Структурные элементы белков rpS15e и eRF1, соседствующие с мРНК в декодирующем центре рибосомы человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

? На правах рукописи

ХАЙРУЛИНА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА

СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ БЕЛКОВ гр815е И еКР1, СОСЕДСТВУЮЩИЕ С мРНК В ДЕКОДИРУЮЩЕМ ЦЕНТРЕ РИБОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

- 3 НОЯ 2011

Новосибирск - 2011

4858725

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель: д.х.н., профессор Карпова Галина Георгиевна

Официальные оппоненты: д.х.н. Сергиев Петр Владимирович

д.б.н., доцент Бунева Валентина Николаевна

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардга РАН

Защита состоится < » С^^^лЛ- 2011 г. в ''часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01

при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru Автореферат разослан « ¿¿Г » ¿^/¿.£^¿^¿-2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент ^ Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синтез белков на рибосоме является одним из ключевых процессов жизнедеятельности каждой клетки. Рибосомы прокариот на сегодняшний день детально изучены с применением различных методов, но наиболее впечатляющие успехи были достигнуты на рубеже веков благодаря достижениям рентгеноструктурного анализа (РСА), которые позволили расшифровать структуру рибосом прокариот на уровне отдельных атомов. Однако метод РСА до сих пор не применен для изучения комплексов рибосом высших эукариот с мРНК и тРНК, поскольку их кристаллы, пригодные для такого анализа, еще не получены. Несмотря на значительные успехи в изучении строения рибосом эукариот с помощью метода крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ), этот метод пока не удалось в полной мере применить для изучения структурно-функциональной организации рибосом высших эукариот. Наконец, для исследования рибосом эукариот неприменимы методы, основанные на реконструкции рибосомных субчастиц из белков и рРНК, поскольку пока не найдено подходов для сборки активных рибосомных субчастиц эукариот in vitro. Одним из наиболее информативных методов для изучения структурно-функциональной топографии трансляционных комплексов рибосом эукариот и, в частности человека, оказался метод аффинного химического сшивания (аффинной модификации). Этот метод основан на использовании аналогов компонентов аппарата трансляции, несущих химически активную группу в заданном положении. С использованием аналогов мРНК - производных олигорибонуклеотидов в ЛСФР ИХБФМ СО РАН изучен на уровне белков и нуклеотидов рРНК мРНК-связывающий центр рибосомы человека. Полученные результаты показали, что у высших эукариот белки вносят больший вклад в организацию мРНК-связывающего центра рибосомы, чем у эубактерий, и позволили выявить значительные различия в белковом окружении мРНК на рибосомах млекопитающих и эубактерий. В частности, в декодирующем центре рибосомы человека был обнаружен рибосомный белок S15 (rpS15e) (Graifer et al., 2004), чей прокариотический гомолог rpS19p, по данным РСА, удален от этого центра в 30S субчастице. Однако к моменту начала настоящей работы оставалось неизвестным, какие фрагменты rpS15e вовлечены в формирование декодирующего центра рибосомы человека. Метод аффинной модификации является также наиболее подходящим методом для изучения молекулярных основ декодирования стоп-сигнала на рибосомах высших эукариот, осуществляемого с помощью фактора терминации трансляции eRFl (от англ. eukaryotic release factor class 1). К настоящему времени накоплены данные об аминокислотных остатках eRFl, замена которых приводит к нарушению узнавания стоп-кодона (Bertram et al., 2000, Hatin et al., 2010). С помощью метода аффинной модификации удалось определить фрагмент фактора, контактирующий с первым уридином стоп-кодона в терминационном комплексе (Chavatte et al., 2002). Данных о фрагментах eRFl, формирующих участок узнавания пуринов стоп-сигнала, к моменту начала настоящей работы не было.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось установление фрагментов rpS15e и eRFl, соседствующих с мРНК в декодирующем центре рибосомы человека, с помощью аффинной модификации данных белков аналогами мРНК - производными олигорибокуклеотидов, несущими фотоактивируемую группу в заданном положении, в составе различных модельных комплексов рибосом с этими аналогами. Невысокий выход продуктов сшивки при аффинной модификации белков в составе таких комплексов затрудняет идентификацию модифицированных олигопептидов с помощью масс-спектрометрии. Этих трудностей можно избежать при использовании методологии, основанной на селективном расщеплении белка, сшитого с меченым аналогом мРНК, специфическими протеолитическими агентами.

В ходе работы планировалось решить следующие задачи:

• определить фрагменты rpS15e, сшивающиеся с аналогами мРНК, несущими перфторфенилазидобензоильную группу на остатке уридина или гуанозина, в модельных комплексах 80S рибосом, различающихся по типу кодона в A-участке и положению модифицированного нуклеотида относительно кодона в Р-участке, а также по наличию фактора терминации трансляции eRFl;

• с использованием аналогов мРНК, несущих перфторфенилазидобензоильную группу на остатках уридина, гуанозина или аденозина в разных положениях стоп-сигнала, либо на 3'-концевом фосфате, определить аминокислотные остатки eRFl, сшивающиеся с модифицированными нуклеотидами этих аналогов в терминационных комплексах 80 S рибосом.

Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе представлены новые данные о структурно-функциональной организации комплексов 80S рибосом с различными лигандами, полученные с помощью метода аффинной модификации. В ней использован уникальный набор аналогов мРНК - производных олигорибонуклеотидов, несущих перфторфенилазидогруппу на нуклеотиде в заданном положении. Продемонстрирована результативность метода аффинной модификации в сочетании с методологией, основанной на специфическом расщеплении модифицированных белков, для определения олигопептидов, сшивающихся с аналогами мРНК в составе специфических комплексов 80S рибосом. В рамках настоящего исследования, получены данные о тонкой структуре декодирующего центра рибосомы человека на уровне декапептида 131-PGIGATHSSR-140 rpS15e, соседствующего с кодоном мРНК в A-участке рибосомы, и о фрагментах eRFl, сближенных со стоп-кодоном и нуклеотидом, прилегающим к нему с 3'-сгороны. Полученные результаты имеют принципиальное значение для понимания молекулярных основ функционирования трансляционных комплексов 80S рибосом и дают новое представление о механизмах распознавания остатков гуанина и аденина в терминирующих тегграплетах, объясняющее способность eRFl распознавать все три стоп-кодона.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы. Результаты работы были представлены на следующих международных и

российских конференциях: IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 33rd FEBS Congress & 1 Ith ШВМВ Conference «Biochemistry of Cell Regulation» (Athens, Creece, 2008), ARCUS Workshop "Development of new tools for fundamental research in health and disease" (Страсбург, 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и Пептиды» (Казань, 2009), First Symposium Supramolecular Chemistry for Materials and Life Science (Novosibirsk, 2010), V Российском симпозиуме «Белки и Пептиды» (Петрозаводск, 2011), международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 85-летию академика Д.Г. Кнорре (Новосибирск, 2011).

Личный вклад автора. В диссертационную работу включены материалы исследований, выполненных автором лично.

Структура работы. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы и содержит 5 таблицы и 36 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящей работе определены фрагменты rpSl5е и eRFl, соседствующие с кодоном мРНК в A-участке рибосомы человека. Для этого использована методология, основанная на селективном расщеплении белков, модифицированных мечеными аналогами мРНК - производными олигорибонуклеотидов в составе различных модельных комплексов 80S рибосом, с последующим анализом образующихся олигопептидов гель-электрофорезом в присутствии SDS в Трис-трициновой системе.

1. Аналоги мРНК, использованные для аффинной модификации rpS15e и фактора eRFl в составе специфических комплексов рибосом

Все использованные в настоящей работе аналоги мРНК содержали фенилаланиновый кодон UUU/UUC, за которым следовал смысловой или стоп-кодон, и перефторфенилазидогруппу (АТВ), которая была присоединена через различные линкерные группировки к остатку уридина, гуанозина или аденозина, либо к З'-концевому фосфату (см. рис. 1 и табл. 1). Для введения АТВ-группы в различные положения олигорибонуклеотидов использована методология, основанная на том, что вначале к выбранному нуклеотиду присоединяют линкер с алифатической аминогруппой, по которой затем селективно вводят АТВ-группу путем бензоилирования N-гидроксисукцинимидным эфиром п-азидотетрафторбензойной кислоты. Для присоединения линкера по остатку гуанозина, олигонуклеотид с единственным остатком G обрабатывали 4-(N-2-хлорэтил-Ы-метиламино)бензиламином (CIRCH2NH2), при этом происходило присоединение остатка -RCH2NH2 селективно по атому N7 остатка G.

Производные олигорибонуклеотидов, несущие группу -NHCH2CH2NH2 на остатке уридина или аденозина, а также производные с линкерной группой -О-CH2CHOHCH2NH2 на З'-концевом фосфате были синтезированы и охарактеризованы в Лаборатории химии РНК (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). В экспериментах по сшивкам использовали аналоги мРНК, несущие метку 32Р на 5'-конце.

3

rb

v- „V a-= | jC

i " I

rib lib

Рис. 1. Структурные формулы модифицированных остатков в составе использованных фотоактивируемых аналогов мРНК. Длина линкерной группировки, отделяющей азидогруппу от гетероциклического основания, у аналогов с модифицированным U или А составляет llA, а с модифицированным G - 14А. Длина линкерной группировки, отделяющей азидогруппу от фосфата, у аналогов с модифицированным З'-концевым фосфатом составляет 12А.

Таблица 1. Аналоги мРНК, использованные в настоящей работе. Звездочкой отмечены модифицированные нуклеозиды и 3'- концевой фосфат, структура которых приведена на рис.1, стоп-кодоны подчеркнуты. Обозначение аналога мРНК отражает его длину (цифра справа), положение модифицированного нуклеотида (цифра слева) и место присоединения фотоактивируемой группы в нем (остаток гетероциклического основания или З'-концевой фосфат).

9 он

Р* = rlb-O-P-O-CHj-CH-R ОН

Аналоги мРНК Нуклеотидная последовательность

аналога мРНК

+4U6 UUC U*AA

+5U6 UUU GU*U

+6U6 UUC ACU*

+7U7 UUU AAC U*

+9U9 UUU AAC UCU*

+12U12 UW AAC UCU CCU*

+4U7 UUC U*AAA

+5G9 UUC UG*A AAA

+6G9 UUC UAG* AAA

+7G9 UUC UAA G*AA

+5А9 UUC UA*A AAA

+6А9 UUC UAA* AAA

+7А9 UUC UAA A*AA

+6Р6 UUC UAAd*

+7Р7 UUC UAA Ap*

1.1. Модельные комплексы 80S рибосом с тРПКр>" и аналогами мРНК, в которых проводили аффинную модификацию rpS15e и eRFl

Типы комплексов, в которых проводили аффинную модификацию rpS15e и фактора eRFl, представлены на рис. 2 на примере аналогов +4U6 и +5G9. Для получения таких комплексов вначале аналоги мРНК фазировали на рибосоме с помощью тРНК№е, которая направляла фенилапниновый кодон UUU/UUC в Р-участок рибосомы с образованием комплекса типа I. В таком комплексе нуклеотид со сшивающей группой оказывался в положении от +4 до +7 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке, т.е. в A-участке (в

декодирующем центре) или с З'-стороны от кодона в этом участке. Комплексы типа II получали путем связывания комплексов типа I, образованных с участием аналогов мРНК, несущих стоп-кодон, с eRFl, который содержал His-хвост (LEHHHHHH), присоединенный к С-концу белка. Рекомбинантный eRFl человека и его мутантные формы были получены в Лаборатории структурно-функциональной геномики (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН). В контрольных опытах использовали аналоги мРНК, содержащие модифицированные остатки в составе смысловых кодонов (UUCUG*CAAA, UUCUCG*AAA, UUCUCAG*AA, UUCUA*CAAA, UUCUCA*AAA, UUCUCAp*). Степень связывания аналогов мРНК с 80S рибосомами в присутствии тРНК№е составляла приблизительно 0.7±0.1 моль аналога на моль 80S рибосом, а в отсутствие тРНК была на порядок ниже, что свидетельствует о специфичности связывания используемых аналогов мРНК с 80S рибосомами.

Рис. 2. Схематическое изображение модельных

комплексов 80S рибосом с аналогами мРНК. А, Р и Е — тРНК-связывающие участки. Указаны положения модифицированных нуклеотидов относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке.

Для аффинной модификации rpS15e и eRFl аналогами мРНК соответствующие комплексы облучали мягким УФ-светом с длиной волны >290 нм в условиях, когда происходит специфическая сшивка перфторфенилазидо-содержащих аналогов мРНК с рРНК и рибосомными белками, т.е. сшивка, зависящая от присутствия перфторфенилазидогрупп в аналогах мРНК (для обзора см., например, Грайфер и др., 2001).

1.2. Выделение белков rpS15e и eRFl, сшитых с мечеными аналогами мРНК, из облученных комплексов рибосом

В случае аналогов мРНК со стоп-кодоном модифицированные белки -rpS15e и фактор терминации eRFl выделяли непосредственно из облученных 80S комплексов рибосом типа II, очищенных от несвязавшихся компонентов (eRFl, аналога мРНК и тРНКРЬе) центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (15-30%). Для выделения модифицированного rpS15e из облученных комплексов типа I вначале их разделяли на субчастицы с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (10-30%) в условиях диссоциации рибосом. Модифицированные 80S рибосомы или 40S субчастицы осаждали, разрушали и рибосомные компоненты разделяли ID гель-электорофорезом в присутствии SDS. Полосы, соответствующие модифицированным rpS15e и eRFl, вырезали из высушенных радиоавтографированных гелей (положение данных полос на

электрофореграммах известно из работ (Bulygin et al., 2002, Graifer et al., 2004; Molotkov et al., 2006) и использовали в дальнейших экспериментах.

