Расположение кодонов мРНК в А-, Р- и Е-участках по данным аффинной модификации рибосом человека аналогами мРНК - производными олигорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на остатке гетероциклического основания тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ДЕМЕШКИНА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

РАСПОЛОЖЕНИЕ КОДОНОВ мРНК В А-, Р- И Е-УЧАСТКАХ ПО , ДАННЫМ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ РИБОСОМ ЧЕЛОВЕКА АНАЛОГАМИ мРНК - ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОРИБОНУКЛЕОТИДОВ С ФОТО АКТИВИРУЕМОЙ ,' ГРУППОЙ НА ОСТАТКЕ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКОГО ОСНОВАНИЯ

02.00.10 - биоорганическая химия

I

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата'биологических наук

Новосибирск, 2003 г.

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (бывший Новосибирский институт биоорганической

химии СО РАН)

Научные руководители: д.х.н., профессор Карпова Галина Георгиевна

к.х.н. Грайфер Дмитрий Маратович

Официальные оппоненты: д.х.н., профессор Лаврик Ольга Ивановна

д.б.н., профессор Загребельный Станислав Николаевич

Ведущая организация: Московский государственный университет

' " им. М.В. Ломоносова, химический факультет

часов

Защита состоится « ^ » 2003 г. в Но

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01

в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-^, пр; Лаврентьева, 8 •

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « И » ОКТ$с>рЯ 2003 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

д.х.н. Н Фёдорова О.С.

Н Ф

.

2oo g-A

^SCoj

' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение структурно-функциональной топографии рибосом важно не только для понимания молекулярных механизмов биосинтеза белка, но и для разработки подходов к регуляции этого процесса. К настоящему времени достигнуты значительные успехи в изучении структурно-функциональной организации рибосом бактерий, вместе с тем наблюдается значительное отставание в изучении рибосом эукариот, что, по-видимому, связано не только с меньшей доступностью рибосом эукариот (и, в частности, человека), но и с тем, что многие из методов, успешно применяемых для изучения бактериальных рибосом, пока что не могут быть использованы для исследования рибосом высших организмов. Прежде всего это касается метода рентгеноструктурного анализа (РСА), так как кристаллы эукариотических рибосом пока не получены, и методов, основанных на реконструкции рибосомных субчастиц из белков и рРНК, поскольку до сих пор не найдено подходов к сборке активных субчастиц рибосом эукариот in vitro. В связи с этим, пожалуй, единственным на сегодняшний день методом, с помощью которого может быть получена детальная информация о структурной организации рибосом эукариот, является метод аффинной модификации (или, как теперь принято называть, метод аффинного химического сшивания), основанный на использовании реакционноспособных аналогов компонентов аппарата трансляции (мРНК, тРНК и т.п.), который оказался в свое время очень продуктивным при изучении бактериальных рибосом (Карпова и Кнорре, 1991; Сергиев и соавт., 1998).

Лаборатория Структуры и Функции Рибосом ИХБФМ СО РАН является единственным в мире научным коллективом, где на протяжении ряда лет проводится систематическое исследование мРНК-связывающего центра рибосом человека с помощью метода аффинной модификации. К моменту начала настоящей работы были выявлены существенные отличия во взаимодействии мРНК с рибосомами про- и эукариот. Так, было установлено, что взаимодействие мРНК с эукариотической рибосомой осуществляется за счет меньшего числа контактов с рРНК малой субчастицы. Было также известно с какими основаниями 18S рРНК сближены первые нуклеотиды кодонов матрицы в Р- и E-участках (положения +1 и -3, соответственно) и нуклеотиды, расположенные с З'-стороны от кодона в A-участке (положения от +7 до +13) и с 5'-стороны от кодона в E-участке (положение -6), а также с каким основанием 18S рРНК соседствует нуклеотид, примыкающий с З'-стороны к кодону в Р-участке. Кроме того, было изучено белковое окружение первых нуклеотидов кодонов матрицы в А-, Р- и E-участках и нуклеотидов, расположенных с 5'- и З'-сторон от этих участков (Грайфер и соавт., 2001).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение окружения на 80S рибосоме человека первого нуклеотида кодона в А-участке (положение +4 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке) и

каждого из нуклеотидов кодонов матрицы в Р- и £пучасгках-(гюлеженнялОТ +3

! ПАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА j С.Петербург ОЭ 300j uaQíá >

до -3) с помощью метода аффинного химического сшивания с использованием коротких аналогов мРНК, производных олигорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на остатке гетероциклического основания, в составе комплексов, имитирующих различные состояния рибосомы в процессе элонгации. Конкретные задачи состояли в определении нуклеотидов 18S рРНК и рибосомных белков, сшивающихся с фотоактивируемыми производными олигорибонуклеотидов в составе модельных комплексов.

Научная новизна и практическая ценность. Изучена аффинная модификация рибосом человека реакционноспособными аналогами мРНК, производными гексарибонуклеотида pUUUGUU, несущими

перфторфенилазидогруппу на первом, втором или третьем остатке урацила или на остатке гуанина, а также производным додекарибонуклеотида pUUAGUAUUUAUU с перфторфенилазидогруппой на остатке гуанина, в составе различных модельных комплексов. Показано, что модификации во всех случаях подвергается в основном 40S субчастица рибосомы, а в её составе - как РНК, так и белки. Определены нуклеотиды 18S рРНК и рибосомные белки, сближенные с каждым из нуклеотидов кодонов мРНК в Р- и Е-участках, а также нуклеотиды 18S рРНК, соседствующие с первым нуклеотидом кодона матрицы в А-участке. На основании полученных результатов с учётом предыдущих данных (Грайфер и соавт., 2001), предложена схема расположения матрицы на 80S рибосоме человека в процессе элонгации. Сопоставление результатов по аффинной модификации 80S рибосом человека с данными, полученными с помощью РСА, по расположению кодонов мРНК в А-, Р- и Е-участках рибосом бактерий, позволило выявить новые универсальные элементы структуры рРНК малой субчастицы, сближенные с кодонами матрицы в А-, Р- и Е-участках рибосомы, универсальную черту расположения кодонов матрицы в Р- и Е-участках, а также сходство и отличия в белковом окружении матрицы.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 4-ой ежегодной встречи «RNA Society» (Эдинбург, 1999), международной конференции «RNA as Therapeutic and Genomic Target» (Новосибирск, 2001), международной конференции «Protein Synthesis», посвященной 75-летию Александра Спирина (Пущино, 2001), III Съезде Биохимического Общества Российской Академии Наук (С.-Петербург, 2002) и международной конференции «Targeting RNA: artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference» (Новосибирск, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура работы. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, состоит из введения, трёх глав, выводов, списка литературы и содержит 8 таблиц и 24 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов.

В настоящей работе для изучения окружения нуклеотидов матрицы в А-, Р- и Е-участках рибосомы использовали набор аналогов мРНК -производных олигорибонуклеотидов, несущих фотоактивируемую перфторфенилазидогруппу на одном из остатков гетероциклических оснований. Производные гексарибонуклеотида ри1ЛЮии содержали перфторфенилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина или на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила; производное додекарибонуклеотида рШАСиАиШАШ содержало аналогичную группу на атоме N7 остатка гуанина.

л 1,А

ри*иивии (I)

f е

1

pUU*UGUU (II) U* = HA-m^-co-(jNi

pUUU*GUU (III) о^

14Á

б

pUUUG*UU (IV) \F,

pUUAG*UAUUUAUU (V) q* = н^ CO-NH-C^-^N-CH^CH, О

CHj

fl

3 Rib

Рис.1. Аналоги мРНК - производные олигорибонуклеотидов, используемые для аффинной модификации 80S рибосом человека; (а) - несущие фотоактивируемую группу на остатке урацила; (б) - несущие фотоактивируемую группу на остатке гуанина; структурные формулы реакционноспособной группы на атоме С5 остатка урацила и на атоме N7 остатка гуанина предсталены справа панелей (а) и (б), соответственно (скобкой указана длина реакционноспособной группы в Á).

Производные гексарибонуклеотида pUUUGUU, несущие перфторфенилазидогруппу на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила (рис. 1а), получены и охарактеризованы в Группе химии олигорибонуклеотидов (Лаборатория химии нуклеиновых кислот, НИБХ СО РАН) (Репкова и соавт., 1999).

Для получения фотоактивируемых производных

олигорибонуклеотидов pUUUGUU и pUUAGUAUUUAUU, несущих перфторфенилазидогруппу на остатке гуанина (рис. 16), использовали подход, предложенный ранее (Власов и соавт., 1989) для получения фотоактивируемых аналогов тРНК, основанный на селективном алкилировании остатков гуанина. Для этого олигорибонуклеотид вначале алкилировали [4-(Ы-2-хлорэтил)-Ы-метиламино]бензиламином в условиях,

когда присоединение алкилирующей группы происходит только по атому N7 остатка гуанина, а затем по введенной алифатической аминогруппе остатка реагента вводили перфторфенилазидогруппу путем обработки алкилированного олигорибонуклеотида N-гидроксисукцинимидным эфиром n-азидотетрафторбензойной кислоты.

2. Образование комплексов аналогов мРНК с 80S рибосомами в

присутствии тРНК.

Фотоаффинную модификацию 80S рибосом аналогами мРНК (см. рис. 1) проводили в составе комплексов, имитирующих различные состояния рибосомы в процессе элонгации (рис. 2). Комплексообразование проводили либо в буфере с высокой концентрацией Mg2+(13 мМ) (буфер А), либо в более физиологических условиях, т.е. в буфере с низкой концентрацией Mg2+ (4 мМ), содержащем полиамины (буфер Б). Расположение кодонов матрицы в А- и Р-участках или в Р- и E-участках задавали либо с помощью Phe-TPHKPhe (или тРНКРЬе), узнающей кодон UUU, либо с помощью Val-TPHKVal (или TPHKv¡d), узнающей кодоны GUU и GUA. При этом учитывали тот факт, что в отсутствие факторов трансляции тРНК в любой форме имеет наибольшее сродство к Р-участку (Rodnina et al., 1989; Graifer et al., 1992). Таким образом, комплексы с кодон-антикодоновым взаимодействием в Р-участке получали инкубированием 80S рибосом с соответствующим аналогом мРНК и тРНК, узнающей либо кодон UUU (рис. 2, комплексы 1 в случае аналогов I, II, III и IV и комплекс 6 в случае аналога V), либо кодоны GUU и GUA (рис. 2, комплексы 3 в случае аналогов I, II, III и IV и комплекс 4 в случае аналога V). Для получения комплексов 2 и 5, имитирующих претранслокационное состояние рибосомы, комплекс 1 инкубировали с Val-TPHKVal, а комплекс 4 -с Phe-xPHKphe. Эти молекулы могли связаться только в A-участке, в соответствии с установленным в нем валиновым кодоном GUU (рис. 2, комплекс 2, слева) или фенилаланиновым кодоном UUU (рис. 2, комплекс 5). После добавления Val-TPHKVal к комплексу 1 (образованному с участием Phe-тРНКРЬе) и Phe-TPHKphe к комплексу 4 происходила реакция транспептидации. В результате этой реакции в комплексах 2 (рис. 2, комплекс 2, справа) и 5 (рис. 2, комплекс 5) в Р-участке оказывались деацилированные тРНКРЬе и тРНКУа|, соответственно, а в А-участке - либо PheVal-TPHKVal в случае комплекса 2, либо ValPhe-TPHKPhe в случае комплекса 5. Комплекс 7, моделирующий состояние рибосомы после транслокации, когда деацилированная тРНК из Р-участка переходит в E-участок, а пептидил-тРНК - из A-участка в Р, получали инкубированием комплекса 6, образованного в присутствии РЬе-тРНКРЬе, с тРНКУа|, узнающей кодон GUA в E-участке (рис. 2, комплекс 7). Контролем для комплекса 7 служил комплекс 8, который получали инкубированием комплекса 6 с кодон-неспецифичной tPHKAsp (рис. 2, комплекс 8). О наличии молекулы тРНК в E-участке рибосом в комплексах 7 и 8 судили по результатам связывания с комплексом 6 тРНКУа| и tPHKAsp,

меченных 32Р. Величины степени связывания этих тРНК с 80S рибосомами практически не отличались, мало зависели от состава буфера, в котором происходило связывание, и составляли примерно 0.8 ± 0.2 моль тРНК на моль 80S рибосом. Фотоаффинную модификацию 80S рибосом с помощью аналогов мРНК I - V проводили также в составе бинарных комплексов, т.е. в отсутствие тРНК (комплексы 9).

UUAGUAUUUAUU

Рис. 2. Комплексы 80S рибосом с производными олигорибонуклеотидэв pUUUGUU и рUUAGUAUUUAUU. Цифрами указаны положения нуклеотидов мРНК, несущих сшивающую группу, относительно первого нуклеотида кодона в Р-учасгке; А, Р и Е -тРНК-связывающие участки рибосомы; • - остаток аминокислоты; фенилаланиновый (Phe) и валиновый (Val) кодоны в последовательностях аналогов мРНК подчеркнуты.

Положения модифицированных нуклеотидов аналогов мРНК на рибосоме в комплексах обозначали, как обычно принято: положение +1 соответствует первому нуклеотиду кодона в Р-участке, положение +4 -первому нуклеотиду кодона в A-участке, а положение -3 - первому нуклеотиду кодона в E-участке. Таким образом, в комплексах 1-8, полученных в присутствии аналогов I-V (см. рис. 2), нуклеотид со сшивающей группой находился попеременно в положениях от +4 до -3, т.е. соответствовал первому нуклеотиду кодона в A-участке и каждому из нуклеотидов кодонов в Р- и Е-участках.

Степень связывания аналогов мРНК I - V с рибосомами в присутствии тРНК зависела от типа комплекса и положения модифицирующей группы в аналоге мРНК, а также от буфера, в котором проводили комплексообразование (табл. 1).

Таблица 1. Связывание аналогов мРНК I - V с 80S рибосомами.

Аналог мРНК Тип комплекса (положение модифицированного нуклеотида мРНК на рибосоме) Буфер А, моль аналога мРНК/моль 80S рибосом Буфер Б, моль аналога мРНК/моль 80S рибосом

I К+1) 0.78 ±0.04 0.87 ±0.04

2(+1) 0.75 ±0.04 0.99 ±0.04

3(-3) 0.14 ±0.02 0.16 ±0.02

9 0.02 ±0.01 0.02 ±0.01

II 1(+2) 0.04 (*) 0.14 ±0.02

2 (+2) 0.10 (*) 0.22 ±0.03

3(-2) 0.10(*) 0.10 ±0.02

9 0.02 0.02 ±0.01

III 1(+3) 0.03 (*) 0.12 ±0.02

2(+3) 0.07 (*) 0.18 ±0.03

3(-1) 0.07 (*) 0.15 ±0.03

9 <0.02 0.03 ±0.01

IV 1(+4) 0.67 ±0.04 н.о.

