарозы, либо одномерным гель-электрофорезом в присутствии SDS.

1.3. Определение участков сшивки аналогов мРНК с 18S рРНК

В первых работах (с алкилирующими производными олигоуридилатов) участки 18S рРНК, содержащие сшитый меченый аналог мРНК, определяли с помощью блот-гибридизации модифицированной 18S рРНК с фрагментами рестрикции соответствующей рДНК, иммобилизованными на капроновой мембране. В последующих работах модифицированную рРНК гидролизовали рибонуклеазой H в присутствии дезоксирибоолигонуклеотидов, комплементарных различным последовательностям 18S рРНК (кДНК), продукты гидролиза разделяли электрофоретически с последующим окрашиванием и радиоавтографированием гелей. Сопоставление результатов, полученных с помощью различных кДНК, позволяло определить фрагмент длиной несколько десятков нуклеотидов, содержащий участок сшивки с аналогом мРНК.

Нуклеотиды 18S рРНК, с которыми сшивались аналоги мРНК, определяли с помощью обратной транскрипции, используя модифицированную 18S рРНК в качестве матрицы. Праймеры выбирали с учетом данных по определению районов 18S рРНК, содержащих участки сшивки. Поскольку удлинение меченого праймера на рРНК как на матрице прерывается/замедляется при достижении растущей цепью ДНК модифицированного нуклеотида рРНК, сшитым считали обычно нуклеотид рРНК, расположенный с 5'-стороны после основания, на котором произошла остановка обратной транскрипции.

1.4. Определение рибосомных белков, сшивающихся с аналогами мРНК

Белки, сшитые с мечеными аналогами мРНК, разделяли с помощью одномерного гель-электрофореза в присутствии SDS и двумерного электрофореза в различных системах, для которых известно положение пятен рибосомных белков млекопитающих на электрофореграммах. В большинстве случаев для двумерного разделения использовали систему I, в которой в первом направлении разделение происходит при рН 8.3, а во втором - при рН 6.75 в присутствии SDS. В тех случаях, когда разделение в этой системе не позволяло определить модифицированные белки, проводили дополнительный анализ в системе II (разделение в первом направлении при рН 8.3, а во втором - при рН 4.0) или в системе в системе III (разделение первом направлении - рН 5.5, во втором - рН 4.5). Для идентификации модифицированных белков радиоавтограф накладывали на соответствующий окрашенный гель и определяли положения радиоактивных полос или пятен относительно полос или пятен, соответствующих немодифицированным белкам. При сопоставлении радиоавтографов и окрашенных гелей принимали во внимание, что остаток аналога мРНК, сшитый с белком, меняет его электрофоретическую подвижность. Если гидролиз сшитого аналога мРНК не приводил к потере метки 32Р в модифицированном белке, его гидролизовали РНКазой А для уменьшения его влияния на электрофоретическую подвижность белка. В отдельных случаях идентификацию подтверждали с помощью иммуноблотинга или иммунопреципитации с использованием специфических антител против определенных рибосомных белков человека или крысы.

1.5. Определение фрагментов рибосомного белка, сшитых с аналогами мРНК

Для определения участков рибосомного белка S15, содержащих сшитый меченый аналог мРНК, использован подход, основанный на специфическом расщеплении полипептидной цепи белка по определенным аминокислотным остаткам с последующим разделением образовавшихся продуктов гель-электрофорезом. В качестве протеолитических агентов использовали бромциан, расщепляющий полипептидную цепь после остатков метионина, и гидроксиламин, гидролизующий пептидную связь между остатками Asn и Gly. Модифицированные олигопептиды

определяли, сравнивая молекулярные массы фрагментов, несущих сшитый остаток меченого аналога мРНК, с величинами, рассчитанными для всех фрагментов, которые могли образоваться при расщеплении белка данным протеолитическим агентом.

2. Аффинная модификация 80S рибосом алкилиругощими производными олигорибонуклеотидов

Для определения рибосомных белков и нуклеотидов рРНК, соседствующих с мРНК в рибосоме человека, использовали олигоуридилаты разной длины, несущие алкилирующую группу на 5'- или З'-конце, ClRp(U)n (п=3, 4, 6 или 12) и (Up)„C-R'Cl (п =

3, 6 или 12), а также CIRpGUGUUU (рис. 1, а, б). В присутствии тРНКр,1е степень связывания аналогов мРНК составляла около 0.7 моль на моль 80S рибосом (примерно 1 моль аналога мРНК на моль активных рибосом).

2.1. Аффинная модификация 80S рибосом производными (pU)„

Модификации во всех случаях подвергались практически только 40S субчастицы; сшивки происходили в составе соответствующих специфических комплексов, поскольку их практически не наблюдали в отсутствие тРНК и в комплексах, полученных в присутствии избытка соответствующего ^модифицированного олигоуридилата (табл. 2). В случае 5'-алкилирующих производных доля модификации 18S рРНК резко снижалась с увеличением длины олигоуридилатной части реагента и, соответственно, увеличивалась доля модификации белков 40S субчастицы (табл. 3). Основной «скачок» в изменении окружения 5'-конца аналога мРНК происходил при переходе от производных тетра- к производным гексауридилата, т.е., при изменении типа комплекса аналога мРНК с 80S рибосомами (см. раздел 1.1). Это указывало на изменения в окружении 5 '-концевого нуклеотида кодона, связанного в Р-участке, индуцируемые кодоном в A-участке, что неудивительно, поскольку известно, что в прокариотических рибосомах соседние кодоны мРНК в А и Р-участках образуют угол. В случае (Up)nC-R'Cl распределение сшивки между 18S рРНК и белками мало зависело от п, и во всех случаях на долю рРНК приходилось 60-70% сшитого аналога мРНК.

Эксперименты по блот-гибридизации показали, что участки сшивки 5'-производных три- и тетрауридилатов локализованы во фрагментах 975-1061 и 1058-1172, гексауридилата - во фрагменте 975-1061, а производного додекауридилата - в трех фрагментах 975-1172, 593-674 и 1748-1869. Большее число фрагментов рРНК, модифицированных производным (pU)12, по-видимому, связано с его неоднозначной посадкой на рибосоме. Для всех З'-алкилирующих аналогов мРНК получены практически одинаковые результаты - сшивки во фрагментах 1610-1748 и 1749-1869.

Из данных, приведенных на рис. 4, можно заключить, что 5'-производные олиго(и) сшивались с нуклеотидами U1022, U1025, С1057 и А1058, а З'-производные - с G1702. Однако ароматические иприты, использованные в настоящей работе, неспособны алкилировать остатки уридина при значениях рН, близких к нейтральным (Ross, 1962). Поэтому можно предположить, что остановки на А1023 и С1026 вызваны не сшивками с U1022 и U1025, а расщеплением рРНК по А1023 и С1026 вследствие алкилирования межнуклеотидных фосфатов с образованием лабильных фосфотриэфиров (см. Карпова и соавт., 1981). Большее число точек модификации 18S рРНК 5'-производными (pU)n (п = 3 или 4) по сравнению с производным (pU)6, возможно, связано с большей подвижностью 5'-концевого фосфата в случае производных, фиксированных на рибосоме кодон-антикодоновым взаимодействием только в Р-участке.

Таблица 2. Аффинная модификация 80S рибосом алкилирующими производными олиго(и). Ошибка эксперимента составляла примерно 10%; концентрации ингибитора (pU)n были на порядок выше концентраций соответствующих алкилирующих производных.

Аналог мРНК тРНК1 ?hc (pU)„ Степень сшивки, моль остатков реагента/ моль 40S

ClR[32P](pU)3 + 0.36

ClR[32P](pU)3 - 0.01

ClR[32P](pU)3 + 0.02

ClR[32P](pU)4 + 0.29

ClRr32Pl(pU)4 + 0.01

ClR[32P](pU)4 - 0.01

ClR[32P](pU)6 + 0.24

ClR[32P](pU)& - 0.02

ClR[32P](pU)6 + + 0.05

ClR[32P](pU)i2 + 0.28

ClR[32P](pU)i2 - 0.04

ClR[32P](pU)]2 4- 0.06

(Up)2U[32P]pC-R'Cl + 0.28

(Up)5U[12P]pC-R'Cl + 0.36

(Up)5U[32P]pC-R'Cl - 0.05

(Up)5U[32P]pC-R'Cl + + 0.03

(Up)nU[32P]pC-R'Cl + 0.60

Таблица 3. Распределение сшивки 5'-алкилирующих производных олигоуридилатов между 18S рРНК и белками в 40S субчастицах. Ошибка эксперимента составляла примерно 10%.

Аналог мРНК Распределение сшивки между рРНК и белками, % рРНК белки

ClR[32P](pU)3 96 4

ClR[32P](pU)4 93 7

ClR[32P](pU)6 24 76

ClR[12P](pU)i2 4 96

а

U G С А 3 4 6 к

— ш I •

I - щ Ш ш Ф* Тщ 4P ™

Ф

ш ш

Ш i

А-1058 ' G-1059

б

UGCA346k

> ш ш

в

U С G А к 1 2 3

Рис. 4. Радиоавтограммы, показывающие положение остановок/пауз при удлинении 5'-32Р-меченого праймера, комплементарного последовательности 1181-1200 (а), 1081-1100 (б) и 1812-1831 (в), на матрице 18S рРНК. U, G, С и А - продукты секвенирования, образованные в присутствии ddATP, ddCTP, ddGTP и dTTP соответственно. Дорожки 3, 4 и б на панелях (а) и (б) - 18S рРНК, модифицированная ClRp(U)3, ClRp(U)4 и ClRp(U)6, соответственно. К - 18S рРНК, выделенная из ^модифицированных рибосом, выдержанных в условиях алкилирования.

Результаты анализа белков, сшивающиеся с 5'-алкилирующими производными (ри)6 и (ри)|2, после гидролиза сшитых с белками остатков олиго(и) РНКазой А и щелочной фосфатазой, приведены на рис. 5.

а б

Рис. 5. Анализ белков 40Э субчастиц, сшитых с 5'-л2Р- меченым С1Яр(и)б, двумерным гель-электрофорезом в системе II (см. раздел 3.1.5). (а), электрофореграмма окрашенного геля; (б) радиоавтограф геля. На окрашенном геле выделены белки, соседствующие с ' " эгз 824 радиоактивным пятном (отмечено

% пунктиром). Радиоавтограф геля в случае

325 эгв производного С1Яр(и)12 практически такой

же (не приведен).

Единственное радиоактивное пятно на электрофореграммах соответствует по положению модифицированному белку ^ ^ 826. Для окончательной идентификации

^ счь модифицированного белка проводили

Л О

уЯ <£> <¿8 иммунопреципитацию с использованием антител кролика ^ <?г с, против рибосомного белка Э26 крысы. Белки,

экстрагированные из осадков и соответствующих супернатантов, анализировали с помощью одномерного гель-электрофореза (рис. 6). Видно, что как в случае СШр(и)6, так и в случае СЖ.р(и),2 более 90% метки 32Р находится в полосе, соответствующей белку 826. Следовательно, среди белков практически единственным продуктом модификации рибосом был белок 826.

S26

Рис. 6. Анализ рибосомных белков, сшитых с ClRp(U)s и ClRp(U)i2, с помощью иммунопреципитации и последующего гель-электрофореза. Радиоавтограф нитроцеллюлозной мембраны после переноса на нее с геля рибосомных белков, осажденных иммуносорбентом, специфичным крибосомному белку S26 (дорожки PAS-S26-p(U)6H PAS-S26-Р(и)п), и белков, выделенных из соответствующих супернатантов (дорожки SUP-p(U)6 и SUP-P(U)12).

а б Рибосомные белки, сшивающиеся с 3'-производными

1 олигоуридилатов, анализировали вначале с помощью

одномерного электрофореза (рис. 7).

S3a,

Рис. 7. Анализ модифицированных белков одномерным гель-электрофорезом: а - окрашенный гель; б - радиоавтограф геля. Дорожки 1, 2 и 3 - белки, модифицированные (ир)2и['2Р]рС-Я'С1, (ир)5и[32Р]рС-Я'С1 и (ир)ии[32Р]рС-К'С1 соответственно. Указаны положения полос некоторых немодифицированных белков.

Поскольку электрофоретическая подвижность модифицированного белка тем меньше, чем больше масса присоединенного к нему аналога мРНК, можно предположить, что модификации

во всех случаях подвергались две одинаковые группы белков. Верхняя полоса в геле соответствует белкам S2/S3/S3a/S4/S6, а нижняя - белкам S12/S15a/S20/S26/S27a. Аналоги мРНК (Up)6C-R'Cl и (Up)i2C-R'Cl модифицировали преимущественно белки, соответствующие верхней полосе, a (Up)3C-R'Cl - нижней полосе. В случае (Up)6C-R'Cl и (Up)12C-R'Cl окончательную идентификацию модифицированных белков проводили с помощью иммунопреципитации с использованием антител против рибосомных белков S3, S3a и S26, которые являлись наиболее вероятными мишенями модификации (рис. 8).

Рис. 8. Анализ рибосомных белков, сшитых с (Up)6C-R'Cl (1) или с (Up)i2C-R'Cl (2), с помощью иммунопреципитации и последующего гель-электрофореза. Радиоавтограф нитроцеллюлозной мембраны после переноса на нее с геля рибосомных белков, осажденных иммуносорбентом, специфичным к белкам S3 и S26 (а) или к белку S3a (б). Положения модифицированных белков S3, S3a и S26 указаны стрелками.

В контрольных экспериментах, выполненных с каждым из аналогов мРНК, к суммарному рибосомному белку, выделенному из модифицированных 40S субчастиц, добавляли иммуносорбент, содержащий антитела против белков S3, S3a и S26 одновременно. При этом практически вся радиоактивная метка оказывалась связанной с иммуносорбентом (т.е. супернатант не содержал радиоактивности), поэтому сделано заключение, что никакие другие рибосомные белки (кроме белков S3, S3a и S26) не сшивались с аналогами мРНК. В эксперименте с производным (Up)3C с помощью иммунопреципитации было показано, что нижняя полоса соответствует белку S26 (соответствующий радиоавтограф не приведен). Данные по аффинной модификации 80S рибосом человека алкилирующими производными олигоуридилатов суммированы в табл. 4.

2.2. Аффинная модификация 80S рибосом 5'-алкилиругощим производным pGUGU3

Модификацию рибосом с помощью ClR[5'-32P]pGUGUUU, содержащим валиновыи кодон GUG и фенилаланиновый кодон UUU, проводили либо в комплексе с кодон-антикодоновым взаимодействием в Р-участке, образованном с участием TPHKVal или тРНК''|1С, либо в комплексе с двумя кодон-антикодоновыми взаимодействиями. Обе гРНК существенно стимулировали связывание и сшивку ClR[5'-32P]pGUGU3 с 80S рибосомами (табл. 5), что свидетельствовало о способности кодонов GUG и UUU аналога мРНК участвовать в кодон-антикодоновом взаимодействии с соответствующими тРНК. Во всех случаях, кроме комплекса с тРНК¥а! в Р-участке, сшивка происходила практически только с рибосомными белками (табл. 5). Анализ модифицированных белков одно- и двумерным гель-электрофорезом показал, что в комплексах с одной тРНКРЬе и с двумя тРНК модифицировался преимущественно белок с подвижностью, лучше всего соответствующей модифицированному S26, а в комплексе с TPHKVal - модифицированному S6. Для подтверждения сшивки с белком S26 использовали иммуноблоттинг. Как видно из результатов анализа, представленных на рис. 9, антисыворотка против белка S26 проявляла интенсивную полосу (дорожка 2), соответствующую немодифицированному белку S26 (дорожка 1), и более слабую полосу (дорожка 2), положение которой совпадало с положением радиоактивной полосы на дорожке 3. Очевидно, что слабая полоса соответствует модифицированному белку S26.

Таблица 4. Результаты аффинной модификации 80S рибосом человека алкилирующими производными олигоуридилатов.

Аналог мРНК Положение сшивающей группы на 80S рибосоме Сшивка с 40S субчастицами

18S рРНК Белки

Относительная доля модификации, % Основные сайты сшивки Относительная доля модификации, % Сшитые белки*

ClRp(U)3 +1 96 А1023. С1026, С1057,А1058 4 И.о.**

ClRp(U)4 +1/-1 93 А1023, С1026, С1057, А1058 7

ClRp(U)„ +1 24 С1057 76 S26

CIRpflJb Неоднозначно (от-6 до +1) 4 593-674, 975-1172, 1749-1869 96 S26

p(U)3C-R'Cl +3/+4*** 80 G1702 20 S26. S3, S3a

p(U)6C-R'Cl +6/+7*** 70 G1702 30 S3, S3a. S26

p(U),2C-R'Cl Неоднозначно (от+6 до+13) 65 G1702 35 S3, S3a, S26

* Выделены основные мишени сшивки среди белков. **Не определено.

""Неоднозначность положения алкилирующей группы аналога мРНК на рибосоме связана с возможностью фиксации матрицы как с помощью кодонов иии, так и с помощью кодона ииС.

Таблица 5. Аффинная модификация 80S рибосом в составе модельных комплексов с ClR[5'-32P]pGUGU,.

тРНК Связывание, моль аналога мРНК на моль 80S рибосом Ковалентно присоединенный аналог, моль/моль 40S субчастиц Относительная степень модификации, %

Белки 18S рРНК

Без тРНК 0.12 0.16 90 10

тРНК™ 0.52 0.33 55 45

тРНКРЬе 0.65 0.58 97 3

TPHKv"' +тРНКр|,е 0.65 0.56 96 4

Рис. 9. Идентификация модифицированного белка Э26 с помощью иммуноблотинга после разделения белков одномерным гель-электрофорезом и последующего переноса их на нитроцеллюлозную мембрану. Приведены результаты анализа белков, модифицированных СЖ[5'-'"Р]рОиОиз в комплексе с тРНКр|,е. Аналогичные результаты получены для комплекса рибосом с двумя тРНК (не приведены). I -мембрана, окрашенная амидо-черным; 2 - проявление белка ¿26 с помощью соответствующей антисыворотки; 3 -радиоавтограф мембраны. Указаны положения некоторых немодифицированных белков.

Обращает на себя внимание то, что результаты аффинной модификации 80S рибосом производным pGUGU3 в комплексе с тРНКУа1 и в комплексе с двумя тРНК значительно различаются, несмотря на одинаковое положение (+1) нуклеотида со сшивающей группой на рибосоме. Напротив, в комплексах с тРНКРЬе и с двумя тРНК, различающихся по расположению на рибосоме нуклеотида, несущего алкилирующую группу (соответственно, -3 и +1), получены практически одинаковые результаты. Это можно объяснить тем, что вместо комплекса с двумя молекулами тРНК происходило образование комплекса, где тРНКРЬс и кодон UUU находились в Р-участке, тогда как А-участок оставался свободным. Очевидно, это было вызвано тем, что тРНКГ1е имеет большее сродство к Р-участку 80S рибосомы по сравнению с тРНКУа|. Из -за этого не все активные рибосомы находились в комплексе с аналогом мРНК в присутствии тРНКУа1, и имело место равновесие между связанным и свободным аналогом. При добавлении тРНКРЬе равновесие смещалось в сторону образования более стабильного комплекса, содержащего кодон UUU и тРНКРЬе в Р-участке.

Результаты по сшивкам производного pGUGU3 в присутствии TPHKphc позволили получить однозначную информацию о белковом окружении на рибосоме модифицированного нуклеотида в положении -3, которую невозможно было получить помощью производных олиго(и). Практически единственной мишенью модификации 80S рибосом в составе этого комплекса был белок S26, что хорошо согласуется с аналогичными данными для 5'-производного (pU)i2, алкилирующая группа которого могла находиться с 5'-стороны от кодона в Р-участке в положениях от +1 до -6.