1.3. Определение участков rpSISe, сшивающихся с аналогами мРНК

Модифицированный rpS15e, выделенный из облученных 80S рибосом или 40S субчастиц, в параллельных экспериментах гидролизовапи гидроксиламином (расщепляет пептидную связь Asp-Gly), бромцианом (расщепляет связи после остатков метионина) и эндопротеиназой Glu-C (расщепляет связи после остатков глутамата) с последующим разделением образующихся продуктов гель-электрофорезом. Полипептидная цепь rpS15e имеет единственный сайт для гидролиза гидроксиламином (после Asp98), расщепление по которому приводит к образованию двух фрагментов (1-98 и 99-145), чьи молекулярные массы отличаются более, чем в два раза, 7 сайтов для расщепления бромцианом и 14 сайтов для GluC. Результаты анализа модифицированных олигопептидов, образующихся при расщеплении rpS15e, сшитого с мечеными аналогами мРНК, гидроксиламином, GluC и бромцианом, представлены на рис. 3 (панели А-В). При расщеплении гидроксиламином во всех случаях наблюдали образование олигопептида, чья молекулярная масса (после вычета массы сшитого с ним аналога мРНК) составляла приблизительно 5.3 кДа, что соответствует фрагменту 98-145 rpS15e (рис. 3, панели А и Г). Расщепление бромцианом позволило сузить участок сшивки до фрагмента 111-145 (рис. ЗВ), a Glu-C —до фрагмента 119-145

(рис. ЗВ, Г).

Рис. 3. Электрофоретическое разделение продуктов, образующихся при расщеплении модифицированного rpS15e,

гидроксиламином (A), GluC (Б) и CNBr (В) (радиоавтографы). Слева на панели указаны положения маркеров молекулярной массы белков. (Г) Схемы расщепления rpS15e гидроксиламином, GluC и CNBr, сверху указаны молекулярные массы образующихся фрагментов, рассчитанные с помощью программы Peptide cutter (www.exspasv.org). На схемах отмечен модифицированный фрагмент rpS15e.

Для более точной локализации участка сшивки внутри фрагмента 119-145 модифицированный rpS15e расщепляли эндопротеазой ArgC, которая гидролизует пептидную связь после остатков аргинина. На рис. 4 в качестве примера приведены результаты расщепления rpS15e, модифицированного аналогами мРНК +4U6 и +6G9 ArgC. Видно, что при расщеплении ArgC образуется фрагмент, электрофоретическая подвижность которого существенно выше, чем подвижность фрагмента 119-145. Это позволяет исключить из дальнейшего рассмотрения фрагмент 119-130, поскольку в случае модификации внутри этого фрагмента расщепление ArgC приводило бы к образованию

А Б

NH,OH GluC

В

CNBr

Ifllif ЩИ HI ffjfjff

U.í-6.5

-17

м.г

.13

Я 45

GluC 3.3

w

смв» з.з

6SW4 ; _4Д 1.S

XkIÍ

ш

icemne

Я 45

-Us

фрагмента 82-130 с электорофоретической подвижностью намного меньшей, чем подвижность фрагмента 119-145. Таким образом, модифицированным мог быть декапептид 131-140, пентапептид 141-145 или пентадекапептид 131-145, образование которого возможно в случае сшивки по Argl40, если она препятствует гидролизу ArgC пептидной связи после этого остатка. Для того, чтобы выбрать между этими пептидами, радиоактивную полосу, соответствующую модифицированному олигопептиду, полученному при расщеплении сшитого rpS15e с помощью ArgC, вырезали из высушенной электрофореграммы и обрабатывали пепсином. Видно, что обработка пепсином не приводит к изменению электрофоретической подвижности олигопептида, что однозначно указывает на то, что во всех случаях участок сшивки находится во фрагменте 131-140, не'содержащем сайта для расщепления пепсином (dhc. 4Б).

Рис. 4. Определение участка сшивки аналогов мРНК в районе 119-145 rpS15e. Электрофоретическое разделение

модифицированных продуктов,

образующихся при расщеплении rpSl5e, сшитого с мечеными аналогами мРНК +4U6 или +5G9, протеазами GluC и ArgC (дорожки GluC и ArgC); при расщеплении пепсином меченого продукта, образующегося в результате обработки модифицированного rpS15e ArgC (дорожки ArgC+pepsin), и при гидролизе модифицированного rpS 15е пепсином (контроль для проверки активности фермента) (дорожка pepsin). Под радиоавтографами приведены карты расщепления rpS15e соответствующими протеолитическими агентами.

Таким образом, можно заключить, что все нуклеотиды кодона мРНК в А-участке 80S рибосомы соседствуют с декапептидом 131-PGIGATHSSR-140 rpS15e, независимо оттого, какого типа ко дон (смысловой или стоп) находятся в A-участке, и присутствия eRFl в случае стоп-кодона.

1.3. Определение участков eRFl, сшивающихся с аналогами мРНК

Сначала модифицированный eRFl расщепляли с помощью CNBr по остаткам метионина. Фактор терминации eRFl человека содержит восемь остатков метионина, поэтому в результате CNBr-индуцированного гидролиза должны образовываться 9 фрагментов, если не один из восьми остатков метионина не подвергается модификации, которая может препятствовать расщеплению по соответствующему сайту (см., например, Megli et al., 1985). Из данных, представленных на рис. 5, видно, что во всех дорожках, за исключением +4U7, присутствуют две радиоактивные полосы (обозначенные как "а" и "Ь"). Верхняя полоса "а" соответствует фрагменту, масса которого после вычета

GluC

А19СС

Т

area. m д

31

=f№ I И.....F

667174 88 106110118

10W8 JÓ i)"*

PapsN-j ■ v ■ I -yr

14 21 32 4Sés

lOó

lillül1!

массы сшитого аналога мРНК (3.2 кДа), составляет около 16 кДа. Очевидно, что эта полоса относится к фрагменту 52-195 eRFl (рис. 5Б).

Рис. 5. Электрофоретическое разделение модифицированных олигопептидов, образующихся при расщеплении бромцианом eRFl, | сшитого с мечеными аналогами мРНК (Л) Радиоавтографы гелей, обозначения дорожек

соответствуют обозначениям аналогов мРНК (табл. 1). Слева от панелей указаны положения маркеров молекулярной массы белков. (Б) Схема расщепления eRFl с помощью CNBr; сверху указаны молекулярные массы образующихся фрагментов,

рассчитанные с помощью программы Peptide cutter (www.expasy.org).

1.4. Идентификация участков сшивки во фрагменте eRFl, соответствующем полосе "а", для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой на остаткеуридина или гуанозина

Для установления участка сшивки аналогов мРНК внутри фрагмента 52-195 использовали мутантные формы eRFl, которые содержали точечные замены функционально несущественных аминокислот на метионин для создания в этом фрагменте дополнительных мест для расщепления полипептидной цепи с помощью CNBr. В случае аналога +4U7 использовали мутанты с заменой в области 60-73 eRFl, поскольку наиболее вероятный участок сшивки этого аналога мРНК с eRFl находится в районе мотива 61-NIKS-64 eRFl человека (Chavarte et al., 2002). При расщеплении бромцианом мутантов S60M и S64M, сшитых с меченым аналогом +4U7, наблюдали образование модифицированного олигопептида с электрофоретической подвижностью несколько большей, чем подвижность фрагмента 52-195, образующегося при гидролизе модифицированного eRFl дикого типа (wt-eRFl) (рис. 6, сравнить дорожки wt-eRFl, S60M и S64M). Полученные данные указывают на то, что участок сшивки во фрагменте 51-195 eRFl находится с С-концевой стороны от положения, в которое введен дополнительный остаток метионина. С другой стороны, расщепление модифицированного мутанта G73M приводило к образованию короткого фрагмента с молекулярной массой около 5 кДа, который может соответствовать только фрагменту 52-73. Таким образом, можно заключить, что участок сшивки располагается во фрагменте 64-73, при этом наиболее вероятной мишенью для модификации является остаток V66, поскольку модифицированный мутант V66M eRFl был устойчив к действию CNBr (рис. 6, дорожка V66M).

Для определения участков сшивки во фрагменте 74-195 использовали набор двойных мутантов eRFl, в которых был заменен остаток метионина в положении

Б

34 51

tí*

«Да «Да

26.6~> ■V ■ :

- »'. :

17.0-. *" а 17.0— 4- а

14.2- 14.2—

6.5 -. —, b бе- Штл, »-Ь

3.5 зе-»

15.8 кДа 5.1 кДа5.6 «Да

195 241 —ГГ 314329 372 422

51 и введен новый сайт для СЫВг-индуцированного гидролиза в районе УхСхххР-мотива. Из данных, представленных на рис. 7, видно, что при расщеплении этих мутантов, сшитых с меченым аналогом +509, продукт, соответствующий полосе "а", исчезает, но появляется новый продукт (рис. 7А полоса "(1"), подвижность которого уменьшается в ряду Ы24М+М51А, Ы26М+М51А, К130М+М51А, что указывает на расположение участка сшивки во фрагменте 36-124 (рис. 7, сравнить панели А и Б). Учитывая данные, полученные для мутантов с заменами в районе 60-73 (рис. 6), можно заключить, что участок сшивки находится во фрагменте 74-124.

Рис. 6. Картирование участков сшивки аналогов мРНК в районе 60-73 eR.Fl. (А) Электрофоретическое разделение

продуктов расщепления

модифицированных мутантов (указанных над соответствующими дорожками) бромцианом. Полосы "а" и "Ь" указаны по аналоги с рис. 5. Положения маркеров молекулярной массы белков приведены слева от панелей. Полосы выше полосы "а", соответствуют продуктам неполного гидролиза. (Б) Схематическое

представление сайтов расщепления во фрагменте 52-195, соответствующего полосе "а".

*лит

(и*АА)

+569

+6в9 +7С9

(илот (ЦДАС)

14.2—

« Мнй *»}.Ъ

-«-5.0 «Да

В случае аналога +609, СЫВг-индуцированный гидролиз модифицированных мутантов еКР 1 также приводил к исчезновению полосы "а", но при этом образования полосы, соответствующей продукту полного гидролиза, не наблюдали. Это могло быть связано с тем, что радиоактивная полоса, соответствующая продукту полного расщепления, совпадает с интенсивной полосой, соответствующей фрагменту "Ь". С другой стороны, для всех модифицированных мутантов (за исключением Н132М+М51А) в верхней части геля наблюдали полосы "с", которые, очевидно, соответствуют продуктам неполного гидролиза модифицированных мутантных форм eR.F1. Такие фрагменты могли образовываться, если не происходило расщепления, например, по остаткам М195 и М241 (рис. 7А). Таким образом, участок сшивки мутантов еИЛ с аналогом +609 находится с С-концевой стороны от положения 124, 126 или 130, в которое введен дополнительный остаток метионина, то есть во фрагменте 131-195. Поскольку мутант Н132М+М51А устойчив к действию бромциана, можно предположить, что именно остаток МеШ2 подвергается модификации. Однако в \vt-eRFl сшивка, возможно, происходит с РЬе131, поскольку остаток гистидина (в положении 132) неспособен образовывать ковалентные сшивки с перфтофенилазидами (Т.С. Годовикова, неопубликованные данные).

Рис. 7. Картирование участков сшивки аналогов мРНК в районах 74-195 и 74-124 eRFl с использованием набора мутантов eRFl (указаны над соответствующими дорожками). (А) и (Б) - электрофоретическое разделение продуктов гидролиза CNBr wt-eRFl и мутантов L124M+M51A, L126M+M51A, К130+М51А и

Н132М+М51А, сшитых с аналогами +5G9, +6G9 и +7G9 (А) и мутантов К109М+М51А и И20М+М51А, сшитых с аналогом +5G9 (Б). Полосы "а" и "Ь" отмечены по аналогии с рис. 5; природа полосы, расположенной между полосами "а" и "d", не установлена; полосы "с" на панели (А) отнесены к продуктам неполного гидролиза

модифицированных мутантов. Ожидаемые молекулярные массы продуктов гидролиза модифицированных мутантов К109М+М51А и П20М+М51А и положения соответствующих им полос указаны справа от панели (Б). Положения маркеров молекулярной массы белков указаны слева от панелей. (В) и (Г) Карты расщепления фрагментов 35-195 (В) и 52-241 (Г) мутантов eRFl с указанием рассчитанных молекулярных масс образующихся пептидных фрагментов.

Результаты, полученные для аналога мРНК +7G9 (рис. 7А), указывают на существование двух участков сшивки во фрагменте 52-195 eRFl. Одним из участков, соответствующих полосе "с", вероятно, является Phel 31 (по аналогии с аналогом мРНК +6G9; см. выше), а о наличии второго участка сшивки свидетельствует присутствие полосы "d" в дорожках с мутантами L126M+M51A и К130М+М51А, которой не было в случае аналога +6G9 (рис. 7А). Следует отметить, что в случае мутанта L124M+M51A полосы "d" не наблюдали, что может быть связано либо с отсутствием участка сшивки внутри фрагмента 1-124 eRFl, либо с модификацией Metl24, которая делала этот остаток устойчивым к действию CNBr. При отсутствии участка сшивки внутри фрагмента 1-124 появление радиоактивной полосы "d" в дорожке с мутантом L126M+M51A может указывать на то, что модификация происходила по Туг125. Сшивка с аминокислотным остатком в положении 126 представляется маловероятной, поскольку в этом случае модифицированный мутант L126M+M51A eRFl был бы устойчив к CNBr-индуцированному гидролизу. С другой стороны, фрагмент 1-126 мог соответствовать модификации по положению 124, в котором у wt-eRFl находится остаток Leu и по которому не происходило бы расщепления в случае мутанта L12.4M+M51 А, но при этом нельзя было бы исключить сшивку с Туг125. Таким образом, учитывая все вышесказанное, можно предположить, что вторым участком сшивки для аналога мРНК +7G9 является Leul24 и/или Туг125.