2 (+4) 0.65 ±0.04

3(+1) 0.11 ±0.02

9 0.02 ±0.01

V 4 (+1) 0.2 ±0.02 0.7 ±0.1

5(+1) 0.9 ±0.1

6(-3)

7(-3)

8(-3)

9 0.1 ±0.015 0.1 ±0.015

Примечание: и.о. - не определяли; (*) - относительная ошибка измерения составляла около 15%.

В отсутствие тРНК связывания производных гексарибонуклеотида рии1Юии практически не наблюдали. Напротив, производное додекарибонуклеотида рииАСиАиииАии в заметной степени связывалось с рибосомами и в отсутствие тРНК (см. табл. 1, комплексы 9). Поли(1)) полностью блокировала это связывание, что свидетельствовало о связывании рииАСиАиииАии в мРНК-связывающем центре.

3. Сшивки фотоактивируемых аналогов мРНК с 80S рибосомами.

Для образования сшивок аналогов мРНК с 80S рибосомами комплексы облучали УФ-светом (270 > X > 380 нм). После этого комплексы разрушали добавлением EDTA и КС1 и анализировали включение радиоактивной метки в рибосомные субчастицы центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Присоединение аналогов мРНК происходило практически только к 40S субчастицам, модификация 60S субчастиц была незначительной (степень модификации составляла менее 0.01 моль аналога мРНК на моль 60S субчастиц). Сшивки аналогов мРНК с 40S субчастицами были полностью кодонзависимы. В отсутствие тРНК наблюдали лишь незначительную сшивку аналогов мРНК с 40S субчастицами.

В 40S субчастицах модифицировались как 18S рРНК (рис. 3, верхняя часть электрофореграммы), так и белки (для аналогов I-III см. рис. 7; для аналогов IV и V данные не приведены), кроме того, во всех комплексах, стабилизированных кодон-антикодоновыми взаимодействиями, наблюдалась модификация тРНК (рис. 3, нижняя часть электрофореграммы).

б

а

Рис. 3. Анализ сшивки 18S рРНК и тРНК с [иР]-мечеными аналогами мРНК в комплексах, представленных на рис. 2, с помощью тРНК -*■

электрофореза в 5%-ном ПААГ. Радиоавтограф.

(а) Сшивка с аналогом I в буфере Б (аналогичная картина получена в буфере А); (б) сшивка с аналогом II в буфере Б (аналогичные картины получены в буфере Айв случае аналога III для обоих буферов);

'+1' У\ 1 2

+2 (+3) -2 (-1)

/ " 12 3 9

в

И

+1

t 3

I8S-

-18S

iPHK-*gf Ф m

-rPHK

аналог l

аналог II (III) аналог IV

+1 4 5

• -3

/ I N 6 7 8

9 К

+1' 4 5

-3;

/ i \ 5 7 8

—18S -

^ вш* ^Èfè

тРНК / \

¿a^ .Ш^

^ЯЩг ^ЯШ ^Нр

аналог V

(в) сшивка с аналогом IV в буфере А (аналогичная картина получена в буфере Б); (г) сшивка с аналогом V в буферах А (слева) и Б (справа). Номера дорожек соответствуют номерам комплексов (в рамках указаны положения модифицированного нуклеотида на рибосоме); дорожки 9 - сшивка в отсутствие тРНК; дорожка К - 18S рРНК, выделенная из облученной смеси 80S рибосом с аналогом V и тРНЮЧ

4. Определение участков 18S рРНК, содержащих нуклеотиды, сшитые с аналогами мРНК.

Фрагменты 18S рРНК, в пределах которых находятся участки сшивок с производными pUUUGUU и pUUAGUAUUUAUU, были определены с помощью гидролиза модифицированной рРНК РНКазой H в присутствии 20-звенных олигодезоксирибонуклеотидов (ОДН), комплементарных различным последовательностям 18S рРНК. Продукты гидролиза разделяли электрофоретически с последующим окрашиванием и радиоавтографированием гелей. Окрашивание гелей позволяло выявить обе части рРНК, «разрезанной» в присутствии каждого ОДН, а радиоавтография -определить, в которой из частей находится участок сшивки аналога мРНК. В качестве примера на рис. 4 представлен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления 18S рРНК, сшитой с аналогом мРНК II в комплексе 2, образованном в присутствии тРНК и Val-TPHKVal (см. рис. 2, комплекс 2, слева), и гидролизованной в присутствии ОДН, комплементарных последовательностям 1081-1100, 1197-1216 и 1222-1241 18S рРНК. Из рисунка видно, что гидролиз 18S рРНК РНКазой H в присутствии ОДН, комплементарного району 1197-1216, приводит к образованию двух фрагментов, не содержащих метки 32Р, т.е. пришитого аналога мРНК. Это свидетельствует о том, что участок сшивки аналога II в комплексе 2 находится в пределах последовательности 1197-1216 18S рРНК; данные по расщеплению 18S рРНК в присутствии ОДН, комплементарных участкам 1081-1100 и 1222-1241, подтверждают этот вывод (см. схему внизу рис. 4). В случае комплекса 2, образованного в присутствие Phe-TPHKphe и Val-TPHKVal (см. рис. 2, комплекс 2, справа), получена аналогичная картина (данные не приведены).

к s = 2

1081— 769-

1081

1197

1222

1869

Рис. 4. Анализ фрагментов, образующихся после гидролиза 18S рРНК, сшитой с аналогом II в комплексе 2 (образованном в буфере А), РНКазой H в присутствии 20-звенных ОДН, комплементарных

-1222

---1197

-653

«-628

653

628

последовательностям 1081-1100, 1197-1216 и 12221241, с помощью электрофореза в 5 %-ном ПААГ.

Радиоавтограф. Дорожка К - контрольная 18S рРНК, выделенная из облученного комплекса 2 и обработанная РНКазой H в отсутствие ОДН. Стрелками указаны приблизительные длины фрагментов РНК (без учета длины пришитого олигорибонуклеотида); внизу панели представлена схема фрагментов 18S рРНК, образующихся при гидролизе (черным закрашены фрагменты, содержащие сайт пришивки аналога мРНК; серым отмечен участок модификации 18S рРНК). Аналогичная картина была получена в случае комплексов 2, образованных в буфере Б.

769 3'

1197-

-1216

На основании гидролиза РНКазой H рРНК, сшитой с аналогами мРНК I-V, в присутствии различных ОДН определено, что в комплексах, где модифицированный нуклеотид находился в положении +4, сшивка происходит в пределах участка 1812-1831 18S рРНК, а в комплексах, с модифицированным нуклеотидом в положениях от +3 до -1 и в положении -3, - внутри района 1100-1222. Кроме того, модифицированный нуклеотид в положении +1 сшивался с последовательностью 1641-1869, фрагментом 18401849 и в меньшей степени с участком 391-655 18S рРНК, а нуклеотид в положениях -2 и -3 - с участком 674-1081 и районом 840-1081, соответственно. В отсутствие тРНК аналог V модифицировал в основном участок 1840-1849 18S рРНК и в меньшей степени 391-655. Результаты гидролиза 18S рРНК РНКазой Н, сшитой с аналогами мРНК I-IV в комплексах 1-3 и аналогом V в комплексах 4 и 6-8, не зависели от буфера, в котором проводили связывание рибосом с этими аналогами. Участки модификации 18S рРНК аналогами мРНК I-V представлены в табл. 2.

Таблица 2. Фрагменты и нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с аналогами мРНК.

Аналог м РНК Тип комплекса (положение модифицированного нуклеотида на рибосоме) Фрагмент 18S рРНК Нуклеотид 18S рРНК

I К+1) 1197-1216 G1207

2(+1) 1197-1216 G1207

3(-3) 840-1081 G961

11 1(+2) 1197-1216 G1207

2 (+2) 1197-1216 G1207

3(-2) 674-1081 G961

III 1(+3) 1100-1222 G1207

2(+3) 1100-1222 G1207

3(-1) 1100-1222 G1207

IV 1(+4) 1812-1831 A1823, A1824, A1825

2 (+4) 1812-1831 A1823, A1824, A1825

3(+1) 1641-1869 G1702

V 4(+1) 1840-1849(*), 391-655 H.O.

5(+1) 1197-1222 (*) G1207

6(-3) 1197-1222 (*) G1207

7(-3) 1197-1222 (») G1207

8(-3) 1197-1222 (*) G1207

9 1840-1849(*), 391-655 H.O.

Примечание: н.о. - не определено; (*) основной участок модификации 18S рРНК; приведены результаты для комплекса 5, образованного в буфере с 13 мМ Mg2^

5. Определение нуклеотидов 18S рРНК, сшитых с аналогами мРНК.

Точную идентификацию нуклеотидов 18S рРНК, сшитых с аналогами мРНК, определяли с помощью обратной транскрипции. Модифицированным, как принято, считали нуклеотид, расположенный после основания, на котором произошла остановка (или пауза) обратной транскрипции (в направлении к 5'-концу рРНК). Для поиска нуклеотидов 18S рРНК, сшитых с аналогами мРНК, в качестве праймеров использовали ОДН, выбранные на основании результатов гидролиза модифицированной рРНК РНКазой Н. Таким образом, было установлено, что в комплексах, где нуклеотид, несущий сшивающую группу, находится в положении +4, происходит модификация

А1823, А1824 и

а

1 2 9 к u g с а

б

в г

3 9 к 1 2 3 9 к ugca

4 6 7 8 9 к

А1824--. -А1825-Ж G1826 — m

А1208„

А1208

EU

аналог IV д ugca 3 9 к

1/ \

FÏÏ+2)! El ED

аналог I (II) аналог III 0ugca 1 2 3 9 к

Ш

ш

аналог V

Cl 703

А962

EtD

ED

аналог IV

аналог 1 (II)

Al 825 18S рРНК (рис. 5а), а в положениях от +3 до -1 (рис. 66 и в) и в положении -3 (рис. 5г) - G1207. Кроме того,

модифицированный нуклеотид в

положении +1 сшивался с G1702 18S рРНК (рис. 5д), а в положениях -2 и -3-е G961 (рис. 5е). Нуклеотиды 18S рРНК, сшитые с аналогами мРНК I -V, представлены в табл. 2.

Рис. 5. Авторадиограммы, показывающие положение остановок (пауз) при удлинении [5'-32Р|меченого праймера, комплементарного последовательности 1835-1849 (я), 1222-1241 (б, в, г), 1812-1831 (д) или 1081-1100 (tr), на матрице 18S рРНК. Дорожки U, G, С и А - продукты секвенирования, образованные в присутствии ddATP, ddCTP, ddGTP и dl'l Р, соответственно. Удлинение праймера на 18S рРНК, выделенной из комплексов 80S рибосом, модифицированных аналогом IV (а и à), I и II (б и е), III (в) или V (г), а также на контрольной 18S рРНК, выделенной из облученных рибосом (дорожки К). В случае комплекса 5, образованного в буфере А, была получена картина, аналогичная (г) для комплексов 6-8. Вверху каждой панели цифрами указаны номера комплексов 80S рибосом, представленных на рис. 2, а внизу в рамке - положение модифицированного нуклеотида на рибосоме в соответствующем комплексе.

6. Определение белков, сшитых с аналогами мРНК I, II и III.

Для предварительного анализа белков, сшитых с аналогами I, II и III, модифицированные этими аналогами 40S субчастицы, выделяли и анализировали электрофорезом в присутствии SDS с последующей радиоавтографией (рис. 6). Радиоактивные полосы в самой верхней части геля (на границе концентрирующего и разделяющего гелей) соответствуют модифицированной 18S рРНК, поскольку в случае аналога I эти полосы исчезают после обработки сшитых 40S субчастиц РНКазой А (рис. 6д). Все остальные радиоактивные полосы соответствуют модифицированным

Рис. 6. Анализ 40S

после обработки после обработки

протеиназой К

III

в присутствии РНКазой А поли(Ц)

I

-А-

12391239 123 9К 12391239

—ISSpPHK

■■■■'■■щ-'tnn, „»4,4-

а

в

субчастиц, выделенных из облученных комплексов 80S рибосом с аналогами Ш (а, б), II (в) и I (г, <)). Радиоавтограф. В случае (а) 40S субчасгицы перед анализом были обработаны протеиназой К, а в случае (ó) - РНКазой А. Номера дорожек соответствуют номерам комплексов (см. рис. 2). Дорожка К - анализ 40S субчастиц, выделенных из S14/S23/S15акомплекса gQg рибосом С

^S19/S26 аналогом I, образованного в

присутствии поли(Ц). Дорожка е -типичный окрашенный гель (указаны белки, которые соответствуют окрашенным полосам).

белкам, поскольку они исчезают при обработке 40Б субчастиц протеиназой К (рис. 6а), но сохраняются после обработки РНКазой А (рис. 6д). При сопоставлении данных радиоавтографии и окрашенных полос рибосомных белков принимали во внимание, что аналог мРНК, сшитый с белком, уменьшает подвижность данного белка. Это влияние тем сильнее, чем длиннее присоединённый остаток олигорибонуклеотида. Во всех случаях основной модификации подвергались белки (верхняя треть электрофореграммы) с молекулярной массой около 30 кДа. Полоса, соответствующая модифицированному белку, в центральной части второй трети электрофореграммы существенна только в случае аналога I в комплексе 3 (рис. 6г и д, дорожки 3). Модификация белков в нижней части электрофореграммы является значительной только в случае аналога I в комплексах с тРНК (рис. 6г и д, дорожки 1-3).

Белки, сшивающиеся с аналогом мРНК I, определяли с помощью двумерного электрофореза в ПААГ (рис. 7). Остаток пришитого гексарибонуклеотида предварительно гидролизовали с помощью РНКазы А,

33 *

а - 52

814

ЕЕ

- 1-ое направление

1 83 ♦ ** " 2 ^ 83 в2 ♦ ♦ 3 82 ♦

Б23 'Ш- Б14 Б23 814 Э14

826 1—1 526 шЗ 4 ш Ж, ЧИв Б26

826

Рис. 7. Анализ белков, сшитых с аналогом I, с помощью 'двумерного электрофореза в ПААГ. Разделение в первом направлении - при рН 8.6, а во втором - в присутствии БОБ при рН 6.75. (а) - радиоавтографы гелей после разделения белков, выделенных из 40Э субчасгиц, модифицированных в ДЮ. -,<523 составе комплексов 1-3 и в бинарном комплексе 9 (номер

?3 .,32

* «Р -____

комплекса указан в правом верхнем углу радиоавтографа;

526 положение модифицированного нуклеотида аналога мРНК на рибосоме отмечено в рамке в левом нижнем углу).