Суммируя результаты, полученные с помощью алкилирующих производных олигорибонуклеотидов, можно отметить, что они позволили впервые установить нуклеотиды рРНК, соседствующие с кодонами мРНК в 80S рибосоме, определить положения нуклеотидов в мРНК, сближенных с белками S3, S3a и S26, найденными ранее в мРНК-связывающем центре рибосом из печени крысы (Stahl and Kobetz, 1981; 1984; Stahl and Karpova, 1985) и выявить новые белки S2 и S6 в области мРНК-связывающего центра. Однако, информация, которую могут дать алкилирующие аналоги мРНК, ограничена окружением 5'- и 3'-концов рибозо-фосфатного остова мРНК. Поэтому в дальнейшем для исследования мРНК-связывающего центра рибосом человека использовали фотоактивируемые аналоги мРНК, несущие остатки s4U, и производные олигорибонуклеотидов с АТВ-группой на остатках гетероциклических оснований.

3. Сшивки рибосом с синтетическими аналогами мРНК, несущими остатки 4-тиоуридииа (s4U)

Синтетические аналоги мРНК длиной от 30 до 50 нт, несущие остатки s4U, нашли широкое применение в исследованиях мРНК-связывающего центра рибосом Е.соЧ, наиболее активно проводившихся в 90-х годах XX века в группах Р. Бримакомба в Германии, А.Богданова и О.Донцовой в России и П.Воллензиена в США. С помощью таких аналогов были определены нуклеотиды рРНК, контактирующие с мРНК на протяжении практически всего ее «пути» через рибосому, начиная от участка ее входа до самого участка выхода (Bhangu and Wollenzien, 1992; Rinke-Appel et al., 1993; Baranov et al., 1999). В настоящей работе для аффинной модификации 80S рибосом человека использовали тот же набор аналогов мРНК (табл. 1) и ту же методологию анализа их сшивок с рРНК, что и в группе П.Воллензиена при изучении мРНК-связывающего центра 70S рибосом. Это дало возможность провести корректное сопоставление данных об устройстве мРНК-связывающего центра 70S и 80S рибосом.

Продукты сшивок аналогов мРНК с рРНК, выделенные из облученных комплексов, анализировали электрофорезом в агарозе. Контролями служили необлученные комплексы и комплексы с аналогами мРНК, в которых вместо э и были остатки уридина. Результаты анализа для мРНК 1с и 7 с остатками Б4и, статистически распределенными вдоль всей цепи РНК, приведены в качестве примера на рис. 10 (сходные результаты получены для остальных мРНК).

1с

CI JJ. H s4U

\ + - + +- +

мРНК

tPHK

- 28S pPHK

- 18S pPHK

- MPHK

Рис. 10. Анализ гель-электрофорезом в агарозе РНК, выделенной из облученных комплексов 80S рибосом с мРНК 1с и 7 (радиоавтограф высушенного геля). Отмечено наличие в мРНК остатков s U или уридина (U). Комплексы 80S рибосом с аналогами мРНК получали в присутствии (+) или в отсутствие (-) тРНК, узнающих кодон Phe в мРНК 1с или кодон Тгр в мРНК 7. Контрольная дорожка С1 соответствует РНК, выделенной из необлученного комплекса 80S рибосом с мРНК 1с и TPHKphc. Положение полос 18S pPHK, 28S рРНК и мРНК (указано справа) определено по флуоресценции соответствующих полос в геле, окрашенном бромистым этидием.

Видно, что сшивка аналогов мРНК с рРНК полностью зависит от наличия в них остатков s4U и УФ-облучения комплексов; из рРНК главной мишенью сшивки являлась 18S рРНК, степень сшивки с которой мало менялась в присутствии тРНК, но зависела от последовательности мРНК.

При определении сшитых нуклеотидов 18S рРНК с помощью обратной транскрипции использовали набор праймеров, позволяющий провести анализ большей части рРНК (последовательности 392-1810). В качестве примера на рис. 11 приведены результаты анализа сшивки аналогов мРНК в районе U630; все результаты суммированы в табл. 6.

Видно, что аналоги мРНК 1с и 7 с остатками s4U, статистически распределенными практически вдоль всей цепи РНК, сшивались главным образом с нуклеотидом U-630 18S рРНК, как и мРНК 8 и 9е' с остатками s4U, расположенными на расстоянии 16 и более нуклеотидов с 3'- или 5'-стороны от области кодон-антикодоновых взаимодействий. Нуклеотид U630 соответствует U534 16S рРНК E.coli, который находится рядом с G530, взаимодействующим с кодон-антикодоновым дуплексом в А-участке 30S субчастицы. В случае мРНК 1с наблюдали также слабые сшивки с д Щ нуклеотидами А1060,

U1046 и U966. Первые два находятся в консервативной спирали 24, апикальная часть которой

8' 9е'_§1 _9е1

g U S4U S4U ++++•++■

UCGA + +- + -• + -

9S"

-ifi- мРНК

UsiU

+ -+ TPHKGIï • - - TPHKt

10c J0ç_ 10b мрнк

m m

+ + + + --+ TPHKGly

/■Thr

UCGA

тРНК

Thr

Рис. 11. Анализ сшивки ... ибзо ^^■■■P"™""" — иезо аналогов мРНК в районе

U630 в составе комплексов, образованных в присутствии (+) или отсутствие

(-) тРНК. Радиоавтографы, показывающие положение остановок/пауз обратной транскрипции при удлинении 5'-:Р-меченого праймера, комплементарного последовательности 655-674, на матрице 18S рРНК. А. С, С и U - продукты секвенирования 18S рРНК, образованные в присутствии ddATP, ddCTP, ddGTP и dTTP соответственно. Результаты, приведенные на панели Б, свидетельствуют об отсутствии сшивки с U630 в случае мРНК 10Ь и 10с.

Таблица 6 Результаты экспериментов по сшивкам аналогов мРНК, содержащих остатки s4U, с 18S рРНК в составе комплексов 80S рибосом.

Аналог мРНК Ожидаемое положение s"U Сшитый нуклеотид

18S рРНК*

мРНК 8' +20....+26 U630

мРНК 9е' -20...-16 U630

мРНК 10 -3, -1, +4+6 U630, Ш111/А1112

мРНК Юс -3, -1 U1111/A1112

мРНК 10b +4, +6 Не определен

мРНК 1с Распределены статистически U630, A1060,U1046, U966

мРНК 7 Распределены статистически U630

'Выделены основные сшивки.

(«790 loop») в 30S субчастице находится в непосредственной близости от кодона в Р-участке (Carter et al., 2000; Yusupova et al., 2001; Selmer et al., 2006). Нуклеотид U966 находится в апикальной петле "690-loop" в спирали 23, которая в 30S субчастице соседствует с кодоном мРНК в Е-участке (Yusupova et al., 2001). Нуклеотиды Ulll 1/Al 112 18S рРНК, которые сшивались с мРНК 10 и 10с, лежат вне консервативного кора рРНК малых субчастиц (в 16S рРНК E.coli им примерно соответствуют нуклеотиды 838/839, не имеющие отношения к декодирующему центру). Для мРНК 10b не удалось определить участков сшивки с 18S рРНК, скорее всего, из-за того, что они находились в З'-концевом фрагменте 1812-1869 18S рРНК и поэтому не могли быть определены с помощью использованного набора праймеров.

Полученные результаты существенно отличаются от данных по сшивкам тех же аналогов мРНК с 16S рРНК в комплексах с 70S рибосомами E.coli (Bhangu and Wollenzien, 1992; Bhangu et al., 1994). Хотя в обоих случаях сшивки происходили преимущественно с рРНК малой субчастицы и почти не зависели от присутствия тРНК, модификация 18S рРНК протекала более избирательно, чем 16S рРНК. Так, в случае рибосом E.coli было выявлено 12 основных точек контакта 16S рРНК с мРНК, несущими остатки s4U, статистически распределенные вдоль всей цепи РНК (Bhangu and Wollenzien, 1992), а в комплексах с рибосомами человека те же аналоги мРНК сшивались только с нуклеотидом U630 18S рРНК (табл. 6). Аналогично, мРНК, несущие остатки s4U в определенных положениях, сшивались с 1-2 нуклеотидами 18S рРНК в комплексах с 80S рибосомами (табл. 6) и с 3-6 нуклеотидами 16S рРНК в комплексах с 70S рибосомами (Bhangu et al., 1994). Эти различия обусловлены, скорее всего, тем, что в рибосомах млекопитающих большая часть мРНК контактирует не с рРНК, а с белками (см. раздел 4.1).

Таким образом, использование синтетических аналогов мРНК с остатками s4U позволило впервые получить информацию о том, что взаимодействие матрицы с рибосомой млекопитающих осуществляется за счет меньшего числа контактов с рРНК, чем с бактериальной рибосомой.

4. Сшивки рибосом с производными олигорибонуклеотидов, несущими АТВ-группы

Для аффинной модификации рибосом человека использовали производные олигорибонуклеотидов длиной 6-12 нуклеотидных остатков с АТВ-группами либо на 5'-концевом фосфате, либо на гетероциклическом основании - атоме С5 остатка уридина или N7 остатка гуанозина (рис. 1, в-д).

4.1. Аффинная модификация рибосом производными с АТВ-группой на 5'-концевом фосфате

Для изучения окружения на 80S рибосоме 5'-концевого нуклеотида мРНК в

положении 1

+1 или -3

использовали 2

NjR'p

- SOS-

COS-

NjR'p;

производные pGUGUUU, pUUUGUU и pUUCUAAA, в которых АТВ-группа была присоединена к 5'-фосфату через этилендиаминовый спейсер (рис. 1, в). Аффинную модификацию 80S рибосом проводили в составе 6 типов модельных комплексов (рис. 12). Контролями для каждого из комплексов служили бинарные комплексы соответствующих аналогов мРНК с 80S рибосомами. тРПКр,:с использовали в аминоацилированной форме для того, чтобы при получении комплексов 4 и 5 исключить ее связывание в E-участке и обеспечить заполнение этого участка деацилированной тРНКУа1 в комплексе 4.

Рис. 12. Типы модельных комплексов, в которых изучали сшивку с 80S рибосомами человека фотоактивируемых аналогов мРНК с АТВ-группой (N3R") на 5'-концевом фосфате.

Ни один из аналогов практически не связывался с рибосомами и не образовывал сшивок в присутствии избытка соответствующего немодифицированного олигомера или в отсутствие тРНК (табл. 7). Это свидетельствовало о том, что связывание и сшивки происходили в составе специфических комплексов этих аналогов мРНК с 80S рибосомами и тРНК. Как и в опытах с алкилирующими производными олигорибонуклеотидов, модификации подвергались практически только 40S субчастицы. Более низкий уровень связывания и сшивки в комплексе 1, образованном с участием с тРНКУа|, по сравнению с аналогичными комплексами 5 и 6, полученными в присутствии тРНК№е, очевидно, обусловлен тем, что TPHKVal имеет меньшее сродство к Р-участку 80S рибосом, чем тРНКРЬс (см. раздел 2.2).

Данные по распределению сшивок между рРНК и белками (за исключением данных для комплекса 2), хорошо согласуются с результатами, полученными с помощью алкилирующих аналогов мРНК (см. раздел 2). Так, АТВ-группа в положении -3 сшивалась в основном с белками, а в положении +1 - с рРНК и белками в сопоставимой степени. Что касается комплекса 2, где АТВ-группа должна была находиться в положении +1, то данные, полученные для этого комплекса, резко отличались от результатов для комплекса 1 с тем же расположением модифицированного нуклеотида, но были очень схожими с данными для комплексов 3 и 4, где АТВ-группа находилась в положении -3. По-видимому, при получении комплекса 2 фактически происходило образование комплекса 3 вследствие того, что TPHKVaI имеет меньшее сродство к Р-участку 80S рибосом, чем тРНКр,1е (см. раздел 2.2). В результате сшивающая группа оказывалась в положении -3, а не +1.

Таблица 7. Аффинная модификация 80S рибосом производными олигорибонуклеотидов с АТВ-группой на 5'-концевом фосфате. Ошибка эксперимента была в пределах 10%.

Тип комплекса (см. Связывание аналога Ковалентно Относительная

рис. 12), в скобках мРНК, моль/моль 80S присоединённый степень модификации,

указано положение рибосом реагент, моль/моль )

нуклеотида со 40S

сшивающей группой

18S рРНК Рибосомные

белки

1а* 0.03 <0.01 - -

1(+1) 0.20 0.12 70 30

2 (+1)" 0.78 0.50 12 88

3(-3) 0.74 0.52 8 92

3 (-3) в присутствии <0.05 <0.01 - -

избытка немодифици-

рованного рОивиз

4 (-3) 0.80 0.47 6 94

5а* 0.08 0.07 - -

5(+1) 0.60 0.45 50 50

6а* 0.08 0.06 - -

6(-+1) 0.68 0.55 40 60

*Данные для бинарных комплексов соответствующих аналогов мРНК с 80S рибосомами **Указано ожидаемое положение

Эксперименты по расщеплению модифицированной рРНК РНКазой H показали, что во всех комплексах сшивка аналогов мРНК с 18S рРНК происходила внутри района 12001222 (на рис. 13 в качестве примера представлены результаты, полученные в случае производного pGUGUUU). На основании этого в качестве праймера для определения модифицированных нуклеотидов 18S рРНК с помощью обратной транскрипции использовали дезокси-олигомер, комплементарный нуклеотидной последовательности

1222-1241. Во всех типах комплексов, образованных с участием тРНК, остановка обратной транскрипции происходила на нуклеотиде А1208 18S рРНК. Следовательно, модификации подвергался нуклеотид G1207 (рис. 14). В отдельном эксперименте показано, что G1207 был единственной мишенью для сшивки аналогов мРНК с 18S рРНК, поскольку продукты гидролиза 18S рРНК РНКазой H в присутствии дезоксирибо-олигомера, комплементарного последовательности 1197-1216, не содержали

________метки 32Р, т.е. ковалентно присоединенного

"" «» аналога мРНК.

Рис. 13. Анализ продуктов гидролиза модифицированной 18S рРНК РНКазой H в присутствии 20-звенных кДНК, комплементарных последовательностям 1548-1567, 1222-1241, 1181-1200, 10811100, 950-969 и 821-840 18S рРНК (дорожки 1-6 соответственно), электрофорезом в ПААГ. «к» -модифицированная 18S рРНК, «к'» она же, обработанная РНКазой H в отсутствие кДНК; а - гель, окрашенный «Stains ail», б - радиоавтограф. Стрелками указаны ожидаемые длины фрагментов РНК. В эксперименте использовали 18S рРНК, модифицированную в составе комплекса I.

к к' 1 2 3 4 5 6 к к' 123456

1SS

(1869) ~SfS*w Г- ;

1548 ' _ )

1222 / , ,

1081669628'

,-950 .1029

- Л

.^foo

1 2 34 la к U G С A к 5а 5 6а 6 р,1с. 14 Анализ продуктов обратной

транскрипции модифицированной 18S рРНК в присутствии 5'-згР-меченого праймера. комплементарного последовательности 1222-1241. Радиоавтограф геля. Номер дорожки соответствует номеру комплекса, комплексы 1а, 5а и 6а соответствуют комплексам 1, 5 и 6. полученным в отсутствие тРНК. Дорожка «к» -18S рРНК, выделенная из 80S рибосом, выдержанных в тех же условиях, что и комплексы. U, G, С. А - продукты секвенирования. образованные в присутствии ddATP. ddCTP, ddGTP и dTTP соответственно. Положение остановки (паузы) обратной транскрипции, ~ • вызванной сшивкой 18S рРНК с аналогом мРНК,

А1208 * ^ А1208 обозначено стрелкой.

g Видно, что сшивка с G1207 не зависит от

природы кодона в A-участке (смысловой или стоп-кодон) и нуклеотида в воббл-положении кодона в Р-участке. Можно полагать, что G1207 находится ближе к нуклеотиду мРНК в положении +1, чем в положении -3, поскольку эффективность сшивки с рРНК АТВ-группы на нуклеотиде в положении +1 гораздо выше, чем в положении -3 (табл. 7). Нуклеотид G1207 во вторичной структуре рРНК малых рибосомных субчастиц соответствует G926 в 16S рРНК E.coli, который в 30S субчастице контактирует с кодоном в Р-участке и расположен на расстоянии всего нескольких ангстрем от нуклеотидов 789-790, соответствующих нуклеотидам 1057-1058 18S рРНК. сшивающимся с 5'-алкилирующими производными олиго(Ц) (раздел 2.1).

Результаты анализа рибосомных белков, сшитых с 5'-АТВ-производным pGUGUUU, представлены в табл. 8. Видно, что результаты, полученные помощью 5'-фотоактивируемого производного pGUGU3, существенно отличаются от результатов, полученных с помощью 5'-алкилирующего производного этого же гексамера в составе идентичных комплексов с рибосомами (см. разделы 4.1 и 2.2). Иными словами, алкилирующее и фотоактивируемое производные имели разные мишени для модификации в 18S рРНК и среди рибосомных белков. Это, очевидно, связано с разной природой образующихся активных промежуточных частиц, которые могут иметь разную химическую и/или стереохимическую селективность к нуклеотидам 18S рРНК или аминокислотным остаткам белков, находящимся в радиусе их действия. Следовательно, результаты, полученные с помощью алкилирующих и фотоактивируемых аналогов мРНК, являются взаимно дополняющими.

Интересно сравнить результаты модификации 80S рибосом в комплексах 3 и 4, где кодон pGUG с модифицирующей группой на 5'-концевом фосфате находился в Е-участке. В комплексе 4, в отличие от комплекса 3, не наблюдали сшивки с белком S2, что легко можно объяснить экранирующим эффектом тРНК в E-участке. Напротив, сшивка с белком S30 происходила только в комплексе 4, указывая на то, что тРНК в Е-участке влияла на белковое окружение 5'-концевого фосфата кодона в этом участке. Таким образом, применение 5'-фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов позволило существенно расширить представление о молекулярном окружении кодонов мРНК в Р и E-участках 80S рибосомы, полученное с помощью алкилирующих аналогов мРНК. С использованием АТВ-производных выявлены новые структурные элементы

мРНК-связывающего центра - нуклеотид G1207 18S рРНК и белки S2 и S3Û. соседствующие с кодонами в Р- и/или E-участках, и получены первые данные о влиянии тРНК в E-участке на белковое окружение нуклеотида в положении -3.

Таблица 8. Белки, модифицированные 5'-АТВ-производным pGUGUUU в составе различных комплексов с 80S рибосомами.

Тип комплекса Положение нуклеотида с АТВ-группои на рибосоме Модифицированные белки

S2 S6 S26 S30

1 +1 ++ - - -

2 +1* +++ ++ + -

3 -3 +++ ++ ++ -

4 -3 - +++ ++ +

"Указано ожидаемое положение

4.2. Аффинная модификация рибосом производными UUUGUU, несущими АТВ-груипы в триплете UUU или на остатке G, и производным UUAGUAUUUAUU с АТВ-г руппой на остатке G

Модификацию рибосом производными pUUUGUU с АТВ-группой, присоединенной к

первому, второму или третьему остатку U, либо к остатку G (аналоги [-IV

соответственно), и производным pUUAGUAUUUAUU с аналогичной группой на остатке

G (аналог V) проводили в составе комплексов, где нуклеотид со сшивающей группой

находился в положениях от -3 до +4 (рис. 15). Модельные комплексы 1-8 (рис. 15)

получали инкубацией рибосом с аналогами мРНК и тРНК в буфере с 13 мМ Mg2+ (буфер

А), использованном во всех описанных выше экспериментах по сшивкам, или в буфере Б

с 4 мМ Mg2+, содержащем полиамины. Комплекс 7 получали инкубацией комплекса 6 с

тРНК¥а1, узнающей кодон GUA в E-участке, а комплекс 8 с кодон-неспецифичной

tphkasp в е_участке .

инкубацией комплекса б с tPHKAsp.

Рис. 15. Комплексы 80S рибосом с производными олигорибонуклеотидов pUUUGUUи pUUAGUAUUUAUU. Цифрами указаны положения нуклеотидов мРНК, несущих сшивающую группу, относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке; • - остаток аминокислоты; фенилаланиновый (Phe) и валиновый (Val) кодоны в

последовательностях аналогов мРНК подчеркнуты.