Для более точной локализации участка сшивки аналога +5G9 во фрагменте 74-124 были использованы мутанты M195L+K109M и M195L+I120M eRFl (рис. 7Б). Сравнение данных электрофоретического анализа с картой

а б

+sg9 +609 +7g9 4-sg9

(IKS'A) (UAC-) (UAAO*) (UO"A)

расщепления eR.Fl показало, что участок сшивки расположен во фрагменте 121241, который перекрывается с фрагментом 74-124 (см. выше) трипептидом в положениях 121-124 еЯР1. Таким образом, участок сшивки аналога +509 находится во фрагм енте 121 -124 еЯР 1.

I 1.5. Идентификация участков сшивки еЯП во фрагменте, соответствующем полосе "а", для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой на остатке аденозина или 3 '-концевом фосфате

Для определения участка сшивки аналогов мРНК с модифицирующей группой на остатке аденозина использовали те же наборы мутантов с двойными заменами, что и в случае аналогов с модифицированными остатками гуанозина (рис. 8). Для всех аналогов мРНК вместо фрагмента 52-195 (полосы "а") образуются модифицированные фрагменты с более высокой электрофоретической подвижностью, при этом подвижность этих фрагментов у мутанта К109М+М51А ниже, чем у мутанта И20М+ М195Ь (рис. 8А, сравнить дорожки 2 и 3). Эти данные указывают на то, что участок сшивки аналогов мРНК находится с С-концевой стороны от положений 109 и 120, то есть во фрагменте 121-195. Использование другого набора мутантов еЯР1 позволило более точно идентифицировать участок сшивки фактора с этими аналогами мРНК (рис. 8А, правая панель). Сравнение электрофоретической подвижности фрагментов, образующихся при расщеплении мутантов Ы24М+М51 А, 1Л26М+М51А и Н132М+М51А (рис. 8А, правая панель, мРНК +5А9, дорожки 4-6), сшитых с меченым аналогом +5А9, с картой расщепления еЯР1 (рис. 8Б) показало, что модифицированными были фрагменты ^ 125-195, 127-195 и 35-132. Следовательно, участок сшивки находится в районе 127-I 132 еИЧ.

Подобные рассуждения в случае тех же мутантов еКР1, сшитых с аналогом +7А9, позволили заключить, что модификации подвергаются фрагменты 35-124, | 35-126 и 35-132 (рис. 8А, правая панель, сравнить дорожки 4-6 для аналога +7А9 и рис. 8Б). Учитывая данные по локализации участка сшивки во фрагменте 121-195 1 (рис. 8А, дорожки 1, 2 и 3 для аналога +7А9), можно сделать вывод, что с аналогом ' +7А9 сшивался фрагмент 120-124 еШ7!. В случае аналога +6А9, в отличие от аналогов +5А9 и +7А9, наблюдали образование двух модифицированных фрагментов, один из которых соответствовал фрагменту 121-124, а другой -фрагменту 124-132 (рис. 8А, правая панель, сравнить дорожки 4-6 для аналогов +6А9, +7А9, +5А9).

I В случае аналога +7Р7 для идентификации участка е1У1, соответствующего

полосе "а", применяли набор мутантов, которые содержали точечные замены аминокислотных остатков на остатки метионина в районе МК8-мотива. Было показано, что участок сшивки аналога +7Р7 в еРР1 находился во фрагменте 67-73 еШ3! (рис. 9Б, сравнить дорожки 2 и 3). Что касается аналога +6Р6, то участок сшивки в районе 52-195 еЫР1 идентифицировать не удалось, поскольку выход продукта сшивки, соответствующего полосе "а", был слишком низким (см. рис. 5).

А +5А9 +«3 *7АЭ +5А9 +SA9 +7АЭ (UA-AWUAA'KUAAA-) (UA-A>| (UAA*) IfUAAA'

■ V». »!.}.» »I'j'i.1 4 3 lili 4 s eli < 5 i

дороявка 1 (uieRFI) 1&8*fla___

t IH"--—I I H-b-f

1 3451 1И 241 314329 3/2 422

pppoMtKB 2 pt 109M*M195LJ 14 5 "Да

All ll» 241 "

дорожке 3 ((120M*M19SL) 1J2 iOa

■ Ij i, Г

34Si 120 ¿и

т*мх>"> ?-124М<-М51А)в.8иВа I.lila

1 I T 1 i

34 124 195 2At

дороита 5 ^.126М<«ЯА)101^Да 7 s

I .....T } P

34 126 1SS 241

34 126 1SS 241

дрр<ша6(Н132М*1й61А))0.8«Да 6-8 «Да

Рис. 8. Картирование участков сшивки аналогов мРНК во фрагменте 52-195 eRFl с использованием тех же мутантов, что и в случае аналогов с модифицированным остатком G (см. рис. 7). (А) - электрофоретическое разделение продуктов расщепления мутантов, сшитых с мечеными аналогами мРНК, бромцианом. Ожидаемые молекулярные массы фрагментов, сшитых с аналогами мРНК, и положения соответствующих им полос указаны с обеих сторон от панелей (без учета молекулярной массы сшитых аналогов). Полосы "а" отмечены по аналогии с рис. 5. (Б) Схема расщепления eRFl с помочило CNBr, сверху указаны рассчитанные молекулярные массы (кДа) образующихся фрагментов; серым цветом выделены модифицированные фрагменты eRFl.

+7Р7 (UAAAnT

i г а.

■Я ХУ . ь

ш

Рис. 9. Картирование участка сшивки аналога +7Р7 внутри фрагмента 60-73 с использованием мутантных форм eRFl, несущих замены внутри этого фрагмента. (А) - электрофоретическое разделение продуктов гидролиза vvt-eRFl и мутантов V66M и G73M, сшитых с аналогом +7Р7, с помощью CNBr. Фрагменты "а" и "Ь" отмечены по аналогии с рис. 5. (Б) Схемы расщепления eRFl и используемых мутантов, на которых черным цветом выделены

модифицированные фрагменты и указаны их рассчитанные молекулярные массы (без учета массы сшитого аналога).

1.6. Идентификация участков сшивки во фрагменте eRFl, соответствующем полосе "Ь", для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой на остатке гуанозина

Молекулярная масса фрагментов, соответствующих полосам "Ь", наблюдаемым при расщеплении eRFl, сшитого с мечеными аналогами мРНК (рис. 5А), после вычета массы сшитых с ними остатков аналога мРНК составляет от 5 до 6 кДа. Поэтому участок сшивки может находиться в любом из кандидатных фрагментов (2-34, 195-241, 329-372, 372-422). На основании данных

по расщеплению мутантов К109М+М195Ь и И20М+М195Ь, сшитых с мечеными аналогами мРНК (рис. 7Б, для аналогов +6С9 и +7в9 соответствующие радиоавтографы не приведены), фрагмент 196-241 может быть исключен из дальнейшего рассмотрения. Среди оставшихся фрагментов только два фрагмента, а именно 2-34 и 241-314, содержат сайты для расщепления гидроксиламином. Из представленных данных (рис. 10А-В) видно, что в случае аналогов +509, +609 и +709 продукт, соответствующий полосе "Ь", селективно расщепляется гидроксиламином. Аналогичные результаты были получены при расщеплении модифицированных мутантов eR.Fl (рис. 10Б; в качестве примера приведены данные по расщеплению мутанта Ы24М+М51 А). Следовательно, участок сшивки может находится в одном из двух фрагментов: 2-34 или 241-314. Результаты, представленные на рис. 10, позволяют однозначно отнести полосу "Ь" к участку 2-34, поскольку электрофоретическая подвижность фрагмента, образующегося при расщеплении ОиС ниже, чем при обработке гидроксиламином. Если бы модификации повергался фрагмент 241-314 еЯЛ, то обработка продукта, соответствующего полосе "Ь", ОиС приводила бы к образованию фрагмента такого же размера (если участок сшивки в районе 242-262) или существенно более короткого (если участок сшивки в районе 263-314), чем фрагмент, образующийся при гидролизе гидроксиламином.

а б в г

Ж9-, Рнс. 10. Картирование участков сшивки

.найми» ^ Агдс аналогов мРНК во фрагменте, соответствующем

полосе "Ь", образующемся при расщеплении бромцианом еМЧ, сшитого с мечеными аналогами мРНК +509, +609 или +709, и мутанта 1Л24М+М51А, сшитого с аналогом +609. (А)-(Г) Электрофоретическое разделение продуктов, образующихся при расщеплении д фрагмента, соответствующего полосе "Ь",

г__гидроксиламином, С1иС или А^С. (Д) Схема

«ё/Зм з4э!а »>2 ЗГ ' расщепления еШЧ бромцианом (фрагмент 2-34 ^ ми,он у "'"--у выделен серым цветом, сверху указана его

зо £ молекулярная масса) и схемы гидролиза

fjy.4_-_.py .. ,, ........у А^С

фрагмента 2-34 гидроксиламином, 01иС или

15

Сравнение взаимного расположения полос, соответствующих модифицированным фрагментам, образующимся при расщеплении полосы "Ь" гидроксиламином, ИиС или А^С (рис. 10А-Г), показало, что участок сшивки аналогов находится в составе тетрапептида в положениях 31-34 еЯР1, а не во фрагменте 2-30. В последнем случае расщепление гидроксиламином приводило бы к появлению фрагмента более длинного, чем фрагменты, образующиеся при расщеплении 01иС или А^С (рис. 10, сравнить дорожки 01иС и А^С). Таким образом, все аналоги мРНК сшивались с фрагментом 31-34 еЯР1. Более того, полученные результаты позволяют сузить участок сшивки 31-34 до 31-33, так как, если бы остаток метионина в положении 34 был модифицирован,

расщепления ОГОг по этому сайту не происходило бы, приводя к образованию фрагмента 2-51. Однако в этом случае расщепление мутантов еЮЧ, в которых остаток Ме151 был заменен на остаток аланина, приводило бы к появлению более длинного модифицированного продукта по сравнению с фрагментом "Ь", образующимся при расщеплении \vt-eRF 1. Из данных, представленных на рис 10Б (правая часть панели), видно, что электрофоретическая подвижность фрагмента "Ь", образующегося при расщеплении с помощью СЫВг мутанта Ы24М+М51А, сшитого с аналогом +609, такая же, как у соответствующего фрагмента \vt-eRFl. Это означает, что остаток Мй34 не модифицировался. Следовательно, участок сшивки находится во фрагменте 31-ОТ8-33 еЯР1.

1.7. Идентификация участков сшивки во фрагменте еИР1, соответствующем полосе "Ь", для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой на остатке аденозина или З'-копцевом фосфате При идентификации модифицированного фрагмента еКБ1, соответствующего полосе "Ь", наблюдаемой с мечеными аналогами +7А9, +6Р6 и +7Р7, участок 196-241 был исключен из рассмотрения на основании данных, полученных с мутантами К109М+М195Ь и 1120М+М195Ь (рис. 8). Фрагмент 373-422 еЯР1 был исключен на основании данных по расщеплению модифицированных мутантов еЯР1, несущих в этом районе белка единичные замены аминокислотных остатков на остаток метионина (соответствующие радиоавтографы не приведены). Для того, чтобы выбрать между оставшимися кандидатными фрагментами 2-34 и 330-372, кусочки геля, соответствующие радиоактивным полосам "Ь", обработали эндопротеиназой Аг§С, которая имеет сайт для расщепления во фрагменте 2-34, но не во фрагменте 330-372. Как видно из данных, представленных на рис. 11, во всех случаях продукт, соответствующий полосе "Ь", оказался чувствительным к действию Аг§С, что указывает на расположение участка сшивки во фрагменте 2-34 (рис. 11 А, сравнить дорожки 1 и 3).

Для идентификации участка сшивки в районе 2-34 еЯР1 продукт, соответствующий полосе "Ь", расщепляли в параллельных экспериментах с помощью гидроксиламина, С1иС и А^С. Видно, что обработка гидроксиламином приводит к небольшому сдвигу полосы "Ь" (рис. 11, сравнить дорожки 1 и 2), что позволяет исключить из дальнейшего рассмотрения фрагмент 31-34. Сравнение результатов по расщеплению фрагмента "Ь" с помощью в1иС и А^С показало, что во всех случаях гидролиз этого фрагмента АщС приводит к образованию продукта (рис. 11 А, дорожки 3, полосы "с") с электрофоретической подвижностью, существенно меньшей, чем у фрагмента, полученного при обработке С1иС (рис. 11 А, дорожки 4, полосы "с!"). Эти результаты указывают на то, что полосы "с" соответствуют фрагменту 11-28 еЯР1. Для более точной локализации участка сшивки внутри района 11-28 модифицированные фрагменты, образующиеся при расщеплении с помощью 01иС продуктов, соответствующих полосам "Ь" (рис. 11 А, полосы "с!"), вырезали из гелей и обрабатывали в параллельных экспериментах гидроксиламином, эндопептидазой АврЫ и пепсином (рис. 11А и С, дорожки 5-7). Из трех фрагментов, которые

»7*9 (UAAA-)

+7Р7

+7Р7

,12 3 4 9.