% Обозначены модифицированные белки, (б) - типичная электрофореграмма окрашенного геля; положения радиоактивных пятен, соответствующих модифицированным белкам, обозначены пунктиром.

чтобы уменьшить его влияние на электрофоретическую подвижность белков. При идентификации учитывали, что радиоактивные пятна модифицированных белков могут быть заметно смещены влево относительно окрашенных пятен, соответствующих ^модифицированным белкам. Такое смещение связано с тем, что даже при исчерпывающем гидролизе РНКазой А модифицированные белки остаются сшитыми с мононуклеотидным фрагментом, несущим в слабощелочной среде два отрицательных заряда, что уменьшает электрофоретическую подвижность положительно заряженных белков при разделении в первом направлении. При определении сшитых с аналогом мРНК I белков двумерным гель-электрофорезом также учитывали тот факт, что при модификации белков с большей молекулярной массой сдвиг радиоактивного пятна меньше, чем в случае более легких белков.

При сопоставлении результатов двумерного (рис. 7) и одномерного (рис.бг и д) разделения белков, сшитых с аналогом I, на двумерных электрофореграммах не обнаружили пятен, которые могли бы соответствовать белкам Б5 и/или 87, сшивающимся с аналогом I в комплексе 3 по данным одномерного разделения (рис. 6г и д, дорожки 3). Это может быть связано с потерей белков на фазовой границе между гелями первого и второго направления.

Методология, использованная для определения белков, сшитых с аналогом I, непригодна для аналогов II и III, поскольку в этих случаях гидролиз пришитого к белку остатка аналога мРНК приводил бы к потере метки 32Р. Поэтому для аналогов II и III полагали, что радиоактивные полосы, совпадающие с полосами белков для аналога I при одномерном разделении без обработки РНКазой А, соответствуют тем белкам, что и в случае аналога I (см. рис. 6 и 7).

7. Обсуждение результатов модификации SOS рибосом фотоактивируемыми производными олигорибонуклеотидов pUUUGUU и pUUAGUAUUUAUU.

В настоящей работе для изучения окружения первого нуклеотида кодона мРНК в A-участке (положение +4) и каждого из нуклеотидов кодонов в Р- и E-участках (положения от +3 до -3) рибосом человека использовали набор аналогов мРНК нового типа, несущих модифицирующую перфторфенилазидогруппу на одном из гетероциклических оснований - на атоме N7 остатка гуанина или атоме С5 остатка урацила. Атом N7 остатка гуанина и атом водорода при атоме С5 остатка урацила не принимают участия в Уотсон-Криковском спаривании, следовательно, введение модифицирующей группы по этим атомам не должно препятствовать участию соответствующих гетероциклических оснований в кодон-антикодоновых взаимодействиях. Однако из данных по связыванию аналогов мРНК II и III с 80S рибосомами (см. табл. 1) видно, что модифицирующая группа на атоме С5 второго и третьего остатков урацила фенилаланинового кодона затрудняет (вероятно, стерически) взаимодействие этого кодона с тРНК в Р-участке. Относительно низкий уровень связывания аналогов мРНК с рибосомами в комплексах с валиновым кодоном и узнающей его тРНК в Р-участке (см. табл. 1 и рис. 2, комплексы 3 и 4), образованных в буфере с высокой концентрацией Mg2+ (буфер А), по-видимому, связан с низким сродством к Р-участку кодон-антикодонового дуплекса, образованного этим кодоном и tPHKVí', по сравнению со сродством дуплекса фенилаланинового кодона с тРНКРЬс (Bulygin et al., 1997; Смоленская и соавт., 1998). Однако следует отметить, что при переходе к более физиологическим условиям (к буферу Б с 4 мМ Mg2+, содержащему полиамины) в случае аналога V стимулирующее влияние валиновой тРНК на связывание соответствующего ей кодона в Р-участке усиливается (см. табл. 1). Следовательно, можно полагать, что комплекс 5 с валиновым кодоном и узнающей его молекулой тРНК в Р-участке и фенилаланиновым кодоном и молекулой тРНКРЬе в А-участке образуется только в более физиологических условиях, а в буфере с 13мМ Mg2+ образуется смесь комплекса 6 с комплексом 5 (см. рис. 2). В пользу такого предположения свидетельствуют одинаковые уровни сшивок аналога V с 18S рРНК в комплексах 4 и 5, образованных в буфере Б (рис. Зг, панель справа, дорожки 4 и 5), а также тот факт, что этот аналог сшивается с

одним и тем же нуклеотидом 18S рРНК в комплексах 5 и 6, образованных в буфере А (см. табл. 2). Следует также отметить, что в более физиологических условиях сродство дуплекса, образованного молекулой тРНКРЬе и фенилаланиновым кодоном, несущим сшивающую группу на атоме С5 второго или третьего остатка урацила, к Р-участку повышается по сравнению со сродством этого дуплекса в буфере с 13 мМ М§2+(табл. 1, см. данные для комплексов 1 и 2).

7.1. Взаимодействие производного pUUAGUAUUUAUU с 18S рРНК в составе комплекса с 80S рибосомой, образованного в отсутствие тРНК.

В отличие от производных гексарибонуклеотида pUUUGUU (аналоги I - IV), производное додекарибонуклеотида pUUAGUAUUUAUU (аналог V), было способно в заметной степени связываться в мРНК-связывающем центре 80S рибосомы в отсутствие кодон-специфичной тРНК, что позволило осуществить сшивку аналога V с 80S рибосомами в бинарном комплексе. Оказалось, что в отсутствие тРНК модифицированный остаток гуанина производного pUUAGUAUUUAUU контактирует с 3'-концевым участком 1840-1849 18S рРНК и в меньшей степени с районом 391-655 18S рРНК (см. табл. 2). Вероятно, при связывании мРНК с эукариотическими рибосомами, как и в случае бактериальных рибосом, имеет место взаимодействие между 3'-концом рРНК малой субчастицы и 5'-областью мРНК, а сшивка производного pUUAGUAUUUAUU с участком 1840-1849 18S рРНК в составе бинарного комплекса отражает это взаимодействие. По-видимому, район 1840-1849 18S рРНК несколько удален от области A-, Р- и E-участков 80S рибосомы. В пользу сделанного предположения говорит тот факт, что производные pUUUGUU с фотоактивируемой группой на первом остатке урацила или остатке гуанина, а также производные олигорибонуклеотидов с реакционноспособной группой на 5'-концевом фосфате (Bulygin et al., 1997; Смоленская и соавт., 1998; Matassova et al., 1998), не сшивались с участком 1840-1849 18S рРНК (сшивок с 5'-концевым районом 391-655 также не наблюдали) в составе комплексов с модифицированным нуклеотидом в положениях +1 или —3 (см. табл. 2). На этом основании модификацию в 3'- и 5'-концевых доменах 18S рРНК производным pUUAGUAUUUAUU в комплексах, образованных с участием тРНК, можно отнести за счет присутствия некоторого количества бинарного комплекса в реакционных смесях, подвергавшихся УФ-облучению. При этом в смеси, содержащей комплекс 4, концентрация бинарного комплекса, по-видимому, была сопоставима с концентрацией комплекса 4.

7.2. A-, Р- и Е-участки мРНК-связываюшего иентра 80S рибосомы.

Как следует из результатов по сшивкам производного pUUUGUU, несущего перфторфенилазидогруппу на остатке гуанина, первый нуклеотид кодона в A-участке (положение +4) соседствует с нуклеотидами А1823,

А1824 и А1825 З'-концевого домена 18S рРНК (рис. 5а). Появление молекулы тРНК в A-участке не приводит к изменениям в окружении первого нуклеотида кодона в этом участке, а лишь частично экранирует А1823, А1824 и Al825 18S рРНК от модификации (рис. 5а, сравнить дорожки 1 и 2). После перемещения модифицированного остатка гуанина производного pUUUGUU в положение +1 модификации подвергается нуклеотид G1702 18S рРНК (рис. 5ó), однако эффективность сшивки с 18S рРНК значительно ниже, чем с белком S15 (Грайфер и соавт., 1999) и тРНК (рис. Зв, дорожка 3). В случае производного pUUAGUAUUUAUU сшивки с нуклеотидом G1702 18S рРНК в аналогичном комплексе (модифицирующая группа в положении +1) не наблюдали. По-видимому, это связано с тем, что препарат 18S рРНК, сшитой с производным pUUAGUAUUUAUU, был частично деградирован в районе нуклеотидов 1702-1705. В результате на радиоавтографе полоса, соответствующая остановке обратной транскрипции на нукпеотиде С1703 18S рРНК (в случае модификации G1702), сливалась с остановками обратной транскрипции, происходящими на нуклеотидных остатках, по которым происходил разрыв 18S рРНК. В отличие от производных pUUUGUU и pUUAGUAUUUAUU, несущих фотоактивируемую группу на остатке гуанина, производное pUUUGUU с аналогичной группой на первом остатке урацила эффективно сшивалось с 18S рРНК в комплексе с модифицированным остатком в положении +1 (см. рис. 3). В этом случае модификации подвергался нуклеотид G1207 18S рРНК (рис. 56). Наряду с модифицирующей группой на остатке урацила в положении +1 с нуклеотидом G1207 18S рРНК также сшивались аналогичные группы на остатках урацила в положениях +2 и +3 (рис. 56 и в). Это свидетельствует в пользу того, что с остатком G1207 18S рРНК, кроме первого нуклеотида кодона в Р-участке, соседствуют также второй и третий нуклеотиды этого кодона (положения +2 и +3, соответственно).

Нуклеотид G1207 18S рРНК также сближен с кодоном матрицы в Е-участке, о чем свидетельствуют сшивки этого нуклеотида с модифицированным остатком урацила в положении -1 в случае производного pUUUGUU (рис. 5в) и с модифицированным остатком гуанина в положении -3 в случае производного pUUAGUAUUUAUU (рис. 5г). Вместе с нуклеотидом G1207 18S рРНК к окружению кодона в E-участке относится нуклеотид G961, который сшивался с модифицированным остатком урацила из положения -2 или -3 (рис. 5е). Необходимо отметить, что сшивку с G1207 18S рРНК неоднократно наблюдали ранее в комплексах при использовании производных олигорибонуклеотидов с перфторфенилазидогруппой на 5'-концевом фосфате на нуклеотиде в положении +1 или -3 (Bulygin et al., 1997). В то же время производное p(UUU)2 с алкилирующей группой на 5'-фосфате в комплексе с 80S рибосомами и РЬе-тРНКРЬс сшивалось с С1057 18S рРНК (Malygin et al., 1994). Различия в результатах модификации 18S рРНК в комплексах 80S рибосом с фотоактивируемыми и алкилирующим

производными гексарибонуклеотидов могут быть связаны как с разной природой сшивающих групп, так и с разной пространственной ориентацией этих групп. С другой стороны, тот факт, что один и тот же нуклеотид G1207 18S рРНК сшивается с фотоактивируемой группой, присоединенной к разным положениям в нуклеотиде (к 5'-концевому фосфату и к атому N7 остатка гуанина или атому С5 остатка урацила), указывает на то, что G1207 в равной степени доступен для этой группы, несмотря на то, что ее пространственная ориентация в этих положениях может сильно отличаться.

На основании вышеизложенных данных можно заключить, что кодоны мРНК в A-, Р- и Е-учасгках 80S рибосомы сближены с нуклеотидами G961, С1057, G1207, G1702, А1823, А1824 и А1825 18S рРНК на стадии элонгации. Данные о том, что нуклеотид G1207 18S рРНК соседствует практически со всеми нуклеотидами кодонов в Р- и Е-участках свидетельствуют в пользу того, что матрица на рибосоме делает резкий изгиб между этими ко донами, благодаря чему нуклеотид G1207 оказывается примерно на одинаковом расстоянии от любого из нуклеотидов кодонов в Р-и E-участках. Сшивка реакционноспособных групп на нуклеотидах в положениях +1 (результаты настоящей работы), +3/+4 и +6/+7 (Malygin et al., 1994) с G1702 18S рРНК, по-видимому, также отражает изгиб матрицы между кодонами в Р- и A-участках, который, как известно, имеет место между кодонами мРНК в Р- и A-участках рибосом бактерий (Yusupov et al., 2001; Yusupova et al., 2001).

Многие из белков, окружающие по данным сшивок нуклеотиды кодона в Р-участке, соседствуют с нуклеотидами кодона в E-участке. Так, белки S2 и S3 согласно результатам по сшивкам производных pUUUGUU с фотоактивируемой группой на первом, втором или третьем остатке урацила, сближены со всеми нуклеотидами кодонов матрицы в Р- и E-участках (т.е. с нуклеотидами в положениях от +3 до -3) (рис. 6). Обращает на себя внимание тот факт, что сшивка с белками S2 и S3 происходит эффективно и в отсутствие тРНК. Кроме того, для производного pUUUGUU, несущего фотоактивируемую группу на первом остатке урацила, наблюдали слабую независимую от тРНК модификацию белка S14. Поли(и) полностью блокирует эти сшивки (см. в качестве примера данные для аналога I, рис. 6г, дорожка К), следовательно, они происходят в мРНК-связывающем центре, а не являются результатом какой-либо неспецифической модификации рибосом. Поскольку бинарные комплексы производных pUUUGUU с 80S рибосомами очень лабильны (связывания не обнаруживали методом фильтрации на нитроцеллюлозных фильтрах) (см. табл. 1, комплексы 9), то достаточно высокий уровень сшивок с белками мог быть обусловлен быстрым обменом между связанным и свободным фотоактивируемым производным pUUUGUU во время облучения. В связи с этим можно было бы предположить, что в комплексах 1-3 сшивка производных pUUUGUU с белками S2 и S3 происходила за счет бинарных комплексов,

присутствовавших в реакционных смесях. Однако, по крайней мере, для комплексов 1 и 2 с производным pUUUGUU, несущим фотоактивируемую группу на первом остатке урацила, такое предположение неправомерно, поскольку практически все рибосомы находились в соответствующем комплексе (см. табл. 1). Кроме того, маловероятно, что в комплексах 1-3 и в бинарном комплексе расположение аналога мРНК относительно компонентов рибосомы одинаково. Поэтому, хотя одни и те же белки S2 и S3 сшиваются с аналогами I-III в комплексах 1-3 и в бинарном комплексе, модификация, скорее всего, происходит в разных фрагментах соответствующих белков.