UUUGUU 1 Phe Val ^

г)ЛпЛг)

. ^^^..........m il i flfti i л......л I il i .......Z7. . 7Г77?.....'

pu UAOI^AIUJLM^ J

PUUA<^JAUUUAL(U PU U A<¡y AUÜÚ AljÚ

-3

Уровень связывания аналогов мРНК с рибосомами в присутствии тРНК сильно зависел от типа комплекса. В случае аналогов I, IV и V стимулирующее влияние TPHKVal на связывание кодона GUA/GUU в Р-участке 80S рибосом было в 3-4 раза меньше, чем влияние тРНКр|1С на связывание кодона UUU, что подтверждает сделанный в разделе 2.2. вывод о более низком сродстве тРНК4,1' к Р-участку 80S рибосом по сравнению со сродством тРНКРЬс.

Интересно, что этого эффекта не наблюдали в случае аналога V в буфере Б. Это дает основания полагать, что использование буфера Б с 4 мМ Mg2' и полиаминами вместо буфера А позволило в случае аналога V получить комплекс 5, где в Р-участке 80S рибосом находился кодон GUA и тРНКУа|, а в А-участке - кодон UUU и тРНКРЬс. В случае аналогов мРНК II и III степень связывания в комплексах 1 и 2 была намного ниже, чем в аналогичных комплексах с аналогом I, но выше, чем в отсутствие тРНК. Это свидетельствовало о том, что модифицирующая группа на атоме С5 остатка U во втором и третьем (но не в первом) положении кодона существенно затрудняла (вероятно, стерически) кодон-антикодоновое взаимодействие с тРНКРЬс в Р-участке, но не препятствовала ему полностью. В отсутствие тРНК (комплексы 9) связывания производных гексарибонуклеотида pUUUGUU с рибосомами практически не наблюдали; производное додекарибонуклеотида (аналог мРНК V) в заметной степени связывалось с рибосомами и в отсутствие тРНК. и кодон-неспецифичная tPHKAsp не стимулировала его связывание.

Во всех случаях сшивка аналогов мРНК происходила практически только с 40S субчастицами, степень модификации которых хорошо коррелировала с уровнем связывания аналога мРНК с рибосомами в соответствующем комплексе. Результаты модификации 18S рРНК не зависели от состава буфера (А или Б), в котором получали комплексы (рис. 16, 17 и табл. 9).

а

UGCA 1 2 3 9К

д

UGCA I 2 3 9 К

в

UGCA I 2 3 9 К

— AI208

-А 1208

Рис. 16. Удлинение меченого праймера, •• ■чщяшт комплементарного

~ последовательности

1222-1241 (а, в) или 1081-1100(5), на ~ 9 матрице 18S рРНК.

Дорожки U, G, С и -А962 „, А - продукты

~ секвенирования.

Удлинение праймера на 18S рРНК из рибосом, модифицированных

___ _ аналогом 1(а, б) и

_Y— —!— \! \ III (в) в составе

+ '(+2)| |-3(-2)| комплексов 1-3 и 9

-— --7777, ' - (дорожки 1 -3 И 9

аналог!»!) аналог! (11) аналог III соответственно), а

также на контрольной 18S рРНК из облученных рибосом (дорожки К) (в случае аналога II получены результаты, аналогичные тем, которые представлены на панелях (а) и (б)). Стрелками обозначены положения остановок (пауз) обратной транскрипции, вызванных сшивками 18S рРНК с аналогами мРНК. Внизу панелей в рамках указаны положения модифицированного нуклеотида аналога мРНК на рибосоме.

Таким образом, результаты аффинной модификации 80S рибосом различными аналогами мРНК оказались практически не чувствительными к составу буфера (буфер А с 13 мМ Mg2+ или буфер Б с 4 мМ Mg2+H полиаминами), использованного для

а

б

в

ug са 1 2 9 к u g с а 3 9 к

аналог IV ---

аналог V

Рис. 17. Удлинение меченого праймера, комплементарного последовательности 1835-1849 (а), 18121831 (б) или 1222-1241 (в), на матрице 18S рРНК, выделенной из рибосом, модифицированных аналогом IV в составе комплексов 1-3 (а, б), аналогом V в составе комплексов 4, 6-8 (в), и этими же аналогами в бинарных комплексах 9 (номера дорожек соответствуют номерам комплексов). Детали -см. подпись к рис. 16.

комплексообразования аналогов мРНК с рибосомами. Поэтому данные о молекулярном окружении мРНК на рибосоме, полученные в буфере А с концентрацией Mg2+ более высокой, чем его концентрация в условиях, близких к физиологическим, можно считать вполне корректными.

Таблица 9. Фрагменты и нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с аналогами мРНК I-V.

Тип комплекса Участок сшивки в 18S рРНК

Аналог (в скобках - природа и положение Фрагмент Нуклеотид

м РНК нуклеотида, несущего сшивающую группу)

I 1 (и+1) 1197-1216 G1207

1 2 (4+1) 1197-1216 G1207

I 3 (и-3) 840-1081 G961

II 1 (11+2) 1197-1216 G1207

II 2 (Ц+2) 1197-1216 G1207

II 3 Ш-2) 674-1081 G961

III 1 (и+3) 1100-1222 G1207

III 2 (и+3) 1100-1222 G1207

III 3(11-1) 1100-1222 G1207

IV 1 (0+4) 1812-1831 A1823-A1825

IV 2 (в+4) 1812-1831 A1823-A1825

IV 3(0+1) 1641-1869 G1702

V 4(0+1) 1641-1869 и.о.

V 5 (0+1)** 1197-1216(*) G/207

V 6 (0-3) 1197-1222С) G1207

V 7 (0-3) 1197-1222(*) G1207

V 8 (0-3) 1197-1222(*) G1207

* Указан основной участок модификации 18S рРНК.

** Приведены результаты, полученные в буфере А, где вместо комплекса 5 фактически имело место образование комплекса 6.

Результаты по сшивкам производных UUUGUU показали, что расположение кодона мРНК в Р-участке и первого нуклеотида кодона в A-участке относительно 18S рРНК практически не зависит от наличия молекулы тРНК в A-участке 80S рибосомы, исключая частичное экранирование оснований А1823-А1825 от сшивки с аналогом мРНК IV в случае, когда модифицированный G аналога находился в положении +4 (рис. 17, а). Данные, приведенные в табл. 9, свидетельствуют о том, что нуклеотид G1207 соседствует с нуклеотидами мРНК в положениях от -3 до +3, G961 - в положениях -3 и -2, G1702 - в положении +1, а участок AI823-A1825 сближен с нуклеотидом мРНК в положении +4. То, что нуклеотид G1207 18S рРНК соседствует практически со всеми нуклеотидами кодонов в Р- и E-участках, указывает на наличие изгиба, который делает матрица на рибосоме между этими кодонами, благодаря чему нуклеотид G1207 оказывается сближенным с каждым нуклеотидом кодонов в Р- и Е-участках.

Результаты анализа 40S субчастиц, сшитых с аналогами мРНК I, II и III, одномерным гель-электрофорезом в присутствии SDS приведены на рис. 18. Все радиоактивные полосы, кроме самой верхней, соответствовали модифицированным белкам, поскольку они исчезали при обработке субчастиц протеиназой К (рис. 18, а), но сохранялись после обработки РНКазой А (рис. 18, д). Сшивка с белками, соответствующими полосам в центральной и нижней частях геля, сильно зависела от присутствия тРНК. Напротив, модификацию белков, соответствующих двум интенсивным полосам в верхней части геля, наблюдали во всех случаях, в том числе и в бинарных комплексах. Эта модификация была специфичной, поскольку поли(и) полностью блокировала ее (дорожка К). Достаточно высокий уровень сшивок с белками в лабильных бинарных комплексах коротких аналогов мРНК с 80S рибосомами, по-видимому, обусловлен быстрым обменом между связанным и свободным аналогом мРНК во время облучения. В связи с этим нельзя исключить, что в комплексах, где степень связывания аналогов мРНК была невысокой (все комплексы с аналогами II и III и комплекс 3 с аналогом I), сшивка с белками, соответствующими верхним полосам (рис. 18), происходила полностью или частично в составе бинарных комплексов.

после обработки прптеинячой К

1239 1239 1239 К12391239

в присутствии поли(и)

после обработки РНКазой Т1

Рис. 18. Анализ 40S субчастиц, выделенных из облученных

комплексов 80S рибосом с аналогами мРНК III (а, б), II (в) и 1 (г, д), электрофорезом в ПААГ в присутствии SDS. Радиоавтограф. В случае (a) 40S субчастицы перед

анализом

оыли

обработаны протеиназой К, а в случае (d) -РНКазой А. Номера дорожек соответствуют номерам комплексов. Дорожка К - анализ 40S субчастиц, выделенных из комплекса 80S рибосом с аналогом I, образованного в

присутствии поли(и). Дорожка е - типичный окрашенный гель.

а

б

в

г

Д е

Результаты, полученные с аналогом мРНК I хорошо согласуются с данными по сшивкам 80S рибосом с аналогами мРНК, несущими алкилирующую или фотоактивируемую группу на 5'-фосфате. Так, в комплексах 1 и 2 с модифицированным U в положении +1 сшивка происходила в большей степени с 18S рРНК, а в комплексе 3 с модифицированным U в положении -3 - преимущественно с белками.

Сопоставление радиоавтографа (панель д) с окрашенным гелем (панель е) в случае аналога I позволило отнести две верхние радиоактивные полосы к модифицированным белкам S2/S3a и S3, полосу в средней части геля - к S5/S7, а две нижние полосы - к S14/S23/S15а и S16/S19/S26. Результаты анализа сшивок аналога I с белками двумерным электрофорезом после гидролиза сшитого с белком остатка аналога мРНК РНКазой А приведены на рис. 19 и в табл. 10. Для аналогов II и III полагали, что радиоактивные полосы, совпадающие с полосами белков для аналога I при одномерном разделении без обработки РНКазой А (рис. 18), соответствуют тем же белкам, что и в случае аналога I.

В случае аналога IV анализ модифицированных белков проводили без гидролиза остатка гексарибонуклеотида, сшитого с белками, поскольку гидролиз приводил бы к потере метки 32Р; для более надежной идентификации белки, выделенные из модифицированных 40S субчастиц, анализировали двумерным электрофорезом в двух системах (I и II). Результаты определения белков, модифицированных аналогами I-IV, суммированы в табл. 10.

а

i

Ш.

S14

'ЧЦ

ЕО

S2 3

ЕЕИ

S3 S2

S3 #

SM

б

1 -ос направление

?3 „S2

tlsîS**^.

..S23

Рис. 19. Анализ белков, сшитых с аналогом мРНК I, с помощью двумерного электрофореза в системе I. (й) - радиоавтографы гелей после разделения белков, выделенных из 40Я субчастиц, обозначены модифицированные белки, (б) - типичная электрофореграмма окрашенного геля; положения радиоактивных пятен, соответствующих модифицированным белкам, отмечены пунктиром. Номера комплексов указаны в правых верхних углах радиоавтографов, а положение модифицированного нуклеотида аналога мРНК на рибосоме дано в рамках в левых углах.

Таблица 10. Рибосомные белки, сшивающиеся с модифицирующей группой на нуклеотидах аналогов мРНК в положениях от -3 до +4 (выделены основные мишени модификации).

Полученные результаты хорошо согласуются с данными по аффинной модификации 80S рибосом аналогами мРНК с 5'-концевыми сшивающими группами (см. разделы 2 и 4.1), однако использование аналогов мРНК с АТВ-группами на остатках гетероциклических оснований позволило выявить ряд новых белков. Полученные данные показывают, что белковое окружение

Аналог мРНК Тип комплекса (в скобках положение модифицированного нуклеотида на рибосоме) Модифицируемые белки (выделены основные продукты)

I 1 (+1) S3, S26, S2, S14, S23

I 2(+1) S3, S26, S2, S14, S23

I 3(-3) S3, S26, S2, S14, S5/S7

IV 1(+4) S15, S2, S30

IV 2 (+4) S15

IV 3(+1) SI 5, S2, S6

кодона мРНК в Р и E-участках в значительной степени сходно. Различия в окружении кодонов в Р- и E-участках проявлялись в том, что сшивка с белком S14 была сильнее при расположении модифицированного нуклеотида в E-участке, сшивку с белками S5/S7 наблюдали только в E-участке, а с белком S23 - только в Р-участке. Можно полагать, что белки S5/S7 и S14 относятся к непосредственному окружению кодона в E-участке, а белок S23 соседствует только с кодоном в Р-участке. При расположении модифицированного U в E-участке доля сшивки с белками была значительно выше, чем в Р-участке. По-видимому, кодон в E-участке 80S рибосомы соседствует преимущественно с белками, а в Р-участке - с белками и 18S рРНК.

4.3. Сшивка рибосом с модифицированными остатками U или G с 5'-стороны от кодона в Е-участке

Для изучения окружения мРНК с 5'-стороны от кодона в E-участке 80S рибосом использовали набор аналогов мРНК, несущих фенилаланиновый кодон UUU на 3'-конце и остаток U или G с АТВ-группой с 5'-стороны от этого кодона (табл. 11). При связывании кодона UUU в Р-участке в присутствии TPHKphc модифицированные нуклеотиды аналогов мРНК оказывались в положениях -4, -6 или -9 относительно первого нуклеотида этого кодона.

Таблица 11. Аналоги мРНК, использованные для изучения окружения мРНК с 5'-стороны от кодона в E-участке. Серым цветом выделен кодон UUU, направляемый в Р-участок. Обозначение аналога мРНК отражает его длину (в скобках), а также природу и положение модифицированного нуклеотида относительно первого нуклеотида кодона, направляемого в Р-участок.

Во всех комплексах, где нуклеотид аналога мРНК, несущий фотоактивируемую группу, находился с 5'-стороны от кодона в E-участке (в положениях от -4 до -9), относительные степени модификации рРНК были очень низкими -сшивка происходила практически только с белками независимо от природы нуклеотида, несущего сшивающую группу. Следовательно, можно полагать, что мРНК с 5'-стороны от кодона в E-участке соседствует в основном с белками. Наборы белков, сшитых с аналогами мРНК, также мало зависели от природы и положения модифицированного нуклеотида в области от -4 до -9. Основной мишенью для сшивки во всех случаях был белок S26 (идентификация основана на данных одно- и а ^ двумерного гель-электрофореза после гидролиза сшитого с

11 2 з"к 1 2 З1 белками аналога мРНК с помощью РНКазы А и

подтверждена иммуноблотингом (рис. 20)).

Рис. 20. Определение модифицированного белка S26 с помощью иммуноблотинга после разделения белков одномерным электрофорезом в присутствии SDS и последующего переноса на нитроцеллюлозную мембрану. Приведены результаты анализа белков, сшитых с аналогами мРНК -4U(9), -6U(9) и -9U(12) в составе

«ta............ <-------тройных комплексов с 80S рибосомами и тРНК№,! (дорожки 1-3

»-»»ж» S26 соответственно), и контрольного опыта с белками, выделенными из немодифицированных рибосом (дорожка К). Радиоавтограф (а); проявление белка S26 с помощью специфических антител (б).

Принимая во внимание данные разделов 2 и 4.1, можно

Аналог мРНК Последовательность

аналога мРНК

-4U(9) UCIPGUGUUU

-6U(9) U*CUGUGUUU

-9U(12) U*CUCUCGUGUUU

-4G(9) CUG*UCAUUU

-6G(9) G*UAUCAUUU

-9G(12) G*UAUCUCUCUUU

сделать вывод, что нуклеотиды в положении от -9 до +1 сближены с белком S26, причем этот белок вносит определяющий вклад в формирование участка связывания мРНК с 5'-стороны от кодона в Е-участке.

4.4. Аффинная модификация 80S рибосом в области декодирующего центра

Для изучения молекулярного окружения кодона мРНК в декодирующем центре 80S рибосомы использовали три аналога мРНК, позволяющие направлять остаток U с АТВ-группой в положения от +4 до +6 (см. табл. 12).

Таблица 12. Аналоги мРНК, использованные для сшивок модифицированных нуклеотидов в составе кодона в A-участке. Комментарии - см. табл. 12.

В тройных комплексах 80S рибосом с аналогами мРНК и тРНК phe около 30% сшивок приходилось на долю 18S рРНК, которая модифицировалась только в присутствии TPHKphc, а 70% - на долю белков. Аналоги +4U(7), +5U(6) и +6U(6) сшивались с теми же нуклеотидами А1823-А1825 18S рРНК, что и аналог IV при локализации модифицированного остатка G в положении +4 (см. раздел 4.2), что свидетельствует об ключевой роли этих нуклеотидов в формировании декодирующего центра.

Среди рибосомных белков одной из основных мишеней модификации в тройном комплексе рибосом с аналогами мРНК +4U(7), +5U(6) и +6U(6) и TPHKphc был белок S15 (в качестве примера см. рис.21), степень сшивки с которым уменьшалась при переходе от аналога +4U(7) к аналогу +6U(6). Принимая во внимание данные о том, что белок S15 являлся одной из основных мишеней для сшивки с 80S рибосомами аналогов мРНК, несущих остаток s4U в составе кодона в A-участке (Bulygin et al., 2005), можно сделать вывод о том, что белок S15 играет ключевую роль в формировании декодирующего центра 80S рибосом млекопитающих. Кроме белка S15 модифицированные нуклеотиды в составе кодона в A-участке сшивались с белком S3 и, в некоторых случаях, с белком S2. Эти белки модифицировались также при расположении нуклеотида со сшивающей группой в Р- или E-участке (см. разделы 2, 4.1 и 4.2) и в отсутствие тРНК. Следовательно, белки S3 и S2, в отличие от белка S15, сближены с мРНК в различных участках мРНК-связывающего центра 80S рибосом (в том числе в участках, удаленных от декодирующего центра).

4.5. Сшивка рибосом с модифицированными остатками U или G с 3'-стороны от кодона в А-участке

Для изучения окружения мРНК с З'-стороны от кодона в A-участке 80S рибосом использовали набор аналогов мРНК, несущих на 5'-конце фенилаланиновый кодон UUU/UUC, который направляли в Р-участок, и остаток U или G с АТВ-группой в положении +7, +9 или +12 относительно первого нуклеотида этого кодона (табл. 13). Все аналоги мРНК сшивались преимущественно с белками, причем при перемещении модифицированного нуклеотида аналога мРНК в 3'-сторону от кодона в A-участке доля сшивки с 18S рРНК уменьшалась (с 20% до 2% в случае U* и с 7% до 2% в случае G*), а с белками - соответственно возрастала.

Аналог мРНК Нуклеотидная последовательность аналога мРНК

+4UÍ7) UUCU*CAA

+5U(6) UUUGU*U

+6U(6) UUUGUU*

шл

s3*

fc...

s10*/si5*

1-е направление

ИШ I

ю s.

S3 S3a S2 S6

,S8

sir "»-S. 52Г514

^24

si95i \s26 SIJ

SI 5*

1+46(7)1

SIS"

F60(6)|

S10-4 T^SlfcSIS

sr— 7? f»-sl1

s20 /si;. s'„ У-Л2*

SI4ÎSI5 / *

S23S24/S25

Рис. 21. Анализ белков, сшитых с аналогами мРНК (указаны на панелях), с помощью двумерного электрофореза в ПААГ в системах 1 (а) и II (б). Типичные электрофореграммы окрашенных гелей в электрофоретических системах I и II, на которых указаны положения белков и радиоактивных пятен (пунктиром), приведены справа. Разделение в системе I позволило определить основной продукт сшивки как SI0*/S15*, а разделение в системе II идентифицировать его более точно как S15*.

Таблица 13. Аналоги мРНК, использованные для изучения окружения мРНК с 3'-стороны от кодона в А-участке. Комментарии — см. табл. 10.

Как и во всех предыдущих случаях, сшивки с 18S рРНК наблюдали только в составе комплексов, образованных в присутствии тРНКРЬе. Все аналоги мРНК в этих комплексах сшивались с нуклеотидами А1823-А1825, С1698 и участком 605-630, в котором с помощью обратной транскрипции не удалось определить модифицированный нуклеотид. В разделах 4.1 и 4.2 показано, что нуклеотиды А1823-А1825 и G626, входящий в участок 605-630, соседствуют с кодоном в А-участке. Поэтому можно предположить, что матрица делает резкий изгиб между кодоном в А-участке и примыкающим к нему с 3'-стороны кодоном, благодаря чему оба кодона оказываются сближенными с одними и теми же рибосомными компонентами. При этом триплет, расположенный с 3'-стороны от кодона в А-участке, соседствует также с нуклеотидом С1698 и последовательностью 605-630 18S рРНК.