могут образовываться при расщеплении продукта "Ь" с помощью 01иС, только один 26-34 имеет сайт для расщепления гидроксиламином (рис. 11Б, дорожка 4 и рис. ПС, дорожка 5). Как видно из данных, представленных на рис. 11 А, для всех аналогов мРНК продукт "сГ оказался чувствительным к действию гидроксиламина, но не пепсина и Айр-Ы, что однозначно указывает на то, что полоса "(1" соответствует модифицированному фрагменту 26-34 еЯР1. Учитывая, что участок сшивки аналогов +7А9, +6Р6 и +7Р7 находится в районе 11-28 еКР 1, можно заключить, что модификации подергается трипептид 26-28 еШЧ.

Рис. 11. Картирование участков сшивки аналогов мРНК, соответствующих полосе "Ь", во фрагменте 2-34 еЯР1. (А) Электрофоретическое разделение

фрагментов, образующихся при расщеплении меченого продукта, соответствующего полосе "Ь",

гидроксиламином (дорожка 2), А^С (дорожка 3) или 01иС (дорожка 4). Дорожки 5-7 — расщепление гидроксиламином, АврЫ или пепсином, соответственно, меченого продукта "<1" (дорожка 4), полученного при гидролизе 01иС фрагмента "Ь". (Б) Схема расщепления еЛР1 СЫВг и схемы гидролиза фрагмента 2-34 гидроксиламином, А^С или 01иС. Серым цветом выделены модифицированные фрагменты. (В) Схема расщепления гидроксиламином АврИ или пепсином фрагментов 2-13, 14-25 и 26-34 (отмеченных вертикальными пунктирными линиями) внутри фрагмента 2-34.

дорожка 1 I

3ti]» jL"

¿2

дсраяоса 2 NH.OH

3.3 «Да

дорожха 3 (АгдС)'

?0.9«Да

2.1 «Да 0.5 «Да ^

э 4 (GUC) ^

ю

1.3 «Да

в

дорсжга 5 (MHjOH) i

дороиия 6 (AspN)%

0.5 «Да

1.5 «Да 0.е«Да31

3.2 «да

0.4 «Да ,

2.9 «Да I

дорожка 7 (pepsin)4

«Да 0.5«Да j 1.1 «Да д<

Т

1.8.

Участки еЯП, сшивающиеся с аналогами мРНК Таким образом, аналоги мРНК сшиваются с тремя отдельными районами в Ы-домене белка. В случае аналогов мРНК с модифицированным остатком О во втором, третьем или четвертом положении терминирующего тетраплета фрагмент 31-33 был основной мишенью сшивки, тогда как модифицированные остатки А в тех же положениях аналога мРНК сшивались с аминокислотными остатками в районе УхСхххР-мотива, который был основной мишенью сшивки для аналогов с модифицированным А во втором или третьем положении стоп-кодона. Модифицированный А в четвертом положении терминирующего тетраплета сшивался преимущественно с трипептидом 26-ААК-28, который также был главной мишенью модификации для аналога мРНК с реакционнноспособной группой на З'-концевом фосфате стоп-кодона иАА. При расположении модифицирующей группы на З'-концевом фосфате тетраплета иААА сшивка происходила в основном не с трипептидом 26-ААЛ-28, а с фрагментом 67-73, соседствующим с мотивом 61-Ы1К8-64 еКР 1. Район ЫГКЯ-мотива, а именно остаток У66 еИ7!, сшивался с аналогом +4Ш.

j

2. Обсуждение результатов по аффинной модификации rpSISe и eRFl аналогами мРНК в составе специфических комплексов 80Sрибосом человека Правомерность использования коротких перфторфенилазидо-содержащих аналогов мРНК для изучения непосредственного окружения нуклеотидов мРНК в составе специфических комплексов 80S рибосом следует из сравнения результатов по аффинной модификации 18S рРНК этими аналогами (Graifer et al., 2004, Molotkov et al., 2006) с данными, полученными с помощью более длинных аналогов, несущих остаток s4U, способный образовывать сшивки нулевой длины (Pisarev et al., 2008). Оказалось, что при использовании разных типов аналогов мРНК схожие наборы нуклеотидов 18S рРНК подвергаются модификации, несмотря на различия в природе сшивающих групп и разные способы комплексообразования аналогов мРНК с рибосомами. Положения этих нуклеотидов во вторичной структуре 18S рРНК (Graifer et al., 2004, Molotkov et al., 2006) практически точно совпадают с положениями нуклеотидов 16S рРНК, контактирующих с соответствующими нуклеотидами мРНК в составе комплексов 70S рибосом по данным РСА (Yusupov et al., 2001, Setmer et al., 2006). Таким образом, все вышесказанное позволяет рассматривать декапептид 131-PG1GATHSS-140 rpS15e и участки 26-28, 31-33, 121-131 и 67-73 eRFl, сшивающиеся с аналогами мРНК, как непосредственное пептидное окружение смыслового кодона или стоп-сигнала в А-участке 80S рибосомы.

2.1. Сравнение результатов, по аффинной модификации rpS15e с данными крио-ЭМ и РСА рибосом про- и эукариот

Проведено сопоставление полученных результатов с данными РСА рибосом низших эукариот. В обеих доступных на сегодняшний день кристаллографических моделях отсутствуют мРНК и тРНК (Yusupov et al., 2010, Ban et al., 2010). Тем не менее, можно оценить расстояние между последним картированным на моделях аминокислотным остатком rpS15e и первым нуклеотидом кодона в А-участке рибосомы, вычислив расстояние от этого остатка до нуклеотида 18S рРНК, соответствующего нуклеотиду 16S рРНК, контактирующему с первым нуклеотидом кодона в А-участке 70S рибосомы. В одной из этих моделей (Ban et al., 2010) это расстояние составляет ~26Â, что хорошо согласуется с данными настоящей работы, если учесть, что в обсуждаемой модели у rpS15e отсутствуют аминокислотные остатки в положениях, соответствующих фрагменту 130-145 rpS15e человека. Таким образом, использование аналогов мРНК, несущих перфторфенилазидогруппу в заданном положении, позволило получить информацию о тонкой структуре декодирующего центра рибосом млекопитающих на том уровне, которого пока не удалось достичь с помощью РСА даже для рибосом низших эукариот.

Что касается крио-ЭМ моделей рибосом эукариот, то следует упомянуть недавно опубликованную модель 80S рибосом дрожжей (Beckman et al., 2010а, 2010b), в которую с помощью компьютерного моделирования встроен фрагмент мРНК. Результаты настоящей работы не согласуются с этой моделью, поскольку в ней минимальное расстояние между первым нуклеотидом кодона в А-участке и декапептидом, соответствующим фрагменту 131-140 в rpS15e, превышает 40 Â, что

в несколько раз больше радиуса действия АТВ-группы в аналогах мРНК. Обсуждаемая модель также противоречит данным обеих рассмотренных выше работ по РСА. Так, в кристаллографических моделях С-концевой фрагмент rpS15e, следующий за последним консервативным мотивом белка (LGEF/LAEF), неструктурирован, тогда как в крио-ЭМ модели после этого мотива следует а-спираль, которая не позволяет С-концевому фрагменту белка дотянуться до декодирующего центра рибосомы.

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белков семейства rpS19p показало, что идентифицированный в настоящей работе декапептид 131-PGIGATHSS-140 rpS15e высококонсервативен у эукариот и архей, но почти не имеет гомологии с С-концевым фрагментом белка S19p эубактерий. Следует отметить, что лишь короткие фрагменты этой последовательности были найдены в Protein Data Base для некоторых других семейств белков. Все это указывает на важную роль декапептида в положениях 131-140 в процессе трансляции у эукариот и, возможно, у архей. В процессе элонгации этот декапептид может вносить вклад в фиксацию кодона мРНК в декодирующем центре рибосомы, обеспечивая таким образом более высокую точность трансляции и меньшую вероятность сдвига рамки считывания, а в процессе терминации он может контактировать с eRFl, поскольку rpS15e практически полностью экранируется фактором от сшивки с мРНК, несущей s4U в первом положении стоп-кодона (Chavatte et al., 2003, Bulygin et al., 2005).

2.2. Фрагменты eRFl, соседствующие со стоп-сигналом мРНК в А-участке 80S рибосомы

Высококонсервативные фрагменты N-домена eRFl — 31-GTx-33, 63-73 (район NDCS-мотива) и 121-132 (район YxCxxxF-мотива), обнаруженные среди мишеней модификации аналогами мРНК со сшивающей группой на остатках G или А (табл. 2), удалены друг от друга в первичной структуре eRFl. Следовательно, участок узнавания стоп-кодона в eRFl образован тремя отдельными районами его N-домена, которые оказываются сближенными со стоп-кодоном и друг с другом в A-участке терминационного комплекса 80S рибосом. Сшивка аналогов мРНК с фотоактивируемой группой на З'-концевом фосфате с фрагментом 26-28 eRFl (табл. 2), указывает на то, что рибозо-фосфатный остов стоп-сигнала сближен с этим трипептидом. Можно предположить, что положительно заряженный остаток лизина или аргинина в положении 28 eRFl взаимодействует с З'-концевой фосфатной группой стоп-кодона. Такое взаимодействие может вносить вклад в энергию взаимодействия eRFl и терминирующего кодона. Участок 67-73 eRFl, сшивающийся с аналогом, несущим модифицированную группу на З'-концевом фосфате терминирующего тетраплета (табл. 2), содержит остатки (в положениях 70,71), которые, согласно литературным данным (Cheng et al., 2009, Eliseev et al., 2010), вовлечены в процесс связывания/распознавания пуринов стоп-кодна. Однако механизм, с помощью которого данные остатки eRFl могут быть вовлечены в этот процесс, остается неизвестным. На основании данных по сшивкам, можно предположить, что район 70-71 eRFl участвует, скорее всего, во взаимодействиях,

17

обеспечивающих поддержание специфической конформации N-домена eRFl, не контактируя с пуринами сгоп-кодона.

К настоящему времени накоплено много данных, указывающих на участие YxCxxxF-мотива в процессе распознавания пуринов сгоп-кодона (см., например, Cheng et al., 2009). Результаты по сшивкам eRFl с аналогами мРНК хорошо согласуются с этими данными (табл. 2) и являются первым экспериментальным доказательством того, что фрагмент 121-131, содержащий YxCxxxF-мотив в положениях 125-131, соседствует с пуринами различных стоп-кодонов в терминационных комплексах 80S рибосом.

Таблица 2. Фрагменты eRFI, сшивающиеся с аналогами мРНК, и аминокислотные остатки, соседствующие с модифицированными нуклеотидами аналогов по данным молекулярного моделирования_

Аналога мРНК (рис. 1) Распределение сшивок между фрага ежами а N-домеие в %** (аскобкахуказаны мишени модификации) Аишюкшлош ые остатки cRf I, соседста)№шме с мщифиц>фованньгми нуогопоами аналогов гю данным люла^лярюго моделирования

UUCUG'AAAA 22(Nl2l-Lt24) 753 (G31-S33) G3Î-T32, К63,С127, L312-E324, K3S4-K360

UUCUAG* AAA 24 (FI31) 76(G31-S33) T32-S33.N67-V7I, YI2S.K354-0359, Е370

UUCUAAG'AA 25(L124.FI31! 75(G3l-S33) 031-132. N67-V71. Y125-К130, К360-Н366

UUC UA*A AAA 100(С127-НШ) К65, V66

UUCUAA* AAA IOO(NI2I-U24,LI24-H|32) KM-V66

UUCUAAA'AA IO(NI21-LI24),«0<A26-R2ÍI) К45,Ы65

UUCUAAp* >95 (A2MUS) Е104.Т362-Е367

UUCUAAA'p 75 (N67-G73), 25 (A26-R28) K28.R29. R65, V101-E103.NI29

*Нуклеотид, несущий перфторфенилазидогруппу

"Рассчитано из данных, представленных на рнс. 5, в процентах от общего количества аналога мРНК, сшитого с eRFl. Относительная ошибка составляла -10%.

Результаты настоящей работы показывают, что мишени сшивки в eRFl зависят от природы модифицированного пурина (табл. 2), свидетельствуя о различном расположении eRFl относительно остатков А и G стоп-сигнала в терминационном комплексе 80S рибосом. Дипептид 31-GT-32, сшивающийся только с модифицированными остатками G, инвариантен в первичной структуре eRFl, и его ключевая роль в процессе распознавания сгоп-кодона вместе с N1KS-и YxCxxxF-мотивами была недавно показана с помощью сайт-направленного мутагенеза (Wang et al., 2010).