Белок S26 соседствует с первыми нуклеотидами кодонов в Р- и Е-участках, о чем свидетельствует сшивка с этим белком модифицированного остатка урацила из положениий +1 и -3 в случае производного pUUUGUU (рис. 7). Сшивки с белком S5/S7 фотоактивируемой группы на остатке урацила в положениях +2, +3 и от -1 до -3 и белком S14 аналогичной группы на остатке урацила в положениях +1 и -3 также позволяет отнести эти белки к окружению кодонов в Р- и E-участках (рис. 6). Однако тот факт, что сшивка с белками S5/S7 и S14 наиболее эффективна в случае, когда модифицированный остаток урацила находится в положении -3, свидетельствует о непосредственном соседстве этих белков в первую очередь с кодоном матрицы в E-участке. В отличие от белков S5/S7, S14 и S26, белок S23 принадлежит только окружению кодона в Р-участке, поскольку сшивка производного pUUUGUU с этим белком наблюдается лишь в комплексах с модифицированным остатком урацила в положении +1, но не в положении -3 (см. рис. 7).

Модификацию белков S2, S3 и S26 неоднократно наблюдали ранее при использовании различных производных олигорибонуклеотидов в комплексах, где модифицированный нуклеотид находился в A-, Р- или Е-участке 80S рибосом (Грайфер и соавт., 2001). Было высказано предположение, что белки S2 и S3 занимают центральное положение в области мРНК-связывающего центра, а белок S26 сближен с кодонами в Р- и E-участках, последнее подтверждают результаты настоящей работы. Таким образом, на основании полученных результатов, а также принимая во внимание предыдущие данные (Грайфер и соавт., 2001), можно заключить, что в процессе элонгации белки S2, S3 и S3a окружают кодоны в A-, Р- и Е-участках, белок S15 соседствует с кодонами в А- и Р-участках, белок S23 сближен только с 5'-стороной кодона в Р-участке, в то время как кодоны в Р-и E-участках расположены вблизи белков S6, S5/S7, S14 и S26. Следует отметить, что практически во всех случаях независимо от природы сшивающей группы (результаты настоящей работы и данные, полученные ранее (Malygin et al., 1994; Смоленская и соавт., 1997; Bulygin et al., 1997)) модификация белка S26 была всегда сильнее, чем модификация остальных белков, что может являться отражением непосредственного контакта белка S26 с кодонами в Р- и Е-участках.

7.3. Соотнесение данных по аффинной модификаиии 80S рибосом человека реакиионноспособными аналогами мРНК со структурой мРНК-связываюшего иентра рибосом бактерий. И BS Поскольку к

\ G961(G693) I----------- "

4,4..::..,-:.

оп!

ft

цЩйЛШШ

г ; î?

Ч>.

ciWà. 4!.¡ vï

C1057(U789) w ;■•••• i.!"'"1;

« й íh,

'{.Г G1207(G926)

J>

настоящему времени нет структурных данных по рибосомам млекопитающих с

разрешением, позволяющим «видеть» отдельные белки и нуклеотиды рРНК,

данные по сшивкам аналогов матрицы с рибосомами человека были соотнесены с данными, полученными с помощью РСА, по расположению матрицы на бактериальных 70S рибосомах (Carter et al., 2000; Yusupov et al., 2001; Yusupova et al., 2001; Ogle et al., 2001). Нуклеотиды G961, C1057, Gl207, G1702, A1823 и A1824 18S рРНК (рис. 8), сближенные с кодонами в A-, Р- и Е-участках 80S рибосом человека, соответствуют нуклеотидам G693, U789, G926, G1401, А1492 и А1493 16S рРНК (Neefs et al., 1990; Gutell, 1993), которые принадлежат высококонсервативным районам рРНК малых субчастиц и образуют тесный кластер в участке структуры 30S субчастицы, известном как декодирующий центр. Нуклеотиды С1057 и G961 18S рРНК, как и соответствующие им нуклеотиды U789 (спираль Н24а) и G693 (спираль H23b) 16S рРНК, принадлежат к окружению кодона матрицы в Р- и Е-участках, соответственно. Нуклеотидный остаток G1207 18S рРНК, сближенный со всеми нуклеотидами кодонов мРНК в Р- и Е-участках, соответствует G926 («выпетленному» нуклеотиду в середине спирали Н28) 16S рРНК, который находится на «шее» 30S субчастицы. Согласно данным РСА между кодонами в Р- и Е-участках матрица делает резкий поворот, при этом район G925 16S рРНК оказывается сближенным с нуклеотидами в положениях от -1 до -3 и в +1. Данные по сшивкам аналогов мРНК с

г

...( I Ж

/ | j \ VA1825 (А1508-О1517) &2 Щ ) / i ! \?А1824(А1493) <>...■•' —' ' V? А1823(А1492)

<G1 lï Ш

,м Рис. 8. Вторичная

•jS структура 18S рРНК П человека согласно И (Gutell, 1993). Указаны нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с аналогами мРНК (положения нуклеотидов, несущих сшивающую группу, обозначены в рамке). В скобках указаны соответствующие нуклеотиды 16S рРНК E.coli.

Pf)

"-■■y v;v"'

рибосомами человека, хорошо кореллируют с этими данными, следовательно можно полагать, что наличие резкого изгиба между кодонами в Р- и Е-участках вблизи нуклеотида в середине

спирали Н28 рРНК малой субчастицы (G1207 18S рРНК или G926 16S рРНК) является универсальной чертой расположения матрицы в мРНК-связывающем центре рибосом всех организмов. Нуклеотид G1702 18S рРНК соответствует G1401 (основание спирали Н44) 16S рРНК, который в кристаллической структуре комплекса 70S с мРНК и тРНК сближен с первым нуклеотидом кодона в A-участке и последним нуклеотидом кодона в Р-участке и стабилизирует изгиб матрицы между кодонами в этих участках. В случае рибосом эукариот, по-видимому, имеет место такой же изгиб, в результате которого нуклеотиды кодонов в А- и Р-участках оказываются сближенными, а нуклеотид G1702 18S рРНК располагается внутри образуемой кодонами «петли». Таким образом, наличие изгиба между кодонами в А- и Р-участках вблизи нуклеотида G1702 18S рРНК (или G1401 16S рРНК) также можно считать универсальной чертой расположения матрицы на рибосомах всех организмов. Нуклеотиды А1823 и А1824 18S рРНК, соседствующие с кодоном в A-участке рибосом человека, соответствуют нуклеотидам А1492 и А1493 (основание спирали Н44) 16S рРНК E.coli, находящимся в основании «шеи» 30S субчастицы, которые непосредственно участвуют в процессе декодирования (Ogle et al., 2001). Последовательность 1840-1849 в З'-концевом домене 18S рРНК, с которой сближена матрица в отсутствие тРНК, соответствует району 1508-1517 (спираль Н45) 16S рРНК, который расположен на «теле» 30S субчастицы и находится на расстоянии порядка 20 Â от нуклеотида G926 (Mundus and Wollenzien, 1998), соседствующего с первым нуклеотидом кодона в Р-участке. Следовательно, есть все основания полагать, что часть матрицы, не фиксированная кодон-антикодоновыми взаимодействиями, связывается на 80S рибосоме в участке, расположенном вблизи декодирующего центра. Таким образом, результаты настоящей работы подтверждают сделанный ранее вывод о том, что кодоны матрицы в А-, Р- и E-участках рибосом человека и бактерий окружены универсальными нуклеотидами, т.е. нуклеотидами занимающими одинаковое положение в эволюционно-консервативных участках вторичной структуры рРНК малых субчастиц.

Белки S2, S3, S3a, S5/S7, S6, S14, S15, S23 и S26, окружают кодоны матрицы в A-, Р- и E-участках рибосом человека. Гомологами белков S2, S3, S5, S14, S15 и S23 являются белки S5, S3, S7, Sil, S19 и S12 рибосом E.coli, тогда как S3a, S6 и S26 вообще не имеют гомологов среди рибосомных белков бактерий (Wool et al., 1996). Рибосомные белки S7 и Sil бактерий, как и гомологичные им белки S5 (S5/S7) и S14 рибосом млекопитающих, сближены с кодоном матрицы в E-участке. Белок S19 удален от кодонов в А-и Р-участках в кристаллической структуре 70S рибосом, в то время как его гомолог S15 соседствует с этими кодонами в мРНК-связывающем центре 80S

рибосом человека. Белок S12 прокариот контактирует с ко доном в А-участке кристаллической структуры 70S рибосомы, а его гомолог S23 сближен с первым нуклеотидом кодона в Р-участке 80S рибосом. Наконец, белки S5 и S3 бактерий соседствуют только с нуклеотидами матрицы в положениях от +11 до +15, тогда как гомологичные им белки S2 и S3 занимают центральное положение в мРНК-связывающем центре рибосом млекопитающих, т.е. сближены практически со всеми нуклеотидами кодонов в A-, Р- и Е-участках. Таким образом, на основании вышеизложенного можно заключить, что хотя многие из белков, сближенных с кодонами матрицы на рибосомах бактерий и млекопитающих, являются гомологами, большинство из этих белков окружает разные части матрицы на 70S и 80S рибосомах.

Заключение.

Использование производных олигорибонуклеотидов с перфторфенилазидогруппой на одном из остатков гетероциклических оснований позволило получить детальную информацию об окружении каждого из нуклеотидов кодонов мРНК в Р- и E-участках, а также данные о нуклеотидных остатках 18S рРНК, сближенных с первым нуклеотидом кодона в A-участке. Результаты настоящей работы подтвердили сделанный ранее вывод о том, что кодоны матрицы в A-, Р- и E-участках соседствуют с нуклеотидами, занимающими одинаковое положение во вторичной структуре рРНК малых субчастиц рибосом бактерий и млекопитающих. Кроме того, с использованием данных производных найдены новые структурные элементы в З'-концевом (нуклеотиды А1823, А1824 и А1825) и центральном (нуклеотид G961) доменах 18S рРНК, сближенные с кодонами матрицы в А- и Е-участках, соответственно, а также выявлено сходство в расположении матрицы на рибосомах бактерий и млекопитающих, а именно, наличие резкого изгиба между кодонами в Р- и E-участках. Наряду со сходством обнаружены отличия в расположении матрицы на рибосомах прокариот и высших эукариот. Одно из отличий вызвано появлением дополнительного (по сравнению с 16S рРНК) нуклеотида А1825 18S рРНК, сближенного с кодоном мРНК в A-участке рибосом человека. Другое отличие касается белкового окружения матрицы в A-, Р- и E-участках. Белок S26, не имеющий гомолога среди бактериальных рибосомных белков, сближен с кодонами матрицы в Р-и E-участках 80S рибосомы; а белок S23 соседствует с 5'-стороной кодона в Р-участке, в отличие от гомологичного ему белка S12, вблизи которого располагается ко дон в А-участке 70 S рибосомы.

На основании полученных результатов, а также принимая во внимание предыдущие данные (Грайфер и соавт., 2001), предложена схема расположения матрицы в A-, Р- и E-участках 80S рибосом человека (рис. 9). Согласно этой схеме, между кодонами в А- и Р-участках матрица делает изгиб, в результате чего эти кодоны оказываются сближенными с нуклеотидом G1702 18S рРНК

60S субчасти

40S субчасти па

S15

мРНК

и белком S15, в то время как нуклеотиды А1823, А1824 и А1825 соседствуют только с кодоном в А-участке, а первый нукпеотид кодона в Р-участке - с С1057. Другой более резкий изгиб делает матрица между кодонами в Р- и Е-участках, благодаря которому нуклеотид G1207 18S рРНК и белок S26 располагаются вблизи этих кодонов, при этом остаток G961 соседствует только с первым и вторым нуклеотидами кодона в Е-участке.

Рис. 9. Схема расположения матрицы в A-, Р- и E-участках 80S рибосом человека.

ВЫВОДЫ

1. Изучено окружение на 80S рибосоме кодонов мРНК в A-, Р- и E-участках с помощью аффинной модификации рибосом человека аналогами мРНК -фотоактивируемыми производными олигорибонуклеотидов, несущими перфторфенилазидогруппу на остатке гетероциклического основания.

а) Определены нуклеотиды 18S рРНК и рибосомные белки, сшивающиеся с производными гексарибонуклеотида pUUUGUU с перфторфенилазидогруппой на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях от +3 до -3 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке:

— показано, что модификации во всех случаях подвергается исключительно 40S субчастица, а в её составе - как 18S рРНК, так и белки;

— установлено, что модифицированный остаток урацила в положениях от -1 до +3 сшивается с нуклеотидом G1207 18S рРНК, а в положениях -2 и -3 - с G961;

— обнаружено, что во всех изученных комплексах производные pUUUGUU модифицируют белки S2 и S3, сшивка с которыми происходит и в отсутствие тРНК;

— установлено, что модифицированный остаток урацила в положении +1 сшивается с белком S26 и в незначительной степени с белком S23, а в положении -3 - также с белком S26 и в незначительной степени с белком S5/S7.

б) Определены нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с производным гексарибонуклеотида pUUUGUU с перфторфенилазидогруппой на атоме N7

остатка гуанина в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях +4 и +1. Показано, что модифицированный остаток в положении +4 сшивается с нуклеотидами А1823, А1824 и А1825 18S рРНК, а в положении +1 - с Gl 702.

в) Определены нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с производным додекарибонуклеотида pUUAGUAUUUAUU с перфторфенилазидогруппой на атоме N7 остатка гуанина в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положении -3, и в бинарном комплексе (т.е. в отсутствие тРНК). Показано, что модифицированный остаток в положении -3 сшивается с нуклеотидом G1207 18S рРНК независимо от наличия и природы тРНК в Е-участке, а в бинарном комплексе - с 3'- концевым участком 1840-1849.

2. Сопоставление результатов по фотоаффинной модификации рибосом человека с данными рентгеноструюурного анализа рибосом бактерий позволило выявить:

а) новые универсальные элементы структуры рРНК малой субчастицы, сближенные с кодонами в А- (нуклеотиды А1823 и А1824 18S рРНК и соответствующие им нуклеотиды А1492 и А1493 16S рРНК E.colí) и Е-(нуклеотид G961 18S рРНК и соответствующий ему нуклеотид G693 16S рРНК E.colí) участках;

б) универсальную черту расположения матрицы на рибосоме - резкий изгиб между кодонами в Р- и Е-участках;

в) отличие в белковом окружении матрицы на рибосомах млекопитающих и бактерий, а именно, белок S26, не имеющий гомолога среди бактериальных рибосомных белков, соседствует с кодонами в Р- и Е-участках 80S рибосомы.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Грайфер Д.М., Демешкина H.A., Булыгин К.Н., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. Окружение 5'-концевого нуклеотида кодона мРНК в Р- и E-сайтах рибосом человека: сшивки с производными pUUUGUU. несущими фотоактивируемую группу на остатке урацила или 5'-фосфате // Молекуляр. биология. 2000. Т. 34. С. 270-276.

2 .Демешкина H.A., Репкова М.Н., Веньяминова А.Г., Грайфер Д.М., Карпова Г.Г. Аналог мРНК — производное pUUUGUU с арилазидогруппой на остатке гуанозина, сшивается с нуклеотидами А-1823 и А-1824 18S рРНК в составе 80S рибосом человека // Молекуляр. биология. 2000. Т. 34. С. 894-898.