Среди белков основной мишенью сшивки независимо от природы модифицированного нуклеотида в аналоге и его положения с 3'-стороны от кодона в А-участке был белок S3; в небольшой степени модифицировались также белки S2, S15 и

Аналог мРНК Нуклеотидная последовательность аналога мРНК

+7U(12) UUUAACU*CUCCU

+9U(12) UUUAACUCU*CCU

+12U(12) UUUAACUCUCCU*

+7G(9) UUCUCAG*AA

+9G(12) UUUAACCUG*UCU

+12G(12) UUUAACUCUCUG*

+7U(7) UUUAACU*

+9U(9) UUUAACUCU*

+7G(7) UUCUAAG*

+9G(9) UUUAACCUG*

S30, причем эффективность сшивки с белком S15 резко падала при удалении модифицированного нуклеотида в З'-сторону от кодона в А-участке (в качестве примера см. рис. 22).

м .....

LtZGffl

|+12G(12j

Рис. 22. Анализ белков, сшитых с аналогами мРНК (указаны на панелях), с помощью двумерного электрофореза в ПААГ в системе II. Типичная электрофореграмма окрашенного геля, на которой указаны положения белков и радиоактивных пятен (пунктиром), приведена внизу справа.

/ S15*

S30'

\

Можно полагать, что белок 83 играет ключевую роль в формировании участка связывания мРНК с 3'-стороны от кодона в декодирующем центре, однако часть белка

соседствует также с кодонами в A-, Р- и E-участках рибосомы (см. разделы 2.4.1 и 2.4.2). В определенной степени аналогичный вывод можно сделать также относительно белка S2 (см. рис. 22).

Результаты по сшивкам аналогов мРНК с 80S рибосомами суммированы в табл. 14.

4.6. Фрагменты белка S15, содержащие участки сшивки с аналогами мРНК

На примере белка S15, ключевого структурного компонента декодирующего центра 80S рибосомы, впервые сделана попытка выйти на олигопептидный уровень при изучении белкового окружения мРНК на рибосоме эукариот. Для определения фрагментов белка S15, сшивающихся с мечеными аналогами мРНК, использован подход, основанный на специфическом расщеплении белков, сшитых с мечеными аналогами мРНК в составе комплексов с рибосомами, с последующим определением модифицированных олигопептидов. В качестве селективных протеолитических агентов использованы гидроксиламин и бромциан. Полипептидная цепь белка S15 содержит единственный сайт расщепления гидроксиламином, расщепление по которому приводит к образованию двух фрагментов (1-98 и 99-145), и 7 сайтов расщепления бромцианом (рис. 23).

Анализ показал, что во всех случаях в результате расщепления получается практически единственный фрагмент, несущий радиоактивную метку, причем электрофоретическая подвижность этого фрагмента тем меньше, чем больше молекулярная масса сшитого с ним аналога мРНК (рис. 23). Модифицированные олигопептиды идентифицировали, сравнивая массы фрагментов, несущих сшитый остаток меченого аналога мРНК (рис. 23), с расчетными молекулярными массами всех фрагментов, которые могут образовываться при расщеплении белка S15 гидроксиламином или бромцианом. При расщеплении гидроксиламином оказалось, что

S. !£B. ÏS-Mr, гэ => г> => кДа ï便

17 «14.2 »-

Mr. кДа

17 14.2 -»■

Mr, кДа

14.2 6.5 >-

3.5 «-

V X Mr.

кДа

* 14.2 6.5

■« 3.5

11.7

5.3

M

2733

8893

+

110

1

145

Рис. 23. Анализ модифицированных олигопептидов, образующихся при расщеплении белка S15, сшитого с мечеными аналогами мРНК, бромцианом (левая панель) и гидроксиламином (правая панель), (о) Разделение модифицированных олигопептидов гель-электрофорезом (радиоавтограф). Положения пептидных маркеров молекулярной массы указаны слева и справа от панелей (Мг -молекулярная масса), (б) Схема расщепления рибосомного белка S15 человека гидроксиламином (правая панель) и бромцианом (левая панель), сверху указаны рассчитаные молекулярные массы образующихся фрагментов, снизу - номера аминокислотных остатков, после которых происходит расщепление полипептидной цепи белка S15. Отмечен С-концевой фрагмент белка S15, масса которого наиболее точно соответствует результатам эксперимента.

радиоактивная метка во всех случаях содержится во фрагменте с массой примерно 5.3 кДа (после вычета массы сшитого аналога мРНК), который соответствует С-концевому фрагменту 99-145 (рис. 23, правая панель). При расщеплении бромцианом метка во всех случаях была во фрагменте с массой немного меньше 4 кДа, который с учетом данных по расщеплению гидроксиламином мог соответствовать только фрагменту 111-145 белка S15 (рис. 23, левая панель).

Таким образом, нуклеотиды мРНК в положениях от +4 до +12 сближены с С-концевым фрагментом 111-145 белка S15. Поскольку сшивка с белком S15 была наиболее эффективна в случаях, когда модифицированные нуклеотиды аналогов мРНК находились в A-участке (см. разделы 4.2, 4.4 и 4.5), можно полагать, что С-концевой фрагмент этого белка непосредственно соседствует с кодоном в А-участке.

5. Расположение мРНК на рибосоме человека по данным сшивок с аналогами мРНК

Результаты по сшивкам аналогов мРНК с 80S рибосомами (табл. 14) позволили впервые выявить характерные особенности устройства мРНК-связывающего центра 80S рибосомы, основные черты которого схематически представлены на рис. 24. Оказалось, что мРНК с З'-стороны от кодона в A-участке и с 5'-стороны от кодона в Е-участке окружена в основном белками, а кодоны в А, Р и E-участках сближены как белками, так и 18S рРНК (кодон в E-участке соседствует в большей степени с белками, чем с рРНК). Сопоставление результатов по аффинной модификации 80S рибосом человека с данными по устройству мРНК-связывающего центра 70S рибосомы свидетельствует о

Таблица 14. Результаты аффинной модификации 80S рибосом человека аналогами мРНК -реакционноспособными производными олигорибонуклеотидов.

Положение Модифицированного нукпеотида аналога мРНК на рибосоме Место присоединения и природа сшивающей группы Распределение сшивки между 18S рРНК и рибосомными белками, % Мишени для сшивки аналогов мРНК в 80S рибосоме (выделены основные)

18S рРНК Белки Нуклеотиды 18S рРНК (в скобках - нумерация по 16S рРНКг.со/i) Белки 40S субчастицы

-9 U (АТВ) <2 >98 - S26

-9 G (АТВ) <2 >98 - S26, S14

-6 U (АТВ) <3 >97 - S26

-6 G (АТВ) <3 >97 - S26, S14

-4 U, G (АТВ) <3 >97 - S26, S3

-3 5'р (RC1) 3 97 - S26, S6

-3 5'р (АТВ) 6-8 92-94 G1207 (G926) S2, S6, S26, S30

-3 U (АТВ) 7 93 G961 (G693) S3, S26, S2, S5/S7, S14

-3 G (АТВ) И.о. * Н.о. G1207 Н.о.

-2 U (АТВ) И.о. Н.о. G961 Н.о.

-1 U (АТВ) И.о. Н.о. G1207 Н.о.

+1 5'р (RC1, pGUGUj) 5'р (RC1, рВД 45 24 55 76 Cl 057 (U789) S6 S26

+1 5'р (АТВ) 40-70 30-60 G1207 S2

+1 U (АТВ) 50 50 G1207 S3, S26, S2, S14, S23

+1 G (АТВ) 30 70 G1702 (G1401) SIS, S2, S6

+2 U (АТВ) И.о. Н.о. G1207 Н.о.

+3 U (АТВ) И.о. Н.о. G1207 Н.о.

+3/+4 З'ОН (RC1) 80 20 G1702 S26, S3, S3a

+4 G (АТВ) 70 30 U823-1825 (1491-1493) S15, S2, S30

+4 U (АТВ) И.о. Н.о. А1823-1825 S15, S3

+5 U (АТВ) 32 68 А1823-1825 S15, S3

+5 G (АТВ) И.о. Н.о. А1823-1825, G626 (G530) Н.о.

+6 U (АТВ) 29 71 А1823-А1825 S15, S3

+6 G (АТВ) И.о. Н.о. А1823-А1825, G626 Н.о.

+7 G (АТВ) U (АТВ) 20 8 80 92 А1823-А1825, район 605-630 (509-534), С1698 (С1397) S3, S15, S2, S30

+9 G (АТВ) U (АТВ) 10 7 90 93 Al 823-Al 825, район 605630, С1698 S3, S2, S15.S30

+12 G (АТВ) U (АТВ) 2 2 98 98 А1823-А1825, район 605630,01698 S3, S2

*Н.о. - не определено или результат не однозначен.

Рис. 24. Схема расположения мРНК относительно компонентов 80S рибосомы человека rio данным сшивок с аналогами мРНК. Большие овалы - рибосомные белки, кружочки - нуклеотиды 18S рРНК.

сходстве в расположении кодонов мРНК в А, Р и E-участках и с З'-стороны от кодона в A-участке относительно рРНК малой субчастицы у прокариот и эукариот. Все нуклеотиды 18S рРНК, которые соседствуют с мРНК в 80S рибосоме, расположены в наиболее консервативных районах рРНК малых субчастиц: либо точно в тех же положениях вторичной структуры рРНК, что и нуклеотиды 16S рРНК, непосредственно контактирующие с мРНК в рибосомах прокариот (G626, G961, G1207, С1698, G1702, Al 824/1825), либо в положениях, непосредственно

примыкающих к ним (Al823, С1057) (рис. 25). Следовательно, можно заключить, что все нуклеотиды 18S рРНК, соседствующие с мРНК, составляют консервативный "кор" (сердцевину) рибосомы, структурно идентичную в рибосомах всех организмов.

Наиболее характерными компонентами белкового окружения мРНК на 80S рибосоме являются белки S3, S15 и S26. Белок S15 гомологичен белку S19р эубактерий, который находится на голове 30S субчастицы вдали от мРНК-связывающего центра. Лишь его неструктурированная С-концевая часть («хвост») вытянута в сторону А-участка (рис. 25), приближаясь к нему на расстояние до 35 Â. Согласно данным РСА, неструктурированный С-концевой хвост белка S19p Th. thermophilus включает в себя 18 а.о. Выравнивание аминокислотных последовательностей белков S15 человека и S19p Th. Thermophilus показало, что наиболее консервативной является их центральная часть, которая в белке S19р высокоструктурирована. Последним структурированным фрагментом в первичной структуре белка S19p является пентапептид LGEFA в положениях 71-75, которым заканчивается наиболее консервативная часть белка. В белке S15 за консервативным тетрапептидом LGEF (в положениях 115-119) следует С-концевой фрагмент 120-145, который соответствует неструктурированной части белка S19p. Это дает основания полагать, что фрагмент 120-145 белка S15 также неструктурирован. Длина этого фрагмента составляет 26 а.о., что примерно в 1.5 раза больше, чем длина соответствующего «хвоста» белка S19p, благодаря чему С-концевой фрагмент белка S15 может достигать декодирующего центра рибосомы и контактировать с мРНК. Анализ последовательностей белка S15 различных эукариот показал, что их С-концевой фрагмент весьма консервативен. Поэтому можно полагать, что он вносит существенный вклад в эффективность работы эукариотической рибосомы. Возможно, этот фрагмент стабилизирует кодон мРНК в декодирующем центре 80S рибосомы в дополнение к взаимодействиям этого кодона с нуклеотидами рРНК малой субчастицы, тем самым обеспечивая более высокую точность трансляции и меньшую вероятность сдвига рамки.

С З'-стороны от кодона в A-участке мРНК соседствует в основном с белком S3, а также с белком S2. Рибосомные белки S3 и S2 человека гомологичны прокариотическим белкам S3p и S5p, которые являются структурными компонентами«участка входа» мРНК

60S субчастица

40S субчастица

С1698

S15

G1401 в рибосому. Выравнивание

(G1698) __ _

/ ____¡¡ (G1702) аминокислотных

А1492/ ' последовательностей белков S3

(А1824) ' (S2) Thermus thermophilus и человека

показало, что три из четырех аминокислотных остатков белка S3 Thermus thermophilus, контактирующих с мРНК по данным РСА, находятся в консервативных участках белка. Это дает основание полагать, что эволюционно консервативные аминокислотные остатки белков S3 эубактерий и человека вовлечены в формирование участка связывания мРНК с З'-стороны от кодона в декодирующем центре. Таким образом, белковое окружение мРНК с З'-стороны от кодона в декодирующем центре, по-видимому, сходно в рибосомах всех царств. С другой стороны, в белковом окружении кодонов мРНК в Р- и E-участках 70S и 80S рибосомы имеются значительные различия. В частности, в наборе белков, соседствующих с нуклеотидами мРНК в положениях от -3 до +3 в 80S рибосоме, есть белки, не имеющие прокариотических гомологов, а именно, S6 и S26. То, что белок S26 был одной из главных мишеней сшивки для большинства аналогов мРНК, когда модифицированный нуклеотид аналога находился в Р- или E-участке, может свидетельствовать о непосредственных контактах белка S26 с кодонами мРНК в этих участках. Наконец, эукариот-специфичный белок S26 является основным компонентом молекулярного окружения мРНК с 5'-стороны от кодона в E-участке. Это свидетельствуют о принципиальных различиях в строении участка связывания мРНК с 5'-стороны от кодона в E-участке на рибосомах про- и эукариот. Взаимодействие 5'-концевой части мРНК с белком S26 в 40S субчастице, по-видимому, заменяет те взаимодействия в 30S субчастице, в которых участвуют белок S18p, не имеющий эукариотических гомологов, и фрагменты 16S рРНК, которые связываются с районом последовательности Шайна-Дальгарно, отсутствующей у эукариот.

(G626)

(G1207)

U789

(С1057)

(G961)

Рис. 25. Модель комплекса 30S субчастицы с мРНК и тРНК, полученная на основании данных РСА (Yusupova et al., 2006; код доступа в PDB 2HGR). На модели отмечены белки и нуклеотиды 16S рРНК, гомологичные белкам 40S субчастицы и нуклеотидам 18S рРНК, сшивающимся с аналогами мРНК по данным настоящей работы (приведены в скобках). Нуклеотиды 16S рРНК отмечены желтыми кружками, положения нуклеотидов мРНК указаны стрелками на цепи мРНК (сиреневого цвета). Вид со стороны поверхности

межсубъединичного контакта.

6. Изучение структурно-функциональной топографии 5.88 рРНК в 608 субчастице с помощью фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов

Метод олигонуклеотидного пробинга, основанный на изучении доступности определенных участков рРНК в составе рибосом для связывания комплементарных олигонуклеотидов (зондов), используют уже более двух десятилетий для выявления

экспонированных участков PIIK и для изучения участия различных последовательностей рРНК в функционировании рибосомы. Однако при низкой степени связывания олигонуклеотида-зонда с рибосомой (что бывает часто) трудно судить о специфичности связывания зонда с выбранной последовательностью рРНК и о его влиянии на функционирование рибосомы. Использование вместо олигонуклеотидов их реакционноспособных производных позволяет изучать функциональную топографию рРНК в рибосоме даже в тех случаях, когда олигомер образует с рРНК труднодетектируемые лабильные комплексы, поскольку ковалентное присоединение производного олигомера к рРНК приводит к фиксации таких комплексов. Это дает возможность исследовать изменение доступности комплементарной олигомеру последовательности рРНК в зависимости от функционального состояния рибосомы путем определения степени модификации рРНК производным данного олигомера. Преимуществом использования реакционноспособных производных коротких олигорибонуклеотидов по сравнению с немодифицированными олигомерами является то, что, определив сшивающийся нуклеотид рРНК-мишени, можно судить о селективности связывания зонда с выбранной последовательностью рРНК.

В экспериментах по сшивкам 80S рибосом с производными нонарибонуклеотида UCUGUGUUU, несущего АТВ-группу на остатке уридина в первом или третьем положении (аналоги -6U(9) и -4U(9), табл. 11) было обнаружено, что наряду со значительной модификацией 40S субчастиц, зависимой от присутствия тРНКр|1С, происходит относительно слабая независимая от тРНК модификация 60S субчастиц. Анализ рРНК, выделенной из облученных комплексов, показал наличие единственного радиоактивного продукта с электрофоретической подвижностью, соответствующей подвижности 5.8S рРНК, сшитой с нонамером (рис. 26). Выход этого продукта был намного выше в случае аналога -6U(9). Поли(и) не блокировала, а напротив, усиливала сшивку обоих производных с 5.8S рРНК, что указывало на то, что она происходила вне мРНК-связывающего центра. Сшивка с 5.8S рРНК была сиквенс-специфичной - ее не

из производных других олигорибонуклеотидов, использованных в качестве аналогов мРНК, при этом степень связывания аналогов -6U(9) и -4U(9) с рибосомами в отсутствие тРНК была близкой к фоновым значением.

Рис. 26. Анализ сшивки меченых производных -6U(9) (дорожки 1 и 2) и -4U(9) (дорожки 3 и 4) с 5.8S рРНК электрофорезом в 5%-ном ПААГ. РНК выделяли из комплексов 80S рибосом, полученных в отсутствие (дорожки 1 и 3) или в присутствии (дорожки 2 и 4) поли(и). Положения маркеров длины РНК, определенных с помощью окрашивания геля 'Stains All', указаны справа.

Можно было полагать, что в 5.8S рРНК есть последовательность, комплементарная нонамеру, благодаря чему сшивки могли происходить в составе лабильных комплементарных комплексов, не детектируемых методом фильтрации на нитроцеллюлозных фильтрах. Компьютерный анализ выявил единственную относительно длинную последовательность АСАСА в положениях 82-86 5.8S рРНК человека, которая полностью комплементарна последовательности UGUGU в составе производных нонамера UCUGUGUUU. Анализ нуклеотидов 5.8S рРНК, сшивающихся с аналогом -6U(9), с помощью обратной транскрипции показал, что сшивка происходила с

наблюдали ни для одного 12 3 4

-190 нт

■ 159 нт (5.8S рРНК) -121 нт (5S рРНК)

■ 76 нт (тРНК)

V/A„

G89, расположенным вблизи 3'-стороны последовательности АСАСА. Это свидетельствовало о модификации 5.8S рРНК в составе комплементарного комплекса, образованного последовательностью АСАСА и производным нонарибонуклеотида.

Известны две альтернативных вторичных структуры 5.8S рРНК млекопитающих в составе ее комплекса с 28S рРНК (рис. 27 А и Б). В структуре А последовательность 8286 находится в односпиральном участке, а в структуре Б - в двуспиральном (рис. 27). дас д Дуплекс, образованный этой

a<3«aUu hgaAUUgc последовательностью и фрагментом UGUGU в

составе производных нонамера, должен дополнительно стабилизироваться двумя V"^производное терминальными неканоническими парами G*U « V наномера (Zenkova and Karpova, 1993). Очевидно, что

g -6U(9) структура А более предпочтительна для

а о а д связывания производных нонамера.

4gcgucgaug ? ? í 1 ?? sc

I I I I I I I I I ^QI I I I I I у

^CGpAGou а Сц_лд ^gcgvcga pllc 27. Вторичная структура центральной части 5.8S

рРНК человека в ее комплексе с 28S рРНК согласно си и u—a (www.rna.icmb.utexas.edu) (А) и Nazar et al, (1975) (Б).

На структуре А приведена схема комплементарного спаривания производных нонарибонуклеотида UCUGUGUUU с последовательностью 80-86 5.8S рРНК, приводящего к сшивке с G89; на структуре (Б) последовательность 80-86 отмечена жирной линией.

Эффективность сшивки -6U(9) с 5.8S рРНК была примерно одинакова для изолированных 60S субчастиц (рис. 28, дорожка /) и всех типов комплексов 80S рибосом (дорожки 3-6), но значительно ниже, чем в случае вакантных 80S рибосом (дорожка 2). Различия в эффективности сшивания производного нонарибонуклеотида с 5.8S рРНК в составе 60S субчастиц и вакантных 80S рибосом сохранялись в широком диапазоне концентраций производного.