2.3. Сопоставление данных по аффинной модификации eRFl аналогами мРНК с моделями терминационных комплексов 80Sрибосом Для сопоставления с результатами по сшивкам использовали модели терминационных комплексов 80S рибосом, полученные ранее (Воробьев и

18

Киселев, 2007; 2008). Шаблоном для построения этих моделей служила кристаллографическая структура комплекса 70S рибосомы с мРНК и тРНК в А-и Р-участках (2HGP). К этому шаблону подгоняли структуру eRFl так, чтобы его конформация оптимально соответствовала рибосомной полости для связывания молекулы тРНК в А-участке. В результате были получены две альтернативные модели (Ml и М2) расположения eRFl относительно стоп-кодона мРНК, различающиеся степенью деформации структуры eRFl относительно конформации свободного фактора. Данные по сшивкам сопоставляли с моделью Ml, в которой конформация eRFl была близка к L-образной тРНК-подобной конформации, с расстоянием между NIKS- и GGQ-мотивами 76Ä, а между GGQ- мотивом и стоп-кодоном 74Ä, что соответствует расстоянию между . 3'-концом и антикодоном тРНК. Чтобы найти

аминокислотные остатки eRFl, соседствующие с атомом N3 перфторфенилазидогруппы аналогов мРНК, линкерные группировки были | добавлены к соответствующим нуклеотидам мРНК в этой модели, при этом учитывали те аминокислотные остатки, которые находились на расстоянии не более 10 А от атома N3 (табл. 2). Оказалось, что результаты по сшивкам eRFl с аналогами мРНК, несущими перфторфенилазидогруппу на остатках б, хорошо согласуются с этой моделью, в отличие от результатов, полученных для аналогов, несущих такую же группу на остатках А и модифицировавших район

( УхСхххР-мотива, а не №К5-мотива, сшивку с которым ожидали на основании ( модели М1 (табл. 2). Такое несоответствие можно легко объяснить, если I предположить, что Ы-домен eRFl подвергается конформационным перестройкам, при которых спирали а2 и аЗ и ОТ-мотив движутся в противоположных направлениях от центральной оси ^домена; при этом положения остатка R28 и района УхСхххР-мотива остаются неизменными (рис. 13).Такие перестройки, по-видимому, позволяют остаткам аденина стоп-сигнала

Рис. 13. Модель взаимного расположения мРНК, тРНК в Р-участке и eRFl в A-участке в 80S рибосомном терминационном комплексе. (А) Общий вид. Сахарофосфатный остов мРНК представлен трубкой цвета хаки, тРНКр,е в Р-участке рибосомы - трубкой темно-синего цвета; eRFl изображен в виде спирали (N-, М-, и С-домены фактора выделены, соответственно, красным, зеленым и зелено-голубым цветами). (Б) Увеличенное детальное изображение части комплекса, включающей N-домен eRFl и мРНК, представленное таким же образом, что и общий вид. N1KS-, GT-мотивы и остаток Arg28 показаны в виде "стержней", YxCxxxF-мотив изображен в виде широкой "ленты". Отмечены спирали а2 и аЗ eRFl. Нуклеотиды стоп-кодона в A-участке рибосомы (в положениях +4, +5 и +6) изображены в виде "стержней" и обведены розовой областью. Стрелками указаны предполагаемые направления движения фрагментов N-домена.

глубже проникать в "карман" в N-домене eRFl, где происходит их связывание с фактором, что может объяснить различия в наборе мишеней модификации eRFl аналогами мРНК со сшивающей группой на остатках А и G в стоп-сигнале.

Таким образом, остатки аденозина и гуанозина стоп-сигнала мРНК распознаются разными конформациями N-домена eRFl, главным отличием между которыми является расположение пуринов стоп-сигнала относительно универсально консервативного дипептида 31-GT-32 eRFl. Этот дипептид соседствует или даже контактирует с остатками гуанозина, но удален от остатков аденозина. Данные, полученные в настоящей работе, объясняют способность eRFl распознавать все три стоп-кодона и дают новое представление о механизмах распознавания стоп-кодона у эукариот, которые до настоящего времени остаются неизвестными, поскольку методы РСА и крио-ЭМ пока не были применены для изучения терминационных комплексов 80S рибосом.

ВЫВОДЫ

С использованием набора аналогов мРНК - производных олигорибонуклеотидов, несущих перфторфенилазидогруппу в заданном положении, впервые установлены фрагменты одного из ключевых компонентов декодирующего центра рибосом млекопитающих - белка S15 и фактора терминации трансляции eRFl, соседствующие в составе специфических комплексов с кодоном мРНК в декодирующем центре и нуклеотидом, прилегающим к нему с 3'-стороны.

• Специфичный для эукариот и архей декапептид 131-PGIGATHSSR-140 рибосомного белка S15 соседствует с мРНК в процессах элонгации и терминации трансляции; при этом первый нуклеотид кодона в A-участке в большей степени сближен с этим декапептидом, чем другие нуклеотиды.

• Три отдельных высококонсервативных района eRFl в его N-домене (NIKS, YxCxxxF и GTx) оказываются сближенными со стоп-кодоном и друг с другом в A-участке терминационного комплекса 80S рибосом.

• Остатки гуанозина во втором, третьем или четвертом положении стоп-сигнала соседствуют с мотивом 31-GTx-33 eRFl, а остатки аденозина в тех же положениях - с районом 121-131, включающим YxCxxxF-мотив, что соответствует разным конформациям N-домена eRFl.

• Фосфат на 3'-конце четвертого нуклеотида стоп-сигнала сближен с участком 67-73 eRFl в районе NIKS-мотива, содержащем аминокислотные остатки, участвующие в дискриминации пуринов стоп-сигнала, тогда как 3'-концевой фосфат на третьем нуклеотиде стоп-кодона соседствует с неконсервативным фрагментом 26-28 eRFl, который также сближен с остатком аденозина в четвертом положении терминирующего тетраплета.

• Остатки аденозина и гуанозина стоп-сигнала мРНК распознаются разными конформациями N-домена eRFl, различающимися ориентацией абсолютно консервативного дипептида 31-GT-32 относительно этих остатков, что может обеспечивать механизмы, позволяющие eRFl узнавать все три стоп-кодона.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Хайрулина Ю.С.. Молотков М.В, Булыгин К.Н., Грайфер Д.М., Веньяминова А.Г., Карпова Г.Г. С-концевой фрагмент рибосомного белка S15 расположен в декодирующем центре рибосомы человека // Молекуляр. биология. - 2008. - Т. 42,- С. 306-313.

2. Khairulina J.. Graifer D., Bulygin К., Ven'yaminova A., Frolova L., Karpova G. Eukaryote-specific motif of ribosomal protein SI5 neighbors A site codon during elongation and termination of translation // Biochimie. — 2010. — V. 92. — P. 820-

3. Bulygin K.N., Khairulina Yu.S.. Kolosov P.M., Ven'yaminova A.G., Graifer D.M., Vorobjev Yu.N., Frolova L.Yu., Kisselev L.L., Karpova G.G. Three distinct peptides from the N domain of translation termination factor eRFl surround stop codon in the ribosome//RNA. -2010. -V. 16.-P. 1902-1914.

4. Bulygin K.N., Khairulina Yu.S.. Kolosov P.M., Ven'yaminova A.G., Graifer D.M., Vorobjev Yu.N., Frolova L.Yu., Karpova G.G. Adenine and guanine recognition of stop codon is mediated by different N domain conformations of translation termination factor eRFl // Nucleic Acids Res. - 2011. - V. 39. - P. 71347146.

СТРУКТУРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ БЕЛКОВ гр815е И е!Ш, СОСЕДСТВУЮЩИЕ С мРНК В ДЕКОДИРУЮЩЕМ ЦЕНТРЕ РИБОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА

Автореф. дисс. на соискание учёной степени кандидата химических наук. Подписано в печать 12.09.2011. Заказ №89. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии Института катализа СО РАН 630090 Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 5

825.

ХАИРУЛИНА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА

Принятые сокращения

Введение

ГЛАВА 1. Механизмы декодирования генетической информации на рибосомах про-и эукариот на стадиях элонгации и терминации трансляции

Обзор литературы)

1.1. Общие черты строения рибосом

1.2. мРНК-связывающий центр рибосом

1.3. Декодирование мРНК на стадии элонгации

1.3.1. Роль факторов EF-Tu/EF-1 А в процессе элонгации 23 1.3.1.1 .Расположение фактора элонгации EF-Tu на рибосоме 24 1.3.1.2. Механизмы стимуляции ОТРазной активности EF-Tu

1.3.2. Кинетические аспекты процесса декодирования мРНК на стадии элонгации

1.3.3. Структурные основы декодирования генетической информации на рибосомах прокариот

1.3.4. Структура декодирующего центра рибосом эукариот

1.4. Механизмы декодирования стоп-кодона 36 1.4.1. Структура и функции факторов терминации трансляции

1.4.2 Декодирование стоп-кодона на рибосомах прокариот 44 1.4.3. Декодирование стоп-кодона на рибосомах эукариот

1.4.3 Л. Модель распознавания стоп-кодона фактором eRFl 47 1.4.3.2. Участки eRFl, вовлеченные в распознавание стоп-кодона 50 Заключение

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть

2.1. Материалы

2.2. Выделение рибосомных 40S и 60S субчастиц из плаценты человека

2.3. Введение радиоактивной метки на 5'-конец олигонуклеотидов и их производных

2.4. Синтез фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов

2.4.1. Производные, несущие перфторфенилазидогруппу на остатке гуанозина

2.4.2. Производные, несущие перфторфенилазидогруппу на остатке аденозина или уридина, либо на 3'-концевом фосфате

2.5. Получение комплексов 80S рибосом с аналогами мРНК в отсутствие eRFl

2.6. Получение комплексов 80S рибосом с аналогами мРНК в присутствии eRFl

2.7. Определение степени связывания меченых аналогов мРНК с 80S рибосомами

2.8. Фотоаффинная модификация 80S рибосом аналогами мРНК

2.9. Разделение модифицированных 80S рибосом на субчастицы

2.10. Выделение 80S рибосомных комплексов

2.11. Выделение белков, сшитых с мечеными аналогами мРНК

2.12. Приготовление рабочих растворов ферментов

2.13. Подбор условий полного гидролиза белков эндопротеазами

2.14. Расщепление модифицированных белков бромцианом и анализ образующихся фрагментов

2.15. Расщепление модифицированных белков и пептидов гидроксиламином

2.16. Специфическое расщепление модифицированных белков эндопротеиназами

ГЛАВА 3. Структурные элементы рибосомного белка S15 и фактора терминации трансляции eRFl, соседствующие с мРНК в декодирующем центре рибосомы человека (Результаты и wc обсуждение)

3.1. Аналоги мРНК, использованные для аффинной модификации rpS 15е и eRFl в составе специфических комплексов рибосом

3.2. Модельные комплексы 80S рибосом с тРНКРЬе и аналогами мРНК, в которых проводили аффинную модификации rpS15e и eRFl

3.3. Выделение белков rpS 15е и eRFl, сшитых с мечеными аналогами мРНК, из облученных комплексов рибосом

3.4. Определение участков rpS 15е, сшивающихся с аналогами мРНК

3.5. Определение участков eRFl, сшивающихся с аналогами мРНК

3.5.1. Идентификация участков сшивки eRFl во фрагменте, соответствующем полосе "а", для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой на остатке уридина или гуанозина

3.5.2. Идентификация участков сшивки eRFl во фрагменте, соответствующем полосе "а", для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой на остатке аденозина или 3'-концевом фосфате

3.5.3. Идентификация участков сшивки во фрагменте eRFl, соответствующем полосе "Ь", для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой на остатке гуанозина

3.5.4. Идентификация участков сшивки во фрагменте eRFl, соответствующем полосе "Ь", для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой на остатке аденозина или 3 '-концевом фосфате

3.5.5. Участки eRFl, сшивающиеся с аналогами мРНК, несущими перфтрофенилазидогруппу на остатках U, G или А, либо на

3'-концевом фосфате

3.6. Обсуждение результатов по аффинной модификации rpS 15е и eRFl аналогами мРНК в составе специфических комплексов 80S рибосом человека

3.6.1. Сравнение результатов, по аффинной модификации rpS 15е в составе специфических комплексов с данными крио-ЭМ высокого разрешения и РСА рибосом про- и эукариот

3.6.2. Структурные основы узнавания стоп-кодона фактором eRFl на 80S рибосоме

3.6.2.1. Участки eRFl, соседствующие со стоп-кодоном мРНК в A-участке рибосомы

3.6.2.2. Сопоставление данных по аффинной модификации eRFl аналогами мРНК с моделями терминационных комплексов 80S рибосом

Во всех организмах от бактерий до человека заключительный этап реализации генетической информации происходит на рибосоме, где последовательность тринуклеотидов мРНК, скопированная с ДНК, переводится в аминокислотную последовательность синтезируемого белка. Синтез белков на рибосоме является одним из ключевых процессов жизнедеятельности каждой клетки, и поэтому установление молекулярных основ трансляции является одной из важнейших проблем молекулярной биологии. Рибосомы прокариот на сегодняшний день детально изучены с применением различных методов, но наиболее впечатляющие успехи были достигнуты на рубеже веков благодаря достижениям рентгеноструктурного анализа (РСА), которые позволили расшифровать структуру рибосом прокариот на уровне отдельных атомов. За такой прорыв в изучении молекулярных основ процесса трансляции трое ученых в 2009 году были удостоены Нобелевской премии в области химии. Однако метод РСА до сих пор не применен для изучения комплексов рибосом высших эукариот с мРНК и тРНК, поскольку их кристаллы, пригодные для такого анализа, еще не получены. Несмотря на значительные успехи в изучении строения« рибосом эукариот с помощью метода крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ), этот метод пока не удалось в полной мере применить для изучения структурно-функциональной организации рибосом высших эукариот. Наконец, для исследования рибосом эукариот неприменимы методы, основанные на реконструкции рибосомных субчастиц из белков и рРНК, поскольку пока не найдено подходов для сборки активных рибосомных субчастиц эукариот in vitro.