3. Demeshkina N., Repkova M, Ven'yaminova A., Graifer D., Karpova G. Nucleotides of 18S rRNA surrounding mRNA codons at the human A, P, and E sites: A crosslinking study with mRNA analogs carrying an aryl azide group at either the uracil or the guanine residue // RNA. 2000. V. 6. P. 1727-1736.

4. Демешкина H.A., Репкова M.H., Веньяминова А.Г., Грайфер Д.M., Карпова Г.Г. Сшивки аналога мРНК, производного pUUAGUAUUUAUU с фотоактивируемой группой на остатке гуанозина, с 80S рибосомами человека // Молекуляр. биология. 2002. Т. 36. С. 114-122.

5. Демешкина Н.А., Лалетина Е.С., Мещанинова М.И., Репкова М.Н., Венъяминова А.Г., Грайфер Д.М., Карпова Г.Г. Окружение кодонов мРНК в Р-

и Е-участках рибосом человека по данным фотосшивок с производными pUUUGUU // Молекуляр. биология. 2003. Т. 37. С. 147-155.

6. Demeshkina N„ Laletina Е., Meschaninova М., Ven'yaminova A., Graifer D., Karpova G. Positioning of mRNA codons with respect to 18S rRNA at the P and E sites of human ribosome // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1627. P. 39-46.

Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 396-600. Тираж 100 экз.

i

]

!

1

i

i

i )

i

2 oo5-fli ~ iSéoj

P T56 0 Î 7

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Структурно-функциональная организация рибосомы в процессе элонгации (Обзор литературы)

1.1. Структурно-функциональная организация бактериальной рибосомы

1.1.1. Общее строение рибосомы

1.1.2. мРНК-связывающий центр

1.1.3. Расположение молекул тРНК в A-, Р- и E-участках рибосомы

1.1.4. Декодирование мРНК

1.1.4.1. Структурные основы взаимодействия кодон-специфичной тРНК в А-участке

1.1.4.2. Роль фактора элонгации Tu

1.1.5. Образование пептидной связи

1.1.6. Транслокация

1.1.6.1. Модели транслокации

1.1.6.2. Роль фактора G

1.1.7. Механизмы действия некоторых антибиотиков

1.1.8. Сравнение данных по структурной организации активных центров, полученных методом аффинной модификации и РСА

1.1.8.1. мРНК-связывающий центр

1.1.8.2. тРНК-связывающие участки

1.2. Некоторые аспекты структурно-функциональной организации рибосом эукариот

1.2.1. Структурно-функциональная организация рибосом дрожжей

1.2.2. Структурно-функциональная организация рибосом высших эукариот

1.2.3. мРНК-связывающий центр рибосом человека

Изучение структурно-функциональной топографии рибосом важно не только для понимания молекулярных механизмов биосинтеза белка, но и для разработки подходов к m регуляции этого процесса. К настоящему времени достигнуты значительные успехи в изучении структурно-функциональной организации рибосом бактерий [1,2], вместе с тем наблюдается отставание в изучении рибосом эукариот. По-видимому, это связано не только с меньшей доступностью рибосом эукариот (и, в частности, человека), но и с тем, что многие из методов, успешно применяемых для изучения бактериальных рибосом, пока что не могут быть использованы для исследования рибосом высших организмов. Прежде всего это касается метода РСА, так как кристаллы эукариотических рибосом пока не получены, и методов, основанных на реконструкции рибосомных субчастиц из белков и рРНК, поскольку до сих пор не найдено подходов к сборке активных субчастиц рибосом эукариот in vitro. В связи с этим, пожалуй, единственным на сегодняшний день методом, с помощью которого может бьггь получена детальная информация о структурной организации рибосом эукариот, является метод аффинной модификации (или, как теперь принято называть, метод аффинного химического сшивания), основанный на использовании реакционноспособных аналогов компонентов аппарата трансляции (мРНК, тРНК и т.п.), который оказался в свое время очень продуктивным при изучении бактериальных рибосом (см. обзоры [3,4]).

Лаборатория Структуры и Функции Рибосом НИБХ СО РАН является единственным в мире научным коллективом, где на протяжении ряда лет проводится систематическое исследование мРНК-связывающего центра рибосом человека с помощью метода аффинной модификации. К моменту начала настоящей работы были выявлены существенные отличия во взаимодействии мРНК с рибосомами про- и эукариот. Так, с помощью синтетических матриц, несущих остатки 4-тиоуридина, было показано, что взаимодействие мРНК с эукариотической рибосомой осуществляется за счет меньшего числа контактов с рРНК малой субчастицы. С помощью коротких аналогов мРНК -производных олигорибонуклеотидов было установлено с какими нуклеотидами 18S рРНК сближены первые нуклеотиды ко донов матрицы в Р- и Е-участках (положения +1 и -3, соответственно) и нуклеотиды, расположенные с 3'-стороны от ко дона в А-участке (положения от +7 до +13) и с 5'-стороны от кодона в Е-участке (положение -6). Было также известно, с каким нуклеотидом 18S рРНК соседствует нуклеотид мРНК, примыкающий с З'-стороны к ко дону в Р-участке. Кроме того, было изучено белковое окружение первых нуклеотидов кодонов матрицы в А-, Р- и Е-участках и нуклеотидов, расположенных с 5'- и З'-сторон от этих участков (см. обзоры [5,6]).

Целью настоящей работы являлось изучение окружения на 80S рибосоме человека первого нуклеотида кодона в A-участке (положение +4 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке) и каждого из нуклеотидов кодонов матрицы в Р- и Е-участках (положения от +3 до -3) с помощью метода аффинного химического сшивания с использованием коротких аналогов мРНК, производных олигорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на остатке гетероциклического основания, в составе комплексов, имитирующих различные состояния рибосомы в процессе элонгации.

Основными задачами являлись: определение нуклеотидов 18S рРНК и рибосомных белков, сшивающихся с производными гексарибонуклеотида pUUUGUU, несущими перфторфенилазидогруппу на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила, в рибосомных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях от +3 до -3; определение нуклеотидов 18S рРНК, сшивающихся с производным гексарибонуклеотида pUUUGUU, несущим перфторфенилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина, в рибосомных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях +4 и +1; определение нуклеотидов 18S рРНК, сшивающихся с производным додекарибонуклеотида pUUAGUAUUUAUU, несущим перфторфенилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина, в рибосомном комплексе, где модифицированный остаток находился в положении -3, и изучение влияния наличия и природы тРНК в E-участке на сшивку с 18S рРНК в этом комплексе; сопоставление данных по фотоаффинной модификации рибосом человека производными олигорибонуклеотидов pUUUGUU и pUUAGUAUUUAUU с данными, полученными с помощью РСА, по расположению матрицы на бактериальных рибосомах.

выводы

1. Изучено окружение на 80S рибосоме кодонов мРНК в A-, Р- и E-участках с помощью аффинной модификации рибосом человека аналогами мРНК — фотоактивируемыми производными олигорибонуклеотидов, несущими перфторфенилазидогруппу на остатке гетероциклического основания. а) Определены нуклеотиды 18S рРНК и рибосомные белки, сшивающиеся с производными гексарибонуклеотида pUUUGUU с перфторфенилазидогруппой на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях от +3 до -3 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке: показано, что модификации во всех случаях подвергается исключительно 40S субчастица, а в её составе - как 18S рРНК, так и белки; установлено, что модифицированный остаток урацила в положениях от -1 до +3 сшивается с нуклеотидом G1207 18S рРНК, а в положениях -2 и -3 - с G961; обнаружено, что • во всех изученных комплексах производные pUUUGUU модифицируют белки S2 и S3, сшивка с которыми происходит и в отсутствие тРНК; установлено, что модифицированный остаток урацила в положении +1 сшивается с белком S26 и в незначительной степени с белком S23, а в положении -3 - также с белком S26 и в незначительной степени с белком S5/S7. б) Определены нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с производным гексарибонуклеотида pUUUGUU с перфторфенилазидогруппой на атоме N7 остатка гуанина в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положениях +4 и +1. Показано, что модифицированный остаток в положении +4 сшивается с нуклеотидами Al 823, Al 824 и Al 825 18S рРНК, а в положении +1 - с G1702. в) Определены нуклеотиды 18S рРНК, сшивающиеся с производным додекарибонуклеотида pUUAGUAUUUAUU с перфторфенилазидогруппой на атоме N7 остатка гуанина в модельных комплексах, где модифицированный остаток находился в положении -3, и в бинарном комплексе (т.е. в отсутствие тРНК). Показано, что модифицированный остаток в положении -3 сшивается с нуклеотидом G1207 18S рРНК независимо от наличия и природы тРНК в E-участке, а в бинарном комплексе — с 3'-концевым участком 1840-1849.

2. Сопоставление результатов по фотоаффинной модификации рибосом человека с данными рентгеноструктурного анализа рибосом бактерий позволило выявить: а) новые универсальные элементы структуры рРНК малой субчастицы, сближенные с ко донами в А- (нуклеотиды Al 823 и Al 824 18S рРНК и соответствующие им нуклеотиды А1492 и А1493 16S рРНК Е. coli) и Е- (нуклеотид G961 18S рРНК и соответствующий ему нуклеотид G693 16S рРНК Е. coli) участках; б) универсальную черту расположения матрицы на рибосоме - резкий изгиб между кодонами в Р- и Е-участках; в) отличие в белковом окружении матрицы на рибосомах млекопитающих и бактерий, а именно, белок S26, не имеющий гомолога среди бактериальных рибосомных белков, соседствует с кодонами в Р- и E-участках 80S рибосомы.

2.3. Заключение.

Таким образом, использование производных олигорибонуклеотидов с перфторфенилазидогруппой на одном из остатков гетероциклических оснований позволило получить детальную информацию об окружении каждого из нуклеотидов кодонов мРНК в Р- и E-участках, а также данные о нуклеотидных остатках 18S рРНК, сближенных с первым нуклеотидом кодона вА-участке. Результаты настоящей работы подтвердили сделанный ранее вывод о том, что кодоны матрицы в A-, Р- и Е-участках соседствуют с нуклеотидами, занимающими одинаковое положение во вторичной структуре рРНК малых субчастиц рибосом бактерий и млекопитающих. Кроме того, с использованием данных производных найдены новые структурные элементы в 3'-концевом (нуклеотиды А1823, А1824 и А1825) и центральном (нуклеотид G961) доменах 18S рРНК, сближенные с кодонами матрицы в А- и E-участках, соответственно, а также выявлено сходство в расположении матрицы на рибосомах бактерий и млекопитающих, а именно, наличие резкого изгиба между кодонами в Р- и E-участках. Наряду со сходством обнаружены отличия в расположении матрицы на рибосомах прокариот и высших эукариот. Одно из отличий вызвано появлением дополнительного (по сравнению с 16S рРНК) нуклеотида Al 825 18S рРНК, сближенного с ко доном мРНК в A-участке рибосом человека. Другое отличие касается белкового окружения матрицы в A-, Р- и Е-участках. Белок S26, не имеющий гомолога среди бактериальных рибосомных белков, сближен с кодонами матрицы в Р- и Е-участках 80S рибосомы; а белок S23 соседствует с 5'-стороной ко дона в Р-участке, в отличие от гомологичного ему белка S12, вблизи которого располагается кодон в A-участке 70S рибосомы.

На основании полученных результатов, а также принимая во внимание предыдущие данные [147, 150-153,159], предложена схема расположения матрицы в A-, Р- и Е-участках 80S рибосом человека (рис. 24). Согласно этой схеме, между кодонами в А- и Р-участках матрица делает изгиб, в результате чего эти кодоны оказываются сближенными с нуклеотидом G1702 18S рРНК и белком S15, в то время как нуклеотиды Al 823, Al 824 и Al 825 соседствуют только с кодоном в A-участке, а первый нуклеотид ко дона в Р-участке - с С1057. Другой более резкий изгиб делает матрица между кодонами в Р- и Е-участках, благодаря которому нуклеотид Gl207 18S рРНК и белок S26 располагаются вблизи этих ко донов, при этом остаток G961 соседствует только с первым и вторым нуклеотидами кодона в Е-участке.

40S субчастица

Рис. 24. Схема расположения матрицы в A-, Р- и Е-участках 80S рибосом человека.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы

В работе использовали дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты и АТР фирмы «Sigma» (США); акриламид, дезоксихолат натрия, DMSO, DTT, HEPES, LÍCIO4, N-N'-метиленбисакриламид, пуромицин, PIPES, спермин, SDS, Трис, циклогексимид и краситель «Stains all» фирмы «Fluka» (Швейцария); 2-меркаптоэтанол и сорбент Nucleosil 5С18 фирмы «Macherey-Nagel» (Германия); кумасси бриллиантовый голубой - «Ferak» (Германия); TEMED, спермидин и поли(и) - «Reanal» (Венгрия); ферменты: AMV-ревертазу фирмы «Life Science» (США), РНКазу А и протеиназу К фирмы «Sigma» (США), РНКазу U2, РНКазу Т1 и щелочную фосфатазу фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия), РНКазу Н фирмы «Biopol» (Россия), Т4 полинуклеотидкиназу фирмы «Сибэнзим» (Россия), Т4 РНК-лигазу фирмы «Promega» (США). тРНКУа1 (1800 пмоль/ ОЕ26о), тРНКРНе (1300 пмоль/ОЕ26о), [14С]РЬе-тРНКРЬе (800 dpm/пмоль, 1300 пмоль/ОЕгбо), Уа1-тРНКУа1 (1800 пмоль/ОЕгбо) Е. coli любезно предоставлены Т.Г. Шапкиной (Санкт-Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова, г. Гатчина) и tPHKAsp (1300 пмоль/ ОЕгбо), любезно предоставленную H.A. Моор (Лаборатория биоорганической химии ферментов, НИБХ СО РАН); олигорибонуклеотиды UUUGUU, UUUGUU3 0Me, UUAGUAUUUAUU и производные олигорибонуклеотида UUUGUU с перфторфенилазидогруппой на атоме С5 первого, второго или третьего остатка урацила синтезированы и охарактеризованы в Группе химии олигорибонуклеотидов (Лаборатория химии нуклеиновых кислот, НИБХ СО РАН); [у-32Р]АТР (1000 Ки/ммоль) и [5'-32Р]рСр (450 Ки/ммоль) синтезированы Д.В. Семёновым (Лаборатория радиохимии, НИБХ СО РАН); олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные нуклеотидным последовательностям 821-840, 950-969,1081-1100, 11811200, 1197-1216, 1821-1840, 1835-1849, 1830-1849 и 1851-1869 18S рРНК человека, синтезированы в НИБХ СО РАН, а олигомеры, комплементарные последовательностям 655-674, 1222-1241, 1396-1417, 1621-1640 и 1812-1831, любезно предоставлены П. Воллензиеном (Университет штата Северная Каролина, г. Роли, США). CIRCH2NH2 и N

100 гидроксисукцинимидный эфир л-азидотетрафторбензойной кислоты синтезированы Т.М. Ивановой (Лаборатория исследования модификации биополимеров, НИБХ СО РАН).