1 2 3 4 5 6 Р"0, Анализ сшивки меченого аналога -6U(9) с 5.8S

рРНК электрофорезом в ПААГ в составе 60S субчастиц (/), в составе вакантных 80S рибосом (2). в комплексе 80S рибосом с поли(и) (3). в комплексе 80S рибосом с поли(и) и

т. и <■► *» mm Ш РЬе-тРНК№с (4), в комплексе 80S рибосом с аналогом мРНК

UCUCUCGUGUUU и тРНК№1' в Р участке (J) и в комплексе 80S рибосом с UCUCUCGUGUUU, тРНК|Ье в Р участке и

тРНК™ в Е участке (б).

Таким образом, доступность последовательности 82-86 5.8S рРНК для связывания комплементарного зонда в вакантных 80S рибосомах, полученных реассоциацией субчастиц, значительно ниже, чем в изолированных 60S субчастицах или в комплексах 80S рибосом с мРНК и тРНК (иными словами в «программированных» рибосомах). Резкие различия в доступности центральной части 5.8S рРНК в вакантных и «программированных» 80S рибосомах могут быть вызваны конформационными изменениями, сопровождающими переход рибосом из «программированного» состояния в вакантное в процессе белкового синтеза. Известно, что после терминации трансляции все лиганды покидают рибосому, после чего она диссоциирует на субчастицы под действием факторов инициации eIF-3 и eIF-6, а образовавшиеся свободные 40S субчастицы могут принять участие в инициации трансляции новой мРНК. Можно предположить, что диссоциация лигандов из пост-терминационной рибосомы вызывает конформационный переход, облегчающий связывание факторов,

что делает центральную часть 5.8S рРНК менее экспонированной. Такой переход может происходить либо вследствие изменений в молекулярном окружении центральной части 5.8S рРНК, либо из-за изменений во вторичной структуре рРНК, в результате которых последовательность 82-86 оказывается в двуспирапьном участке, недоступном для связывания комплементарных олигонуклеотидов. Из-за наличия двух альтернативных структур 5.8S рРНК в ее комплексе с 28S рРНК (рис. 27) более привлекательным кажется второй вариант. Вероятно, в изолированных 60S субчастицах и в «программированных» 80S рибосомах 5.8S рРНК имеет структуру А, а в вакантных 80S рибосомах - структуру Б, которая может стимулировать связывание факторов, диссоциирующих рибосому, что приводит к образованию свободных субчастиц, способных начать трансляцию новой мРНК. Есть основания полагать, что информационный переход в центральной части 5.8S рРНК специфичен для рибосом эукариот.

Аналог -6U(9) оказался также удобным инструментом для определения белков 60S субчастицы, соседствующих с последовательностью 82-86 5.8SS рРНК в составе 60S субчастицы. Сшивка с белками, как и с 5.8S рРНК, была специфична для -6U(9), поскольку ее не наблюдали в случае использования АТВ-производных других олигорибонуклеотидов. Модификации подвергались белки L6 и L8, которые могли быть однозначно идентифицированы с помощью одномерного гель-электрофореза благодаря большому расстоянию между полосами индивидуальных белков в самой верхней части электрофореграммы. Один из этих белков, L8, был картирован на крио-ЭМ изображении 60S субчастицы дрожжей у основания L1-выступа с внешней стороны субчастицы (Spahn et al., 2001). Белок L6 не имеет прокариотических гомологов, поэтому его не удалось картировать на 60S субчастице с помощью крио-ЭМ. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что в 60S субчастице белок L6 соседствует с центральной частью 5.8S рРНК. На крио-ЭМ модели 60S субчастицы дрожжей сегмент экспансии ES4, куда входит З'-конец 5.8S рРНК, картирован у основания Ll-выступа очень близко к белку L8. Следовательно, можно полагать, что центральная часть 5.8S рРНК, содержащая последовательность 82-86, и белки L6 и L8 расположены по соседству друг с другом у основания Ll-выступа с внешней стороны 60S субчастицы рибосомы человека.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение метода афинной модификации рибосом с использованием производных олигорибонуклеотидов, несущих реакционноспособную группу в заданном положении, позволило получить уникальную информацию о структурно-функциональной организации рибосом млекопитающих, которую до сих пор не могут дать другие методы и подходы. В настоящей работе впервые получено экспериментальное подтверждение распространенного представления о том, что нуклеотиды рРНК, принимающие участие в формировании мРНК-связывающего центра, включая участок декодирования, составляют консервативный "кор" (сердцевину) рибосомы, структурно идентичную в рибосомах всех организмов. Это согласуется с представлением о «мире РНК», согласно которому проторибосома, возникшая на заре эволюции, состояла только из рРНК, а белки появились в составе рибосомы позже. Возможно, первоначальная роль белков состояла в поддержании пространственной структуры рРНК, оптимальной для функционирования рибосомы, но в процессе дальнейшей эволюции роль белков возросла и они стали принимать участие в формировании некоторых функциональных центров рибосом. Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что у эукариот

рибосомные белки вносят больший вклад в формирование мРНК-связывающего центра, чем у прокариот. Более того, молекулярное окружение мРНК на рибосоме млекопитающих в значительной степени состоит из эукариот-специфичных рибосомных белков, а также белков, которые хоть и имеют прокариотические гомологи, но соседствуют с мРНК своими эукариот-специфичными последовательностями. Эти данные несомненно должны поставить под сомнение широко распространенную точку зрения, что эукариотическая рибосома представляет собой просто усложненную копию прокариотической рибосомы, в которой все функциональные центры устроены в общем так же, как и в прокариотической рибосоме, а эукариот-специфичные белки расположены на периферии, вдали от функциональных центров, и нужны главным образом для поддержания «правильной» пространственной структуры фрагментов рРНК, отсутствующих у прокариот.

Можно предположить, что вовлечение в формирование мРНК-связывающего центра 80S рибосом специфичных для эукариот олигопептидных последовательностей или белков связано с их способностью взаимодействовать с различными факторами (шаперонами, модифицирующими ферментами и пр.), влияющими на эффективность и точность трансляции, или служить мишенями для этих факторов. Это, в свою очередь, может обеспечивать более сложную и многостадийную систему регуляции белкового синтеза у эукариот по сравнению с прокариотами. Высказанная гипотеза базируется на том, что различия в молекулярном окружении мРНК на рибосомах прокариот и эукариот касаются в наибольшей степени окружения той части мРНК, которая находится с 5'-стороны от кодона в E-участке; именно те компоненты рибосомы, которые формируют это окружение, отвечают за ее взаимодействие с 5'-нетранслируемой областью мРНК, которая может участвовать в различных регуляторных процессах.

Недавно результаты настоящей работы были полностью подтверждены данными по сшивкам мРНК, несущих остатки s4U, с рибосомами кролика в составе 48S предынициаторного и 80S инициаторного комплексов (Pisarev et al., 2006; 2008). Оказалось, что в составе этих комплексов мРНК соседствует с теми же нуклеотидами рРНК и рибосомными белками, что и в комплексах рибосом человека, изученных в настоящей работе, а нуклеотиды мРНК в положениях от -8 до -17 контактируют со специфичным для эукариот фактором инициации eIF3, что согласуется с высказанной выше гипотезой.

Фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов оказались полезными для изучения не только структурной организации мРНК-связывающего центра рибосомы человека, но и в качестве комплементарно-адресованных зондов (которые имеют ряд преимуществ по сравнению с обычными антисмысловыми олигонуклеотидами) для изучения изменений, которые могут происходить в определенных участках структуры рРНК при переходе рибосомы из одного функционального состояния в другое. В частности, в настоящей работе с использованием такого зонда удалось обнаружить зависимость доступности последовательности в центральной части 5.8S рРНК от состояния рибосомы, благодаря чему стала более понятной роль 5.8S рРНК в процессе трансляции.

Нет сомнений, что использование метода аффинной модификации для изучения структурно-функциональной топографии эукариотической рибосомы дает уникальную возможность получать всестороннюю информацию об особенностях устройства ее функциональных центров, что является принципиально важным для понимания как молекулярных механизмов трансляции у эукариот, так и тех регуляторных процессов, которые обеспечивают эффективность и точность белкового синтеза.

выводы

Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование структурно-функциональной топографии рибосомы человека. Это исследование позволило получить уникальную информацию о молекулярном окружении мРНК на 80S рибосоме на уровне нуклеотидов рРНК и рибосомных белков, в случае одного из них - на уровне олигопептидной последовательности, а также о расположении центральной части 5.8S рРНК в 60S субчастице рибосомы и степени ее экспонированности на разных стадиях трансляции.

1. Для изучения молекулярного окружения мРНК на 80S рибосоме человека предложен набор фотоактивируемых аналогов мРНК - производных олигорибонуклеотидов длиной от 3 до 12 нт, различающихся природой и положением нуклеотида, несущего сшивающую группу, который использован для аффинной модификации рибосом наряду с алкилирующими производными олигорибонуклеотидов.

• Установлено, что в отсутствие факторов трансляции короткие аналоги мРНК, могут быть с высокой степенью точности фазированы на рибосоме с помощью прокариотических тРНК, узнающих кодон, направляемый в Р-участок, в отличие от аналогов мРНК длиной около 50 нт.

• Показано, что при облучении мягким УФ-светом комплексов 80S рибосом с тРНК и аналогами мРНК, несущими алкилирующую группу на 3'- или 5'-конце или п-азидотетрафторбензоильную группу на остатке уридина, гуанозина или 5'-концевом фосфате, происходят сшивки аналогов с рибосомами; для всех аналогов основной мишеныо сшивки являлась 40S субчастица.

2. Определены рибосомные белки и нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с аналогами мРНК. Обнаружено, что результаты аффинной модификации (наборы сшивающихся белков, положение сшитого нуклеотида в 18S рРНК и выход каждого из продуктов сшивки) зависят не только от положения модифицированного нуклеотида аналога мРНК на рибосоме, но и от его природы и типа сшивающей группы.

3. Показано, что нуклеотиды рРНК малых субчастиц, соседствующие с мРНК, составляют консервативный "кор" (сердцевину) рибосомы, структурно идентичную в рибосомах всех организмов.

• Установлено, что 18S рРНК сближена с довольно протяженным фрагментом мРНК - с нуклеотидами в положениях от -3 до +9 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке.

• Показано, что все нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с аналогами мРНК, находятся в консервативных районах рРНК малых рибосомных субчастиц и по положению во вторичной структуре точно соответствуют нуклеотидам 16S рРНК, контактирующим с мРНК по данным рентгеноструктурного анализа рибосом прокариот.

4. Установлено, что у млекопитающих рибосомные белки играют большую роль в организации мРНК-связывающего центра рибосом, чем у прокариот, и обнаружены значительные различия в белковом окружении мРНК на рибосомах про- и эукариот.

• Показано, что белки сближены со всеми нуклеотидами мРНК в положениях от -9 до +12, а нуклеотиды в положениях от -4 до -9 и от +9 до +12 соседствуют в основном с белками.

• Установлено, что на 80S рибосоме нуклеотиды мРНК в положениях от +1 до -3 соседствуют с белками S6 и S26, не имеющими прокариотических гомологов, а в

положениях от -4 до -9 - в основном с белком S26. Нуклеотиды в декодирующем центре (в положениях от +4 до +6) и в положении +7 сближены преимущественно с белком S15, чей прокариотический гомолог S19 удален от декодирующего центра на расстояние более 35 А.

• Обнаружено, что нуклеотиды мРНК в положениях от +4 до +7 соседствуют на 80S рибосоме с С-концевым фрагментом 111-145 белка S15, что указывает на участие этого фрагмента в формировании декодирующего центра эукариотической рибосомы.

• Выявлено сходство в белковом окружении мРНК на рибосоме с З'-стороны от кодона в декодирующем центре у про- и эукариот. Показано, что эта часть мРНК соседствует в основном с белком S3, прокариотический гомолог которого контактирует с мРНК с З'-стороны от кодона в А-участке.

5. С использованием производного нонарибонуклеотида, содержащего

последовательность, комплементарную фрагменту 82-86 в центральном районе 5.8S рРНК, и перфторфенилазидогруппу на первом остатке уридина, впервые изучено расположение этого района 5.8S рРНК в рибосоме млекопитающих, а также его доступность для комплементарно-адресованной модификации этим производным в разных функциональных состояниях рибосомы.

• Установлено, что белки L6 и L8 окружают последовательность 82-86 5.8S рРНК в составе 60S субчастиц. Сопоставление этих результатов с данными по крио-электронной микроскопии эукариотических 60S субчастиц показало, что центральная часть 5.8S рРНК и белки L6 и L8 расположены у основания L1-стержня в 60S субчастице.

• Показано, что доступность фрагмента 82-86 5.8S рРНК для комплементарно-адресованной модификации производным нонарибонуклеотида в свободных 80S рибосомах намного ниже, чем в 60S субчастицах и программированных 80S рибосомах. На основании этих данных выдвинута гипотеза о конформационном переходе в центральной части 5.8S рРНК, сопровождающем диссоциацию 80S рибосом на субчастицы после терминации трансляции.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

Обзоры

1. Грайфер Д.М., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г. Расположение матрицы на рибосоме человека по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК // Биохимия. - 2001.

- Т. 66. - С. 725-744

2. Грайфер Д.М., Карпова Г.Г. Структурно-функциональная топография рибосом человека по данным сшивок с аналогами мРНК - производными олигорибонуклеотидов // Молек. биология.

- 2001.-Т. 35.-С. 584-596.

Статьи в научных журналах

1. Грайфер Д М., Зенкова М.А., Карпова Г.Г., Малыгин А.А., Матасова Н.Б. Особенности неэнзиматического связывания олигорибонуклеотидов - аналогов мРНК и Phe-TPHKphs с 80S рибосомами из плаценты человека. // Молекуляр. биология. - 1990. - Т. 24. - С. 1076-1082.

2. Булыгин К.Н., Грайфер Д.М., Зенкова М.А., Малыгин А.А., Ямковой В И., Карпова Г.Г. Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека аналогами мРНК-производными олигоуридилатов с алкилирующей группой на З'-конце // Молекуляр. биология. - 1992. - Т. 26. -С.821-828.

3. Малыгин А.А., Грайфер Д M , Зенкова М.А., Мамаев C.B., Карпова Г.Г. Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека производными три- и гексауридилатов в качестве аналогов мРНК // Молекуляр. биология. - 1992. - Т. 26. - С. 369-378

4. Graifcr D.M., Nekhai S.Yu , Mundus D A., Fedorova O.S., Karpova G.G. Interaction of human and Escherichia coli tRNAllK with human 80S ribosomes in the presence of oligo- and polyuridylate template. // Biochim. Biophys. Acta - 1992. - Vol. 1171. - P. 56-64.

5. Malygin A.A., Graifer D.M., Bulygin K.N., Zenkova M.A., Yamkovoy V.I., Stahl J., Karpova G.G. Arrangement of mRNA at the decoding site of human ribosomes. 18S rRNA nucleotides and ribosomal proteins cross-linked to oligouridylate derivatives with alkylating groups at either the 3' or the 5' termini // Eur. J. Biochem. - 1994. - Vol. 226. - P. 715-723.

6. Graifer D M , Juzumiene D.I., Karpova G.G , Wollenzien P. mRNA binding track in the human 80S ribosome for mRNA analogues randomly substituted with 4-thiouridme residues. // Biochemistry. -1994.-Vol. 33.-P. 6201-6206.

7. Graifer D.M., Juzumiene D.I., Wollenzien P., Karpova G.G. Cross-linking of mRNA analogues containing 4-thiouridine residues on the 3'- or 5'-side of the coding triplet to the mRNA binding center of the human ribosome. // Biochemistry. - 1994. - Vol. 33. - P. 3878-3884.

8. Булыгин K.H , Матасова Н.Б , Грайфер Д M., Веньяминова А.Г., Ямковой В И., Шталъ И., Карпова Г.Г. Белковое окружение матрицы в декодирующей области 80S рибосом из плаценты человека по данным аффинной модификации аналогами мРНК - производными олигонуклеотидов // Молекуляр. биология. - 1996. - Т. 30. - С. 400-409.

9. Смоленская И.А., Грайфер Д.М., Иванов А.В., Владимиров С.Н., Веньяминова А.Г., Репкова М.Н., Шталь И., Карпова Г.Г. Белковое окружение матрицы в области декодирования по данным аффинной модификации рибосом из плаценты человека алкилирующим производным олигорибонуклеотида pGUGU3 // Молекуляр. биология. - 1997. - Т. 31. - С. 144-151.

10 Bulygin K.N , Graifer D.M , Repkova M.N , Smolenskaya I.A, Veniyaminova A.G., Karpova G.G. Nucleotide G-1207 of 18S rRNA is an essential component of the human 80S ribosomal decoding center// RNA. - 1997. - Vol. 3. - P. 1480-1485.

11. Bulygin К N., Matasova N.B., Graifer D.M , Veniyaminova A.G., Yamkovoy V.I., Stahl J , Karpova G.G. Protein environment of mRNA at the decoding site of 80S ribosomes from human placenta as revealed from affinity labeling with mRNA analogs - derivatives of oligonbonucleotides // Biochim.Biophys.Acta. - 1997. - Vol. 1351. - P. 325-332.

12. Смоленская И.А., Булыгин K.H., Грайфер Д.М., Иванов А.В., Веньяминова А.Г., Репкова М.Н., Карпова Г.Г. Расположение матрицы в области декодирования по данным аффинной модификации рибосом человека фотоактивируемым производным олигорибонуклеотида pGUGUUU. // Молекуляр. биология. - 1998. - Т. 32. - С. 233-241.

13. Грайфер Д М., Ляхович А.В., Демешкина Н.А., Иванов А В., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Фотоаффинная модификация 80S рибосом человека аналогом мРНК -производным гексарибонуклеотида pUUUGUU, несущим арилазидогруппу на остатке гуанина// Молекуляр. Биология. - 1999. - Т. 33. - С. 174-182.

14. Грайфер Д.М., Демешкина Н.А., Булыгин К.Н., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г, Карпова Г.Г. Окружение 5'-концевого нуклеотида кодона мРНК в Р- и Е-сайтах рибосомы человека: сшивки с производными pUUUGUU, несущими фотоактивируемую группу на остатке урацила или на 5'-фосфате // Молекуляр. биология. - 2000. - Г. 34. - С. 270-276.

15. Демешкина Н.А., Репкова М.Н., Веньяминова А Г., Грайфер Д.М , Карпова Г.Г. Аналог мРНК - производное pUUUGUU с арилазидогруппой на остатке гуанозина сшивается с нуклеотидами А1823 и А1824 18S рРНК в составе 80S рибосом человека // Молекуляр. биология. - 2000. - Т.34. - С. 894-898.

16. Demeshkina N., Repkova М., Ven'yaminova A., Graifer D , Karpova G. Nucleotides of 18S rRNA surrounding mRNA codons at the human ribosomal A, P and E sites, respectively, a cross-linking study with mRNA analogues carrying aryl azide group at either the uracil or the guanine residue. // RNA. - 2000. - Vol. 6. - P. 1727-1736.

17. Демешкина H.A., Репкова M.H., Веньяминова А.Г., Грайфер Д.М. Карпова Г.Г. Сшивки аналога мРНК, производного pUUAGUAUUUAUU с фотоактивируемой группой на остатке гуанозина, с 80S рибосомами человека // Молекуляр. биология. - 2002. - Т. 36 - С. 114-122

18. Демешкина Н.А., Лалетина Е.С., Мещанинова М.И., Репкова М.Н., Веньяминова АГ, Грайфер Д М , Карпова Г.Г. Окружение кодонов мРНК в Р и Е-сайтах рибосом человека по

данным фотосшивок с производными pUUUGUU // Молекуляр. биология. - 2003. - Т. 37. - С. 147-155.

19. Demeshkina N., Laletina Е., Meschaninova М., Ven'yaminova A., Graifer D., Karpova G. Positioning of mRNA codons with respect to 18S rRNA at the P and E sites of human ribosome // Biochim. Biophys. Acta. - 2003. - Vol. 1627. - P. 39-46.