Одним из наиболее информативных методов для изучения структурно-функциональной топографии трансляционных комплексов рибосом эукариот и, в частности человека, оказался метод аффинного химического сшивания (аффинной модификации). Этот метод основан на использовании аналогов компонентов аппарата трансляции (обычно мРНК или тРНК), несущих химически активную группу в заданном положении. Метод аффинной модификации оказался весьма продуктивным для изучения строения функциональных центров бактериальных рибосом в 80-90-х годах XX века [1, 2]. Полученные с помощью этого метода результаты в дальнейшем были практически полностью подтверждены данными РСА. С использованием аналогов мРНК — производных олигорибонуклеотидов, несущих перфторфенилазидогруппу на определенном нуклеотидном остатке, в ЛСФР ИХБФМ СО РАН изучен на уровне белков и нуклеотидов рРНК мРНК-связывающий центр рибосомы человека. Полученные результаты показали, что у высших эукариот белки вносят больший вклад в организацию мРНК-связывающего центра рибосомы, чем у эубактерий, и позволили выявить значительные различия в белковом окружении мРНК на рибосомах млекопитающих и эубактерий. В частности, в декодирующем центре рибосомы человека был обнаружен рибосомный белок S15 (rpS15e), чей прокариотический гомолог rpS19p, по данным РСА, удален от этого центра в 30S субчастице. Однако к моменту начала настоящей работы оставалось неизвестным, какие фрагменты rpS15e вовлечены в формирование декодирующего центра рибосомы человека.

Метод аффинной модификации является также наиболее подходящим методом для изучения молекулярных основ декодирования стоп-сигнала на рибосомах высших эукариот, осуществляемого с помощью фактора терминации трансляции eRFl (от англ. eukaryotic recycling factor class 1). К настоящему времени накоплены данные об аминокислотных остатках eRFl, замена которых приводит к нарушению узнавания стоп-кодона [3, 4]. С помощью аффинной модификации удалось определить фрагмент фактора, контактирующий с первым уридином стоп-кодона- в терминационном комплексе. Оказалось, что это высококонсервативный' мотив NIKS, расположенный в N-домене фактора [5]. Однако данных о фрагментах eREl, формирующих участок узнавания пуринов стоп-сигнала, к моменту начала настоящей работы не было.

Настоящая работа является продолжением серии работ, проводимых в ЛСФР* ИХБФМ СО РАН, по изучению молекулярного окружения мРНК в специфических комплексах рибосом человека с помощью коротких аналогов мРНК — реакционноспособных производных олигорибонуклеотидов.

Целью настоящей работы являлось установление фрагментов рибосомного белка S15 и фактора терминации трансляции eRFl, соседствующих с мРНК в декодирующем центре рибосомы человека, с помощью аффинной модификации данных белков аналогами мРНК - производными олигорибонуклеотидов, несущими фотоактивируемую группу в заданном положении, в составе различных модельных комплексов рибосом с этими аналогами. Невысокий, выход продуктов сшивки при аффинной модификации белков в составе таких комплексов затрудняет идентификацию модифицированных олигопептидов с помощью масс-спектрометрии. Этих трудностей можно избежать при использовании методологии, основанной на селективном расщеплении белка, сшитого с меченым аналогом мРНК, специфическими протеолитическими агентами.

В ходе работы планировалось решить следующие задачи: • определить фрагменты rpS15e, сшивающиеся с аналогами мРНК, несущими перфторфенилазидобензоильную группу на остатке уридина или гуанозина, в модельных комплексах 80S рибосом, различающихся по типу кодона в A-участке и положению модифицированного нуклеотида относительно кодона в Р-участке, а также по наличию фактора терминации трансляции eRFl;

• с использованием аналогов мРНК, несущих перфторфенилазидобензоильную . группу на остатках уридина, гуанозина или аденозина в разных положениях стоп-сигнала, либо на 3'-концевом фосфате, определить аминокислотные остатки фактора терминации трансляции eRFl, сшивающиеся с модифицированными нуклеотидами этих аналогов в терминационных комплексах 80S рибосом.

выводы

С использованием набора аналогов мРНК — производных олигорибонуклеотидов, несущих перфторфенилазидогруппу в заданном положении, впервые установлены фрагменты одного из ключевых компонентов декодирующего центра рибосом млекопитающих - белка S15 и фактора терминации трансляции eRFl, соседствующие в составе специфических комплексов с кодоном мРНК в декодирующем центре и нуклеотидом, прилегающим к нему с 3'-стороны.

Специфичный для эукариот и архей декапептид 131-PGIGATHSSR-140 рибосомного белка S15 соседствует с мРНК в процессах элонгации и терминации трансляции; при этом первый нуклеотид кодона в A-участке в большей степени сближен с этим декапептидом, чем другие нуклеотиды.

Три отдельных высококонсервативных района eRFl в его N-домене (NIKS, YxCxxxF и GTx) оказываются- сближенными со стоп-кодоном и друг с другом в А-участке терминационного комплекса 80S рибосом.

Остатки- гуанозина во- втором, третьем или четвертом положении стоп-сигнала соседствуют с мотивом 31-GTx-33 eRFl, а остатки аденозина'в тех же положениях — с районом 121-131, включающим YxCxxxF-мотив, что соответствует разным конформациям N-домена eRFl.

Фосфат на 3'-конце четвертого нуклеотида стоп-сигнала сближен с участком 67-73 eRFl'в районе NIKS-мотива, содержащем аминокислотные остатки, участвующие в дискриминации пуринов стоп-сигнала, тогда как 3'-концевой- фосфат на третьем нуклеотиде стоп-кодона соседствует с неконсервативным фрагментом 26-28 eRFl, который также сближен с остатком аденозина в четвертом положении терминирующего тетраплета.

Остатки аденозина и гуанозина стоп-сигнала мРНК распознаются разными конформациями N-домена eRFl, различающимися ориентацией абсолютно консервативного дипептида 31-GT-32 относительно этих остатков, что может обеспечивать механизмы, позволяющие eRFl узнавать все три стоп-кодона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение метода аффинной модификации с использованием аналогов мРНК, несущих перфторфенилазидогруппу в заданном положении, в сочетании с методологией, основанной на специфичном расщеплении модифицированного белка, позволило получить уникальную информацию о структурных элементах рибосомного белка S15, одного из ключевых компонентов декодирующего центра 80S рибосомы, и фактора терминации eRFl, соседствующих с мРНК. Полученные данные о том, что специфичный для эукариот и архей декапептид 131-PGIGATHSSR-140 rpS15e вовлечен в формирование декодирующего центра рибосомы человека, отражают принципиальные отличия в строении этого центра в рибосомах млекопитающих и эубактерий, очевидно, связанные с более сложным и многостадийным процессом регуляции трансляции у эукариот. Результаты по аффинной модификации фактора терминации трансляции eRFl в составе терминационных комплексов 80S рибосом в сочетании с данными молекулярного моделирования позволили получить новое представление о механизмах распознавания остатков гуанина и аденина в терминирующих тетраплетах, объясняющее способность eRFl распознавать все три стоп-кодона.

1. Карпова Г. Г., Кнорре Д. Г. (1991) Структурно-функциональная топография рибосом E.coli по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК и тРНК. Успехи биологической химии. 32,' 3-49.

2. Сергиев П. В., Донцова О. А., Богданов А. А. (2001) Изучение структуры прокариотической рибосомы биохимическими методами: судный.день. Молекуляр. биология. 35,559-583.

3. Bertram G., Bell Н. A., Ritchie D. W., Fullerton G., and Stansfield I. (2000) Terminating eukaiyote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop codon recognition. RNA. 6, 1236-1247.

4. Hatin I., Fabret C., Rousset J. P., Namy O. (2009)* Molecular dissection of translation termination mechanism identifies,two new critical regions in eRFl. Nucleic Acids Res. 37, 1789-1798.

5. Chavatte L., Seit-Nebi A., Dubovaya V., Favrem A. (2002) The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSRToop of human eRFl in the ribosome. EMBO J. 21,5302-5311.

6. Steitz T. A. (2008) A structural understanding of the dynamic ribosome machine. Mol. Cell Bio. 9,242-253.

7. Doudna J. A., and- Rath V. L. (2002) Structure and function of the eukaryotic ribosome: the next frontier. Cell-. 109,153-156.

8. Brodersen D. E., and Nissen P. (2005) The social life of ribosomal proteins. FEBS J. 272, 2098-2108.

9. Rodnina M. V. and Wintermeyer W. (2009) Recent mechanistic insights into eukaryotic ribosome. Curr. Opin. CeirBiol. 21,1-9.

10. Myasnikov A. G., Simonetti A., Marzi S., Klaholz B. P. (2009) Structure-function insights into prokaryotic and eukaryotic translation initiation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 300-309.

11. Nygard O. and Nilsson L. (1990) Translational dynamics. Interaction between the translational factors, tRNA and ribosomes during eukaryotic protein synthesis. Eur. J. Biochem. 191,1-17.

12. Wimberly В. Т., Brodersen D. E., Clemons W. M., Morgan-Warren R. J., Carter A. P., Vonrhein, C., Hartsch, T. and Ramakrishnan, V. (2000) Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature. 407, 327-339.

13. Ban N., Nissen P., Hansen J., Moore P. B. and Steitz T. A. (2000) The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science. 289, 905-920.

14. Yusupov M. M., Yusupova G. Zh., Baucom A., Lieberman K., Earnest T. N., Cate J. H. D. and Noller, H. F. (2001) Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science. 292, 883-292.

15. Yusupova G. Zh., Yusupov M. M., Cate J. H. D. and Noller H. F. (2001) The path of messenger RNA through the ribosome. Cell. 106,233-241.

16. Selmer M., Dunham C. M., Murphy IV F. M., Weixlbaumer A., Petry S., Kelley A. C., Weir J. R. and Ramakrishnan V. (2006) Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science. 313, 1935-1942.

17. Korostelev A., Trakhanov S., Laurberg M., Noller H. F. (2006) Crystal structure of a 70S ribosome-tRNA complex reveals functional interactions andJ rearrangements. Cell'. 126, 1065-1077.

18. Spahn C. M. T., Beckmann R., Eswar N., Penczek P. A., Sali A., Blobel G. and Frank J. (2001) Structure of the 80S ribosome from Saccaromyces serevisiae tRNA-ribosome and subunit-subunit interactions. Cell. 107, 373-386.

19. Morgan D. G., Menetret J-F., Neuhof A., Rapoport T. A. and Akey C. W. (2002) Structure of the mammalian ribosome-channel complex at 17 A resolution. J. Moll Biol. 324, 871886.

20. Chandramouli P., Topf M., Menetret J-F., Eswar N., Cannone J. J., Gutell R. R., Sali A. andoAkey C. W. (2008)tStructure of the Mammalian 80S Ribosome at 8.7 A Resolution. Structure. 16,535-548.

21. Sengupta J., Nilsson Ji, Gursky R., Spahn C. M. T., Nissen P. and Frank J. (2004) Identification of the versatile scaffold protein RACK1 on the eukaryotic ribosome by cryo-EM. Nature Struct. Mol. Biol. 11, 957-962.

22. Taylor D. J., Devkota B., Huang A. D., Topf M., Narayanan E., Sali, A., Harvey S. C. and Frank J. (2009) Comprehensive molecular structure of the Eukaryotic ribosome. Structure. 17,1591-1604.

23. Halic M., Becker T., Frank J., Spahn C. M. and Beckmann R. (2005) Localization and dynamic behavior of ribosomal protein L30e. Nat. Struct. Mol. Biol. 12,467-468.

24. Armache J-P., Jarasch A., Anger A. M., Villa E., Becker T., Bhushan S., Jossinet F., Habeck M., Dindar G., Franckenberg S., Marquez V., Mielke T., Thomm M., Berninghausen O., Beatrix B., Soding J., Westhof E., Daniel N., Wilson D. N. and

25. Beckmann R. (2010) Cryo-EM structure and rRNA model of a translating eukaryotic 80S ribosome at 5.5-A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107,19748-19753.

26. Pisarev A. V., Kolupaeva V. G., Yusupov M. Ml, Hellen C. U. T and Pestova T. V. (2008) Ribosomal position and contacts of mRNA in eukaryotic translation »initiation complexes. EMBO J. 27,1609-1621.

27. Ben-Shem A., Jenner L., Yusupova G., Yusupov M. (2010) Crystal structure of the eukaryotic ribosome. Science. 330, 1203-1209.

28. Malygin A. A. and Karpova G. G. (2010) Structural motifs of the bacterial ribosomal proteins S20, SI8 and S16 that contact rRNA present in the eukaryotic ribosomal proteins S25, S26 and S27A, respectively. Nucleic Acids Res. 38, 2089-2098.

29. Rabl J., Leibundgut M., Ataide S. F., Haag A. and Ban N. (2010) Crystal structure of the eukaryotic 405" ribosomal subunit in complex with initiation factor 1. Science. 331, 730736.

30. Steitz T. A. (1969) Polypeptide chain initiation: nucleotide sequences of the three ribosomal binding sites in bacteriophage R17 RNA. Nature. 224, 957-964.

31. Beyer D., Shripkin E., Wadzack J., Nierhaus K. H. (1994) How the ribosome moves along the mRNA during protein synthesis. J. Biol. Chem. 269, 30713- 30717.

32. Hiittenhofer A. and Noller H. F. (1994) Footprinting mRNA-ribosome complex with chemical probes. EMBO J. 13, 3892-3901.

33. Shatsky I. N., Bakin A. V., Bogdanov A. A., Vasiliev V. D. (1991) How does the mRNA pass through the ribosome? Biochimie. 73, 937-945.