Прочие неназванные реактивы были марки «хч», «чда» или «осч». Для приготовления всех растворов использовали бидистиллированную воду (прибор для очистки воды VHQ-PS фирмы «SITA», Великобритания). Для фильтрования растворов и анализа связывания меченых лигандов с 80S рибосомами использовали нитроцеллюлозную мембрану фирмы «Millipore» (США) с диаметром пор 0,45 мкм.

Оптическую плотность регистрировали с помощью микроспектрофотометра «Милихром» (НПО «Научприбор», г. Орёл). Фотоаффинную модификацию 80S рибосом проводили, используя УФ-лампу фирмы «SpotCure» (Великобритания). Препараты сушили на вакуумном испарителе «UNIYAPO 100Н» (Германия). Измерение pH проводили на рН-метре ОР-264/1 «Radelkis» (Венгрия). Радиоактивность просчитывали на счётчиках «Rackbeta» и «Minibeta» фирмы «LKB-Pharmacia» (Швеция). Пробы, меченные 14С, просчитывали в 5 мл толуольного сцинтиллятора (5 л толуола, 20 г РРО, 1 г РОРОР), меченные 32Р, — в 1 мл воды по Черенкову. Гели радиоавтографировали с использованием рентгеновской плёнки фирмы «Cónica» (США). В работе использовали ультрацентрифугу «Beckman L8M», а также центрифуги «Beckman J2-21M», «Eppendorf 5403» и «Eppendorf 5415С» (Германия).

3.2. Выделение рибосомных 40S и 60S субчастиц из плаценты человека.

Рибосомные 40S и 60S субчастицы с интактной рРНК выделяли из нормальной послеродовой плаценты. Промежуток времени между родами и гомогенизацией ткани не превышал 30 мин. Плаценту немедленно погружали в 500 мл буфера I (20 мМ Трис-НС1, pH 7.5, 125 мМ KCl, 10 мМ MgCb, 0.5 мМ EDTA, 4 мМ 2-меркаптоэтанол), который предварительно охлаждали до 4°С. Не позже, чем через 20 мин после родов, плаценту резали на кусочки по 25-30 г, освобождаясь при этом от мембран и соединительной ткани, отмывали от крови в буфере I и суспендировали при 4°С в равном по весу количестве буфера I, содержащего 250 мМ сахарозу, 1 г/л гепарина и 0.05 г/л циклогексимида. Полученный гомогенат центрифугировали на центрифуге «Beckman J2-21M» (ротор JA-14) при 4°С и 13000 об/мин в течение 30 мин. К постмитохондриальному супернатанту

101 добавляли дезоксихолат натрия до концентрации 1% и перемешивали в течение 30 мин при 4°С. Постмитохондриальный супернатант, обработанный дезоксихолатом, наносили на сахарозную подушку (35%-ный раствор сахарозы в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 100 мМ NH4CI, 3 мМ MgCh, 0.15 мМ EDTA, 5 мМ 2-меркаптоэтанол) и центрифугировали при 4°С 20 ч (центрифуга «Beckman L8M», ротор SW-28, 26000 об/мин). По окончании центрифугирования супернатант осторожно сливали. Осадок полисом растворяли при 4°С в 10 мл буфера 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 100 мМ NH4CI, 3 мМ MgCh, 0.125 мМ EDTA и 10 мМ 2-меркаптоэтанол; нерастворившийся материал удаляли центрифугированием (центрифуга «Beckman J2-21M», ротор JA-20, 17000 об/мин, 15 мин, 4°С). Раствор полисом обрабатывали 0.5 мМ пуромицином 10 мин при 0°С, затем к раствору добавляли по каплям при постоянном помешивании 3 М КС1 до концентрации 0.5 М и инкубировали 20 мин при 37°С, после чего раствор наносили на линейный градиент плотности сахарозы (10 - 30%) в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 500 мМ КС1, 3 мМ MgCh, 0.125 мМ EDTA и 10 мМ 2-меркаптоэтанол, и центрифугировали 18 ч при 4°С (ультрацентрифуга «Beckman L8M», ротор SW-28, 20000 об/мин). Фракции, соответствующие 40S и 60S субчастицам, осаждали центрифугированием (центрифуга «Beckman L8M», ротор SW-28, 24000 об/мин, 22 ч, 4°С), предварительно повысив концентрацию Mg2+ до 20 мМ и снизив концентрацию КС1 до 120 мМ. Осадки растворяли в воде до концентрации 80-120 ОЕгбо/мл и хранили в жидком азоте порциями по 25 мкл. Перед использованием к 40S и 60S субчастицам добавляли '/4 объема пятикратного буфера А (однократный буфер А: 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 120 мМ КС1, 13 мМ MgCl2, 0.65 мМ EDTA) или буфера Б (однократный буфер Б: 20 мМ HEPES-NaOH, рН 7.5, 100 мМ NH4CI, 4 мМ MgCl2, 0.15 мМ EDTA, 0.6 мМ спермидин, 0.8 мМ спермин) до концентрации субчастиц 15-20 ОЕгбо/мл, реактивировали в течение 10 мин при 37°С, осветляли центрифугированием в течение 1 мин при комнатной температуре при 14000 об/мин и замеряли оптическую плотность, полагая, что 1 ОЕгбо соответствует 50 пмоль 40S или 25 пмоль 60S субчастиц по данным [171]. Для получения 80S рибосом субчастицы смешивали в мольном соотношении 40S:60S = 1:1.3, при этом, как показал анализ 80S рибосом в линейном градиенте плотности сахарозы (10

30%) в буфере А (центрифуга «Beckman L8M», ротор SW-40, 24000 об/мин, 19 ч, 4°С), практически все 40S субчастицы ассоциируют с 60S субчастицами. Конечная концентрация реактивированного препарата 80S рибосом составляла примерно 10"6 М. Активность 80S рибосом в поли(Ц)-зависимом связывании [14C]Phe-TPHKPhe измеряли по методике, описанной в работе [172], она составляла примерно 70% (т.е. около 1.4 моль [14C]Phe-TPHKPhe связывалось с 1 моль 80S рибосом).

3.3. Синтез фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов, несущих перфторфенилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина.

Присоединение перфторфенилазидогруппы по атому N7 остатка гуанина олигорибонуклеотидов UUUGUU (UUUGUU3>oMe) и UUAGUAUUUAUU проводили в две стадии. Вначале олигорибонуклеотиды алкилировали, инкубируя 0.5 ОЕ2бо UUUGUU (UUUGUU3 oMe) с 400 нмоль C1RCH2NH2 в 160 мкл 8 мМ Трис-HCl, рН 7.5, в течение 5 ч при 37°С или 0.66 ОЕгео UUAGUAUUUAUU с 24 нмоль C1RCH2NH2 в 120 мкл 8 мМ Трис-HCl, рН 7.5, в течение 2 ч при 47°С. Продукты алкилирования выделяли с помощью офВЭЖХ на микроколонке объёмом 200 мкл со смолой Nucleosil 5С18 (элюция ступенчатым градиентом концентрации 10, 20, 30, 40 и 90%-ного метанола в 50 мМ ТЭА-ацетате, рН 7.5, 24 мин, скорость элюции 100 мкл/мин). Элюция алкилированных олигорибонуклеотидов происходила при несколько более высокой концентрации метанола (54%-ной в случае UUUGUU и 60%-ной в случае UUAGUAUUUAUU), чем элюция исходных олигорибонуклеотидов. Степень модификации олигорибонуклеотидов составляла 90%. Фракцию, содержащую алкилированный олигорибонуклеотид, упаривали досуха в вакууме, растворяли в 5 мкл Н20, затем к этому раствору добавляли 10 мкл DMSO и обрабатывали N-гидроксисукцинимидным эфиром «-азидотетрафторбензойной кислоты (NSu-Az), как описано в [152]. Для этого отдельно растворяли 1.8 мг NSu-Az в 20 мкл DMSO и полученный раствор порциями добавляли к раствору алкилированного олигорибонуклеотида при комнатной температуре через каждые полчаса (сначала 10 мкл, затем два раза по 5 мкл). После окончания реакции к смеси в качестве носителя добавляли 1 мкл 0.1 М АТР и нуклеотидный материал осаждали 10 объёмами 2%-ного LiClQ» в ацетоне. Осадок отделяли центрифугированием при 14000 об/мин в течение 3-5 мин при комнатной температуре, высушивали в течение 10-15 мин и растворяли в 40 мкл НгО. Затем проводили повторное переосаждение, как указано выше. Осадок сушили на воздухе в течение 15-20 мин, растворяли в 20 мкл Н2О. Фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов выделяли с помощью офВЭЖХ, как описано выше. Элюция фотоактивируемых производных происходила при несколько большей концентрации метанола (72%-ной в случае ииШШ и 76%-ной в случае ШАСиАЦЦиАШ), чем элюция алкилированных олигорибонуклеотидов, из-за наличия гидрофобной перфторфенилазидогруппы. Выход продуктов, содержащих перфторфенилазидогруппу, по отношению к алкилированным олигорибонуклеотидам составлял около 90%. При расчете молярной экстинкции фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов полагали, что молярная экстинкция перфторфенилазидной части реагента равна 8.6» 103 моль"1 см"1 [173].

3.4. Введение радиоактивной метки на 5'-конец.

Введение метки 32Р на 5'-конец олигорибонуклеотидов и их производных, тРНК и ОДЫ проводили с помощью [у-32Р]АТР и Т4 полинуклеотидкиназы. Для этого реакционную смесь объемом 20 мкл, содержащую 100 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 60 мМ МдСЬ, 1 мМ ЕБТА, 0.5-1.5 нмоль олигорибонуклеотида (0.2 нмоль ОДЫ или 0.4 нмоль тРНК), 10-20 МБк [у-32Р]АТР и 15 ед. акт. Т4 полинуклеотидкиназы, инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Затем в случае олигорибонуклеотидов и их производных к смеси добавляли примерно 1 мкмоль нерадиоактивного АТР и дополнительно инкубировали 15 мин при 37°С. Во всех случаях нуклеотидный материал осаждали 10 объёмами 2%-ного ПСЮ4 в ацетоне и выделяли офВЭЖХ, как описано в разделе 3.3. Удельная активность меченых олигорибонуклеотидов и их производных была (50-100)* 103 имп/мин на пмоль, тРНК - (30-50)-103 имп/мин на пмоль, а ОДН - (5-10)*105 имп/мин на пмоль по Черенкову.

3.5. Гидролиз РНКазой Т1.

Примерно 100 пмоль меченного 32Р исходного или алкилированного ф олигорибонуклеотида (рЦиивии или рЦиАСиАЦЦилии) (см. раздел 3.4) инкубировали в 15 мкл 20 мМ цитрата натрия, рН 5.0, содержащего 250 мкг/мл суммарной тРНК Е. соН, в течение 15 мин при 55°С. Затем к смеси добавляли 0.5 ед. акт. РНКазы Т1 и дополнительно инкубировали 15 мин при 55°С. Продукты гидролиза осаждали 10 объемами 2%-ного ЫСЮ4 в ацетоне (см. раздел 3.3), осадок растворяли в 4 мкл деионизованного формамида, содержащего 0.01%-ный бромфеноловый синий и 0.01%-ный ксиленцианол. Полученный раствор инкубировали в течение 1 мин при 90°С, охлаждали во льду до 0°С и анализировали с помощью электрофореза в 20%-ном ПААГ, содержащем 0.4%-ный бис-акриламид и 8 М мочевину в буфере ТБЕ (89 мМ Трис-борат, рН 8.3, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЕОТА). По окончании электрофореза гель высушивали в вакууме и радиоавтографировали на рентгеновскую пленку.

3.6. Дефосфорилирование тРНК. тРНКУа| или тРНКА;ф (0.4 - 0.6 нмоль) инкубировали в 10 мкл буфера 10 мМ Трис

НС1, рН 7.5, содержащего 0.5 ед. акт. щелочной фосфатазы, при 37°С в течение 30 мин. Затем к реакционной смеси добавляли 40 мкл НгО и выделяли тРНК двухкратной экстракцией равным объёмом водонасьпценного фенола. Следы фенола экстрагировали из водного раствора тРНК трехкратным объёмом серного эфира. Затем к водной фазе добавляли 0.1 объёма 3 М ЫаАс, рН 5.2, 3 объёма охлажденного этанола, после чего пробы выдерживали в течение 3-5 ч при -20°С. Осадок тРНК отделяли центрифугированием (12500 об/мин, 5 мин, 2°С), промывали 200 мкл 70%-ного охлажденного этанола, высушивали на воздухе (20 - 30 мин), растворяли в краске и анализировали с помощью электрофореза в 10%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (см. раздел 3.5). Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (10"6 г/мл); полосы геля, содержащие тРНК, вырезали. Дефосфорилированную тРНК элюировали из геля 300 мкл буфера 300 мМ КаАс, рН 5.2, содержащего 1 мМ ЕОТА и 0.5%-ный БЭЭ, в течение 4-8 ч при 4°С. После элюции тРНК из раствора осаждали этанолом, как описано выше, осадок тРНК растворяли в 10 мкл НгО и вводили Р на 5'-конец тРНК (см. раздел 3.4). Меченую тРНК выделяли с помощью электрофореза в 8%-иом ПААГ в денатурирующих условиях, как описано в разделе 3.5. Полосы, содержащие меченую тРНК, вырезали; тРНК элюировали из геля и осаждали, как описано выше, после чего осадок тРНК растворяли в НгО до конечной концентрации 15 пмоль/мкл. Выход меченой тРНК составил 70-75% (около 300 пмоль) от исходного количества тРНК, взятого в реакцию дефосфорилирования.

3.7. Получение комплексов 80S рибосом с аналогами мРНК в присутствии тРНК.

Рибосомы реактивировали в буфере А (20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 120 мМ КС1, 13 мМ MgCl2) 0.65 мМ EDTA) или Б (20 мМ HEPES-NaOH, рН 7.5, 100 мМ NH4CI, 4 мМ MgCl2, 0.15 мМ EDTA, 0.6 мМ спермидин, 0.8 мМ спермин) при 37°С в течение 10 мин, после чего осветляли центрифугированием при 14000 об/мин в течение 1 мин при комнатной температуре. Препараты тРНК перед использованием переводили в буфер А или Б, реактивировали при 37°С в течение 5 мин и помещали в лед. Связывание 80S рибосом с меченными Р аналогами мРНК в присутствии тРНК проводили, инкубируя смесь соответствующих компонентов в буфере А или Б при 22°С в течение 50 мин.