20 Стяжкина В.А., Молотков M.B., Демешкина H.A., Булыгин К.Н., Грайфер Д.М., Мещанинова М И., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Расположение смыслового и терминирующею кодонов матрицы в А-участке рибосом человека по данным фотосшивок с производными олигорибонуклеотидов // Молекуляр. биология. - 2003. - Т. 37. - С. 1019-1026.

21. Демешкина Н.А., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Грайфер Д.М , Карпова Г.Г. Первый нуклеотид кодона в Р-участке 80S рибосом сближен с нуклеотидом G1702 18S рРНК - по данным сшивок с производным pUUUGUU, несущим перфторфенилазидогруппу на остатке гуанина // Молекуляр. биология. - 2004. - Т. 38. - С. 501-506.

22. Молотков М В., Грайфер Д.М., Мещанинова М.И., Репкова М.Н., Веньяминова А Г., Карпова Г.Г. Белковое окружение смыслового кодона матрицы в А-участке рибосом человека по данным фотосшивок с производными олигорибонуклеотидов // Молекуляр. биология. - 2004. -Т. 38.-С. 493-500.

23. Молотков М.В., Грайфер Д.М., Еремина А.В., Иванов А.В., Лалетина Е.С., Репкова М Н., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Часть матрицы с 5'-стороны от кодона в Е-участке сближена с белком S26 на 80S рибосоме человека // Молекуляр. биология. - 2004. - Т. 38. - С. 1033-1040.

24. Graifer, D., Molotkov, М., Styazhkina, V., Demeshkina, N., Bulygin, К., Eremina, A., Ivanov, A., Laletina, E., Ven'yaminova, A., and Karpova, G. Variable and conserved elements of human ribosomes surrounding the mRNA at the decoding and upstream sites // Nucleic Acids Res. - 2004. -Vol. 32. - P. 3282-3293.

25. Graifer D., Molotkov M., Eremina A., Ven'yaminova A., Repkova M. and Karpova G. The central part of the 5.8S rRNA is differently arranged in programmed and free human ribosomes // Biochem. J. - 2005. - Vol. 387. - P. 139-145.

26. Molotkov M., Graifer D., Demeshkina N., Repkova M., Ven'yaminova A., Karpova G. Arrangement of mRNA 3' of the A site codon on the human 80S ribosome // RNA Biology. - 2005. - Vol. 2. - P. 63-69.

27. Молотков M.B , Грайфер Д.М., Демешкина H.A., Репкова M.H., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Расположение матрицы с 3'-стороны от кодона в А-участке на 80S рибосоме человека // Молекуляр биология. - 2005. - Т. 39. - С. 999-1007.

28. Molotkov M.V., Graifer D.M., Popugaeva Е.А., Bulygin K.N., Meschaninova M.I., Ven'yaminova A.G. and Karpova G.G. mRNA 3' of the A site bound codon is located close to protein S3 on the human 80S ribosome // RNA Biology. - 2006. - Vol. 3. - P. 122-129.

29. Молотков M.B , Грайфер Д.М., Попугаева E.A., Булыгин K.H., Мещанинова М.И., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Белок S3 в 80S рибосоме человека соседствует с мРНК с 3'-стороны от кодона в А-участке // Биоорган, химия - 2007. - Т. 33. - С. 431-441.

30. Хайрулина Ю.С., Молотков М.В, Булыгин К.Н., Грайфер Д М., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. С-концевой фрагмент рибосомного белка S15 расположен в декодирующем центре рибосомы человека// Молекуляр. биология. - 2008. - Т. 42. - С. 306-313.

Подписано в печать 17.10.2008. Заказ № 92 Тираж 130 экз.

Типография Института катализа им. Т.К. Борескова СО РАН

Принятые сокращения.

Введение.

Глава 1. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ РИБОСОМЫ

И ЕЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЦЕНТРОВ (обзор литературы).

1.1. Общая характеристика рибосомных субчастиц эукариот

1.1.1. Особенности морфологии 40Б и 608 субчастиц.

1.1.2. Изменчивость структуры рибосом эукариот.

1.2. Компоненты эукариотической рибосомы.

1.2.1. рРНК

1.2.1.1. Вторичная структура рРНК.

1.2.1.2. Номенклатура элементов вторичной структуры рРНК

1.2.1.3. Роль рРНК в структурной организации и функционировании рибосом

1.2.2. Рибосомные белки

1.2.2.1. Номенклатура и особенности рибосомных белков.

1.2.2.2. Гомология между рибосомными белками эукариот, эубактерий. и архей.

1.2.2.3. Посттрансляционные модификации.

1.2.2.4. Роль рибосомных белков в структурной организации и функционировании рибосомы эукариот

1.2.3. Ионы и полиамины

1.3. Укладка белков и рРНК в рибосомных субчастицах эукариот

1.3.1 Укладка рРНК

1.3.1.1. Методология химического, энзиматического и олигонуклеотидного пробинга.

1.3.1.2. Пробинг вторичной и третичной структуры рРНК.

1.3.2. Расположение белков и рРНК на рибосоме.

1.3.2.1. Данные, полученные с помощью сшивок.

1.3.2.2. Расположение белков на поверхности субчастиц по данным иммуноэлектронной микроскопии.

1.3.2.3. Расположение рРНК и белков в рибосомных субчастицах по данным крио-ЭМ.

1.4. Строение функциональных центров эукариотической рибосомы.

1.4.1. Участки рРНК, вовлеченные в функционирование рибосомы.

1.4.1.1. Участки, вовлеченные в ассоциацию субчастиц.

1.4.1.2. Участки 18S рРНК, вовлеченные в связывание eIF на 40S субчастице

1.4.1.3. Участки рРНК, вовлеченные в связывание eEF2 на 80S рибосоме и «ОТРаза-активирующий центр».

1.4.1.4. Участки рРНК, вовлеченные в связывание мРНК, пептидил-тРНК и белков, ассоциированных с полисомами.

1.4.1.5. Фрагмент 18S рРНК в районе декодирующего центра

1.4.1.6. Фрагмент 5.8S рРНК, вовлеченный в процесс транслокации

1.4.2. Рибосомные белки, влияющие на функционирование рибосомы.

1.4.3. Строение функциональных центров рибосомы эукариот по данным крио-ЭМ.

1.4.3.1. Контактные поверхности субчастиц.

1.4.3.2. тРНК-связывающие центры.

1.4.3.3. мРНК-связывающий центр.

1.4.3.4. Участок связывания eEF

1.4.3.5. Участок связывания eEF

1.4.3.6. Выход из полипептидного туннеля и участок связывания SRP.

1.4.3.7. Участок связывания большой субчастицы с мембраной эндоплазматического ретикулума.

В клетках всех организмов - от прокариот до человека - реализация генетической информации происходит на рибосомах, где последовательности тринуклеотидов-кодонов мРНК, скопированные с ДНК, транслируются в аминокислотные последовательности синтезируемых белков. Рибосома - это уникальный рибонуклеопротеид, обладающий сложнейшей четвертичной структурой и состоящий из большой и малой субчастиц, каждая из которых содержит рРНК и несколько десятков белков. Синтез белков на рибосомах является одним из ключевых процессов жизнедеятельности организмов, поэтому установление молекулярных механизмов, лежащих в его основе, и строения функциональных центров рибосомы является одной из важнейших проблем молекулярной биологии. Эта проблема особенно актуальна в случае рибосом млекопитающих, в частности, человека, поскольку природа многих болезней связана с нарушениями в механизмах регуляции функционирования белок-синтезирующей системы. Знание особенностей устройства функциональных центров эукариотической рибосомы является принципиально важным для понимания не только молекулярных механизмов трансляции у эукариот, но и природы тех регуляторных процессов, которые обеспечивают эффективность и точность белкового синтеза.

Рибосомы прокариот к настоящему времени детально изучены с применением различных методов, но наиболее впечатляющие успехи в расшифровке структуры рибосомы достигнуты на рубеже XX и XXI столетий благодаря рентгеноструктурному анализу (РСА), который позволил установить с высоким разрешением строение рибосом прокариот (Ban et al., 2000; Carter et al„ 2000; Yusupov et al., 2001; Selmer et al., 2006; Korostelev et al., 2006) и выйти на новый уровень биохимических исследований, касающихся изучения молекулярных аспектов функционирования рибосомы (см., например, Leonov et al., 2003; Sergiev et al., 2005; Kubarenko et al., 2006). Однако метод РСА до сих пор неприменим для изучения эукариотических рибосом, поскольку кристаллы рибосом, пригодные для такого анализа, пока не получены. Метод крио-электронной микроскопии, интенсивно используемый для изучения эукариотических рибосом в последнее время, пока остается непригодным для определения структуры одного из важнейших функциональных центров рибосомы - мРНК-связывающего центра, поскольку разрешение, которое удается получить на эукариотических рибосомах, не позволяет четко "видеть" мРНК. Кроме того, с помощью этого метода не могут быть картированы рибосомные белки, не имеющие прокариотических гомологов. Наконец, методы, основанные на реконструкции рибосомных субчастиц из белков и рРНК (например, сайт-направленный мутагенез рРНК и сайт-направленное введение сшивающих групп в рРНК или белки), неприменимы для исследования рибосом высших эукариот, потому что до сих пор не найдено подходов к сборке активных субастиц рибосом эукариот in vitro.

К моменту начала настоящей работы практически отсутствовали данные по структурно-функциональной топографии рибосомы эукариот за исключением нескольких работ по изучению мРНК-связывающего центра рибосом из печени крысы с помощью аффинной модификации с использованием аналогов мРНК - алкилирующих производных олигорибонуклеотидов (Stahl and Kobetz, 1981, 1984; Stahl and Karpova, 1985) и по исследованию 48S предынициаторных комплексов методом прямых УФ-индуцированных сшивок (см., например, Westermann and Nygard, 1984). Метод аффинной модификации (аффинного химического сшивания) оказался очень продуктивным для изучения структурно-функциональной топографии прокариотических рибосом и остается на сегодняшний день одним из наиболее приемлемых методов, способных давать детальную информацию о молекулярном окружении мРНК на эукариотической рибосоме. Основной целью настоящей работы являлось установление структурной организации мРНК-связывающего центра рибосомы человека, а именно, выявление нуклеотидов рРНК и рибосомных белков, принимающих участие в формировании этого центра. Для решения поставленной задачи использован один из наиболее продуктивных методов биоорганической химии, а именно метод аффинной модификации (аффинного химического сшивания) рибосом реакционноспособными аналогами мРНК. В качестве таких аналогов использован набор производных олигорибонуклеотидов, различающихся длиной, последовательностью и типом сшивающей группы, а также положением и природой нуклеотида, несущего эту группу. Одно из таких производных применено в качестве зонда для изучения структурно-функциональной топографии уникальной для рибосом эукариот 5.8S рРНК.

В ходе исследования планировалось:

• разработать методологию получения модельных комплексов аналогов мРНК с рибосомами, в которых расположение аналога мРНК можно было бы задавать с помощью тРНК, узнающей определенный кодон мРНК в отсутствие факторов трансляции;

• изучить фотоаффинную модификацию 80S рибосом человека аналогами мРНК длиной около 50 нт, несущими остатки 4-тиоуридина, и определить нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с этими аналогами;

13

• изучить аффинную модификацию 80S рибосом производными олигорибонуклеотидов, несущими алкилирующую или п-азидотетрафторбензоильную группу, в составе комплексов, различающихся расположением модифицированного нуклеотида аналога мРНК относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке;

• определить нуклеотиды рРНК и рибосомные белки, сшивающиеся с указанными аналогами мРНК, и тем самым получить информацию о структурных элементах 80S рибосомы, соседствующих с мРНК в области кодон-антикодоновых взаимодействий и в районах, прилегающих к кодонам в Е и А-участках;

• на основании полученных результатов охарактеризовать основные черты структурной организации мРНК-связывающего центра рибосомы человека и, сопоставив эти результаты с данными по структурно-функциональной топографии прокариотической рибосомы, выявить элементы сходства и различия в структурной организации этого центра у прокариот и млекопитающих;

• показать возможность использования реакционноспособных производных олигорибонуклеотидов в качестве зондов для изучения доступности и молекулярного окружения определенных последовательностей в рРНК на разных стадиях процесса трансляции.

ВЫВОДЫ

Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование структурно-функциональной топографии рибосомы человека. Это исследование позволило получить уникальную информацию о молекулярном окружении мРНК на 80S рибосоме на уровне нуклеотидов рРНК и рибосомных белков, в случае одного из них - на уровне олигопептидной последовательности, а также о расположении центральной части 5.8S рРНК в 60S субчастице рибосомы и степени ее экспонированности на разных стадиях трансляции.

1. Для изучения молекулярного окружения мРНК на 80S рибосоме человека предложен набор фотоактивируемых аналогов мРНК - производных олигорибонуклеотидов длиной от 3 до 12 нт, различающихся природой и положением нуклеотида, несущего сшивающую группу, который использован для аффинной модификации рибосом наряду с алкилирующими производными олигорибонуклеотидов.

• Установлено, что в отсутствие факторов трансляции короткие аналоги мРНК, могут быть с высокой степенью точности фазированы на рибосоме с помощью прокариотических тРНК, узнающих кодон, направляемый в Р-участок, в отличие от аналогов мРНК длиной около 50 нт.

• Показано, что при облучении мягким УФ-светом комплексов 80S рибосом с тРНК и аналогами мРНК, несущими алкилирующую группу на 3'- или 5'-конце или п-азидотетрафторбензоильную группу на остатке уридина, гуанозина или 5'-концевом фосфате, происходят сшивки аналогов с рибосомами; для всех аналогов основной мишенью сшивки являлась 40S субчастица.

2. Определены рибосомные белки и нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с аналогами мРНК. Обнаружено, что результаты аффинной модификации (наборы сшивающихся белков, положение сшитого нуклеотида в 18S рРНК и выход каждого из продуктов сшивки) зависят не только от положения модифицированного нуклеотида аналога мРНК на рибосоме, но и от его природы и типа сшивающей группы.

3. Показано, что нуклеотиды рРНК малых субчастиц, соседствующие с мРНК, составляют консервативный "кор" (сердцевину) рибосомы, структурно идентичную в рибосомах всех организмов.

• Установлено, что 18S рРНК сближена с довольно протяженным фрагментом мРНК - с нуклеотидами в положениях от -3 до +9 относительно первого нуклеотида ко дона в Р-участке.

• Показано, что все нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с аналогами мРНК, находятся в консервативных районах рРНК малых рибосомных субчастиц и по положению во вторичной структуре точно соответствуют нуклеотидам 16S рРНК, контактирующим с мРНК по данным рентгеноструктурного анализа рибосом прокариот.

4. Установлено, что у млекопитающих рибосомные белки играют большую роль в организации мРНК-связывающего центра рибосом, чем у прокариот, и обнаружены значительные различия в белковом окружении мРНК на рибосомах про- и эукариот.

• Показано, что белки сближены со всеми нуклеотидами мРНК в положениях от -9 до +12, а нуклеотиды в положениях от -4 до -9 и от +9 до +12 соседствуют в основном с белками.

• Установлено, что на 80S рибосоме нуклеотиды мРНК в положениях от +1 до -3 соседствуют с белками S6 и S26, не имеющими прокариотических гомологов, а в положениях от -4 до -9 - в основном с белком S26. Нуклеотиды в декодирующем центре (в положениях от +4 до +6) и в положении +7 сближены преимущественно с белком S15, чей прокариотический гомолог S19 удален от декодирующего центра на расстояние более 35 Â.

• Обнаружено, что нуклеотиды мРНК в положениях от +4 до +7 соседствуют на 80S рибосоме с С-концевым фрагментом 111-145 белка S15, что указывает на участие этого фрагмента в формировании декодирующего центра эукариотической рибосомы.

• Выявлено сходство в белковом окружении мРНК на рибосоме с 3'-стороны от кодона в декодирующем центре у про- и эукариот. Показано, что эта часть мРНК соседствует в основном с белком S3, прокариотический гомолог которого контактирует с мРНК с 3'-стороны от кодона в А-участке.

5. С использованием производного нонарибонуклеотида, содержащего последовательность, комплементарную фрагменту 82-86 в центральном районе 5.8S рРНК, и перфторфенилазидогруппу на первом остатке уридина, впервые изучено расположение этого района 5.8S рРНК в рибосоме млекопитающих, а также его доступность для комплементарно-адресованной модификации этим производным в разных функциональных состояниях рибосомы.

253

БЛАГОДАРНОСТИ

На разных этапах настоящей работы в ней принимали участие сотрудники и аспиранты Лаборатории структуры и функции рибосом НИБХ СО РАН (с 2003 г. ИХБФМ СО РАН) -М.А. Зенкова, A.A. Малыгин, К.Н. Булыгин, H.A. Демешкина и М.В. Молотков, а также д-р П. Воллензиен (США), д-р И. Шталь (Германия) и работавшие под руководством автора студенты НГУ. Автор приносит им искреннюю благодарность. Автор также очень благодарен зав. лабораторией химии РНК ИХБФМ СО РАН А.Г. Веньяминовой и ее сотрудникам, которые обеспечили работу олигорибонуклеотидами и их производными, содержащими реакционноспособную группу на остатках уридина.

Особую признательность автор выражает д.х.н. профессору Г.Г. Карповой, которая была инициатором работы и уделяла ей первоочередное внимание на всех стадиях от постановки задач до представления результатов в виде статей, тезисов докладов и настоящей диссертации. Автор также очень признателен академику Д.Г. Кнорре за постоянную поддержку и интерес к данной работе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение метода афинной модификации рибосом с использованием производных олигорибонуклеотидов, несущих реакционноспособную группу в заданном положении, позволило получить уникальную информацию о структурно-функциональной организации рибосом млекопитающих, которую до сих пор не могут дать другие методы и подходы. В настоящей работе впервые получено экспериментальное подтверждение распространенного представления о том, что нуклеотиды рРНК, принимающие участие в формировании мРНК-связывающего центра, включая участок декодирования, составляют консервативный "кор" (сердцевину) рибосомы, структурно идентичную в рибосомах всех организмов. Это согласуется с представлением о «мире РНК», согласно которому проторибосома, возникшая на заре эволюции, состояла только из рРНК, а белки появились в составе рибосомы позже. Возможно, первоначальная роль белков состояла в поддержании пространственной структуры рРНК, оптимальной для функционирования рибосомы, но в процессе дальнейшей эволюции роль белков возросла и они стали принимать участие в формировании некоторых функциональных центров рибосом. Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что у эукариот рибосомные белки вносят больший вклад в формирование мРНК-связывающего центра, чем у прокариот. Более того, молекулярное окружение мРНК на рибосоме млекопитающих в значительной степени состоит из эукариот-специфичных рибосомных белков, а также белков, которые хоть и имеют прокариотические гомологи, но соседствуют с мРНК своими эукариот-специфичными последовательностями. Эти данные несомненно должны поставить под сомнение широко распространенную точку зрения, что эукариотическая рибосома представляет собой просто усложненную копию прокариотической рибосомы, в которой все функциональные центры устроены в общем так же, как и в прокариотической рибосоме, а эукариот-специфичные белки расположены на периферии, вдали от функциональных центров, и нужны главным образом для поддержания «правильной» пространственной структуры фрагментов рРНК, отсутствующих у прокариот.

Можно предположить, что вовлечение в формирование мРНК-связывающего центра 80S рибосом специфичных для эукариот олигопептидных последовательностей или белков связано с их способностью взаимодействовать с различными факторами (шалеронами, модифицирующими ферментами и пр.), влияющими на эффективность и точность трансляции, или служить мишенями для этих факторов. Это, в свою очередь, может обеспечивать более сложную и многостадийную систему регуляции белкового синтеза у эукариот по сравнению с прокариотами. Высказанная гипотеза базируется на том, что различия в молекулярном окружении мРНК на рибосомах прокариот и эукариот касаются в наибольшей степени окружения той части мРНК, которая находится с 5'-стороны от кодона в E-участке; именно те компоненты рибосомы, которые формируют это окружение, отвечают за ее взаимодействие с 5'-нетранслируемой областью мРНК, которая может участвовать в различных регуляторных процессах.