34. Andreev D. E., Terenin I. M., Dunaevsky Y. E., Dmitriev S. E., Shatsky I. N. (2006) A leaderless mRNA can bind to mammalian 80S ribosomes and direct polypeptide synthesis in the absence of translation initiation factors. Mol. Cell Biol. 26, 3164-3169.

35. VanLoock M. S., Easterwood Т., Harvey S. C. (1999) Major groove binding of the tRNA/mRNA complex to the 16S ribosomal RNA decoding site. J. Mol. Biol. 285. 20692078.

36. Jenner L. В., Demeshkina N., Yusupova G., Yusupov Mi (2010) Structural aspects of messenger RNA reading frame maintenance by the ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 555-560.

37. Demeshkina N., Jenner L., Yusupova G., Yusupov M. (2010). Interactions of the ribosome with mRNA andtRNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 325-332.

38. Грайфер Д. M., Карпова Г. Г., Кнорре Д. Г. (2001). Расположение матрицы на рибосоме человека по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК. Биохимия. 66, 725-744.

39. Грайфер Д. М., Карпова Г. Г. (2001) Структурно-функциональная топография рибосом человека по данным сшивок с аналогами мРНК производными олигорибонуклеотидов. Молекуляр. биология. 35, 584-596.

40. Demeshkina N., Meshaninova M., Ven'yaminova A., Graifer D. and Karpova G. (2003) Positioning1 of mRNA codons with respect to 18S rRNA at the P and E sites of human ribosome. Biochim. Biophys. Acta. 1627, 39-46.

41. Molotkov M., Graifer D., Demeshkina N., Repkova M., Ven'yaminova A., Karpova G. (2005) Arrangement of mRNA 3' of the A site codon of the human 80S ribosome. RNA Biol. 2,63-69.

42. Molotkov Mi V., Graifer D. M., Popugaeva E. A., Bulygin K. N., Meshaninova M. I., Ven'yaminova A. G., Karpova G.G. (2006) mRNA 3' of the A site bound codon is located close to protein S3 on the human 80S ribosome. RNA Biol. 3, 122-129.

43. Bouadloun F., Donner D., and Kurland C. G. (1983) Codon-specific missense errors in vivo. EMBO J. 2, 1351-1356.

44. Rodnina, M:.V. andWintermeyer W. (2001) Fidelity of aminoacyl-tRNA selection-on-theiribosome: kinetic and structural mechanisms. Annu. Rev. Biochem. 70• 415-435.

45. Berchtold H., Reshetnikova L., Reiser G. O., Schirmer N. K., Sprinzl M. and Hilgenfeld R. (1993) Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature. 365, 126-132.

46. Kjeldgaard M., Nissen P., Thirup S. and« Nyborg» J: (1993) The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation. Structure. 1, 35-50.

47. Abel K., Yoder M. D., Hilgenfeld R. and Jurnak F. (1996) An alpha to beta conformational switch in EF-Tu. Structure. 4, 1153-1159.

48. Polekhina G., Thirup S., Kjeldgaard M., Nissen P., Lippmann C. and.Nyborg J: (1996) Helix- unwinding in the effector region of elongation factor EF-Tu-GDP. Structure. 4, 1141—115i.

49. Song H., Parsons M. R., Rowsell S., Leonard G. and Phillips S. E. (1999) Crystal structure of intact elongation factor EF-Tu from Escherichia coli in GDP conformation at 2.05 A resolution. J. Mol. Biol. 285,1245-1256.

50. Clark B. F. C., Kjeldgaard M., La Cour T. F. M., Thirup S. and Nyborg J. (1990) Structural determination of the functional sites of E. coli elongation factor Tu. Biochim. Biophvs. Acta. 1050, 203-208.

51. Kjeldgaard M. and Nyborg J. (1992) Refined structure of elongation factor Tu from Escherichia coli. J. Mol. Biol. 223, 721-742.

52. Swart G. W. M., Parmeggiani A'., Kraal B. and Bosch L. (1987) Effects of the mutation Gly-222-*Asp on the functions of elongation factor Tu. Biochemistry. 26, 2047-2054.

53. Tubulekas I. and Hughes D. (1993) A single amino acid substitution in elongation factor Tu disrupts the interaction between ternary complex and the ribosome. J. Bacteriol. 175, 240-250.

54. Abdulkarim F., Liljas L. and Hughes D. (1994) Mutations to kirromycin resistance occur in the interface of domains I and lll of EF-Tu-GTP. FEBS Lett. 352, 118-122.

55. Mesters J. R., Zeef L. A. H., Hilgenfeld R., Degraaf J. M., Kraal B. and Bosch L. (1994) The structural and functional basis for the kirromycin resistance of mutant EF-Tu species in E. coli. EMBO J. 13, 4877-4885.

56. NissenP., Thirup S., Kjeldgaard M. and Nyborg J. (1999) The crystal structure of Cys-tRNACys-EF-Tu-GDPNP1 reveals general and specific features in the ternary complex and intRNA. Structure. 7,143-156.

57. Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G., Reshetnikova L., Clark B. F. and Nyborg J. (1995) Crystal structure of'the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science. 270,1464-1472.

58. Shulman R. G., Hibers C. W., Miller D. L. (1974) Nuclear magnetic resonance studies of protein-RNA interaction. I. The elongation factor Tu-GTP aminoacyl-tRNA complex. J. Mol. Biol. 90, 601-607.

59. Noble C. G. and Song H. (2008) Structural studies of elongation and release factors. Cell. Mol. Life Sci. 65, 1335-1346.

60. Limmer S, Reiser C. O. A., Schirmer N. K., Grillenbeck N. W., Sprinzl M. (1992) Nucleotide binding and GTP hydrolysis by elongation factor Tu from Thermus thermophilus as monitored by proton NMR. Biochemistry. 31,2970-2977.

61. Daviter T, Wieden H.J., Rodnina M. V. (2003) Essential role of histidine 84 in elongation factor Tu for the chemical step of GTP hydrolysis on the ribosome. J. Mol. Biol. 332, 689-699.

62. Valle M., Zavialov A., Li W., Stagg S. M., Sengupta J., Nielsen R. C., Nissen P., Harvey S. G., Ehrenberg M*., Frank J. (2003) Incorporation of aminoacyl-tRNA into the ribosome as seen by cryo-electron microscopy. Nat. Struct. Biol. 10, 899-906.

63. Kothe U., Wieden H. J., Mohr D., Rodnina M. V. (2004) Interaction of helix D of elongation factor Tu with helices 4 and-5 of protein L7/12 on the ribosome. J. Mol. Biol. 336,1011-1021.

64. Mohr D., Wintermeyer W., Rodnina M. V. (2002) GTPase activationof elongation factors Tu and G on the ribosome. Biochemistry. 41, 12520-12528.

65. Andersen G. R., Pedersen L., Valente L., Chatterjee L, Kinzy T. G., Kjeldgaard M., and Nyborg J. (2000) Structural basis for nucleotide exchange and competition with tRNA in-the yeast elongation factor complex eEFlA:eEFlBa. Mol: Cell. 6,1261-1266.

66. Ogle J. M., Ramakrishnan V. (2005) Structural insights into translational fidelity. Annu. Rev. Biochem. 74, 129-77.

67. Agirrezabala X., and Frank J. (2009). Elongation in translation as a dynamic interaction among the ribosome, tRNA, and elongation factors EF-G and EF-Tu. Q. Rev. Biophys. 42, 159-200.

68. Voorhees R. M., Schmeing T. M., Kelley A. C., Ramakrishnan V. (2010) The mechanism for activation of GTP hydrolysis on the ribosome. Science. 330, 835-837.

69. Rodnina M. V., Fricke R., Kuhn L. and Wintermeyer W. (1994) Transient conformational states of aminoacyl-tRNA during ribosome binding catalyzed by elongation factor Tu. Biochemistry, 33, 12267-12275.

70. Marshall R. A., Aitken C. E., Dorywalska M., Puglisi J. D. (2008) Translation at the single-molecule level. Annu. Rev. Biochem. 77, 177-203.

71. Ali I. K., Lancaster L., Feinberg J., Joseph S., Noller H. F. (2006) Deletion of a central ribosomal intersubunit RNA bridge. Mol. Cell. 23, 865-874.

72. Hausner T. P., Atmadja J., Nierhaus K. H. (1987) Evidence that the G2661 region of 23S rRNA is located at the ribosomal binding sites of both elongation factors. Biochimie. 69,' 911-923.

73. Rambelli F., Brigotti M., Zamboni M., Denaro M., Montanaro L., Sperti S. (1989) Effect of the antibiotic purpuromycin on cell-free protein-synthesizing systems. Biochem. J. 259, 307-310.

74. Zaher H. S. and Green R. (2009) Fidelity at the molecular level: lessons from protein synthesis. Cell. 136,- 746-762.

75. Rodnina M. V., Pape T., Fricke R., Kuhn L., Wintermeyer W. (1996) Initial binding of the elongation factor Tu*GTP»aminoacyl-tRNA complex preceding codon recognition on the ribosome. J. Biol. Chem. 27, 646-652.

76. Blanchard S. C., Gonzalez R. L., Kim H. D., Chu S. and Puglisi J. D. (2004) tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11,1008-1014.

77. Pape T, Wintermeyer W., Rodnina M. V. (1999) Induced fit» in initial selection« and proofreading of aminoacyl-tRNA on the ribosome. EMBO J. 18, 3800-3807.

78. Gromadski K. B, Rodnina M. V. (2004) Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Mol. Cell. 13,191-200.

79. Gromadski K. B., Daviter T., and Rodnina M. V. (2006). A uniform t response to mismatches in codon-anticodon complexes ensures ribosomal fidelity. Mol. Cell. 21, 369377.

80. Lee T. H., Blanchard S. C., Kim H. D., Puglisi J. D., Chu S. (2007) The role of fluctuations in tRNA selection by the ribosome. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 104, 13661-13665.

81. Rodnina M. V., Fricke R., Kuhn L. and Wintermeyer W. (1995) Codon-dependent conformational change of elongation factor Tu preceding GTP hydrolysis on the ribosome. EMBO J. 14,2613-2619.

82. Pape T., Wintermeyer W. and Rodnina M. V. (1998) Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A site of the E-coli ribosome. EMBO J. 17, 7490-7497.

83. Kothe U., Rodnina M. V. (2006) Delayed release of inorganic phosphate from elongation factor Tu following GTP hydrolysis on the ribosome. Biochemistry. 45, 12767-12774.

84. Moazed D., Noller H. F. (1986) Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal RNA from attack by chemical probes. Cell. 47, 985-994.

85. Fourmy D., Recht M. I., Blanchard S. C., Puglisi J. D. (1996) Structure of the A site of Escherichia coli 16S ribosomal RNA complexed with an aminoglycoside antibiotic. Science. 274,1367-1371.

86. Yoshizawa S., Fourmy D., Puglisi J. D. (1999) Recognition of the codon-anticodon helix by ribosomal RNA. Science. 285, 1722-1725.

87. Nissen P.', Ippolito J. A., Ban N., Moore P. B. & Steitz, T. A. (2001) RNA tertiary interactions in the large ribosomal subunit: the A-minor motif. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98,4899-4903.

88. Carter A. P., demons W. M., Brodersen D. E., Morgan-Warren R. J., Wimberly B. T., Ramakrishnan V. (2000). Functional insights from the structure of the 30S ribosomal, subunit and its interaction with antibiotics. Nature. 407,340-348.

89. Lynch S. R. and Puglisi J. D. (2001) Structure of a eukaryotic decoding-region A-site RNA. J. Mol. BioK 306,1023-1035.

90. Kondo J.', Urzhumtsev A. and Westhof E. (2006) Two conformational states in the crystal" structure of the Homo sapiens cytoplasmic ribosomal decoding A site. Nucleic Acids Res. 34; 676-685.

91. Fan-Minogue H. and Bedwell D. M. (2008) Eukaryotic ribosomal.RNA determinants of aminoglycoside resistance and their role in translational'fidelity. RNA. 14, 1-10.

92. Cochella L., Brunelle J. L. and' Green R. (2007)- Mutational' analysis reveals two independent molecular requirements during transfer RNA selection on.the ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 30-36.

93. Gutell R. R: (1993) Collection of small subunit (16S- and 16S-like) ribosomal RNA structures. Nucleic Acids Res. 21, 3051-3054.

94. Kisselev L. L., Ehrenberg M., Frolova L. Yu. (2003) Termination of translation: Interplay of mRNA, rRNAs and release factors? EMBO J. 22, 175-182.

95. Grentzmann G., Brechemier-Baey D., Heurgue V., Mora L., and Buckingham R. H. (1994) Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 5848-5852.

96. Mikuni O., Ito K., Moffat J., Matsumura K., McCaughan K., Nobukuni T., Tate W. and Nakamura Y. (1994) Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 5798-5802.

97. Dunkle J. A. and Cate J. H. D. (2010) Ribosome structure and Dynamics during translocation and termination. Annu. Rev. Biophys. 39, 227-244.

98. Zavialov A. V., Buckingham R. H., and Ehrenberg M. (2001) A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell. 107,115-124.

99. Petry S., Weixbaumer A. and Ramakrishnan V. (2008). The termination of translation. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 70-77.

100. Alkalaeva E. Z., Pisarev A. V., Frolova L. Y., Kisselev L. L. and Pestova T. V. (2006) In vitro reconstitution of eukaryotic translation reveals cooperativity between release factors eRFl and eRF3. Cell. 125, 1125-1136.