Для получения комплексов 1 и 6 80S рибосомы инкубировали с соответствующим аналогом мРНК и РЬе-тРНКРЬе (или тРНКРЬе) (табл. 7). Комплексы 3 и 4 получали аналогично, инкубируя 80S рибосомы с соответствующим аналогом мРНК и Val-TPHKVal (или тРНКУЫ) (табл. 7). Комплексы 2 и 5 получали инкубированием комплексов 1 и 4 с Val-TPHKVal и РЬе-тРНК , соответственно, а комплексы 7 и 8 - инкубированием комплекса 6 с тРНКУа1 и тРНК^15, соответственно (табл. 7). Бинарные комплексы получали, инкубируя 80S рибосом с соответствующим аналогом мРНК.

Степень связывания меченных Р аналогов мРНК с 80S рибосомами в составе комплексов, образованных в присутствии тРНК, и в бинарных комплексах, и меченных 32Р тРНКУа1 и TpHKAsp с комплексом 6 (табл. 7), образованным в присутствии немеченого аналога V, анализировали с помощью фильтрования комплексов через нитроцеллюлозные фильтры. Для этого нитроцеллюлозные фильтры предварительно обрабатывали 0.6 М NaOH при 28°С в течение 20 мин, затем фильтры промывали не менее 7 раз бидистиллированной водой и вымачивали в буфере А или Б в течение 30 мин. По окончании инкубации комплексы фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры, промывали два раза соответствующим буфером (А или Б) порциями по 1 мл и связанную на фильтрах радиоактивность просчитывали во флаконах в воде по Черенкову.

1. Carter А.Р., Clemons W.M., Brodersen D.E., Morgan-Warren R.J., Wimberly B.T., Ramakrishnan V. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interaction with antibiotics // Nature. 2000. V. 407. P. 340-348.

2. Yusupov M.M., Yusupova G.Zh, BaucomA., Lieberman K., Earnest T.N., Cate J.H.D., Noller H. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution // Science. 2001. V. 292. P. 883-896.

3. Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г. Структурно-функциональная топография рибосом Е. coli по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК и тРНК // Успехи биологической химии. 1991. Т. 32. С. 3-49.

4. Сергиев П.В., Лаврик И.Н., Докудовская С.С., Донцова О.А., Богданов А.А. Строение декодирующего центра рибосомы // Биохимия. 1998. Т. 63. С. 1129-1143.

5. Грайфер Д.М., Карпова Г.Г., Кнорре ДГ. Расположение матрицы на рибосоме человека по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 725-744.

6. Грайфер ДМ., Карпова Г.Г. Структурно-функциональная топография рибосом человека по данным сшивок с аналогами мРНК — производными олигорибонуклеотидов // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С. 584-596.

7. Stoffler G., Stoffler-Meilicke М. Immuno electron microscopy on E. coli ribosomes // Structure, function and genetics of ribosomes / Eds B. Hardesty, G. Kramer. New York: Springer-Verlag, 1986. P. 28-46.

8. Frank J., Zhu J., Penczek P., Li Y., Srivastava S., Verschoor A., Radermacher M., Grassucci R., Lata K.R., Agrawal R.K. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome //Nature. 1995. V. 376. P. 441-444.

9. Frank J. The ribosome — structure and functional ligand-binding experiments using cryo-electron microscopy // J. Struct. Biol. 1998. V. 124. P. 142-150.

10. Frank J. Ribosomal dynamics explored by cryo-electron microscopy // Methods. 2001. V. 25. P. 309-315.

11. Gabashvili I.S., Agrawal R.K., Spahn C.M.T., Grassucci R.A., Svergun D.I., Frank J., Penczek P. Solution structure of the E. coli 70S ribosome at 11.5 Ä resolution // Cell. 2000. V. 100. P. 537-549.

12. Clemons W.M., Jr., MayJ.L.C., Wimberly B. T., McCutcheon J.P., Capel M.S., Ramakrishnan R. Structure of bacterial 30S ribosomal subunit at 5.5 A resolution // Nature. 1999. V. 400. P. 833-840.

13. Wimberly B.T., Brodersen D.E., Clemons W.M., Jr., Morgan-Warren R.J., Carter A.P., Vonrhein C., Hartsch T., Ramakrishnan V. Structure of the 30S ribosomal subunit // Nature. 2000. V. 407. P. 327-339.

14. Schlüenzen F., Tocilj A., Zarivach R., Harms J., Gluehmann M„ Janell £>., Bashan A., Agmond I., Franceschi F., Yonath A. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution // Cell. 2000. V. 102. P. 615-623.

15. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P.B., Steitz T.A. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution // Science. 2000. V. 289. P. 905-920.

16. Harms J., Schlüenzen F., Zarivach R., Bashan A., Gat S„ Agmon I., Bartels H., Franceschi F., Yonath A. High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium // Cell. 2001. V. 107. P. 679-688.

17. CateJ.H., Yusupov M.M., Yusupova G.Zh, Earnest T.N., Noller H.F. X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes // Science. 1999. V. 285. P. 2095-2104.

18. Yusupova G.Zh., Yusupov M.M., Cate J.H.D., Noller H.F. The path of messenger RNA through the ribosome // Cell. 2001. V. 106. P. 233-241.

19. Nissen P., Ippolito J.A., Ban N., Moore P.B., Steitz T.A. RNA tertiary interactions in the large ribosomal subunit: The A-minor motif// Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001. V. 98. P. 4899-4903.

20. Ramakrishnan V. Ribosome structure and the mechanism of translation // Cell. 2002. V. 108. P. 557-572.

21. Guteil R.R. Collection of small subunit (16S- and 16S-like) ribosomal RNA structures // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 3051-3054.

22. Steitz T.A. Polypeptide chain initiation: nucleotide sequences of the three ribosomal binding sites in bacteriophage R17 RNA //Nature. 1969. V. 224. P. 957-964.

23. Hüttenhofer A., Noller H.F. Footprinting mRNA-ribosome complexes with chemical probes // EMBO J. 1994. V. 13. P. 3892-3901.

24. Beyer D., Shripkin E., Wadzack J., Nierhaus K.H. How the ribosome moves along the mRNA during protein synthesis // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 30713- 30717.

25. Shatsky I.N., Bakin A. V., Bogdanov A.A., Vasiliev V.D. How does the mRNA pass through the ribosome // Biochimie. 1991. V. 73. P. 937-945.

26. Stark H., Orlova E. V., Rinke-Appel J., Jünke N., Mueller F., Rodnina M., Wintermeyer W„ Brimacombe R., van Heel M. Arrangment of tRNAs in pre- and posttranslocational ribosomes revealed by electron cryomicroscopy // Cell. 1997. V. 88. P. 19-28.

27. Agrawal R.K., Spahn C.M.T., Penczek P., Grassucci R.A., Nierhaus K.H., Frank J. Visualization of tRNA movements on the Escherichia coli 70S ribosome during the elongation cycle // J. Cell Biol. 2000. V. 150. P. 447-459.

28. Olge J.M., Brodersen D.E., Clemons ¡V.M., Tarry M.J., Carter A.P., Ramakrishnan V. Recognition by cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit // Science. 2001. V. 292. P. 897-902.

29. Jovine L., Djordjevic S., Rhodes D. The crystal structure of yeast phenylalanine tRNA at 2.0 Ä resolution: cleavage by Mg2+ in 15-year old crystals // J. Mol. Biol. 2000. V. 301. P. 401-414.

30. Dabrowski M., Spahn C.M.T., Schäfer A., Patzke S., Nierhaus K.H. Protection patterns of tRNAs do not change during ribosomal translocation // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 3279332800.

31. Noller F.H., Yusupov M.M., Yusupova G.Z., BaucomA., Cate J.H.D. Translocation of tRNA during protein synthesis // FEBS Lett. 2002. V. 514. P. 11-16.

32. Pape T., Wintermeyer W., Rodnina M. V. Induced fit in initial selection and proofreading of aminoacyl-tRNA on the ribosome // EMBO J. 1999. V. 18. P. 3800-3807.

33. Pape 71, Wintermeyer W., Rodnina M.V. Conformational switch in the decoding region of 16S rRNA during aminoacyl-tRNA selection on the ribosome // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P.m 104-107.

34. Rodnina M.V., Wintermeyer W. Fidelity of aminoacyl-tRNA selection on the ribosome: kinetic and structural mechanisms // Annu. Rev. Biochem. 2001. V. 70. P. 415-435.

35. Olge J.M., Murphy IVF. V., Tarry M.J., Ramakrishnan V. Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form // Cell. 2002. V. 111. P. 721-732.

36. Olge J.M., Carter A.P., Ramakrishnan V. Insights into the decoding mechanism from recent ribosome structure // Trends Biochem. Sci. 2003. V. 28. P. 259-266.

37. Moazed D., Noiler H. Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal RNAfrom attack by chemical probes // Cell. 1986. V. 47. P. 985-994.

38. Moazed D., Noller H. Binding of the tRNA to the ribosomal A and P sites protects two distinct sets of nucleotides in 16S rRNA // J. Mol. Biol. 1990. V. 211. P. 135-145.

39. Yoshizawa S., Fourmy D., Puglisi J.D. Recognition of the codon-anticodon helix by ribosomal RNA // Science. 1999. V. 285. P. 1722-1725.

40. VanLoock M.S., Easterwood T.R., Harvey S.C. Major groove binding of the tRNA/mRNA• complex to the 16S ribosomal RNA decoding site // J. Mol. Biol. 1999. V. 285. P. 2069-2078.

41. Puglisi J.D., Blanchard S.C., Green R. Approaching translation at atomic resolution // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 855-861.

42. Fourmy D„ Recht M.I., Blanchard S.C., Puglisi J.D. Structure of the A site Escherichia coli 16S ribosomal RNA complexed with aminoglycoside antibiotic // Science. 1996. V. 274. P. 1367-1371.

43. Gavrilova L.P., Kostiashkina O.E., Koteliansky V.E., Rutkevich N.M., SpirinA.S. Factor-free ("non-enzymic") and factor-dependent systems of translation of polyuridylic acid by Escherichiacoli ribosomes // J. Mol. Biol. 1976. V. 101. P. 537-552.

44. SpirinAS. Ribosome as a molecular machine // FEBS Lett. 2002. V. 514. P. 2-10.

45. Stark H., Rodnina M. V., Rinke-Appel J., Brimacombe R, Wintermeyer W., van Heel M. Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome // Nature. 1997. V. 389. P. 403-406.

46. Moazed D., Robertson J.M., Noller H.F. Interaction of elongation factors EF-Tu and EF-G with a conserved loop in 23S RNA // Nature. 1988. V. 334. P. 362-364.

47. Agrawal R.K., Penczek P., Grassucci R.A., Li Y„ Leith A., Nierhaus K.H., Frank J. Direct visualization of A-, P-, and E-site transfer RNAs in the Escherichia coli ribosome // Science. 1996. V. 271. P. 1000-1002.

48. Piepenburg O., Pape T., Pleiss J.A., Wintermeyer W„ Uhlenbeck O.C., Rodnina M. V. Intact aminoacyl-tRNA is required to trigger GTP hydrolysis by elongation factor Tu on the ribosome // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 1734-1738.

49. Valle M., Sengupta J., Swami N.K., Grassucci R.A., Burkhardt N., Nierhaus K.H., Agrawal R.K., Frank J. Cryo-EM reveals an active role for aminoacyl-tRNA in the accommodation process//EMBO J. 2002. V. 21. P. 3557-3567.

50. Yarus M., Valle M., Frank J. A twisted tRNA intermediate sets the threshold for decoding // RNA. 2003. V. 9. P. 984-985.

51. Lodmell J.S., Dahlberg A.E. A conformational switch in Escherichia coli 16S ribosomal RNA during decoding of messenger RNA // Science. 1997. V. 277. P. 1262-1267.

52. Pape T., Wintermeyer W., Rodnina M. V. Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A-site of the E. coli ribosome // EMBO J. 1998. V. 17. P. 7490-7497.

53. Noller H.F., Hoffarth V., Zimniak L. Unusual resistance of peptidyl transferase to proteinmextraction procedures // Science. 1992. V. 256. P. 1416-1419.

54. Green R., Noller H.F. Ribosomes and translation // Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 679-716.

55. Nissen P., Hansen J., Ban N., Moore P.B., Steitz T.A. The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis // Science. 2000. V. 289. P. 920-930.

56. Hansen J.L., Schmeing T.M., Moore P.B., Steitz T.A. Structural insights into peptide bond formation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 11670-11675.

57. Jenni S., Ban N. The chemistry of protein synthesis and voyage through the ribosomal tunnel // Curr. Opin. Struct. Biol. 2003. V. 13. P. 212-219.

58. Green R., Switzer C., Noller H.F. Ribosome-catalyzed peptide-bond formation with an A-site substrate covalently linked to 23S ribosomal RNA // Science. 1998. V. 280. P. 286-289.

59. BayfieldM.A., DahlbergA.ESchulmeister U., Dorner S., Barta A. A conformational change in the ribosomal peptidyl transferase center upon active/inactive transition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 10096-100101.

60. PolacekN., GaynorM., YassinA., MankinA.S. Ribosomal peptidyltransferase can withstand mutations at the putative catalytic nucleotide // Nature. 2001. V. 411. P. 498-501.

61. Moazed D., Noller H.F. Interaction of tRNA with 23S rRNA in the ribosomal A, P, and E sites // Cell. 1989. V. 57. P. 585-597.

62. Moazed D., Noller H. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome // Nature. 1989. V. 342. P. 142-148.

63. Semen/cov Y.P., Shapkina T.G., Kirillov S. Puromycin reaction of the A-site bound peptidyl-tRNA // Biochimie. 1992. V. 25. P. 411-417.

64. Роднина M.B., Семенное Ю.П., Завельсберг А., Катунин В.К, Песке Ф., Вильден Б., Винтермайер В. Механизм транслокации тРНК на рибосоме // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С. 655-665.

65. Макаров Е.М., Катунин B.JI., Одинцов В.Б., Семенков Ю.П., Кириллов С.В. Как участки связывания рибосом различают функциональные формы тРНК? // Молекуляр. биология. 1984. Т. 18. С. 1342-1347.

66. Fienberg J.S., Joseph S. Identification of molecular interaction between P-site tRNA and the ribosome essential for translocation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 11120-11125.

67. Zavialov A., Ehrenberg M. Peptidyl-tRNA regulates the GTPase activity of translation factors//Cell. 2003. V. 114. P. 113-122.

68. Robertson J.M., Paulsen H., Wintermeyer W. Pre-steady-state kinetics of ribosomal traslocation // J. Mol. Biol. 1986. V. 192. P. 351-360.