Недавно результаты настоящей работы были полностью подтверждены данными по сшивкам мРНК, несущих остатки s4U, с рибосомами кролика в составе 48S предынициаторного и 80S инициаторного комплексов (Pisarev et al., 2006; 2008). Оказалось, что в составе этих комплексов мРНК соседствует с теми же нуклеотидами рРНК и рибосомными белками, что и в комплексах рибосом человека, изученных в настоящей работе, а нуклеотиды мРНК в положениях от -8 до -17 контактируют со специфичным для эукариот фактором инициации eIF3, что согласуется с высказанной выше гипотезой.

Фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов оказались полезными для изучения не только структурной организации мРНК-связывающего центра рибосомы человека, но и в качестве комплементарно-адресованных зондов (которые имеют ряд преимуществ по сравнению с обычными антисмысловыми олигонуклеотидами) для изучения изменений, которые могут происходить в определенных участках структуры рРНК при переходе рибосомы из одного функционального состояния в другое. В частности, в настоящей работе с использованием такого зонда удалось обнаружить зависимость доступности последовательности в центральной части 5.8S рРНК от состояния рибосомы, благодаря чему стала более понятной роль 5.8S рРНК в процессе трансляции.

Нет сомнений, что использование метода аффинной модификации для изучения структурно-функциональной топографии эукариотической рибосомы дает уникальную возможность получать всестороннюю информацию об особенностях устройства ее функциональных центров, что является принципиально важным для понимания как молекулярных механизмов трансляции у эукариот, так и тех регуляторных процессов, которые обеспечивают эффективность и точность белкового синтеза.

1. Беликова A.M., Гринёва Н.И. Алкилирование нуклеиновых кислот и их компонентов. VIII. Реакция 2\3'-0-4-(№2-хлорэтил-М-метиламино).бензилиден]-уридина и -аденозина с тРНК //Изв.Сиб.Отд. АН СССР, сер.хим.наук. 1971. Вып. 5. С. 119-127.

2. Булычев Н.В., Грайфер Д.М., Карпова Г.Г., Лебедев A.B. Препаративное выделение индивидуальной тРНКРЬе высокоэффективной жидкостной обращенно-фазовой хроматографией //Биоорган, химия. 1988. Т. 14. С. 27-30.

3. Гимаутдинова О.И., Карпова Г.Г., Козырева H.A. Аффинная модификация рибосом Е. coli 4-(ТЧ-2-хлорэтил-1\1-метил)амино.-бензил-5'-фосфамидами олироуридилатов разной длины //Молекуляр. биология. 1982. Т. 16. С. 752-762.

4. Карпова Г.Г., Кобец Н.Д., Силина С.А., Годовиков A.A. Аффинная модификация 16S РНК в составе рибосом E.coli аналогом гептауридилата, несущим на З'-конце химически активную группу // Биоорган, химия. 1981. Т. 7. С. 1503-1511.

5. Карпова Г.Г. Химические аспекты комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот //Изв. СО АН СССР, сер. хим. наук. 1987. Вып. 12. С. 82-95.

6. Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г. Структурно-функциональная топография рибосом E.coli по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК и тРНК // Успехи биологической химии. 1991. Т. 32. С. 3-49.

7. Кнорре Д.Г., Карпова Г.Г., Кобец Н.Д. Аффинная модификация рибосом E.coli вблизи мРНК- и тРНК связывающих центров // Итоги науки и техники (ВИНИТИ). 1985. Т. 4. С. 87-143.

8. Росс У. Биологически активные вещества// Медицина (Москва). 1964. С. 30, 98, 100.

9. Сергиев П.В., Донцова О.А., Богданов А.А. Изучение структуры прокариотической рибосомы биохимическими методами: судный день // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С. 559-583.

10. Черноловская E.JL, Черепанов П.П., Горожанкин А.В., Добриков М.И., Власов В.В., Кобец Н.Д. Взаимодействие фотоактивных производных олиготимидилата с хроматином клеток HeLa // Биоорган, химия. 1993. Т. 19. С. 889-896.

11. Alkemar G. and Nygard О. Secondary structure of two regions in expansion segments ES3 and ES6 with the potential of forming a tertiary interaction in eukaryotic 40S ribosomal subunits // RNA. 2004. Vol. 10. P. 403-411.

12. Alkemar G. and Nygard O. Probing of the secondary structure of expansion segment ES6 in 18S ribosomal RNA // Biochemistry. 2006. Vol. 45. P. 8067-8078.

13. Azad F., Failla P. and Hanna P.J. Inhibition of Ribosomal Subunit Association and Protein Synthesis by Oligonucleotides Corresponding to Defined Regions of 18S rRNA and 5S rRNA // Biochim. Biophys. Res. Commun. 1998. Vol. 248. P. 51-56.

14. Ban N, Nissen P., Hansen J., Moore P.B. and Steitz T.A. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution // Science. 2000. Vol. 289. P. 905-920.

15. Bakowska-Zywicka K. and Twardowski T. Correlation of the structure and conformational changes of selected fragments of plant small ribosomal RNA within the steps of polypeptide chain elongation // J. Plant Physiol. 2007. Vol. 164. P. 496-504.

16. Ballesta J.P., Rodriguez-Gabriel M.A., Bou G., Briones E., Zambrano R. and Remacha M. Phosphorylation of the yeast ribosomal stalk. Functional effects and enzymes involved in the process // FEMS Microbiol. Rev. 1999. Vol. 23. P. 537-550.

17. Bartetzko A. and Nierhaus K.H. Mg2+/NH4/polyamine system for polyuridine-dependent polyphenylalanine sunthesis with near in vivo characteristics // Methods Enzymol. 1988. Vol. 164. P. 650-658.

18. Bashan A., Zarivach R., Schluenzen F., Agmon I., Harms J., Auerbach, T., Baram D., Berisio R., Bartels H., Hansen H.et al. Ribosomal Crystallography: peptide bond formation and its inhibition //Biopolymers. 2003. Vol. 79. P. 19-41.

19. Bhangu R. and Wollenzien P. L. The mRNA binding track in the Escherichia coli ribosome for mRNAs of different sequences // Biochemistry. 1992. Vol. 31. P. 5937-5944.

20. Bhangu R., Juzumiene D.I. and Wollenzien P. L. Arrangement of messenger RNA on Escherichia coli ribosomes with respect to 10 16S rRNA cross-linking sites // Biochemistry 1994. Vol. 33. P. 3063-70.

21. Bielka H., Bommer U.-A., Noll F., Stahl J., Welfle H. and Westermann P. The eukaryotic ribosome /Bielka H., ed. Academie-Verlag, Berlin, 1982.

22. Blau M., Mullapudi S., Becker t., Dudek J., Zimmermann R., Penczek H.A. and Beckmann R. ERjlp uses a universal ribosomal adaptor site to coordinate the 80S ribosome at the membrane // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. Vol. 12. P. 1015-1016.

23. Boehringer, D., Thermann, R., Ostareck-Lederer, A., Lewis, J.D. and Stark, H. Structure of the hepatitis C virus IRES bound to the human 80S ribosome: remodeling of the HCV IRES // Structure. 2005. Vol. 13. P. 1695-1706.

24. Boguski M. S., Hieter P. A. and Levy C. C. Identification of a cytidine-specific ribonuclease from chicken liver // J. Biol. Chem. 1980. Vol. 255. P. 2160-2163.

25. Briones C. and Ballesta J.P.G. Conformational changes induced in the Saccharomyces cerevisiae GTPase-associated rRNA by ribosomal stalk components and a translational inhibitor // Nucl. Acids Res. 2000. Vol. 28. P. 4497-4505.

26. Brodersen D.E. and Nissen P. The social life of ribosomal proteins // FEBS J. 2005. Vol. 272. P. 2098-2108.

27. Brosius J., Dull T.J. and Noller H.F. Complete nucleotide sequence of a 23S ribosomal RNA gene from Escherichia coli // Proc. Natl. Acad Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 201-204.

28. Carter A.P., Clemons W.M., Brodersen D.E., Morgan-Warren R.J., Wimberly B.T. and Ramakrishnan V. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics // Nature. 2000. Vol. 407. P. 340-348.

29. Ceci M., Gaviraghi C., Gorrini C., Sala L.A., Offenhauser N., Marchisio P.C. and Biffo S. Release of eIF6 (p27BBP) from the 60S subunit allows 80S ribosome assembly // Nature. 2003. Vol. 426. P. 579-584.

30. Chandramouli, P., Topf, M., Menetret, J.-F., Eswar, N., Cannone, J.J., Gutell, R.R., Sali, A. and Akey, C.W. Structure of the Mammalian 80S Ribosome at 8.7 A Resolution // Structure. 2008. Vol. 16. P. 535-548.

31. Changchien L.-M. and Craven G.R. The use of hydroxylamine cleavage to produce a frament of ribosomal protein S4 which retains the capacity to specifically bind 16S ribosomal RNA // Nucleic Acids Res. 1986. Vol. 14. P. 1957-1966.

32. Chavatte L., Frolova L., Kisselev L., Favre A. The polypeptide chain release factor eRFl specifically contacts the s(4)UGA stop codon located in the A site of eukaryotic ribosomes // Eur. J. Biochem. 2001. Vol. 268. P. 2896-904.

33. Chavatte L., Seit-Nebi A., Dubovaya V., Favre A. The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRFl in the ribosome // EMBO J. 2002. Vol. 21. P. 53025311.

34. Chavatte L., Brown B.A.I.I. and Driscoll D.M. Ribosomal protein L30 is a component of of the UGA-selenocysteine recoding machinery in eukaryotes // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. Vol. 12. P. 408-416.

35. Ciesiolka J., Lorenz S. and Erdmann V. A. Different conformational forms of Escherichia coli and rat liver 5S rRNA revealed by Pb(II)-induced hydrolysis // Eur. J. Biochem. 1992a. Vol. 204. P. 583-589.

36. Ciesiolka, J., Lorenz, S. & Erdmann, V. A. Structural analysis of three prokaryotic 5S rRNA species and selected 5S rRNA-ribosomal-protein complexes by means of Pb(II)-induced hydrolysis // Eur. J. Biochem. 1992b. Vol. 204. P. 575-581.

37. Clark C.G., Tague B.W., Ware V.C. and Gerbi S.A. Xenopus laevis 28S rRNA: A secondary structure model and its evolutionary and functional implications // Nucleic Acids Res. 1984. Vol. 12. P. 6197-6220.

38. Cuatrecasas P., Fuchs S. and Anfinsen C. B. Catalytic properties and specificity of the extracellular nuclease of Staphylococcus aureus // J. Biol. Chem. 1967. Vol. 242. P. 1541-1547.

39. Doudna J. A. and Rath V.L. Structure and function of the eukaryotic ribosome: the next frontier // Cell. 2002. Vol. 109. P. 153-156. .

40. Dresios J., Panopoulos P., Frantziou C.P. and Synetos D. Yeast ribosomal protein deletion mutants possesses altered peptidyltransferase activity and sensitivity to cycloheximide // Biochemistry. 2001. Vol. 40. P. 8101-8108.

41. Dresios J., Chan Y.L. and Wool I.G. The role of zinc finger motif and of the residues at the amino terminus in the function of yeast ribosomal protein YL37a // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 316. P. 475-488.

42. Dresios J., Panopoulos P., Suzuki K. and Synetos D. A dispensable yeast ribosomal protein optimizes peptidyltransferase activity and affects translocation // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 3314-3322.

43. Dresios J., Panopoulos P. and Synetos D. Eukaryotic ribosomal proteins lacking a eubacterial counterpart: important players in ribosomal function // Mol. Microbiol. 2006. Vol. 59. P. 16511663.

44. Ehresmann C., Baudin F., Mougel M., Romby P., Ebel J. P. And Ehresmann B. Probing the structure of RNAs in solution //Nucl. Acids Res. 1987. Vol. 15. P. 9109-9128.

45. Elela S.A., Good L., Melekhovets Y.F. and Nazar, R. Inhibition of protein synthesis by an efficiently expressed mutation in the yeast 5.8S ribosomal RNA // Nucleic Acids Res. 1994, Vol. 22. P. 686-693.

46. Elela S.A. and Nazar R. Role of 5.8S rRNA in ribosome translocation // Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25. P. 1788-1794.

47. Favorova O.O., Fasiolo F., Keith G., Vassilenko S.K. and Ebel J. P. Partial digestion of tRNA-aminoacyl-tRNA synthetase complexes with cobra venom ribonuclease // Biochemistry. 1981. Vol. 20. P. 1006-1011.

48. Ferreras A.C., Bandeira E., Cayama E., Zambrano R., Avila H., Yepez A., Triana J.L. and Triana-Alonso F.J. Efficient and faithful in vitro translation of natural and synthetic mRNA with human ribosomes // Int. J. Mol. Med. 2004. Vol. 13. P. 527-536.

49. Fleischer T., Weawer C.M., McAfee K.J., Jennings J.L. and Link A.J. Systematic identification and functional screens of uncharacterized protiens associated with eukaryotic ribosomal complexes // Genes Dev. 2006. Vol. 20. P. 1294-1307.

50. Frank J., Zhu J., Penczek P., Li Y., Srivastava S., Verschoor A., Radermacher M., Grassucci R., Lata R.K. and Agrawal R.K. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome //Nature. 1995. Vol. 376. P. 441-444.

51. Frank J. and Agrawal R.K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation//Nature. 2000. Vol. 406. P. 318-322.

52. Frank J. and Agrawal R.K. Ratchet-like movements between the two ribosomal subunits: their implications in elongation factor recognition and tRNA translocation // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2001. Vol. 66. P. 67-75.

53. Gomez E.B., Medina G., Ballesta J.P., Levin M.J. and Tellez-Inon M.T. Acidic ribosomal P proteins are phosphorylated in Trypanosoma cruzi // Int. J. Parasitol. 2001. Vol. 31. P. 10321039.

54. Gonzalez I.L., Chambers C., Gorski J.L., Stambolian D., Schmickel R.D. and Sylvester J.E. Sequence and structure correlation of human ribosomal transcribed spacers // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 212. P. 27-35.

55. Gorski J.L., Gonzalez I.L. and Schmickel R.D. The secondary structure of human 28S rRNA: the Structure and evolution of a mosaic rRNA gene // J. Mol. Evol. 1987. Vol. 24. P. 236-251.

56. Goss D.J. and Harrigan T. Magnesium ion dependent equilibria, kinetics and thermodynamic parameters of Artemia ribosome dissociation and subunit association // Biochemistry. 1986. Vol. 25. P. 3690-3695.

57. Graifer D.M., Zenkova M.A., Malygin A.A., Mamaev S.V., Mundus D.A. and Karpova G.G. Identification of a site on 18S rRNA of human placenta ribosomes in the region of the mRNA binding center//J. Mol. Biol. 1990. Vol. 214. P. 121-128.

58. Green R. and Noller H. Ribosomes and translation // Annu Rev. Biochem. 1997. Vol. 66. P. 679716.

59. Gu S.Q., PeskeF., Wieden H.J., Rodnina M.V. and Wintermeyer W. The signal recognition particle binds to protein L23 at the peptide exit of the Escherichia coli ribosome // RNA. 2003. Vol. 9. P. 566-573.

60. Gueydan C., Wauquier C., De Mees C, Huez G. and Kruys V. Identification of ribosomal proteins specific to higher eukaryotes // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 45034-45040.

61. Hagiya A., Naganuma T., Maki Y., Ohta J., Tohkairin Y., Shimizu T., Nomura T., Hachimori A. and Uchiumi T. A mode of assembly of P0, PI and P2 proteins at the GTPase-associated center in animal ribosome // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280. P. 39193-39199.

62. Halic M., Becker T., Pool M.R., Spahn C.M.T., Grassucci R.A., Frank J. and Beckmann R. Structure of the signal recognition particle interacting with the elongation-arrested ribosome // Nature. 2004. Vol. 427. P. 808-814.

63. Halic M. and Beckmann R. The signal recognition particle and its interactions during protein targeting // Curr. Opin. Struct. Biol. 2005. Vol. 15. P. 116-25.

64. Halic M., Gartmann M., Schlenker O., Mielke T., Pool M.R., Sinning I. and Beckmann R. Signal recognition particle receptor exposes the ribosomal translocon binding site // Science. 2006. Vol. 312. P. 745-747.

65. Hancock J.M. The contribution of DNA slippage to eukaryotic nuclearl8S rRNA evolution // J. Mol. Evol. 1995. Vol. 40. P. 629-639.

66. Hancock J.M. and Vogler A.P. How slippage-derived sequences are incorporated into rRNA variable-region secondary structure: implications for phylogeny reconstruction // Mol. Phylogenet. Evol. 2000. Vol. 14. P. 366-374.

67. Hoa G.H.B., Begard E., Beaudry P., Maurel P., Grunberg-Manago M. and Douzou P. Analysis of Cosolvent and divalent cation effects on association equilibrium and activity of ribosomes // Biochemistry. 1980. Vol. 19. P. 3080-3087.

68. Hoang L., Fredrick K., Noller H.F. Creating ribosomes with an all-RNA 30S subunit P site // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. Vol. 101. P. 12439-12443.

69. Hogan J.J., Gutell R.R. and Noller H.F. Probing the conformation of 18S rRNA in yeast 40S ribosomal subunits with kethoxal // Biochemistry. 1984a. Vol. 23. P. 3322-3330.

70. Hogan J.J., Gutell R.R. and Noller H.F. Probing the conformation of 26S rRNA in yeast 60S ribosomal subunits with kethoxal // Biochemistry. 1984b. Vol. 23. P. 3330-3335.

71. Holmberg L., Melander Y. and Nygard O. Probing the structure of mouse Ehrlich ascites cell 5.8S, 18S and 28S ribosomal RNA in situ //Nucleic Acids Res. 1994a. Vol. 22. P. 1374-1382.

72. Holmberg L., Melander Y. and Nygard O. Probing the con-formational changes in 5.8S, 18S and 28S rRNA upon association of derived subunits into complete 80S ribosomes // Nucleic Acids Res. 1994b. Vol. 22. P. 2776-2783.

73. Khaitovich P., Tenson T., Mankin A.S. and Green R. Peptidyl transferase activity catalyzed by protein-free 23S ribosomal RNA remains elusive // RNA. 1999. Vol. 5. P. 605-608.

74. Kisselev, L.L., Ehrenberg, M., and Frolova, L.Yu. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors // EMBO J. 2003. Vol. 22. P. 175-182.

75. Klein D .J., Moore P.B., Steitz T.A. The roles of ribosomal proteins in the structure assembly, and evolution of the large ribosomal subunit// J. Mol. Biol. 2004. Vol. 340. P. 141-177.

76. Knorre, D.G., Vlassov, V.V., Zarytova, V.F. and Karpova, G.G. Nucleotide and oligonucleotide derivatives as enzymes and nucleic acid targeted irreversible inhibitors // Chemical aspects. Adv. Enzym. Regulat. 1985. Vol. 24. P. 277-300.

77. Korostelev A., Tralchanov S., Laurberg M., Noller H.F. Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions and rearrangements // Cell. 2006. Vol. 126. P. 1065-1077.

78. Krieg J., Hofsteenge J. and Thomas G. Identification of the 40S ribosomal protein S6 phosphorylation sites induced by cycloheximide // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. P. 1147311477.

79. Kruse T.A, Siboslca G.E. and Clark B. F. C Photosensitized cross-linking of tRNA to the P, A and R sites of Escherichia coli ribosomes // Biochimie. 1982. Vol. 64. P. 279-284.

80. Maden B.E. and Hughes J.M. Eukaryotic ribosomal RNA: the recent excitement in the nucleotide modification pattern// Chromosoma. 1997. Vol. 105. P. 391-400.

81. Madjar J.-J., Arpin M., Buisson M., Reboud J.-P. Spot position of rat liver ribosomal proteins by four different two-dimensional electrophoresis in Polyacrylamide gel // Mol. Gen. Genet. 1979. Vol. 171. P. 121-134.

82. Malygin A.A., Dobrikov M.I., Repkova M.N., Shishkin G.V., Veny'aminova A.G., Karpova G.G. Proteins neighboring 18S rRNA conserved sequences 609-618 and 1047-1061 within the 40S human ribosomal subunit // RNA. 1999. Vol. 5. P. 1656-1664.