101. Pisareva V. P., Pisarev A. V., Hellen C. U., Rodnina M. V. and Pestova T. V. (2006) Kinetic analysis of interaction of eukaryotic release factor 3 with guanine nucleotides. J. Biol. Chem. 281,40224-40235.

102. Buckingham R. H., Grentzmann G., Kisselev, L. (1997) Polypeptide chain release factors. Mol. Microbiol. 24,449-456.

103. Pisarev A. V., Hellen C. U. and Pestova T. V. (2007) Recycling of eukaryotic posttermination ribosomal complexes. Cell. 131,286—299.

104. Pisarev A. V., Skabkin M. A., Pisareva V. P., Skabkina O. V., Rakotondrafara A. M. Hentze M. W., Hellen C. U. T. and Pestova T. V. (2010) The role of ABCE1 in eukaiyotic posttermination ribosomal recycling. Mol. Cell. 37,196-210.

105. Rees D. C., Johnson E. and Lewinson O. (2009) ABC transporters: the power to change. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10,218-227.

106. Skabkin M. A., Skabkina O. V., Dhote V., Komar A. A., Hellen C. U. T. and Pestova T. V. (2010) Activities of ligatin and MCT-1/DENR in eukaryotic translation initiation and ribosomal recycling. Genes Dev. 24; 1787—1801.

107. Shoemaker C. J., Eyler D. E., Green R. (2010) Dom34:Hbsl promotes subunit dissociation and peptidyl-tRNA drop-off to initiate No-Go decay. Science. 330, 369-372.

108. Doma M. K., Parker R; (2006) Endonucleolytic cleavage of eukaryotic mRNAs with stalls in translation elongation. Nature. 440, 561-564.

109. Graille M., Chaillet M., van Tilbeurgh H. (2008) Structure' of yeast Dom34: a protein related to translation termination factor Erfl and involved in No-Go decay. J. Biol. Chem. 283, 7145-7154.

110. Atkinson G. C., Baldauf S. L., Hauryliuk V. (2008) Evolution of nonstop; no-go and nonsense-mediated mRNA decay and their termination factor-derived components. BMC Evol. Biol. 8,-209-3091

111. Khoshnevis S., Gross T., Rotte C., Baierlein C., Eicner R., Krebber H. (2010) The iron-sulphur protein RNase L inhibitor functions in translation termination. EMBO Rep. 11, 214-219.

112. Kurata S., Nielsen K. H., Mitchell S. F., Lorsch J. R., Kaji A., Kaji H. (2010) Ribosome recycling step in yeast cytoplasmic protein synthesis is catalyzed by eEF3 and ATP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10854-10859.

113. Vestergaard B., Van L. B., Andersen G. R., Nyborg J., Buckingham R. H. and Kjeldgaard M. (2001) Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRFl. Mol. Cell. 8,1375-1382.

114. Ito K, Uno M, Nakamura Y. (2000) A tripeptide 'anticodon' deciphers stop codons in messenger RNA. Nature. 403, 680-684.

115. Shin D., Brandsen J., Jancarik J.; Yokota H., Kim R., and Kim S. H. (2004) Structural analyses of peptide release factor 1 from Thermotoga maritima reveal domain flexibility required for its interaction with the ribosome. J. Mol. Biol. 341, 227-239.

116. Klaholz B. P., Pape T., Zavialov A. V., Myasnikov A. G., Orlova E. V., Vestergaard B., Ehrenberg Mi and van Heel M. (2003) Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor 2. Nature 421, 90—94.

117. Rawat U. B., Zavialov A. V., Sengupta J., Valle M., Grassucci R. A., Linde J., Vestergaard B., Ehrenberg'M. and Frank J. (2003) A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound termination factor RF2. Nature 421, 87-90.

118. Rawat U., Gao H., Zavialov A., Gursky R., Ehrenberg M. and Frank J. (2006) Interactions of the release factor RF1 with the ribosome as revealed by cryo-EM. J. Mol. Biol. 357, 1144-1153.

119. Seit-Nebi A., Frolova L., Kisselev L. (2002) Conversion of omnipotent translation termination'factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl. EMBO Rep. 3, 881— 886.

120. Kolosov P.', Frolova L., Seit-Nebi A., Dubovaya V., Kononenko A, OparinaN., Justesen J., Efimov A., Kisselev L. (2005) Invariant amino acids essential for decoding function of polypeptide release factor eRFl. Nucleic Acids Res. 33, 6418—6425.

121. Lekomtsev S., Kolosov P., Bidou L., Frolova L., Rousset J. P. and Kisselev L. (2007) Different modes of stop codon. restriction by the Stylonychia and Paramecium eRFl translation termination factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 10824-10829.

122. Cheng Z., Saito K., Pisarev A. V., Wada M., Pisareva V. P., Pestova T. V., Gajda M., Round A., Kong C., Lim M., Nakamura Y., Svergun D.I., Ito K., and Song H. (2009)

123. Structural insights into eRF3 and stop codon recognition by eRFl. Genes Dev. 23, 1106— 1118.

124. Chavatte L., Frolova L., Laugaa P., Kisselev L., Favre A. (2003) Stop codons and UGG promote efficient binding of the human polypeptide release factor eRFl to the eukaryotic ribosomal A-site. J. Mol. Biol. 331, 745-758.

125. Ma В., Nussinov R. (2004) Release factors eRFl and RF2: A universal mechanism controls the large conformational changes. J. Biol. Chem. 279, 53875-53885.

126. Воробьев Ю. H., Кисселев JI. Л. (2007). Модель структуры эукариотического рибосомного комплекса терминации трансляции. Молекуляр. биология. 41, 103-111.

127. Воробьев Ю. Н., Кисселев Л. Л. (2008) Моделирование расположения фактора терминации трансляции eRFl и стоп-кодона мРНК объясняет сближенность С-концевого домена eRFl со стоп-кодоном в рибосомном комплексе. Молекуляр. биология. 42,341-351.

128. Nakamura Y., Ito К. (2003) Making sense of mimic in translation termination. Trends Biochem. Sci. 28, 99-105.

129. Poole E. S., Askarian-Amiri M. E., Major L. L., McCaughan К. K., Scarlett D. J., Wilson D. N., Tate W. P. (2003) Molecular mimicry in the decoding of translational stop signals. Prog. Nucleic. Acid. Res. Mol. Biol. 74; 83-121.

130. Киселев Л. Л. (2003) Факторы* терминации 1-го класса — функциональные аналоги аминоацил-тРНК. Молекуляр.-биология. 37, 931-943.

131. Petry S., Brodersen D. Е., Murphy, F. V. IV, DunhamC. M., Selmer M., Tarry M. J., Kelley A. C., Ramakrishnan V. (2005) Crystal structures of the ribosome in complex with release factors RF1 and RF2 bound to a cognate stop codon. Cell 123, 1255-1266.

132. Kisselev L. L., Buckingham R. H. (2000) Translation termination comes of age. Trends. Biochem. Sci. 25, 561-566.

133. Freistroffer D., Pavlov M. Y., MacDougall J., Buckingham R. H., and Ehrenberg M. (1997) Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J. 16,4126-4133.

134. Kong C., Ito K., Walsh M. A., Wada M., Liu Y., Kumar S., Barford D., Nakamura Y., and Song H. (2004) Crystal structure and functional analysis of the eukaryotic class II release factor eRF3 from S. pombe. Mol. Cell. 14, 233-245.

135. Czworkowski J., Wang J., Steitz T. A. and Moore P. B. (1994) The crystal structure of elongation factor G complexed with GDP, at 2.7 A resolution. EMBO J. 13, 3661-3668.

136. Ito K., Uno M., Nakamura Y. (1998) Single amino acid substitution in prokaryotic polypeptide release factor 2 permits it to terminate translation at all three termination codons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 8165-8169.

137. Ebihara K. and Nakamura Y. (1999) C-terminal interaction of translational release factors eRFl and eRF3 of fission yeast: G-domain uncoupled binding and the role of conserved amino acids. RNA. 5, 739-750.

138. Frolova L. Yu., Merkulova T. I., Kisselev L. L. (2000) Translation termination in eukaryotes: polypeptide release factor eRFl is composed of two' functionally and structurally distinct domains. RNA. 6, 381-390.

139. Laurberg M., Asahara H., Korostelev A., Zhu J., Trakhanov S., Noller H. F. (2008) Structural basis for translation termination on the 70S ribosome. Nature 454, 852-857.

140. Weixlbaumer A., Jin H., Neubauer C., Voorhees R. Mi, Petry S., Kelley A. C., Ramakrishnan V. (2008) Insights into translational termination from the structure of RF2 bound to the ribosome. Science. 322, 953-956'

141. Korostelev A., Asahara H., Lancaster L., Laurberg Mi, Hirschi A., ZhuJ., Trakhanov S., Scott W. G., Noller H. F. (2008) Crystal structure of a translation termination complex formed with release factor RF2i Proc. Natl: Acad.1 Sci: 105, 19684-19689.

142. Korostelev A., Zhu J., Asahara H., Noller H. F. (2010). Recognition of the amber UAG stop codon by release factor RF1. EMBO J. 29,2577-2585.

143. Youngman E. M., He S. L., Nikstad L. J., Green R. (2007) Stop codon recognition by release factors induces structurals rearrangement of the ribosomal decoding center that is productive for peptide release. Mol. Cell. 28, 533-43.

144. Korostelev A., Ermolenko' D. N. and Noller H. F. (2008) Structural dynamics of the ribosome. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 674-683.

145. Nakamura Y., Ito K., Ehrenberg M. (2000) Mimicry grasps reality in translation termination. Cell. 101, 349-352.

146. Knight R. D:, Landweber L. F. (2000) The early evolution of the genetic code. Cell. 101, 569-72.

147. Kervestin S:, Frolova L., Kisselev L., Jean-Jeans Or (2001) Stop codon recognition in ciliates: Euplotes release factor, does not respond to reassigned UGA codon: EMBO Rep. 2, 680-684.

148. Eliseev В., Kryuchkova P.,. Alkalaeva E. and Frolova L. (2010) A single amino acid change of translation terminations factor eRFl switches between bipotent and' omnipotent stop-codon specificity. Nucleic Acids Res, 39, 599-608.

149. Lozupone C.A., Knight R. D., Landweber L. F. (2001) The molecular basis of nuclear genetic code change in ciliates. Curr Biol. 11,65-74.

150. Semenkov Yu. Pi, Kirillov S. V. and Stahl J. (1985) 40 S subunits from rat liver ribosomes contain two codon-dependent sites for transfer RNA. FEBS Lett: 193,105-108.

151. Ghangchien E.-M. and; Graven G. R. (1986) The use of hydroxylamine cleavage to produce a frament of ribosomal protein S4 which retains the capacity to» specifically bind5 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 14,1957-1966.

152. Горн В. В., Зенкова M. А., Комарова H. И., Репкова M. Н. (1990) Авторматический Н-фосфанатный синтез олигорибонуклеотидов с использованием 2'-0-тетрагидропиранальной защитной группы: Биоорган, химия. 16,,941-950.

153. Демешкина Н. А., Репкова M. Н., Вёньяминова А. Г., Грайфер Д. М. Карпова Г. Г. (2002) Сшивки аналога: мРНК, производного pUUAGUAUUUAUU с фотоактивируемой группой на остатке гуанозина, с 80S рибосомами человека. Молекуляр. биология. 36,114-122.

154. Megli F. M., Van Loon D., Barbuti A. A., Quagliarello E., Wirtz K. W. (1985) Chemical modification of methionine residues of the phosphatidylcholine transfer protein from bovine liver. A spin-label study. Eur. J. Biochem. 149, 585-590.

155. Caskey С. Т., Beaudet A. L., Tate W. P. (1974) Mammalian release factor: in vitro assay and purification. Methods Enzymol. 30,293-303.

156. Кононенко А. В., Дембо К. А., Киселев JI. Jl., Волков В. В. (2004) Молекулярная морфология фактора терминации трансляции^ 1-го класса эукариот eRFl в растворе. Молекуляр. Биология. 38, 303-311.

157. Klein, D; J., Moore P. В., Steitz T. A. (2004) The roles of ribosomal proteins in the; structure assembly, and evolutioniof the large ribosomal subunit; J; Mol. Biol. 340; 141177.

158. Hoang L., Fredrick K., Noller FI. Iv. (2004) Creating ribosomes with an all-RNA 30S subumt P site: Proc. Natl; Acad; Sci. USA. 101;, 12439-12443:

159. Nakao A., Yoshihama M., Kenmochi; N. (2004) RPG: the Ribosomal Protein. Gene database. Nucleic Acids Res. 32, 168-170

160. Rouquette J., Choesmel V., Gleizes P.-E; (2005) Nuclear export and cytoplasmic processing of precursors to the 40S ribosomal: subunits immammalian cells. EMBO J. 24, 2862-2872.

161. Vanrobays E., Gelugne J. P., Gleizes P. E., Caizergues-Ferrer M; (2003) Late cytoplasmic maturation of the small; ribosomal subunit requires RIO proteins in Saccharomyces cerevisiae. Mol; Cell Biol. 23,2083-2095.

162. Yusupova G., Jenner L., Rees В., Moras D:, Yusupov M. (2006) Structural basis for messenger RNA movement on the ribosome. Nature. 444® 391—394.

163. Merkulova T. I., Frolova L. Y., Lazar M., Camonis J., and Kisselev L. L. (1999) C-terminal domains of human translation termination factors eRFl and eRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Lett. 443, 41-47.