69. Agrawal R.K., Heagle A.B., Penczek P., Grassucci R.A., Frank J. EF-G-dependent GTP hydrolysis induces translocation accompanied by large conformational changes in the 70S ribosome // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 643-647.

70. Frank J., Agrawal R.K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation //Nature. 2000. V. 406. P. 319-322.

71. Frank J. Electron microscopy of functional ribosome complexes // Biopolymers. 2003. V. 68. P. 223-233.

72. Valle M., Zavialov A., Sengupta J., Rawat U., Ehrenberg M„ Frank J. Locking and unlocking of ribosomal motions // Cell. 2003. V. 114. P. 123-134.

73. Spahn C.M., Nierhaus K.H. Models of the elongation cycles: an evaluation // Biol. Chem. 1998. V. 379. P. 753-772.

74. Gnirke A., Geigenmuller U., Rheinberger H.J., Nierhaus K.H. The allosteric three-site model for ribosomal elongation cycle. Analysis with a heteropolymeric mRNA // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 7291-7301.

75. VanLoock M.S., Agrawal R.K., Gabashvili I.S., Qi L„ Frank J., Harvey S.C. Movement of the decoding region of the 16S ribosomal RNA accompanies tRNA translocation // J. Mol. Biol. 2000. V. 304. P. 507-515.

76. Гудков A.T. Структура и функции фактора элонгации G прокариот // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С. 647-654.

77. Rodnina M.V., Savelsbergh A., Katunin V.I., Wintermeyer W. Hydrolysis of GTP by elongation factor G drives the tRNA movement on the ribosome // Nature. 1997. V. 385. P. 3741.

78. Rodnina M. V., Savelsbergh A., Matassova N.B., Katunin V.I., Semenkov Y.P., Wintermeyer W. Thiostrepton inhibits the turnover but not the GTPase of elongation factor G on the ribosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 9586-9590.

79. Czworkowski J., Wang J., Steitz T.A., Moore P.B. The crystal structure of elongation factor G complexed with GTP, at 2.7 A resolution // EMBO J. 1994. V. 13. P. 3661-3668.

80. Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G., Reshetnikova L., Clark B.F., Nyborg J. Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu and a GTP analog // Science. 1995. V. 270. P. 1464-1472.

81. Wilson K.S., Noller H.F. Mapping of position of translational elongation factor EF-G in the ribosome by direct hydroxyl radical probing // Cell. 1998. V. 92. P. 131-139.

82. Agrawal R.K., Penczek P., Grassucci R.A., Frank J. Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli ribosome: the mechanism of translocation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 6134-6138.

83. Stark H., Rodnina M.V., Weiden H.-J., van Heel M., Wintermeyer W. Large-scale movement of elongation factor G and extensive conformational change of the ribosome during translocation // Cell. 2000. V. 100. P. 301-309.

84. Porse B.T., Leviev I., Mankin A.S., Garrett R.A. The antibiotic thiostrepton inhibits a functional transition within protein LI 1 at the ribosomal GTPase center // J. Mol. Biol. 1998. V. 276. P. 391-404.

85. Peske F., Matassova N.B., Savelsbergh A., Rodnina M.V., Wintermeyer W. Conformationally restricted elongation factor G retains GTPase activity but is inactive in translocation on the ribosome // Mol. Cell. 2000. V. 6. P. 501-505.

86. Savelsbergh A., Mohr D., Wilden В., Wintermeyer W., Rodnina M. Stimulation of the GTPase activity of translational elongation factor by ribosomal protein L7/12 // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 890-894.

87. Schluenzen F., Zarivach R, Harms J., Bashan A., Tocilj A., Albrecht R, Yonath A., Franceschi F. Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl transferase center in eubacteria//Nature. 2001. V. 413. P. 814-821.

88. Schluenzen F., Harms J.M., Franceschi F., Hansen H.A.S., Bartels H, Zarivach R., Yonath A. Structural basis for the antibiotic activity of ketolides and azalides // Structure. 2003. V. 11. P. 329-338.

89. Hansen J.L., Moore P.В., Steitz T.A. Structures of five antibiotics bound at the peptidyl transferase center of the large ribosomal subunit // J. Mol. Biol. 2003. V. 330. P. 1061-1075.

90. Будкер В.Г., Гиршович A.C., Гринева Н.И., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г., Кобец Н.Д. Специфическая химическая модификация рибосом вблизи мРНК-связывающего центра // Докл. АН СССР. 1973. Т.211. С.725-728.

91. Кнорре Д.Г., Карпова Г.Г., Кобец Н.Д. Аффинная модификация рибосом Е. coli вблизи мРНК- и тРНК-связывающих центров // Итоги Науки и Техники. М.: ВИНИТИ,1985. Т. 4. С. 87-143.

92. Bhangu R., Wollenzien P. The mRNA binding track in the Escherichia coli ribosome for mRNA of different sequences // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 5937-5944.

93. Bhangu R., Juzumiene D., Wollenzien P. Arrangement of messenger RNA on Escherichia coli ribosomes with respect to 10 16S rRNA cross-linking sites // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 3063-3070.

94. Сергиев П.В., Донцова O.A., Богданов A.A. Изучение структуры прокариотической рибосомы биохимическими методами: судный день // Молекуляр. биология. 2001. Т. 35. С.559.583.

95. Neefs J.-M., Van de Peer К, Hendriks L., De Wacher R. Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18 (Supplement). P. 2237-2317.

96. С.В., Макаров Е.М., Махно В.И., Семенков Ю.П. Фотоаффинная модификация Е-сайта рибосом Escherichia coli II Биополимеры и клетка. 1989.Т. 5. С. 35-40.

97. Döring Т., Mitchell Р., Osswald М., Bochkariov D., Brimacombe R. The decoding region of 16S rRNA; a cross-linking study of the ribosomal A, P and E sites using tRNA derivatized at position 32 in the anticodon loop // EMBO J. 1994. V. 13. P. 2677-2685.

98. Rinke-Appel J., Junke N., Osswald M., Brimacombe R. The ribosomal environment of tRNA: crosslinks to rRNA from positions 8 and 20 in the central fold of tRNA located at the A,m P, or E sites // RNA. 1995. V. 1. P. 1018-1028.

99. Rosen K.V., Alexander R.V., Wower J., Zimmermann R.A. Mapping the central fold of tRNA2(fMet) in the P site of the Escherichia coli ribosome // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 12802-12811.

100. Rosen К. V., Zimmermann R.A. Photoaffini ty labeling of 3 OS subunit proteins S7 and Sil by 4-thiouridine-substituted tRNA(Phe) situated at the P site of Escherichia coli ribosomes // RNA. 1997. V. 3. P. 1028-1036.

101. Abdurashidova G.G., Tsvetkova E.A., Budowsky E.I. Determination of tRNA nucleotide residues directly interacting with proteins in the post- and pretranslocated ribosomal complexes // FEBS Lett. 1990. V. 269. P. 398-401.

102. Osswald M., Doring T., Brimacombe R. The ribosomal neighbourhood of the central fold of tRNA: cross-links from position 47 of tRNA located at the A, P, or E sites // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4635-4641.

103. WowerJ., Malloy T.A., Hixson S.S., Zimmermann R.A. Probing tRNA binding sites on the £ Escherichia coli 30S ribosomal subunit with photoreactive analogs of the anticodon arm //

104. Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1050. P. 38-44.

105. Verschoor A., Srivastava S., Grassucci R., Frank J. Native 3D structure of the eukaryotic 80S ribosome: morphological homology with the E. coli 70S ribosome // J. Cell Biol. 1996. V. 133. P. 495-505.

106. Verschoor A., Warner J.R., Srivastava S., Grassucci R.A., Frank J. Three-dimensional structure of the yeast ribosome // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 655-661.

107. Dube P., Weiske M., Stark H., Schatz M., Stahl J., Zemlin F., Lutsch G., van Heel M. The 80S rat liver ribosome at 25 A resolution by electron cryomicroscopy and angular reconstitution // Stucture. 1998. V. 6. P. 389-399.

108. Spahn C.M., Beckmann R., EswarN., Penczek P.A., SaliA., Blobel G„ Frank J. Structure of the 80S ribosome from Saccharomyces cerevisiae tRNA-robosome and subunit-subunit interactions // Cell. 2001. V. 107. P. 373-386.

109. Spahn C.M., Kieft J.S., Grassucci R.A., Penczek P., Zhou K„ Doudna J.A., Frank J. Hepatitis C virus IRES RNA-induced changes in the conformation of the 40S ribosomal subunit I I Science. 2001. V. 291. P. 1959-1962.

110. Doudna J. A., Rath V.L. Structure and function of the eukaryotic ribosome: the next frontier //Cell. 2002. V. 109. P. 153-156.

111. Uchiumi T., Nomura H.K., Hachimori A. Replacement of L7/L12.L10 protein complex in Escherichia coli ribosomes with the eukaryotic counterpart changes the specificity of elongation factor binding // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 27578-27582.

112. Hingerty B., Brown R.S., Jack A. Further refinement of the structure of yeast tRNAphe // J. Mol. Biol. 1978. V. 124. P. 523-534.

113. Beckmann R., Spahn C.M.T., Eswar N., Helmers J., Penczek P.A., SaliA., Frank J., Blobel G. Architecture of the protein-conducting channel associated with the translating 80S ribosome // Cell. 2001. V. 107. P. 361-372.

114. Morgan D.G., Menetret J.-F., Neuhof A., Rapoport T.A., Akey Ch.W. Structure of the mammalian ribosome channel complex at 17 A resolution // J. Mol. Biol. 2002. V. 324. P. 871886.

115. Mueller F., Brimacombe R. A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. I. Fitting the RNA to a 3D electron microscopic map at 20 A // J. Mol. Biol. 1997. V. 271. P. 524-544.

116. Graifer D.M., Juzumiene D.I., Karpova G.G., Wollenzien P. mRNA binding track in the human 80S ribosome for mRNA analogues randomly substituted with 4-thiouridine residues // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 6201-6206.

117. Matassova N.B., Venjaminova A.G., Karpova G.G. Nucleotides of 18S rRNA surrounding mRNA at the decoding site of translating human ribosome as revealed from the cross-linking data // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1397. P. 231-239.

118. Bulygin K.N., Graifer D.M., Repkova M.N., Smolenskaya I.A., Veniyaminova A.G., Karpova G.G. Nucleotide G-1207 of 18S rRNA is an essential component of the human 80S ribosomal decoding center//RNA. 1997. V. 3. P. 1480-1485.

119. Mundus D., Wollenzien P. Neighbourhood of 16S rRNA nucleotides U788/U789 in the 30S ribosomal subunit determined by site-directed crosslinking // RNA. 1998. V. 4. P. 1373-1385.

120. Stahl J., Kobets N.D. Affinity labeling of rat liver ribosomal protein S26 by heptauridylate containing a 5'-terminal alkylating group //Molec. Biol. Rep. 1984. V.9. P.219-222.

121. Rodnina M. V., El'skaya A. К, Semenkov Yu.P., Kirillov S. V. Interaction of tRNA with the A and P sites of rabbit-liver ribosomes and their 40S subunits // Eur. J. Biochem. 1989. V. 185. P.563.568.

122. Graifer D.M., Nekhai S.Yu., Mundus D.A., Fedorova O.S., Karpova G.G. Interaction of human and Escherichia coli tRNA with human 80S ribosomes in the presence of oligo- and polyuridylate template // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1171. P. 56-64.

123. Maden B.E.H., Dent C.L., Farrel Т.Е., Garde J., McCallum F.S., Wakeman J.A. Clones of human ribosomal DNA containing the complete 18S-rRNA and 28S-rRNA genes // Biochem. J. 1987. V. 246. P. 519-522.

124. Малыгин A.A., Шауло Д.Д., Карпова Г.П Диссоциация белков из 40S белков рибосомчеловека в градиенте концентрации хлористого лития // Молекуляр. биология. 2000. Т. 34. С. 887-893.

125. Грайфер Д.М., Зенкова М.А., Карпова Г.Г., Малыгин А.А., Матасова Н.Б. Особенности неэнзиматического связывания олигорибонуклеотидов аналогов мРНК и РЬе-тРНКРЬе с 80S рибосомами из плаценты человека // Молекуляр. биология. 1990. Т. 24. С. 1076-1082.

126. Tranque Р., Ни M.C.-Y., Edelman G.M., Mauro V.P. rRNA complementarity within mRNAs: a possible basis for mRNA-ribosome interactions and translational control // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. V. 95. P. 12238-12243.

127. Cunningham P.R., Nurse K., Weitzmann C.J., Negre D., Ofengand J. G1401: a keystone nucleotide at the decoding site of Escherichia coli 30S ribosomes // Biochemistry. 1992. V. 31.1. P. 7629-7637.

128. Lynch S.R., Puglisi J.D. Structure of a eukaryotic decoding region A-site RNA // J. Mol. Biol. 2001. V. 306. P. 1023-1035.

129. Lynch S.R., Puglisi J.D. Structural origins of aminoglycoside specificity for prokaryotic ribosomes//J. Mol. Biol. 2001. V. 306. P. 1037-1058.

130. Semenkov Yu.P., Kirillov S. V., Stahl J. 40S subunits from rat liver do contain two codon-dependent sites for transfer RNA // FEBS Lett. 1985. V. 193. P. 105-108.

131. Levina A.S., Tabatadze D.R., Khalimskaya L.M., Prihodko N.A., Shishkin G.V., Alexandrova L.A., Zarytova V.F. Oligonucleotide derivatives bearing reactive and stabilizing groups attached to C5 of deoxyuridine // Bioconjugate Chem. 1993. V.4. P.319-325.

132. Wollenzien P. Isolation and identification of RNA cross-links // Methods Enzymol. 1988. V. 164. P. 319-329.

133. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 277. P. 680-685.

134. Madjar J.-J., Arpin M., Buisson M., Reboud J.-P. Spot position of rat liver ribosomal proteins by four different two-dimentional electrophoresis in polyacrylamide gel // Mol. Gen. Genet. 1979. V.171. P.121-134.1. БЛАГОДАРНОСТИ

135. Автор признателен Алие Гусейновне Веньяминовой, Марине Николаевне Репковой, Марие Мещаниновой, Тамаре Михайловне Ивановой за предоставление материалов, необходимых для выполнения настоящей работы.

136. Автор благодарит всех сотрудников Лаборатории Структуры и Функции Рибосом, чьи постоянные помощь, поддержку и заботу автор испытывает на протяжении всего времени работы в этом коллективе.

137. Автор признателен рецензенту Марине Аркадьевне Зенковой за внимательное прочтение работы и ценные советы по оформлению полученных результатов.

138. Огромную благодарность автор выражает своему научному руководителю Галине Георгиевне Карповой за неоценимую помощь в • критическом осмыслении полученных результатов, за великое терпение и большой труд, вложенные в написание данной работы.