83. Malygin, A.A., Dobrikov, M.I., Repkova, M.N., Shishkin, G.V., Veny'aminova, A.G., and Karpova G.G. Proteins neighboring 18S rRNA conserved sequences 609-618 and 1047-1061 within the 40S human ribosomal subunit // RNA. 1999. Vol. 5. P. 1656-1664.

84. Malygin A.A., Shaulo D.D. and Karpova G.G. Proteins S7, S10, S16 and S19 of the human 40S ribosomal subunit are most resistant to dissociation by salt // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1494. P.213-216.

85. Matassova N.B., Venjaminova A.G., Karpova G.G. Nucleotides of 18S rRNA surrounding mRNA at the decoding site of translating human ribosome as revealed from the cross-linking data//Biochim.Biophys.Acta. 1998. Vol. 1397. P. 231-239.

86. Mauro V. and Edelman G. The ribosome filter hypothesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P. 12031-12036.

87. Melander Y., Holmberg L. and Nygard O. Structure of 18S rRNA in native 40S ribosomal subunits // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 3254-3258.

88. Menetret J.F., Neuhof A., Morgan D.G., Plath K., Radermacher M., Rapoport T.A. and Akey C.W. The structure of ribosome-channel complexes engaged in protein translocation // Mol. Cell. 2000. Vol. 6. P. 1219-1232.

89. Merrick, W.C. Mechanism and regulation of eukaryotic protein synthesis // Microbiol. Rev. 1992. Vol. 56. P. 291-315.

90. Merryman C. and Noller H.F. Footprinting and modification interference analysis of binding sites on RNA. In: RNA:protein interactions A practical approach (ed. Smith C.W.J.). Oxford University Press, Oxford, UK, 1998. P. 237-253.

91. Merryman C., Moazed D., McWhirter J. and Noller H.F. Nucleotides in 16S rRNA protected by the association of 30S and 50S ribosomal subunits // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 285. P. 97-105.

92. Meyer T.H., Menetret J.F., Breitling R., Miller K.R., Akey C.W. and Rapoport T.A. The bacterial SecY/E translocation complex forms channel-like structures similar to those of the eukaryotic Sec61p complex // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 285. P. 1789-1800.

93. Moazed D., Stern and Noller H.F. Rapid chemical probing of conformation in 16 S ribosomal RNA and 30 S ribosomal subunits using primer extension // J. Mol. Biol. 1986. Vol. 187. P. 399416.

94. Moazed D., Robertson J.M. and Noller H.F. Interaction of elongation factors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA //Nature. 1988. Vol. 334. P. 362-364.

95. Morgan, D.G., Menetret, J.-.F, Neuhof, A., Rapoport, T.A. and Akey, C.W. Structure of the mammalian ribosome-channel complex at 17 A resolution // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 324. P. 871886.

96. Musters W., Boon K., van der Sande C.A., van Heerikhuizen, H. and Planta R.J. Functional analysis of transcribed spacers of yeast ribosomal DNA // EMBO J. 1990. Vol. 9. P. 3989-3996.

97. Naora H. Involvement of ribosomal proteins in regulating cell growth and apoptosis: translational modulation or recruitment for extraribosomal activity? // Immunol. Cell Biol. 1999. Vol. 77. P. 197-205.

98. Nazar R.N., Sitz T.O. and Busch H. Structural analyses of mammalian ribosomal ribonucleic acid and its precursors. Nucleotide sequence of ribosomal 5.8S ribonucleic acid // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P. 8591-8597.

99. Neefs J.M. and DeWachter R. A proposal for the Secondary structure of a variable area of eukaryotic small Ribosomal subunit RNA involving the existence of a pseudoknot // Nucleic Acids Res. 1990. Vol. 18. P. 5695-5704.

100. Nilsson J., Sengupta J., Frank J. and Nissen P. Regulation of eukaryotic translation by the RACK1 protein: a platform for signalling molecules on the ribosome // EMBO Rep. 2004. Vol. 5.P. 1137-1141.

101. Noller H.F. Ribosomal RNA and translation // Annu. Rev. Biochem. 1991. Vol. 60. P. 191-227.

102. Noller H.F. RNA Structure: reading the ribosome // Science. 2005. Vol. 309. P. 1508-1514.

103. Noller H.F., Hoang L. and Fredrick K. The 30S ribosomal P site: a function of 16S rRNA // FEBS Lett. 2005. Vol. 579. P. 855-858.

104. Nygard O and Nilsson L. Translational dynamics. Interaction between the translational factors, tRNA and ribosomes during eukaryotic protein synthesis // Eur. J. Biochem. 1990. Vol. 191. P. 1-17.

105. Nygard O., Alkemar G. and Larsson S.L. Analysis of the secondary structure of expansion segment 39 in ribosomes from Fungi, Plants and Mammals // J. Mol. Biol. 2006. Vol. 357. P. 904-916.

106. Ofengand J., Malhotra A., Remme J., Gutgsell N. Del Campo M., Jean-Charles, S., Peil L. and Kaya Y. Pseudouridines and pseudouridine synthases of the ribosome // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 2001. Vol. 66. P. 147-159.

107. Ogasawara T., Ito K. and Igarashi K. Effect of polyamines on globin synthesis in a rabbit reticulocyte-free protein synthesizing system // J. Biochem. 1989. Vol. 105. P. 164-167.

108. Ogle J.M., Brodersen D.E., Clemons W.M. Jr, Tarry M.J., Carter A.P., Ramakrishnan V. Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit // Science. 2001. Vol. 292. P. 897-902.

109. Ogle J.M., Murphy F.V., Tarry M.J. and Ramakrishnan V. Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form // Cell. 2002. Vol. 111. P. 721-32.

110. Osborne A.R., Rapoport T.A. and Van den Berg B. Protein translocation by the Sec61/SecY channel // Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 2005. Vol. 21. P. 529-550.

111. Pisarev, A.V., Kolupaeva, V.G., Yusupov, M.M., Hellen, C.U.T and Pestova, T.V. Ribosomal position and contacts of mRNA in eukaryotic translation initiation complexes // EMBO J. 2008. Vol. 27. P. 1609-1621.

112. Pool M.R., Stumm J., Fulga T.A., Sinning I. and Dobberstein B. Distinct modes of signal recognition particle interaction with the ribosome // Science. 2002. Vol. 297. P. 1345-1348.

113. Prinz A., Behrens C., Rapoport T.A., Hartmann E. and Kalies K.-U. Evolutionarily conserved binding of ribosomes to the translocation channel via the large ribosomal RNA // EMBO J. 2000. Vol. 19. P. 1900-1906.

114. Qiu D., Parada P., Marcos A.G., Cardenas D., Remacha M. and Ballesta J.P.G. Different roles of PI and P2 Saccharomyces cerevisiae Ribosomal stalk proteins revealed by cross-linking // Mol. Microbiol. 2006. Vol. 62. P. 1191-202.

115. Ramakrishnan V. Ribosome structure and the mechanism of translation // Cell. 2002. Vol. 108. P. 557-72.

116. Rawat U.B., Zavialov A.V., Sengupta J., Valle M., Grassucci R.A., Linde J.,

117. Vestergaard B., Ehrenberg M., Frank J. A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound termination factorRF2 //Nature. 2003. Vol. 421. P. 87-90.

118. Repkova, M.N., Venyaminova, A.G., and Zarytova, V.F. New photoreactive RNA analogues // Nucleosides & Nucleotides. 1997. Vol. 16. P. 1797-1798.

119. RheinbergerH.-J., Sternbach H. and Nierhaus K.H. Three tRNA binding sites on Escherichia coli ribosomes //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 5310-5314.

120. Rodnina M.V., A.V., Semenkov Yu.P. and Kirillov S.V. Number of tRNA binding sites on 80S ribosomes and their subunits // FEBS Lett. 1988. Vol. 231. P. 71-74.

121. Rodnina M.V., El'skaya A.V., Semenkov Yu.P. and Kirillov S.V. Interaction of tRNA with A and P sites of rabbit-liver 80S ribosomes and their subunits // Eur. J. Biochem. 1989. Vol. 185. P. 563-568.

122. Ross, W.C.J. Biological alkylating agents Butterworth. London and Washington, 1962.

123. Rossniann M.G. Fitting atomic models into electron-microspopy maps // Acta cryst. (section D). 2000. Vol. 56. P. 1341-1349.

124. Ruvinsky I and Meyuhas O. Ribosomal protein S6 phosphorylation: from protein synthesis to cell size // Trends Biochem. Sci. 2006. Vol. 31. P. 342-348.

125. Santos C. and Ballesta J.P.G. The highly conserved protein PO carboxyl end is essential for ribosome activity only in the absence of proteins PI and P2 // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 20608-20614.

126. Santos C. and Ballesta J.P.G. Characterization of the 26S rRNA-binding domain in Saccaromyces serevisiae ribosomal stalk phosphoprotein PO // Mol. Microbiol. 2005. Vol. 58. P. 217-226.

127. Schaletzky J. and Rapoport T.A. Ribosome binding to and dissociation from translocation sites of the endoplasmic reticulum membrane // Mol. Biol. Cell. 2006. Vol. 17. P. 3860-3869.

128. Schluenzen F., Tocilj A., Zarivach R., Harms J.,Gluehman M., Janell D. Bashan A., Bartels H., Agmon I., Franceschi F. and Yonath A. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 A resolution // Cell. 2000. Vol. 102. P. 615-623.

129. Schuwirth B.S., Borovinskaya M.A., Haw C.W., Zhang H.W., Vila-Sanjurjo A., Holton J. and Cate J.D.H. Structures of the Bacterial Ribosome at 3.5 A Resolution // Science. 2005. Vol. 310. P. 827-834.

130. Selmer M., Dunham C.M., Murphy IV F.M., Weixlbaumer A., Petry S., Kelley A.C., Weir J.R. and Ramakrishnan V. Structure of the 70S Ribosome Complexed with mRNA and tRNA // Science. 2006. Vol. 313. P. 1935-1942.

131. Sengupta J., Nilsson J., Gursky R., Spahn C.M.T., Nissen P. and Frank J. Identivication of the versatile scaffold protein RACK1 on the eukaryotic ribosome by cryo-EM // Nature Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11. P. 957-962.

132. Semenkov Yu.P., Kirillov S.V. and Stahl J.) 40 S subunits from rat liver ribosomes contain two codon-dependent sites for transfer RNA // FEBS Lett. 1985. Vol. 193. P. 105-108.

133. Sloma M. and Nygard O. Chemical accessibility of 18S rRNA in native ribosomal complexes: interaction sites of mRNA, tRNA and translation factors // Biol. Chem. 2001a. Vol. 382. P. 661668.

134. Sloma M. and Nygard O. Possible interaction sites of mRNA, tRNA, translation factors and the nascent peptide in 5S, 5.8S and 28S rRNA in in vivo assembled eukaryotic ribosomal complexes //Biochim. Biophys. Acta. 2001b. Vol. 1521. P. 30-38.

135. Spahn C.M.T., Nierhaus K.H Models of the elongation cycle: an evaluation // Biol. Chem. 1998. Vol. 379. P. 753-772

136. Spahn, C.M.T., Beckmann, R., Eswar, N., Penczek, P.A., Sali, A., Blobel, G. and Frank, J. Structure of the 80S ribosome from Saccaromyces serevisiae tRNA-ribosome and subunit-subunit interactions // Cell. 2001. Vol. 107. P. 373-386.

137. Sperrazza J.M., Russell D.W. and Spremulli L.L. Reversible dissociation of wheat germ ribosomes: Cation-dependent equilibria and thermodynamics parameters // Biochemistry. 1980. Vol. 19. P. 1053-1058.

138. Sperrazza J.M. and Spremulli L.L.) Quantitation of cation binding to wheat germ ribosomes: Influences of subunit association equilibria and ribosome activity // Nucleic Acids Res. 1983. Vol. 11. P. 2665-2679.

139. Stahl J. and Kobetz N.D. Affinity labeling of proteins at the mRNA binding site of rat liver ribosomes by an analogue of octauridylate containing an alkylating group attached to the 3'-end //FEBS Lett. 1981. Vol. 123. P. 269-272.

140. Stahl J. and Kobetz N.D. Affinity labelling of rat liver ribosomal protein S26 by heptauridylate containing a 5'-terminal alkylating group // Mol Biol Rep. 1984. Vol. 9. P. 219-22.

141. Stahl J. and Karpova G.G. Investigation on the messenger RNA binding site of eukaryotic ribosomes by using reactive oligo(U) derivatives // Biomed. Biochim. Acta. 1985. Vol. 44. P. 1057-1064.

142. Stebbins-Boaz B. and Gerbi S.A. Structural Analysis of the Peptidyl Transferase Region in Ribosomal RNA of the Eukaryote Xenopus laevis // J. Mol. Biol. 1991. Vol. 217. P. 93-112

143. Steitz T. and Moore P. RNA, the first macromolecular catalyst: the ribosome is a ribozyme // Trends. Biochem. Sci. 2003. Vol. 28. P. 411-418.

144. Strittmatter A.W., Fischer C., Kleinschmidt M. and Braus G.H. FL011 mediated filamentous growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae depends on the expression of the ribosomal rpS26 genes // Mol. Gen. Genomics. 2006. Vol. 276. P. 113-25.

145. Sweeney R., Chen L. and Yao M.C. An rRNA variable region has an evolutionarily conserved essential role despite sequence divergence // Mol. Cell. Biol. 1994. Vol. 14. P. 4203-4215.

146. Synetos D., Frantziou C.P. and Alksne L.E. Mutations in yeast ribosomal proteins S28 and S4 affect the accuracy of translation and alter the sensitivity of the ribosome to paromomycin // Biochim. Biophys. Acta. 1996. Vol. 1309. P. 156-166.

147. Takahashi K. and Moore S. RibonucleaseTl // The Enzymes. 1982. Vol. 15. P. 435-468.

148. Todokoro, K., Ulbrich, N., Chan, Y.-L. and Wool, I.G. Characterization of the binding of rat liver ribosomal proteins L6, L8, L19, S9 and S13 to 5.8S ribosomal ribonucleic acid // J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256. P. 7207-7212.

149. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1979. Vol. 76. P. 4350-4354.

150. Tsurugi, K„ Collatz, E., Todokoro, K. and Wool, I.G. Isolation of eukaryotic ribosomal proteins // J. Biol. Chem. 1977. Vol. 252. P. 3961-3969.

151. Tyulkina L.G. and Mankin A.S. Inhibition of ribonuclease contamination in preparations of T4 RNA ligase, polynucleotide kinase, and bacterial alkaline phosphatase with bentonite // Anal. Biochem. 1984. Vol. 138. P. 285-290.

152. Uchiumi T., Wahba A.J. and Traut R.R. (1987) Topography and stoichiometry of acidic proteins in large ribosomal subunits from Artemia salina as determined by crosslinking. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 5580-5584.

153. Uchiumi T. and Kominami R. A functional site of the GTPase-associated center within 28S ribosomal RNA probed with an anti-RNA autoantibody // EMBO J. 1994. Vol. 13. P. 33893394.

154. Ulbrich, N., Lin, A., and Wool, I.G. Identification by affinity chromatography of the eukaryotic ribosomal proteins that bind to 5.8S ribosomal ribonucleic acid // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 8641-8645.

155. Walker K., Elela S.A. and Nazar, R. Inhibition of protein synthesis by anti-5.8S rRNA oligodeoxyribonucleotides // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 2428-2430.

156. Ware V.C., Tague B.W., Clark C.G., Gourse R.L., Brand R.C. and Gerbi S.A. Sequence analysis of 28S ribosomal DNA from the amphibian Xenopus laevis // Nucleic Acids Res. 1983. Vol. 11. P. 7795-7817.

157. Warner J.R. Nascent ribosomes // Cell. 2001. Vol. 107. P. 133-136.

158. Watanabe S. Interaction of siomycin with the acceptor site of Escherichia coli ribosomes // J. Mol. Biol. 1972. Vol. 67. P. 443-457.

159. Westermann P. and Nygard O. Cross-linking of mRNA to initiation factor eIF-3, 24 kDa cap binding protein and ribosomal proteins SI, S3/3a, S6 and Sll within the 48S pre-initiation complex //Nucleic Acids Res. 1984. Vol. 12. P. 8887-8897.

160. Wilson D.N. and Nierhaus K.H. Ribosomal proteins in the spotlight // Critical reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2005. Vol. 40. P. 243-267.

161. Wimberly B.T., Brodersen D.E., Clemons W.M., Morgan-Warren R.J., Carter A.P., Vonrhein C., Hartsch T. And Ramakrishnan V. Structure of the 30S ribosomal subunit // Nature. 2000. Vol. 407. P. 327-339.

162. Wojtech E., Brimacombe R., Hackel A., Prochnow D. and Fasold H. Cross-linking of nucleic acids to proteins. Modified poly(A) as mRNA for Escherichia coli ribosomes // Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 223. P. 799-803.

163. Wollenzien, P., Expert-Bezancon, A. and Favre, A. Sites of contact of mRNA with 16S rRNA and 23S rRNA in the Escherichia coli ribosome // Biochemistry. 1991. Vol. 30. P. 1788-1795.

164. Wool, I.G., Chan, Y.-L. and Glueck, A. Mammalian ribosomes: the structure and the evolution of the proteins. In J.W.B. Hershey, M.B. Matthews, and N. Sonenberg (eds.), Translational control, Cold Spring Harbor Laboratory Press., (1996). P. 685-732.

165. Valle M., Zavialov A., Li W., Stagg S.M., Sengupta J., Nielsen R.C., Nissen P., Harvey S.C., Ehrenberg M., Frank J. Incorporation of aminoacyl-tRNA into the ribosome as seen by cryo-electron microscopy //Nat. Struct. Biol. 2003a. Vol. 10. P. 899-906.

166. Valle M., Zavialov A., Sengupta J., Rawat U., Ehrenberg M., Frank J. Locking and unlocking of ribosomal motions // Cell. 2003b. Vol. 114. P. 123-134.

167. Van Loock M.S., Easterwood T., Harvey S.C. Major groove binding of the tRNA/mRNA complex to the 16S ribosomal RNA decoding site // J. Mol. Biol. 1999 Vol. 285. P. 2069-2078.

168. Van Nues R.W., Venema J., Planta R.J. and Raue H.A. Variable region VI of Saccharomyces cereisiae 18S rRNA participates in biogenesis and function of the small ribosomal subunit // Chromosoma. 1997. Vol. 105. P. 523-531.

169. Villareal J.Jr. and Lee J.C. Yeast ribosomal protein L26 is located at the ribosomal subunit interface as determined by chemical cross-linking //Biochimie. 1998. Vol. 80. P. 321-324.

170. Vollbrandt T., Willkomm D., Stossberg H. and Kruse C. Vigilin is co-localized with 80S ribosomes and binds to the ribosomal complex through its C-terminal domain // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. Vol. 36. P. 1306-1318.

171. Yoshizawa S., Fourmy D. and Puglisi J.D. Recognition of the codon-anticodon helix by ribosomal RNA // Science. 1999. Vol. 285. P. 1722-1725.

172. Yusupova G.Zh., Yusupov M.M., Cate J.H.D. and Noller H.F. The path of messenger RNA through the ribosome // Cell. 2001. Vol. 106. P. 233-241.

173. Yusupov M.M., Yusupova, G.Zh., Baucom A., Lieberman K., Earnest T.N., Cate, J.H.D. and Noller, H.F. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution // Science. 2001. Vol. 292. P. 883-292.

174. Yusupova G., Jenner L., Rees B., Moras D. and Yusupov M. Structural basis for messenger RNA movement on the ribosome // Nature. 2006. Vol. 444. P. 391-394.

175. Zavialov A.V., Hauryliuk V.V. and Ehrenberg M. Guanine-nucleotide exchange on ribosome-bound elongation factor G initiates the translocation of tRNAs // Journal of Biology. 2005. Vol. 4. Article 9.

176. Zenkova M.A. and Karpova G.G. Imperfectly matched nucleic acid complexes and their biochemical manifestation //Russian Chem. Rev. 1993. Vol. 62. 387-407.